摘要
白细胞介素2（IL-2）是大多数过继性细胞转移（ACT）癌症治疗方案的组成部分，但受短期暴露和高毒性的限制。NKTR-214是一种动力学工程化的IL-2受体βγ（IL-2Rβγ）偏置激动剂，由与多个可释放的聚乙二醇链缀合的IL-2组成，从而导致通过IL-2Rβγ的持续信号传导。我们报道，与IL-2相比，由NKTR-214支持的ACT增加了抗肿瘤T细胞的增殖，归巢和持久性，从而在B16-F10小鼠黑素瘤模型中产生了优异的抗肿瘤活性。在1期试验中，与IL-2相比，NKTR-214的使用增加了小鼠脾脏和肿瘤中多功能T细胞的数量，并增强了接受NKTR-214的患者外周血T细胞和NK细胞的多功能。结论，
识别特定肿瘤抗原的T细胞的过继性细胞转移（ACT）在晚期癌症患者中取得了可喜的结果1。ACT灌注离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或T细胞受体（TCR）工程化的外周血T细胞的临床方案需要同时给予白介素2（IL-2，aldesleukin），通常以最高耐受剂量静脉内给药在住院医院中每8小时一次，以支持过继转移细胞的扩展和功能2。这种给药方案导致了很高的暴露峰值，这说明了急性毒性，这种作用持续时间很短，并且亚最佳激活了IL-2受体3。已经尝试通过降低剂量和皮下给药来降低IL-2的毒性并改善其药代动力学，但是与高剂量的IL-2 4相比是否仍能保持益处尚不清楚。此外，IL-2通过结合中间亲和力异二聚体受体IL-2Rβγ激活效应T细胞和自然杀伤分子（NK）而具有多效刺激作用，但它也与高亲和力异三聚体受体复合物IL-2Rαβγ相互作用膨胀调节性T细胞（Treg细胞），其在肿瘤微环境具有已知的免疫抑制的角色5，6，7。高剂量IL-2施加的这些限制限制了ACT在临床中的使用8。
不同的策略已追求为了开发γ链-信号传导的细胞因子与相对于天然IL-2细胞因子的改善的安全特征和选择性地扩大效应T细胞上的Treg 9，10，11，12。NKTR-214（也称为bempegaldesleukin）是一种前药，其氨基酸序列与临床批准的IL-2相同，但与多条可释放的聚乙二醇（PEG）链缀合。NKTR-214的前药形式不与IL-2受体结合，也不激活T细胞信号传导。但是，当暴露于生理条件时，PEG链会随时间顺序释放，从而使细胞因子结合并触发通过IL-2受体复合物的信号传导。以其最活跃的形式1-PEG-IL-2和2-PEG-IL-2，聚乙二醇化的位置降低了IL-2及其同源IL-2Rα亚基之间的相互作用，同时降低了对IL-2Rβγ的亲和力复杂保持相对不变3，13。先前的研究提供了证据，与IL-2相比，在NKTR-214处理的小鼠中，IL-2Rβγ优先于IL-2Rα的活化导致杀死肿瘤的CD8 T细胞与Treg的比率增加（分别为400倍和18倍）3，13。游离的未结合的IL-2本质上是无法检测到的，因为它的清除速度快于其形成的速度。NKTR-214作为一种单药疗法，并与抗PD-1抗体或Toll样受体（TLR）激动剂联合使用，目前正在多项临床试验中的门诊患者中进行评估，显示出在多种肿瘤类型中具有早期疗效的证据以及有利的门诊剂量14。
在当前的工作中，我们测试了以下假设：共同使用NKTR-214可以胜过IL-2，从而改善过继转移的效应T细胞的体内扩增，激活和持久性，从而提高抗肿瘤功效。为了验证该原理，我们使用临床前pmel-1小鼠模型研究了NKTR-214与ACT联合使用时与ACT + IL-2相比肿瘤特异性CD8 T细胞扩增的行为。来自pmel-1小鼠的所有CD8 T细胞均具有B16-F10鼠黑色素瘤细胞表达的黑色素瘤抗原gp100特异的转基因T细胞受体（TCR）。当与NKTR-214或IL-2组合时，该模型允许对这些T细胞的抗肿瘤活性，生物分布，体内功能和基因表达谱进行可控评估。此外，
在携带ACT时已建立的B16-F10鼠黑色素瘤肿瘤大于150 mm 3的小鼠中，评估了NKTR-214支持过继转移的抗肿瘤T细胞的扩增和功能的抗肿瘤作用。C57BL / 6小鼠植入B16-F10，并接受gp100肽在体外激活的pmel-1 Thy1.1 + T淋巴细胞，然后在使用500 cGy全身照射的淋巴结消灭方案后用IL-2或NKTR-214进行全身性治疗（图 1a）。进行剂量递增以定义与ACT一起给药的NKTR-214剂量，以在小鼠中实现具有可接受毒性谱的抗肿瘤反应（补充图 1a–d）。如前所述，NKTR-214与ACT的结合耐受性高达0.8 mg / kg的NKTR-214，每9天给予一次，共三剂（q9dx3）3。用第四剂没有观察到肿瘤延迟的差异（补充图 1e）。先前报道的ACT + IL-2的给药方案用作比较剂（连续三天为0.4 mg / kg，qdx3）15。为了合理地平衡NKTR-214和IL-2之间的不同药代动力学特征，我们每9天重复qdx3 IL-2给药方案，以符合NKTR-214的q9dx3时间表。过继转移的细胞仅在淋巴切除后的第1天给药，随后的NKTR-214或IL-2给药均不重复ACT。
与IL-2相比，采用NKTR-214过继转移的T细胞具有优异的抗肿瘤反应。pmel-1 ACT模型的示意图。全文中以天为单位的时间点是指在第0天服用ACT + NKTR-214或ACT + IL-2后的天数。在第0天之后，不再给予任何ACT。根据q9dx3给药方案，在第9天和第18天给予第二次NKTR-214（一个剂量）或IL-2（qdx3）剂量。b平均肿瘤体积随时间的变化。数据为平均值±sem（n = 12）。* 与ACT + IL-2相比，p <0.0001；＃p <0.0001与载体相比（双向ANOVA，和Bonferroni-Dunn的多重比较检验）。（c通过插入达到1000 mm 3肿瘤体积的时间来评估每个肿瘤生长曲线的肿瘤生长延迟。 与ACT + IL-2（对数秩Mantel–Cox检验）相比，＃p <0.0001。该实验代表三个重复。
与ACT + IL-2或ACT +载体相比，ACT + NKTR-214在侵袭性B16-F10模型中可显着抑制肿瘤生长，且给药频率较低（图 1b，c）。如先前所证实的16，在该模型中，不添加IL-2的pmel-1 ACT几乎没有抗肿瘤益处，这突显了IL-2通过ACT提供强大的抗肿瘤活性的关键作用。与ACT + IL-2或ACT +载体（分别为19.5和11天）相比，接受ACT + NKTR-214的小鼠显示中位肿瘤生长延迟（评估为达到1000 mm 3的时间）为42天。 。 1C）。直到研究结束，ACT + NKTR-214中的12只小鼠中有2只肿瘤既没有生长也没有缩小（图 1c）。和补充图 2a）。收集并显示来自这些小鼠的具有长期应答的肿瘤，并进行免疫组织化学（IHC）分析，结果显示样品中存在持续浸润肿瘤的CD8 T细胞（补充图 2b）。为了监测潜在的治疗毒性，我们在整个实验过程中观察了小鼠的临床体征并测量了它们的体重。结果显示，在与ACT联合注射0.8 mg / kg NKTR-214后，小鼠没有出现任何体重变化或其他可观察到的副作用（补充图 3a）。）。使用IHC染色评估，在ACT + NKTR-214或ACT + IL-2后第5天，肝脏和肾脏中CD8 T细胞浸润的趋势增加。这些剂量范围从肾脏中的0–6％阳性细胞和肝脏中的0–40％，到第二次给药前第9天下降到不足10％。根据小鼠的活动水平和观察到的行为，这些作用并未导致明显的临床体征（补充图 3b，c）。
为了更好地了解采用ACT + NKTR-214治疗改善抗肿瘤活性和T细胞运输的机制，对pmel-1 Thy1.1 + T细胞进行了基因修饰以表达萤火虫荧光素酶，从而可以使用生物发光成像技术在体内检测T细胞（BLI）跟踪过继转移的T细胞的生物分布和肿瘤特异性归巢（图 2a–c）。BLI分析表明，不含IL-2的ACT导致过继转移的pmel-1细胞在体内的扩增极小甚至没有，但由于同源抗原识别，肿瘤中有一些积聚（图 2a，左栏），正如我们已经先前描述17，进一步描绘了IL-2补充对于ACT有效抗肿瘤反应的关键作用。与ACT + IL-2相比，从ACT + NKTR-214处理获得的BLI图像从第5天到第7天大大增加了脾脏中T细胞的扩增（图 2a，中间和右列）。第5天，在脾脏部位进行感兴趣区域（ROI）分析的连续图像中的BLI定量显示，与ACT + IL-2处理的小鼠相比，ACT + NKTR-214的平均辐射度高14倍（图 2b））。这些数据得到了使用体内靶向CD8的半胱氨酸双抗体（cDb）的免疫PET成像的支持，从而使全身无创成像可以研究CD8 T细胞蓄积的部位（图 2d）。）。另外，对收获器官的放射性进行离体生物分布分析表明，治疗后第5天，ACT + NKTR-214组的脾脏信号比ACT + IL-2组高5倍（图 2e）。）。通过连续数字病理分析的脾脏CD8 IHC证实，与ACT + IL-2相比，用ACT + NKTR-214处理的小鼠中CD8 T细胞的扩增明显更高（图 2f，g）。在ACT + NKTR-214处理的小鼠中，NKTR-214在淋巴去掉后触发了脾脏免疫细胞的快速重建，导致在全身照射后6天，脾细胞计数比ACT + IL-2处理的小鼠高7倍（补充图。 4）。注意到到第9天和第二次NKTR-214或IL-2剂量之前，在脾脏和肿瘤中观察到BLI信号显着降低，与治疗无关（图 2b，c和补充图 5a）。），与q9d的给药时间表一致。通过观察到第9天脾脏和肿瘤中CD8 T细胞信号的暂时减少，抗CD8免疫PET的使用再次提供了对这些动力学的确认（补充图 5b，c）。令人惊讶的是，在第9天给予的第二次NKTR-214剂量触发了脾脏和肿瘤中过继转移T细胞的新扩增（仅在第1天给予），这种新细胞在第12天到第17天持续存在。在用IL-2重新给药的组中注意到了这一点（图。 2a–c）。第14天第二次NKTR-214给药后，肿瘤中的T细胞浸润达到峰值，与ACT + IL-2组相比，ACT + NKTR-214组的平均辐射度高6倍（图。 2a–c）。在第18天进行第三次NKTR-214剂量后，未观察到CD8 T细胞进一步扩增（图2b，c）。
NKTR-214治疗可增加脾脏中T细胞的扩增和持久的肿瘤浸润。萤火虫荧光素酶标记的pmel-1 T细胞在体内的时程生物发光成像（BLI）。第5天和第14天的代表性图像，每组五只复制小鼠。脾脏中的T细胞扩增（上图，SIDE）；肿瘤中的动员和持久性（下图，FRONT）。比例尺显示辐射，从最小3.0×10 5 e到最大5.0×10 6光子，秒-1 cm -2 Steradian -1。b，c脾（b）和肿瘤的感兴趣区域（ROI）的定量成像分析c）至表达荧光素酶的pmel-1T细胞ACT后第23天。小鼠用ACT和NKTR-214（0.8 mg / kg，q9dx3，iv）组合或IL-2（0.4 mg / kg，qdX3每9天3次，ip）或媒介物对照治疗。与ACT + IL-2相比，ACT + NKTR-214的脾脏信号在第5天达到峰值。* p <0.0001 ACT + NKTR-214相比ACT + IL-2， ＃p <0.0001相比ACT +车辆，双向ANOVA和Tukey多重比较检验，Ñ = 5，平均值±SEM。d在用ACT + IL-2或ACT + NKTR-214治疗后第5天获得的代表性免疫PET / CT图像（n = 3 /组），使用Zr-89标记的抗CD8半胱氨酸双抗体（cDb）。比例尺表示从低（黑色）强度到高（红色）强度的每克检测到的每克组织注射的剂量百分比（％ID / g）。e注射Zr-89 cDb后24小时收获的器官中T细胞生物分布的离体分析。％ID / g：每克注射剂量。双抗体和残留的放射性核苷酸经历肾脏清除，因此来自肾脏的高非特异性信号。平均值±sem（n = 3），* p <0.05，*** p <0.001，**** p <0.0001，未配对t检验。F在第5天，来自脾脏的FFPE的CD8 +染色每组三个重复的代表性图像。HALO软件分析显示标记表达的强度，从低（蓝色）到高（红色）表达水平。g使用HALO软件对IHC玻片进行数字病理定量，显示了在不同时间点脾脏中CD8 T细胞扩增的百分比。**** p <0.0001，平均值±sem，未配对t检验。
为了进一步表征治疗诱导的免疫细胞群的功能表型，我们在第7天和第14天（第一个和第二个峰的峰值）对接受ACT与NKTR-214或IL-2联合治疗的小鼠的脾脏和肿瘤进行了大规模细胞计数。第二次CD8 T细胞扩增。我们的小组由T，NK，B和骨髓细胞谱系标记组成（补充表 1）。我们首先使用t随机邻居嵌入（t-SNE）生成的对应于髓样细胞，树突状细胞（DC），NK细胞，B细胞和T的热图手动注释来自CD45 +细胞的七个主要免疫种群（补充图6a）。 细胞（图 3a，b）。正如预期的那样，治疗之间差异更大的簇是脾和肿瘤中的T细胞群体（图 3a–d）。此外，ACT + NKTR-214治疗在第7天和第14天使脾脏中的髓样区增加（图 3a–c）。与第14天（第二剂给药后5天）的IL-2相比，NKTR-214后的强劲再治疗效果尤为突出，证实了图2c的体内成像结果 。NK簇在第7天优先用ACT + IL-2扩增，在第14天优先用ACT + NKTR-214扩增（图 3a–c）。T-SNE密度图显示，IL-2在第7天和第14天导致脾脏中优先B细胞扩增（图 3a）。有趣的是，在早期时间点，在ACT + IL-2和ACT + NKTR-214处理的小鼠中，树突状细胞群均占肿瘤免疫细胞的重要部分（分别为30.3％和18.2％，图 3b–d）。 。在第7天的肿瘤中，除了T细胞外，两种治疗方法在任何免疫人群的扩张方面均无显着差异（图 3b–d）。在第14天，IL-2优先扩增NK，而NKTR-214显着扩增T细胞区室，表明在该模型中T细胞是NKTR-214增强抗肿瘤反应的主要贡献者。通过基于IHC的CD8染色肿瘤切片定量分析证实了这一发现，在第14天时，ACT + NKTR-214组的肿瘤内淋巴细胞数量比ACT + IL-2组高得多（37.5％比9.3％）。总肿瘤细胞，图 4a，b）。
差异活化的免疫细胞A的识别一个，b质谱术在用t-SNE图，显示在脾注释簇（上图）和密度图（下图）处理后第7天和第14（一）和肿瘤的小鼠与处理CT + NKTR-214与ACT + IL-2相比。b密度比例尺代表给定簇的细胞标志物表达，范围从低表达（蓝色）到高表达（红色）。在CD45 +细胞亚群面板中，红色圆点代表B细胞（B），黄色圆点代表树突状细胞（DC），绿色圆点代表髓样细胞（My），紫色圆点代表自然杀伤细胞（NK），蓝色圆点代表T细胞（ T），浅灰色点：未识别的簇（uic）。Ç，d计算带注释簇的细胞频率，并按脾脏（c）和肿瘤（d）逐个显示。平均值±sem（n = 3），* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001，未配对t检验。实验代表两个重复。
T细胞浸润增加是NKTR-214抗肿瘤功效的重要组成部分。一个免疫组织化学（IHC）的CD8 T细胞在不同时间点，每组三个重复的代表图像中染色肿瘤。HALO软件分析显示标记表达的强度，从低表达（蓝色）到高表达（红色）。b HALO软件对IHC载玻片进行数字量化，显示在不同时间点浸润肿瘤的CD8 T细胞的百分比。* p <0.05，**** p <0.0001，平均值±标准误，未配对t检验。Ç，dT细胞区室上的大量细胞计数结果。T-SNE图显示第14天（d）在脾脏（c）和肿瘤中的带注释簇（上图），密度图（中图）和Thy1.1标志物表达水平图（下图）。密度比例尺代表给定簇的细胞标志物表达，范围从低表达（蓝色）到高表达（红色）。在T细胞亚群面板中，黄色圆点代表CD4 + T细胞（TCD4），蓝色圆点代表CD8 + T细胞（TCD8），橙色圆点代表调节性T细胞（Treg），浅灰色圆点代表未识别簇（uic）。e，f计算注释后的T细胞簇在治疗后第7天和第14天的细胞频率，并按小鼠的脾脏（e）和肿瘤（f）。平均值±sem（n = 3），* p <0.05，**** p <0.0001，未配对t检验。实验代表两个重复。
我们使用细胞计数数据（补充图6a）进行了进一步的T细胞亚群分析 。我们确定了三个主要的亚群：CD8 T细胞，CD4 T细胞和Tregs。为了证实先前实验中的描述，对T细胞种群的分析表明，与ACT + IL-2相比，用ACT + NKTR-214治疗的小鼠的脾脏和肿瘤中过继转移的Thy1.1 + CD8 T细胞的扩增和持久性增加，分别在第7天和第14天（图 4c，d，补充图 6b，c））。T细胞簇的密度图显示，对于ACT + NKTR-214处理的小鼠，脾脏和肿瘤中的肿瘤特异性Thy1.1 + CD8 T细胞优先于脾脏和肿瘤中的Tregs激活，而在ACT + IL中观察到相反的趋势-2组，分别在第7天和第14天（图 4c-f，补充图 6b，c）。尽管在第7天和第14天，ACT + NKTR-214后的脾脏Thy1.1 / Tregs比ACT + IL-2高2 倍（补充图7a），但在ACT + NKTR-214时，脾脏Thy1.1 / Tregs比高2倍。 肿瘤，分别（补充图 7b）。值得注意的是，ACT + NKTR-214组在第7天有多达40％的肿瘤内淋巴细胞具有肿瘤抗原特异性，在第14天有高达22％的肿瘤内淋巴细胞（图 4f））。有趣的是，在治疗后第7天，NKTR-214较脾脏中的内源Thy1.2 + CD8 T细胞优先扩增Thy1.1 +肿瘤特异性CD8 T细胞（图 4e，补充图 6b和7e）。Ki-67表达标记分析表明，在两个时间点，ACT + NKTR-214处理均导致T细胞簇（尤其是脾脏和肿瘤中的CD8 T细胞）增殖增加（补充图 7c-e）。两种治疗的脾脏中PD-1的表达均较低或不存在（补充图 7c），而NKTR-214增强了用ACT + NKTR-214治疗的小鼠的T细胞活化（补充图 7d）。 。
为了确定NKTR-214与ACT结合对肿瘤微环境的影响，我们对第12天收集的肿瘤样品进行了RNA测序（RNA-seq）分析。该实验在T细胞扩增第二个高峰之前两天进行在接受ACT + NKTR-214治疗的小鼠的肿瘤中评估其转录组水平的差异，这可能是两种治疗方法之间细胞表型不同的原因。最具可变性的基因的层次聚类表明，ACT + NKTR-214诱导的肿瘤样品中的基因表达远高于ACT + IL-2处理（图 5a）。补充图8a中显示了详细的主成分分析（PCA），其中显示了所有治疗组的三个生物学重复的聚类。 。与ACT + IL-2相比，ACT + NKTR-214之间上调的基因log2的基因集富集分析（GSEA）显示，来自基因本体论（GO）的前十个显着富集的集包括免疫应答，T细胞活化和增殖，以及炎症相关基因（图 5b）。与ACT + IL-2样品相比，在ACT + NKTR-214中表达更高的基因包括干扰素-γ（IFN-γ）（图 5b，补充图 8b），IL-5，IL-6，IL-15， IL-18和IL-27（补充图 8b）以及趋化性相关基因（图 5b补充图 8c））。为了更好地表征T细胞群体的转录特征，我们集中于在调节T细胞群体中具有已知作用的选定基因的表达。如预期的那样，我们在ACT + NKTR-214肿瘤中发现了关键效应基因（穿孔素，IFN-γ和颗粒酶）的上调。这些基因和Pdcd1，PD-1，Cd28和Klrg1的表达增加，表明在ACT + NKTR-214肿瘤中存在高度细胞毒性的CD8 T细胞。抑制受体Ctla4，Lag3，Havcr2（Tim-3）和Tigit以及转录因子Tbx21（T-bet）和Eomes的过度表达提示在NKTR-214治疗后先前通过其TCR发出信号的T细胞的存在增加。有趣的是，在ACT + NKTR-214肿瘤中高表达的基因还包括记忆T细胞的标志物，例如Il7r（CD127），Cd44和Sell（CD62L），反映了NKTR-214治疗诱导的T细胞群体的异质性。
NKTR-214引起免疫基因表达和T细胞多功能性的明显上调。一个热图，表示ACT + NKTR-214和ACT + IL-2处理组（n = 3 /组）中变化最大的基因（〜1500个基因）的层次聚类。b ACT + NKTR-214和ACT + IL-2样品的log2倍数变化的基因集富集分析，代表了具有显着基因诱导作用的前10条生物途径。NES：标准化富集得分；FDR：错误发现率。c选择的T细胞基因的条形图。平均值±sem（n = 3），** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001，ns =不显着，不成对t-测试。d – f从脾脏和肿瘤中过继转移的T细胞的多功能和多功能强度的单细胞测量（每组3个池）。d分析T细胞多功能性的单细胞IsoCode芯片的示意图。e单细胞多功能性（左）和多功能强度指数（PSI）（右）图。多功能性：每个细胞共分泌2+种细胞因子；PSI：样品中多功能细胞的百分比乘以分泌的细胞因子的强度。S：脾脏。T：肿瘤。F单细胞多功能热图说明了每个样品分泌的单细胞细胞因子组合。每列对应于特定的细胞因子或细胞因子的组合，橙色方块代表相应样品分泌该基团的频率。细胞因子组按所有样品的总频率排序。
为了比较ACT + NKTR-214和ACT + IL-2处理的小鼠之间T细胞的功能特性，我们评估了过继转移的Thy1.1 + CD8 T细胞每个细胞分泌多种（> 2）细胞因子的能力，称为多功能。我们利用多重抗体包被的芯片，可以分析单细胞水平上数千个T细胞的28种细胞因子分泌的频率和强度（IsoCode芯片，图 5d）。来自体内用ACT + NKTR-214处理的小鼠的Thy1.1 +细胞显示出增强的诱导多功能T细胞的能力。与ACT + IL-2相比，在脾脏和肿瘤中，ACT + NKTR-214的多功能性分别提高了1.7和10倍（图 5e））。尽管在脾脏中分泌两种细胞因子的细胞百分比几乎相同（分别为2.2％和2.4％），但是暴露于NKTR-214会诱导一部分细胞变得高度多功能。在暴露于ACT + IL-2的小鼠的脾脏样品中，过继转移的T细胞中有百分之零具有高度多功能性。相比之下，ACT + NKTR-214引起Thy 1.1+ CD8 T细胞的多功能强度指数（PSI，定义为样品中多功能细胞的百分比，乘以分泌的细胞因子的强度）增加了21倍。图 5e）。此外，与ACT + IL-2相比，ACT + NKTR-214处理引起TIL的PSI增加1200倍。NKTR-214增加的多功能反应是由化学吸引性RANTES产生，随后是MIP-1α，粒酶B和IFN-γ效应细胞因子产生的（补充图 9a）。尤其是，NKTR-214增加了脾T细胞中IFN-γ和MIP-1α的分泌频率和强度，同时增强了从肿瘤获得的T细胞中的颗粒酶B，MIP-1α，RANTES并降低了调节性/免疫抑制性TGF-β。 （补充图 9b，c）。图5f所示的单细胞多功能热图 证明了NKTR-214后在脾脏和肿瘤中共同产生联合细胞因子的多功能T细胞亚群的增加。
如我们在小鼠模型中所指出的那样，为了探索向人施用NKTR-214是否还会诱导CD4，CD8和NK细胞多功能性谱的增加，我们使用了相同的单细胞多功能性检测芯片来分析来自五个部位的外周血单核细胞一期剂量递增研究（NCT02869295）中使用NKTR-214治疗的患者。结果显示，与给药前（给药前一周期）相比，NKTR-214在第一周期（C1D8）第八天，第二周期八（C2D1和C2D8）和第三周期之一（C3D1）的细胞亚群中诱导出明显的多功能反应。第一天，C1D1）。一个疗程后，NKTR-214上调了所有患者血液样品中NK细胞的PSI，第二次NKTR-214给药后，其升高程度更高（图 6）。）。一名患者的治疗不受CD4和CD8 T细胞的PSI的影响，而其他四名患者在NKTR-214给药后CD4和CD8 T细胞的单细胞多功能强度得到了增强，PSI在不同时间达到峰值不同患者中的这些要点（图 6）证明了连续采样的重要性。效应细胞因子和刺激性细胞因子主导了所有细胞亚群的分布（图 6）。具体而言，对于CD4和CD8 T细胞，PSI升高的主要驱动因素是TNF-α，IFN-γ和IL-5（补充图 10a，b）。
接受NKTR-214的患者的PBMC中多功能T和NK细胞的增加。针对5个患者在不同时间点的CD4，CD8 T细胞和NK细胞计算的单细胞多功能强度指数（PSI）。C1D1：周期1天1；C1D8：周期1天8；C2D1：第2天第1天；C2D8：周期2天8；C3D1：周期3天1。
在这项研究中，我们描述了与IL-2相比，NKTR-214具有更好的抗肿瘤功效，可在临床前模型中支持过继转移T细胞的抗肿瘤活性。我们显示包括NKTR-214的联合疗法能够控制大型，免疫原性较差的肿瘤的生长，并且与更高的扩展性，肿瘤靶向性和多功能抗肿瘤CD8效应T细胞的持久性相关。在1期临床试验18中，在以NKTR-214作为单一药物治疗的患者的外周血中还观察到多功能CD8 T细胞数量增加。
已经进行了各种尝试来利用IL-2途径的有益作用，同时限制其毒性以改善治疗潜力。这些方法包括突变的IL-2的版本具有朝向IL2Rβ更高的结合亲和力11，Fc融合蛋白以增加IL-2的血清半衰期19和IL-2 /抗IL-2抗体复合物优先激活CD8效应T细胞20，21。最近的一项研究旨在使用能够彼此唯一结合但不与内源对应物结合的经工程改造的正交IL-2细胞因子-正交IL-2受体对提高ACT的疗效并减轻毒性。12。所有这些修饰在动物模型中均显示出可喜的结果。但是，需要在临床中对其进行评估，以评估其对人体的潜在体内作用。NKTR-214正在积极的临床测试中，其与IL-2相比改善的药代动力学和药效学可缓解免疫系统立即过度活化并促进耐受性3。PEG链的顺序释放避免了给药后的快速全身免疫活化，同时优先通过IL2Rβγ途径提供持续的信号传导。聚乙二醇化具有额外的能力，即降低对Treg构成的对IL2Rαβγ的亲和力，而与对IL2Rβγ的亲和力相比，具有更大的降低能力，因此与肿瘤中的Tregs相比，有利于效应T细胞在肿瘤中的扩增3，13。这些综合的属性在人体临床试验中提供了方便的给药时间表（每3周一次）。目前，正在门诊环境中对NKTR-214进行临床评估（NCT02869295），并显示出良好的安全性 8。
在我们的研究中有趣的是，用ACT + NKTR-214治疗的小鼠的肿瘤中CD8 / Tregs比率显着增加，而脾脏中的CD8 / Tregs比率则低得多，这可能是由于特定pmel-1效应物的归巢和优先扩增T细胞进入肿瘤，如此处所示，使用几种成像和枚举方法22。特定趋化因子的局部分泌被认为有利于T细胞向肿瘤微环境的迁移23。在我们的研究中，转录组谱显示在用ACT + NKTR-214治疗的小鼠的肿瘤中几种趋化因子及其受体的表达上调，包括CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL6，CCL7，CCL8和CXCR3，以前据报道是与肿瘤部位中效应T细胞的存在有关24。招募到与NKTR-214处理的小鼠的肿瘤的过继转移的T细胞是高度多官能的，并且能够以同时生产化学吸引和效应细胞因子以及维持较长的抗肿瘤反应，如先前在临床试验中报道的25，26。除了增强的多功能性之外，这些细胞还向每个细胞传递高浓度的细胞因子。在临床前和临床环境中，浸润的T细胞分泌IFN-γ，颗粒酶和穿孔素的能力18支持NKTR-214强烈激活一系列细胞毒性效应T细胞的能力。有趣的是，我们小鼠模型中的RNA测序数据显示T细胞效应子和力竭（或功能障碍）基因与与记忆功能相关的基因共存。先前已经描述了该特征，并且该特征可以是实现快速杀死肿瘤细胞和持久抗肿瘤反应的机制27。
用TIL或TCR工程改造的T细胞进行过继T细胞转移疗法需要补充IL-2，以提供足够的IL-2-γ受体信号转导支持宿主中轻快T细胞增殖，而表达嵌合抗原受体的T细胞则不需要（CAR）可能是由于CAR提供了协同刺激信号。总之，我们的结果表明NKTR-214支持过继转移T细胞的扩展和功能。这些特征以及肿瘤部位的免疫抑制Treg水平低，被认为是免疫疗法正确疗效的基础28。NKTR214在我们的临床前ACT模型中强大而持久的作用支持其与基于T细胞的过继转移治疗剂结合使用的其他潜在用途。
C57BL / 6小鼠（Thy1.2 +，密歇根州巴港的杰克逊实验室）和pmel-1（Thy1.1 +）转基因小鼠由加利福尼亚大学洛杉矶分校神经外科系的Robert Prins博士慷慨提供。安吉利斯（UCLA）。经过协议编号2004-159-43I，并经过UCLA动物研究委员会的审查和批准，所有小鼠模型实验均在AALAC批准的UCLA实验放射肿瘤学分部的动物设施中于无特定病原体的条件下进行。B16-F10是从美国典型培养物保藏中心（ATCC，Manassas，VA）获得的gp100阳性自发鼠黑色素瘤。所有细胞系均无支原体，并定期检测支原体污染。B16-F10已通过CellCheck小鼠测试（IDEXX，Westbrook，ME）进行了身份验证。细胞用含有2 mM L-谷氨酰胺（Corning，Corning，NY）和10％胎牛血清（Omega Scientific，Tarzana，CA）的RPMI培养。NKTR-214是根据与Nektar Therapeutics（加利福尼亚州旧金山）签订的材料转让协议（MTA）获得的。人重组IL-2（醛固酮）购自Prometheus Therapeutics＆Diagnostic（加利福尼亚州圣地亚哥）。
在第7天，将C16 / BL6小鼠皮下植入B16-F10同系鼠黑色素瘤细胞系，并在第1天用500 cGy的全身辐射将其淋巴去掉。通过低渗裂解将pmel-1供体小鼠的脾细胞中的红细胞消耗掉，并在存在1μg/ ml gp100的存在50 IU / ml mIL-2的RPMI（Corning）培养基中培养（PeproTech，Rocky Hill，NJ）25– 33肽（AnaSpec，加利福尼亚州弗里蒙特），在培养开始后的第3-5天使用。在第0天，当肿瘤达到至少150 mm 3的体积时，小鼠接受2×10 6静脉内肽激活的pmel-1脾细胞（iv）加NKTR-214（0.8 mg / kg，q9dx3，iv），IL-2（0.4 mg / kg，qdX3每9天一次，通过腹膜内注射，ip）3个周期车辆。每周进行三次卡尺测量。
在UCLA解剖病理学IHC实验室对石蜡包埋的脾脏，肿瘤，肾脏和肝脏进行了免疫组织化学染色。将切片切成4μm的厚度，并用二甲苯去除石蜡，然后通过分级乙醇将其重新水化。用3％的过氧化氢的甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶活性10分钟。使用Biocare脱壳器在95°C下使用0.001 M EDTA缓冲液（pH = 8.00）对所有切片进行热诱导抗原修复（HIER）。然后将载玻片与CD8a（Invitrogen，Carlsbad，CA）在室温下以1/100稀释温育1小时，然后与兔抗大鼠第二代温育30分钟。使用抗兔HRP缀合的聚合物（Agilent，Santa Clara，CA）检测信号，并通过二氨基联苯胺反应观察。将载玻片用苏木精复染，脱水并盖上。使用HALO下一代成像分析软件（Indica Labs，Corrales，NM）进行成像和定量。使用HALO软件自动计算载玻片中CD8 T细胞的百分比。
在pmel-1脾细胞收获和培养三天后，使用含有5'LTR驱动的萤火虫荧光素酶热稳定变异体的逆转录病毒载体pMSCV转导细胞以表达萤火虫荧光素酶，该酶由神经外科的Robert Prins博士慷慨提供。加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）29。转导后48小时，收集细胞，洗涤并用于ACT。在萤火虫荧光素酶转导的Pmel-1 T细胞运输的荷瘤小鼠上进行了体内生物发光成像。成像前，将小鼠用2％异氟烷麻醉，腹膜内注射100 µl 30 mg / ml的荧光素酶底物D-荧光素（Xenogen Corp.，阿拉米达，CA）的PBS溶液。将小鼠剃毛以最小化黑色皮毛吸收的光量。Xenogen IVIS 200成像系统（Xenogen / Caliper Life Sciences，马萨诸塞州沃尔瑟姆）用于检测荷瘤小鼠的光子发射，采集时间为0.5–1分钟17。使用Living Image软件（Xenogen）和Igor Image分析软件（Wave Metrics，Lake Oswego，OR）对图像进行分析，方法是在该区域上绘制感兴趣的区域，并获得光子/秒/ cm 2 /新加坡的最大值。
使用89 Zr-去铁草胺标记的抗CD8 cys-双价抗体（cDb）在UCMP临床前成像技术中心（Crump Institute 30）进行了体内非侵入性免疫PET追踪CD8 T细胞。对于microPET成像，需要在盐水中制备150 µL剂量的Zr-89放射性标记的cDb进行静脉注射。使用2％异氟烷麻醉小鼠，并使用Inveon microPET扫描仪（西门子，德国慕尼黑）进行microPET扫描，然后进行microCT扫描（ImTek，Wedesboro，NJ）。使用非衰减或散射校正的最大后验（MAP）重建技术来重建MicroPET图像，并使用AMIDE进行图像分析和显示31。注射后24小时，对小鼠实施安乐死，收集器官和血液，称重，对放射性进行计数以评估CD8 T细胞的生物分布。使用包含注射剂量31％的标准计算每克组织的注射剂量百分比（％ID / g）。
使用小鼠肿瘤分离试剂盒（Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国）消化从用ACT + IL-2或ACT + NKTR-214处理的小鼠中收获的肿瘤。通过70μm细胞过滤器分离脾脏，并使用ACK裂解缓冲液（Lonza，巴塞尔，瑞士）裂解红细胞。脾细胞和肿瘤细胞染色和数据采集均采用Wei和同事改编的方案32。金属缀合的抗体购自Fluidigm（加利福尼亚州旧金山），Biolegend和Thermo Fisher，或在UCLA流式细胞仪核心与未标记的抗体缀合。补充表1中描述了质谱分析法 。用PBS洗涤细胞，并以1-5×10 6的浓度重悬细胞在无血清RPMI（Corning）中的浓度/ mL，并在37°C下用5μmol/ L顺铂（Fluidigm）进行活死染色5分钟。洗涤细胞并在室温下用表面蛋白抗体混合物染色30分钟，然后洗涤并在4°C旋转10分钟。然后在室温下使用FoxP3 /转录因子特异性固定缓冲液（eBioscience，Santa Clara，加利福尼亚州）将细胞固定1小时，然后添加FoxP3 /转录因子通透缓冲液，并在4°C旋转10分钟。 C。然后在室温下用细胞内抗体混合物将细胞染色1小时。最后，将细胞与250 nmol / L铱嵌入剂（Fluidigm）在室温下孵育1小时，以标记细胞DNA。然后用PBS洗涤细胞，最后用蒸馏水洗涤。在加州大学洛杉矶分校流式细胞仪核心实验室使用Helios质谱仪（Fluidigm，San Francisco，CA）询问样品。通过时间稳定性在FlowJo中手动门控样品，无珠的细胞（Ir193+ / Ce140 - ），清除（对于DNA双阳性），单峰（Ir193 +），活（195Pt - / CD45 +），并通过所需的表达标志物（CD45 +或（CD45 + Cd11b- Cd11c- CD19- CD161-到门控T细胞）用于每个特定的分析（补充图 6a）。使用开源R / Bioconductor软件包cytofkit 33进行大规模细胞计数数据分析。单个样本数据被子采样到5,000个事件。我们基于5000个事件足以进行表型聚类和降维分析的理由来设置此临界值。使用cytofkit进行PhenoGraph聚类和t分布随机邻居嵌入（t-SNE）图，用于细胞亚群的检测，可视化和解释。对于覆盖有单个参数表达的t-SNE图，信号强度以arcsinh转换值显示。
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）从用ACT + IL-2和ACT + NKTR-214治疗的B16-F10肿瘤中提取总RNA。使用Illumina HiSeq 3000平台在UCLA基因组和生物信息技术中心的50 bp单端文库上进行RNA测序。使用HISAT2版本2.0.4 34对读段进行定位，并与小家鼠基因组NCBI构建GRCm38对齐。将读数量化为HTSeq版本0.6.1 35，并标准化为每百万片段映射的外显子每千碱基的片段（FPKM）表达值。然后将FPKM值进行log2转换，其偏移量为1。使用E（）距离度量，使用R（http://www.R-project.org/）。为了确定在ACT + NKTR-214治疗的肿瘤中富集的途径，使用预先排列的选项进行了基因集富集分析（GSEA）。通过ACT + IL-2和ACT + NKTR-214之间的log2倍变化对基因进行排名。在策划的分子签名数据库C5 GO生物过程基因集36中评估了富集。
在治疗后第7天收集经ACT + IL-2或ACT + NKTR-214治疗的小鼠的脾脏和肿瘤中的CD8 pmel-1（Thy-1.1 +）T细胞（3只小鼠/组），合并并使用Alexa进行分选Fluor 700抗小鼠CD90.1（Thy1.1），克隆OX-7抗体（Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚）。用固定的抗小鼠CD3（Invitrogen）和可溶性抗小鼠CD28（Invitrogen）在37°C，5％CO 2下刺激分选的细胞48小时。刺激后，在室温下用Alexa Fluor 647偶联的抗小鼠CD8（Biolegend）将细胞染色20分钟。将约30,000个T细胞上样到IsoCode芯片（IsoPlexis，New Heaven，CN）上，该芯片包含约12,000个微腔室，该腔室预先用28重抗体阵列进行了模式设置，对微腔室中的单细胞位置进行成像，并在37°C，5％CO 2额外16小时。温育期后，使用ELISA检测来确定每个单个细胞正在分泌哪些蛋白质组合。来自单细胞的分泌蛋白被抗体条形码的载玻片捕获。通过IsoPlexis的软件评估了单细胞的多功能图谱（每个细胞2个蛋白质）。
来自组织学确认为局部晚期或转移性实体瘤的患者的十五种冷冻保存的外周血单核细胞（PBMC）由得克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系提供。这项研究是I期剂量递增研究，在www.clinicaltrial.gov上标识为NCT02869295。我们没有报告临床试验的结果，在本文中，我们报告了对从五个受试者的一部分中获得的血细胞样品的分析。每2周或每3周以15分钟静脉输注对患者进行0.003或0.006 mg / kg体重（mg / kg）的治疗。在治疗的第一天（C1D1），治疗后的第1周（C1D8），第二个周期的第一天和第八天（C2D1和C2D8）以及第三个周期的第一天（C3D1）收集血液以获得PBMC。该研究得到德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心的机构审查委员会的批准。所有参与者均已获得知情同意。
将来自五名患者的PBMC融化，并在37°C，5％CO 2的完全RPMI培养基（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州）中加入10 ng / ml IL-2（Biolegend）。过夜孵育后，Ficoll使活细胞富集。CD4 + T细胞，CD8 T细胞和NK细胞通过抗CD4，抗CD8或抗CD56微珠（Miltenyi）分离。富集的NK细胞用羧荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE，Thermo Fisher Scientific）标记，漂洗并以1×10 6 / ml 的密度重新悬浮在RPMI培养基中，加入PMA（5 ng / ml，Sigma-Aldrich）和碘霉素（ 500 ng / ml，Sigma-Aldrich）加载到IsoCode芯片（IsoPlexis）上。富集的CD4和CD8 T细胞以1×10 6重新悬浮在新鲜的完全RPMI培养基中/ ml，并在96孔平底平板（Corning Life Science）中用固定的抗人CD3（10 ug / ml，Thermo Fisher Scientific）和可溶性抗人CD28（5 ug / ml，Thermo Fisher Scientific）激活。在37°C，5％CO 2下持续24小时。刺激后，将细胞在室温下用PE偶联的抗人CD4（Biolegend）或Alexa Fluor 647偶联的抗人CD8（Biolegend）染色20分钟，然后加载到IsoCode芯片上。每个IsoCode芯片均包含约12,000个微腔，这些微腔预先设置了32-plex抗体阵列的完整副本，其中包括效应子：粒酶B，TNFα，IFN-γ，MIP1α，穿孔素，TNFβ；刺激性：GM-CSF，IL-2，IL-5，IL-7，IL-8，IL-9，IL-12，IL-15，IL-21；化学吸引力：CCL11，IP-10，MIP-1β，RANTES；调节性：IL-4，IL-10，IL-13，IL-22，sCD137，sCD40L，TGFβ1; 炎症性：IL-6，IL-17A，IL-17F，MCP-1，MCP-4，IL-1β。通过IsoSpeak软件评估了单个细胞的多功能图谱（每个细胞2个蛋白质）。
数据表示为平均值±SEM，并且代表至少两个独立实验。在肿瘤生长研究中，使用方差分析定义了实验组（ACT +载体，ACT + IL-2和ACT + NKTR-214）之间的显着性，并进行了Bonferroni-Dunn多重比较后测。使用Mantel-Cox检验计算出显示肿瘤延迟（达到肿瘤体积1000 mm 3的时间）的Kaplan-Meier生存曲线差异。使用双向ANOVA（Tukey多重比较）计算P值，以比较BLI实验中的ROI强度。使用未配对的Student's t检验分析了NKTR-214和IL-2之间的差异。P值<0.05被认为是显着的。使用GraphPad Prism版本7.03（GraphPad软件）进行统计分析。
链接到本文的《自然研究报告摘要》中提供了有关研究设计的更多信息 。
作者声明，在此研究过程中生成的所有数据都在文章及其补充信息文件中，并且在合理的要求下来自相应的作者。RNA测序数据已保存在GEO数据库中，登录号为GSE118748。本文的报告摘要可作为补充信息文件获得。
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