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白细胞介素2的制备及检定

发表时间:2019-07-12 16:27作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

白细胞介素2的制备及检定

(一) 原理

白细胞介素2(IL-2)是Th细胞受有丝分裂原或特异性抗原刺激后,并在白细胞介素1的辅助下,产生的一种可溶性糖蛋白。IL-2是体内重要的广谱免疫增强因子,临床上常用于治疗免疫缺陷病及肿瘤等。

(二) 材料和方法

1.制备粗制IL-2无菌采血,肝素抗凝,用RPMI1640按1∶1将血液稀释,然后重层于菲可液面上,以1500r/min离心30min,取白细胞层,用RPMI1640洗2次,按1~3×10-6细胞/ml浓度加入10%胎牛血清RPMI1640,注入一装有磁棒的大瓶中,置37℃搅拌培养4天,取出,分装于50ml离心管中,1500r/min离心20min,弃上清液,将细胞悬浮于1%胎牛血清RPMI1640培养液中,使细胞浓度为10-6细胞/ml。同时加入纯质PHA1~2μg/ml以及多种B 淋巴母细胞株,使其浓度为10-6细胞/ml,37℃搅拌培养18~24h后,取出以1500r/min离心30min,取上清,用0.45μg滤膜过滤除菌,滤液即为粗制IL-2。

2.制备精品IL-2

(1) 硫酸铵沉淀与真空浓缩透析:在4℃下将硫酸铵粉末按50%饱和量加入上述粗制IL-2中,搅拌2h,12000g离心30min,取上清液,再加入80%饱和硫酸铵,4℃过夜,次日以12000g离心30min,弃上清液,将沉淀溶于0.1%PEG6000的1∶2PBS溶液(pH值7.3)中,置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量。

(2) Sephadex G100凝胶过滤:用2×180cm的过滤柱及PBS(同上),以80ml/h流速过滤 。将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其OD值。同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其OD值,绘出IL-2及标准蛋白OD值的曲线。将各管洗脱液过滤除菌后,作白细胞生物活性试验,按试验结果绘出曲线,找出具有最高IL-2活性的几管洗脱液,混合后,作下一步精制。

(3) Blue Sepharose层析:将上述混合后的洗脱液加入Blue Sepharose柱 中,流速约15ml /h,按每管10ml收集流出液,当样品全部流出柱中以后,用上述PBS洗涤样品柱,再用梯度NaCl溶液(从0.075mol/L至0.6mol/L NaCl的PBS溶液)洗脱,按2ml/管收集洗脱液。NaCl溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制。洗脱完毕后,作各管OD值及NaCl浓度的测定。各管洗脱液过滤除菌后,作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合,即为精制的IL-2.

2。置-20℃冰箱保存。

(三) 检定

1.活性测定用10%胎牛血清RPMI1640将上述IL-2稀释为50%、25%、12.5%、6.25%,而后再将每个百分浓度以及100%浓度的IL-2倍比稀释,自1∶2至1∶128,将每个稀释度分别加入多孔板的孔中,每孔0.1ml。然后取CT6细胞株(小鼠的IL-2依赖性T细胞株), 调整浓度为10-6细胞/ml,每孔加入0.1ml,同时用培养基代替IL-2作对照。将多孔板培养24h后,取出按每孔1μci的浓度加H3标记胸腺嘧啶核苷继续培养4h。取出后用ME SHⅡ细胞收集器过滤洗涤细胞,用β计数器测定各孔细胞的cpm。必要时按此结果绘出曲线,确定活性单位。

2.蛋白含量测定采用分光光度计,分别测得OD280及OD260,然后按下式计算:蛋白含量(mg/ml)=(1.44×OD280-0.75×OD260)×稀释倍数。

3.毒性试验及细菌检查参考胸腺肽制备部分。

(四) 注意事项

IL-2的制备过程类似细胞培养的过程,因此,其注意事项也类似细胞培养。IL-2活性测定采用的是同位素掺入法,因此须按要求操作,防止同位素扩散和污染。


文章分类: 蛋白技术资料
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