摘要
癌症发生通过体细胞进化的方法1，2。来自一次活检的测序数据代表了这一过程的快照，可以揭示特定基因组畸变的时机和突变过程的变化影响3。在这里，作为国际癌症基因组协会（ICGC）和癌症基因组图谱（TCGA）的全基因组全癌基因分析（PCAWG）联盟的一部分，对2658种癌症进行了全基因组测序分析4，我们重建了38种癌症的生命史以及突变过程和驱动程序突变序列的演变。早期肿瘤发生的特征是一组受限制的驱动基因突变和特定的拷贝数增加，例如胶质母细胞瘤中的三体性7和髓母细胞瘤中的等染色体17q。在整个肿瘤演化过程中，有40％的样品突变谱发生了显着变化。驱动基因的近四倍多样化和增加的基因组不稳定性是后期的特征。拷贝数变化通常发生在有丝分裂危机中，并导致同时获得染色体片段。时序分析表明，驾驶员突变通常要比诊断早很多年，甚至几十年。这些结果共同决定了癌症的进化轨迹，
与物种进化相似，人体中大约10 14个细胞受到突变和选择的作用1。体细胞进化的这个过程始于合子，直到死亡时才停止，因为细胞不断地暴露于诱变的压力下，每个细胞分裂会引入1-10个突变2。这些诱变力导致整个生命点突变的逐渐累积，在一个范围内的健康组织的观察5，6，7，8，9，10，11种癌症12。尽管这些突变主要是选择性的中性客运突变，但有些是具有增殖优势的驾驶员突变13。对癌症基因组中突变的类型进行了充分的研究，但对这些损伤在体细胞进化过程中出现的时间以及应该在正常进化与癌症进展之间划清界限的时间知之甚少。
大块肿瘤样品的测序使得个体肿瘤的进化史的部分重建的基础上，他们积累的体细胞突变的目录3，14，15。这些推论包括早期体细胞进化过程中的染色体获得定时16，晚期癌症演变的系统发育分析使用来自个体患者匹配的原发性和转移性肿瘤样品17，18，19，20在许多样品，并驱动突变的时间排序21，22。
所述PCAWG联盟已经从2658周的癌症聚集全基因组测序数据4，由ICGC和TCGA产生，并且产生的高精度的体细胞变异的呼叫，驱动突变，和突变签名4，23，24（方法和补充信息）。
在这里，我们利用PCAWG数据集来表征来自38种癌症类型的2658名独特供体的2778种癌症样品的进化历史。我们推断染色体进化的时间和模式，并了解每种癌症类型的样本中突变的典型序列。然后，我们定义了广泛的肿瘤演化时期，并研究了这些时期之间的驱动因素和突变特征是如何变化的。使用类似于时钟的突变过程，我们将突变时间估计映射为近似实时。综合起来，这些分析使我们能够勾画出癌症的典型进化轨迹，并相对于诊断点实时绘制它们的地图。
癌细胞的基因组由其进化过去期间累积的体细胞畸变形成，这种历史的一部分可以从全基因组测序数据3中重建（图1a）。）。最初，每个点突变都发生在单个细胞中的单个染色体上，这导致了带有相同突变的细胞谱系。如果随后复制该染色体基因座，则与获得后的突变或其他等位基因上的突变不同，该等位基因上获得增益之前的任何点突变将随后出现在两个所得等位基因拷贝上。由于测序数据可用于测量等位基因拷贝数，因此可以定义早期和晚期克隆变异的类别，获得拷贝数之前或之后的拷贝，以及未指定的克隆变异，这些变异对于所有癌细胞都是常见的，但无法定时进一步。最后，我们确定了亚克隆突变，补充信息）。
a，基于全基因组测序的时序突变和拷贝数增加的原理。在获得特定拷贝数的情况下，报告点突变的测序读段数可用于区分变异为早期或晚期克隆（分别为绿色或紫色），而在没有拷贝数的情况下，可用于克隆为克隆（蓝色）或亚克隆（红色）。b，一个样品中基于VAF的带注释的点突变（顶部），拷贝数（CN）状态和结构变体（中间）以及所得到的时序估计（底部）。呵呵，杂合性丧失。C，概述了癌症类型之间拷贝数增加的分子时间分布。饼形图描述了癌症类型中给定拷贝数获得的推断突变时间的分布。绿色表示早期克隆获得，后期获得渐变为紫色。每个图表的大小与此事件的重复发生成比例。每种癌症类型的缩写在补充表1中定义 。d，热图代表针对所选肿瘤类型的单个样品（y轴）在不同染色体臂（x轴）上的增益的分子时间估计。e，两个近二倍体情况的时间模式，说明了同步增益（顶部）和异步增益（底部）。F，左图，样本之间同步和异步增益模式的分布，按WGD状态划分。没有信息的样本的增益太少或太小，无法准确计时。正确的是，通过系统的置换测试可以显示近二倍体样品中同步增益的富集。g， 具有次要增益的拷贝数片段（n = 90,387）的比例。误差棒表示95％可信区间。ND，接近二倍体。h， 具有可用时序信息的n = 824次要增益的相对等待时间的分布，按比例缩放到第一次增益后的时间，并按每个染色体聚合。
在获得的区域内重复突变与非重复突变的比率可用于估计克隆进化过程中发生增益的时间点，此处称为分子时间，它测量相对于克隆总数的发生时间。 ）突变。例如，如果在受精后马上就获得了扩增，那么将几乎没有共扩增的早期克隆突变，而在克隆肿瘤进化快结束时发生的扩增将包含许多重复的突变14（图1a，方法）。
这些分析在图1b中示出。如预期的那样，体细胞点突变的变异等位基因频率（VAFs）聚集在样品纯度，局部拷贝数配置和已鉴定的亚克隆种群所强加的值附近。所描绘的透明细胞肾细胞癌在分子早期就获得了染色体臂5q作为不平衡易位t（3p; 5q）的一部分，这证实了这种病变常在青春期发生于16型癌症的观念。。在稍后的时间点，样品经历了一次完整的基因组复制（WGD）事件，在一次事件中复制了所有等位基因，包括衍生染色体，这一点由所有在一个时间点附近聚集的所有拷贝数增益的突变时间估计所证明，与确切的副本编号状态无关。
为了系统地检查PCAWG数据集中整个肿瘤演变过程中染色体增益的突变时间，我们将此分析应用于2116个样本，其拷贝数增益适合于时间（补充信息）。我们发现，染色体增益发生在很宽的分子时间范围内（中位分子时间为0.60，四分位间距（IQR）为0.10-0.87），肿瘤类型之间存在系统差异，而在肿瘤类型内，不同的染色体通常表现出相似的分布（图7）。1c中，扩展数据图1，2，补充信息）。在胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤中，很大一部分收益发生在分子时间的早期。相比之下，在肺癌，黑色素瘤和乳头状肾癌中，在分子时间标度接近尾声时出现了获益。大多数肿瘤类型，包括乳腺癌，卵巢癌和结肠直肠癌，都表现出相对较宽的染色体不稳定期，这表明整个样本的获取时间变化很大。
但是，某些类型的肿瘤始终具有特定染色体区域的早期或晚期增益。最明显的是胶质母细胞瘤，其中90％的肿瘤包含第7、19或20号染色体的单拷贝获得（图1c，d）。值得注意的是，这些增益始终在分子时间的前10％内计时，这表明它们在患者一生中很早就出现了。在三体性7的情况下，通常在整个染色体上的600个单核苷酸变体（SNV）中，少于3个出现在增益之前（扩展数据，图3a，b）。基于µ = 4.8×10 -10到3.0×10 -9每对碱基对的SNV 的突变率25，这表明三体性发生在最初的6–39个细胞分裂内，这暗示了可能的早期发育起源，这与健康大脑中观察到的体细胞镶嵌术[ 26]一致。同样，导致髓母细胞瘤中等染色体17q重复的时间异常提前（Extended Data图3c，d）。
值得注意的是，我们观察到，同一肿瘤中的增益通常似乎发生在相似的分子时间，这指向涉及多数获得性片段的标点数目的突变点阵爆发（图1e）。尽管这在带有WGD的肿瘤中是可以预期的（图1b），但是在近二倍体肿瘤中观察到同步增益似乎令人惊讶，特别是因为只有6％的共同扩增的染色体片段通过直接的染色体间结构变异连接。尽管如此，同步增益仍然很频繁，在信息丰富的近二倍体肿瘤中占57％（在815个中有468个），比偶然预期的频率高61％（P <0.01，置换测试；图1f）。因为大多数臂水平增益使等位基因特异的拷贝数增加1（80-90％；图1g），这些收益似乎是由于后期后期对单个副本的错误隔离而产生的。这一观点进一步得到以下观察结果的支持：在大约85％的具有相同等位基因两个增益的区段中，第二个增益在第一个增益之后出现显着的潜伏期（图1h）。因此，在许多癌症基因组中观察到的广泛的染色体尺度拷贝数异常，似乎是由有限的事件引起的-可能是染色体的梅洛特质附着于多极有丝分裂纺锤体27上，或者是由于个体非整倍体28的负选择所致-提供在乳腺癌和直肠癌间断进化的意见的说明29，30。
如上所述，可以将点突变（SNV以及插入和缺失（indels））定性地分配给不同的时期，从而可以确定驱动程序突变的时间。在2,583个独特样本中的4,700万个点突变中，早期克隆为22％，晚期克隆为7％，未指定克隆为53％，亚克隆为17％（图2a）。在一组453个癌症驱动基因中，鉴定出5,913个致癌点突变4，其中29％为早期克隆，5％为晚期克隆，56％未指定克隆和8％为亚克隆。因此，出现了常见的驱动因素在早期克隆和未指定克隆类别中富集，而在晚期克隆和亚克隆类别中被耗尽，表明优先的早期时机（图2b）。例如，TP53中的驱动程序突变和KRAS在克隆早期分别富集了12倍和8倍。对于TP53，这种趋势与肿瘤类型无关（图2c）。PIK3CA中的突变发生频率比预期高出两倍，而TERT基因附近的非编码变化发生率高出早期克隆发生频率是三倍。
a，顶部，n = 2,778个样本中不同突变时期的点突变分布。中间， 来自唯一供体的n = 2,583白名单样本中的50个最常见病灶中的驱动程序突变的时间分布。底部，不同癌症类型的驱动程序突变分布；颜色如插图中所定义。b，50个最常见的驾驶员病变的相对时机，以早期和晚期克隆驾驶员突变与背景或克隆与亚克隆的比值比计算。误差线表示源自自举重采样的95％置信区间。在少于5％的引导程序样本中，赔率重叠1的情况被认为是有意义的（有色）。具有给定突变的样本的基本数量显示在一个。c，如b中所示，跨癌症类型的TP53突变的相对时间。样本数在x轴标签中定义。d，在n = 2,583个唯一样本中，不同计时时期中贡献所有驱动程序突变的50％的独特病灶（基因）的估计数量，其中n = 5,756个具有可用时序信息的驱动程序突变。误差线表示0到1个伪计数之间的范围；条形表示两个值的平均值。不适用，不适用；NS，不重要。
随着时间的推移，汇总所有驱动程序点突变的克隆状态表明，在肿瘤发展的后期阶段突变的驱动程序基因的多样性增加：所有早期克隆驱动程序突变的50％仅发生在9个基因中，而50％的晚期和亚克隆突变发生在每个大约有35个不同的基因，几乎增加了四倍（图2d）。与个别肿瘤类型的先前的研究相一致31，32，33，34，这些结果表明，在一般情况下，在癌症发展的非常早期的事件时，在一组受限的公共驱动器的，和司机的更多样化的参与晚期肿瘤发展。
尽管单个事件的时间估计反映了一个样本之间的进化周期，但它们部分地定义了每个样本中发生驱动程序突变和拷贝数变化的顺序（图3a-d）。证实通过模拟，跨越样品聚集这些排序定义了一个概率排序病变（图3A），扼要是否发生每个突变优先肿瘤进化过程中早期或晚期（扩展数据图4，5，补充信息）。
a，订购过程的示意图。b – d，单个患者轨迹的示例（部分订购关系），订购模型过程的组成数据。e – g，大肠腺癌（ColoRect–AdenoCA）（e），胰腺神经内分泌癌（Panc– 内分泌）（f）和胶质母细胞瘤（CNS–GBM）（g）的优先排序图。概率分布显示队列中特定事件的时间不确定性。突出显示赔率大于10的事件（较早或较晚）。队列中事件类型的普遍性在右侧以条形图显示。
例如，在大肠腺癌中，我们发现APC突变发生的几率最高，其次是KRAS，17p和TP53缺失以及SMAD4（图3b，e）。全基因组重复发生在肿瘤积累了多个驱动程序突变后，并且许多染色体的得失通常都比较晚。这些结果与Fearon和Vogelstein 35的经典APC-KRAS-TP53进阶模型一致，但增加了相当多的细节。
在许多癌症类型中，先前尚未详细确定癌症进展过程中的事件顺序。例如，在胰腺神经内分泌癌中，我们发现许多染色体丢失，包括染色体2、6、11和16的丢失，都是最早的事件，其次是MEN1和DAXX中的驱动子突变（图3c，f）。由于大量的染色体丢失，这些肿瘤中的许多已经达到假单倍体状态之后，WGD事件随后发生。在胶质母细胞瘤中，我们发现10号染色体的丢失以及TP53和EGFR中的驱动程序突变非常早，通常早于7、19和20号染色体的早期获得（图3d，g）。TERT中的突变 启动子往往发生在早期到中间时间点，而其他驱动程序突变和拷贝数变化往往是后期事件。
在各种癌症类型中，我们通常会在最早的事件中发现TP53突变，以及第17号染色体的丢失（补充信息）。WGD事件通常具有中等的排名，并且大多数副本数量更改会在以后发生。损失通常发生在收益之前，并且与上述结果一致，常见驱动因素通常发生在稀有驱动因素之前。
癌症基因组是由多种突变过程在其寿命期间形，从外源性和细胞固有的DNA损伤，且容易出错的DNA复制所产生，而使特性突变谱的后面，称为突变签名24，36。根据其克隆等位基因状态对突变进行分层，我们发现在29％（1852个中的530个）的信息样本中，早期和晚期克隆时间点之间的突变谱发生了变化（P <0.05，Bonferroni调整似然比检验），改变频谱19％（中值绝对差；范围4–66％）（图4a，b，扩展数据图6））。同样，有信息的样本中有30％（2,387个中的729个）显示出其克隆和亚克隆状态之间突变谱的变化，中位差异为21％（范围为3–72％）。结合起来，在整个肿瘤演化过程中，有40％的样本（在2688个样本中有1,069个）的突变谱发生了变化。
a，在早期（左）和晚期（右）克隆时间点的突变谱之间具有实质性变化的肿瘤示例。显示了突变归因于最具特征性的特征。b，克隆到亚克隆突变谱变化的例子。c，归因于个别突变特征的早期和晚期克隆突变的相对比例之间的倍数变化。点按组织类型着色。显示的是样本（n = 530）的数据，这些样本的整体突变谱具有可测量的变化，并且仅限于至少10个样本中有活性的标记。箱形图划定了分布的第一个和第三个四分位数，中位数显示在中间，胡须覆盖了框内IQR 1.5倍以内的数据。d，样品（n = 729）在克隆期与亚克隆期之间的倍数变化，其突变谱可测量，类似于c。
为了量化观察到的时间变化是否可归因于已知和可疑的突变过程，我们将每个时间点的突变谱分解为57个突变特征的目录，包括双碱基取代和indel特征24（方法）。
通常，这些突变特征在几个数量级上显示出显着的无方向性的时间变异性（图4c，d，扩展数据图7）。此外，几个签名显示出明显的时间趋势。如人们所料，外源诱变的特征在肿瘤发生的早期克隆阶段主要活跃。这些包括在肺腺癌吸烟（签名SBS4，中值倍数变化0.43，IQR 0.31-0.72），与先前的报道一致37，38和黑色素瘤中的紫外线暴露（SBS7；中位数倍数变化0.16，IQR 0.09–0.43）。随着时间的流逝，另一种明显的病因学发现是SBS12，它主要在肝癌中起作用（中位数倍数变化0.22，IQR 0.06-0.41）。在慢性淋巴白血病中，与体细胞高突变（SBS9；中位数倍数变化0.05，IQR 0.02–0.43）相关的突变从克隆期到亚克隆期相对减少20倍。
在整个癌症发展过程中，某些突变过程趋于增加。例如，我们看到，从早期到晚期，APOBEC诱变（SBS2和SBS13）在许多类型的癌症中均会增加（中位数倍数变化2.0，IQR为0.8-3.6），新近描述的特征性SBS38（中位数倍数3.6，IQR）也是如此。 1.8-11）。缺陷错配修复的特征（SBS6、14、15、20、21、26和44）从克隆阶段到亚克隆阶段（中位数1.8倍，IQR 1.2-3.0）增加。
上面显示的分子计时数据不能测量时间顺序中事件的发生。如果每个样品中每年获得突变的速率是恒定的，则时间顺序将只是估计的分子时间和诊断年龄的乘积。但是，如果突变率随时间变化，则该关系将是非线性的，并且如前一部分的分析所建议的那样，由于获得的突变过程而使这种关系膨胀。这些问题中的某些问题可以通过仅计算由内源性和可变性较弱的突变过程引起的突变来缓解，例如CpG到TpG突变（以下简称CpG> TpG），该突变是由CpG二核苷酸的5-甲基胞嘧啶自发脱氨成胸腺嘧啶引起的，已经提出作为分子钟12。我们的补充分析表明，尽管癌症的基线CpG> TpG突变率与正常细胞非常接近，但癌症似乎有中等程度的增加（1-10倍，增加了20％至40％的突变）（扩展数据图8）。随着时间的推移，我们对CpG> TpG突变率演变的不同情况进行了建模（图5a）。
a，在CpG> TpG突变率增加的不同情况下，分子时间估计与时间的映射。在诊断之前，更大的增加表明突变时间尺度的膨胀。b，在n = 569个非超突变性癌症中，至少有100例信息性SNV，正常感染的低肿瘤和每个肿瘤至少五个样品的情况下，在不同CpG> TpG突变率情况下，在诊断前WGD与最后一个可检测的亚克隆之间的中值潜伏期增加组织学。c，在n中不同CpG> TpG突变率的诊断前，MRCA和最后一个可检测的亚克隆之间的中位潜伏期。 = 1,921个非超高变样本，正常感染率低，每种癌症类型至少5例。
将这种逻辑应用于产生足够数量的CpG> TpG突变的时间WGDs，表明在某些突变率升高的情况下，某些类型的癌症在诊断之前会发生数年甚至数十年甚至更长的时间（图5b）。，扩展数据图9）。一个值得注意的例子是卵巢腺癌，它的中位潜伏期似乎超过10年。即使在CpG> TpG速率增加20倍的情况下也是如此，这将远远超过在匹配的原始样本和复发样本39中观察到的7.5倍速率增加（扩展数据图8f）。值得注意的是，这些结果表明WGD可能会在女性的整个生殖生命中发生（扩展数据图9b）。）。MRCA和最后一个可检测到的亚克隆之间的潜伏期较短，通常为数月至数年（图5c）。
癌症演变这些时间尺度是由以下事实：大多数已知的癌前病变到癌的进展通常跨越许多年，甚至几十年进一步支持40，41，42，43，44，45。我们的数据证实了这些时间尺度，并将其扩展到没有可检测到的恶性前病状的癌症类型，从而增加了人们希望在恶性程度较低的阶段也可以检测到这些肿瘤的希望。
据我们所知，我们的研究提出了癌症进化史的首次大规模全基因组重建，同时重建了38种癌症的早期（癌前）和晚期。相对于基因组中所有其他事件而言，拷贝数增加的时机，共扩增点突变的多重性和克隆状态有助于实现这一点。但是，存在一些限制（补充信息）。也许最重要的是，分子时间是基于点突变的，因此会发生突变率的变化。值得注意的是，健康组织获得的速率从那些在癌症中所见不是太不相似的点突变，特别是考虑到只有内源性突变过程时，并且此外，一些组织与驱动基因突变的微观克隆扩展充斥5，6，7，8，9，11。这直接证明了人体几乎所有细胞的生命史，包括发展为癌症的细胞，都是由体细胞进化驱动的。
总之，此处提供的数据使我们能够绘制大致时间表，总结每种癌症类型的典型进化史（图6，所有其他癌症类型的补充信息）。这些利用了点突变和拷贝数变化的定性定时，以及签名活动，可以将其与WGD的时间顺序估计和MRCA的出现交织在一起。
a – d，时间轴代表受精卵与大肠腺癌（a），鳞状细胞癌（b），卵巢腺癌（c）和胰腺腺癌（d的诊断中位年龄之间的时间长度，以年为单位）。对主要事件（例如WGD和MRCA的出现）的实时估计可用于按时间顺序定义肿瘤进化的早期，可变，晚期和亚克隆阶段。还显示了根据变化的时钟突变加速速率的时间估计时间范围，刻度线分别对应于1x，2.5x，5x，7.5x，10x和20x。驱动程序突变和拷贝数变化（CNA）在每个阶段均根据其优先时序显示，如相对顺序所定义。平均而言，在肿瘤进化过程中发生变化的突变信号（Sigs），或者基本上是活跃的但没有变化的突变信号（Sigs）显示在其活性最大的时期。DBS，双碱基取代；SBS，单碱基取代。如果适用，注释从文献中已知时间的病变；匕首符号表示事件具有不同的计时；星号表示与我们的时间安排相符的事件。
值得注意的是，几乎所有癌症的演变显示的顺序，这与一致非常好一些的水平，并增加了很多细节，癌症进展的建立模型35，46。例如，伴有17p缺失的TP53是包括卵巢癌在内的多种癌症中最常见的起始突变之一，其中TP53是其癌前期病变的标志47。此外，典型的早期驱动因素包括大多数其他高度复发的癌症基因，例如KRAS，TERT和CDKN2A，表明在癌症的早期甚至可能的演变过程中发挥了重要作用。这种最初受限制的基因集在癌症发展的后期阶段变宽，这表明上位的适应性环境有助于癌症发展的第一步。随着时间的流逝，随着肿瘤的发展，它们遵循由个别罕见的驱动程序突变和拷贝数变更驱动的越来越多样化的路径。然而，这些趋势都不是绝对的，并且各个肿瘤的进化路径是高度可变的，这表明癌症的进化遵循趋势，但远非确定性的。
我们的研究阐明了在体内肿瘤发展的典型时间尺度，与初始驱动事件似乎发生高达十年前诊断，证明癌症基因组是如何通过体细胞进化的终身过程形的，具有正常衰老之间的流体的边界处理5，6，7，8，9，10，11和癌症演变。然而，具有如此长潜伏期的遗传畸变的出现提出了希望，可以在达到其全部恶性潜能之前及早发现异常克隆。
PCAWG系列包括来自2658个供体的2778个肿瘤样品（列出2703白色，列出75灰色）。该数据集中的所有样本均经历了全基因组测序（肿瘤的平均平均覆盖率至少为30倍，匹配的正常样本为25倍），并经过一套针对特定项目的流水线处理，以进行比对，变异调用和质量控制4。通过使用多层方法将六个单独的调用者的输出组合成一个共识来建立拷贝号调用，从而得到拷贝号配置文件，纯度和倍性值以及肿瘤是否经历了WGD（补充信息）。）。通过整合11个亚克隆重建调用者的输出获得了共识性亚克隆架构，此后，使用MutationTimer.R方法（补充信息）将所有SNV，插入缺失和结构变体分配给突变簇。PCAWG驱动程序工作组4已定义了驱动程序调用，PCAWG签名工作组24已定义了突变签名。在补充信息的第1节中可以找到更详细的描述 。
如相关研究4所述，应计数据是基于ICGC和TCGA的各个成员小组进行的测序实验得出的。由于这是对现有数据的荟萃分析，因此未执行功效计算，并且研究人员对癌症的诊断没有盲目性。
我们使用了三种相关方法来计算获得拷贝数的时间（请参阅 补充信息，第2节）。简而言之，共同的特征是，根据以下公式，突变（E）的预期VAF 与携带突变的等位基因的潜在数目有关：E [ X ] = nmfρ / [ N（1- ρ）+ Cρ ] ，其中X是读取次数，n表示基因座覆盖范围，突变拷贝数m是带有突变的等位基因数目（通常可以推断），f是携带给定突变的克隆的频率（ 对于克隆突变，f = 1）。N是正常拷贝数（常染色体上为2，对于X染色体为1或2，对于Y染色体为0或1），C是肿瘤的总拷贝数，而ρ是样品的纯度。
突变的数量ñ 米 在每一个等位基因拷贝数米 ，然后通知什么时候发生的增益的时间。定时每个增益的基本公式取决于拷贝数配置：
其中2 +1分别指主要副本和次要副本编号2和1。在如何计算每个等位基因上存在的突变数以及如何处理不确定性方面，方法略有不同（补充信息）。
突变拷贝数m和克隆频率f是根据上述原理计算的。可以在补充信息的第2节中找到详细 信息。f = 1的突变表示为“克隆”，而f <1的突变表示为“亚克隆”。f = 1且m > 1的突变表示为“早期克隆”（共同扩增）。在f = 1的情况下，m = 1且C > 2，如果次要拷贝数为0，则将突变标注为“晚期克隆”，否则标注为“克隆”（未指定）。
PCAWG驱动程序和功能解释小组4提供了驱动程序点突变（SNV和插入/缺失）的目录。计时类别的计算方法如上所述。从四个时间类别中，针对样本中具有相同拷贝数组成的片段中存在的所有其他突变的分布，计算了驱动子突变的早期/晚期克隆和克隆（早期，晚期或未指定的克隆）/亚克隆的比值比。与每个特定的驱动程序。这些比值比的背景分布使用1,000个引导程序进行了评估（补充信息，第4.1节）。
对于每对驱动点突变和循环拷贝数变化，都建立了排序（较早，较晚或未指定）。该决定所依据的信息来自每个驱动程序点突变的时间以及克隆和亚克隆拷贝数片段的时间状态。这些表汇总了所有样本，并使用了运动统计模型来计算驾驶员突变的总体排名。补充信息的第4.2节中提供了完整描述 。
将点突变分为四个时期之一后，由PCAWG突变签名工作组24定义的突变三核苷酸取代签名适合具有观察到的签名活性的样品。基于多项式分布的似然比检验用于检验时间点之间的突变谱差异。使用非负线性最小二乘法计算时间分辨的曝光量。补充信息的第5节提供了完整的详细信息。
CpG> TpG突变是在NpCpG范围内计数的，但皮肤黑素瘤除外，其中由于重叠的UV突变谱而排除了CpCpG和TpCpG。用于视觉比较，突变的数量被缩放到有效的基因组大小，定义为1 /平均值（米我 / Ç 我），其中中号我是每个突变的等位基因拷贝的估计数量，并且Ç 我是该位点的总拷贝数，从而缩放到最终拷贝数和更改时间。
分级贝叶斯线性回归适合将诊断时的年龄与突变的比例相关联，从而确保正斜率并通过跨癌症类型的共享伽马分布进行拦截。
对于具有多个时间点的肿瘤，计算了在诊断和复发之间共享的突变集（n D）和对复发具有特异性的突变集（n R）。率加速度计算为：一个 = ñ - [R / Ñ d × 吨d / 吨- [R 。针对所有取代和CpG> TpG突变分别进行此分析。
在这些分析的基础上，选择了大多数癌症类型的5倍典型升高，脑癌的2.5倍较低和卵巢癌的7.5倍较低。
将突变时间中的拷贝数增益的估计值转换为时间顺序的校正不仅取决于速率加速度，而且取决于该加速度发生的时间。由于这通常是未知的，因此我们对诊断之前的15年间隔进行了速率加速的蒙特卡罗模拟，大约相当于60岁时诊断的25％的时间，并指出在此期间内速率增加了5倍与我们的数据兼容的约33％的突变抵消。假定亚克隆突变发生在完全加速时。亚克隆突变的比例除以已鉴定亚克隆的数量，因此保守地假设分支进化。补充信息的第6节提供了完整的详细 信息。
来自每种不同时机分析的结果将结合每种肿瘤类型的癌症演化时间表（图6和补充信息））。每个时间轴从受精卵开始，一直到每个队列的诊断中位年龄。WGD和MRCA的实时估算值是定位点，使我们能够粗略地将四个大致定义的时间段（早期克隆，中间，晚期克隆和亚克隆）映射到患者生命周期中的时间顺序。可以根据联赛模型分析中的顺序将特定的驾驶员突变或副本数变更置于每个时间范围内。显示签名是否通常随时间变化（均值变化的95％置信区间不重叠0），以及签名是否活跃（向一个时间点贡献至少10％的突变）。签名显示在时间线上最活跃的时期。如果我们研究中发现的事件在文献中有已知的时间，该协议在时间表上注明；星号表示约定的时间，而匕首符号表示与我们的结果不同的时间。详细信息在 补充信息，第7节。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
ICGC / TCGA PCAWG联盟生成的体细胞和种系变异调用，突变签名，亚克隆重建，转录本丰度，剪接调用和其他核心数据在其他地方4进行了描述，并可从https://dcc.icgc.org/releases/下载。PCAWG。有关访问数据（包括原始读取文件）的更多信息，请访问https://docs.icgc.org/pcawg/data/。。根据ICGC和TCGA项目的数据访问政策，大多数分子，临床和标本数据处于开放层，不需要访问批准。要访问可能识别参与者的信息，例如种系等位基因和基础测序数据，研究人员将需要通过dbGaP向https://dbgap.ncbi.nlm.nih.gov/aa申请TCGA数据访问委员会（DAC）。/wga.cgi?page=login），以访问数据集的TCGA部分和ICGC数据访问合规办公室（DACO；http：//icgc.org/daco）用于ICGC部分。此外，要访问从TCGA供体衍生的体细胞SNV，研究人员还需要获得dbGaP授权。补充说明3中描述了本研究中使用的数据集和结果，包括拷贝数获得的时间估算，WGD和MRCA的时间估算以及突变特征的变化，在补充说明3中进行了描述， 并可从https://dcc.icgc.org获得。/ releases / PCAWG / evolution-heterogeneity。
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