摘要
癌症驱动的发现历来集中在蛋白质编码基因1，2，3，4。在这里，我们从全基因组全癌基因分析（PCAWG）联盟5的 2658个基因组的非编码区域中，对驱动程序点突变和结构变异进行了分析5国际癌症基因组协会（ICGC）和癌症基因组图谱（TCGA）的代表。对于点突变，我们开发了一种统计严谨的策略，用于组合多种驾驶员发现方法中的显着性水平，从而克服了单个方法的局限性。对于结构变体，我们提出了两种驱动程序发现方法，并确定了受反复断点和反复体细胞并置显着影响的区域。我们的分析证实先前报道的司机6，7，别人使人怀疑，并确定新的候选人，包括在5点突变“的区域TP53，在3'非翻译区NFKBIZ和TOB1，局灶性缺失BRD4和AKR1C基因位点的重排。我们显示，虽然驱动癌症的点突变和结构变异在非编码基因和调控序列中的频率比在蛋白质编码基因中的频率低，但是随着更多癌症基因组的出现，将发现这些驱动因素的其他例子。
以前大规模测序项目已经确定许多推定的癌症基因，但大部分的努力在蛋白质编码基因集中在突变和拷贝数改变，主要是利用全基因组测序和单核苷酸多态性阵列1，2，3，4。全基因组测序使系统地调查非编码区的潜在驱动事件成为可能，包括单核苷酸变异（SNV），小的插入和缺失（indels）和较大的结构变异。全基因组测序可精确定位结构变异断点和不同基因组位点（并列位置）之间的连接。虽然中等规模队列已经揭示候选的先前全基因组测序分析的非编码调节驱动器事件8，9，10，11，12，13，14，15，频率和这些事件的功能的影响保持充分研究6，7，13，16，17。
驾驶员识别保持在非编码区大得多的挑战比在编码基因，由于测序和映射假象，知之甚少局部超突变处理14，18，19，调节区，背景突变率和不准确估计的不完整的注释非编码突变的功能作用未知。由于结构稀疏，缺乏明显的中立事件来构建背景模型以及其复杂的功能效果，因此从结构变体中发现驱动程序变得更加复杂。需要有足够的统计方法来解决这些问题，才能可靠地识别非编码驱动程序。
ICGC和TCGA PCAWG的努力已经收集并系统分析了38种类型的癌症中的2658名患者的癌症基因组序列5，提供了一个表征推定的非编码驱动程序事件的机会，这些事件无法使用全外显子组测序或单核苷酸多态性阵列中的数据找到。在这里，我们描述了对非编码体驱动程序的全面搜索。对于点突变（SNV和插入缺失），我们将多种驱动程序发现算法的结果相结合，并通过仔细评估显着性命中数据，揭示出反复出现的伪像和对突变过程的了解不足，导致先前报道的非编码驱动程序中出现常见的假阳性。对于结构变体，我们引入了两种新方法来识别具有明显重复断点（SRB）和明显并发（SRJ）的两个区域，解释了DNA断裂和修复的速率以及基因组的三维结构中的基因组异质性。最后，为了评估未来非编码驱动程序发现的潜力，我们在PCAWG数据集中量化了我们的统计能力，并估计了已知癌症基因周围非编码调控区中点突变的总体过量。
许多编码蛋白质的驱动程序突变都发生在单点“热点”中。在PCAWG数据集中，只有12个单核苷酸位置的患者突变率> 1％，其中106个突变的患者> 0.5％（Extended Data图1a，方法）。尽管蛋白质编码区仅占基因组的大约1％，但在50个最常见的突变位点中，有15个（30％）是癌症基因（KRAS，BRAF，PIK3CA，TP53和IDH1）中经过充分研究的热点（图。图1A，扩展数据图1B），与所述两个典型沿TERT启动子热点6，7。
a，条形图（左）显示了在特定基因组热点（染色体：位置）上发生突变的PCAWG患者总数。前25个热点归类为已知驱动因素或由突变过程诱发。表格（中）显示了PCAWG队列中子集的突变频率。淋巴恶性肿瘤包括Lymph–BNHL和Lymph–CLL。堆叠的条形图（右）显示了突变过程对热点突变的贡献（方法）。当热点与功能元件重叠（用颜色编码）时，将给出基因名称，其中蛋白质编码基因的氨基酸（AA）发生变化（固相线表示被指示的任何氨基酸取代）。扩展数据图1b显示了前50个热点以及所有同类群组。b，在队列中至少有一个命中的队列中进行人工审查之前，已识别出重要的非编码元素（Q <0.1，为布朗的 多达13种驾驶员发现方法的组合P值的方法）。颜色代表显着性水平。补充表5中提供了详细信息。*潜在的技术文物；＃受突变过程影响的目标。腺癌，腺癌；中枢神经系统，中枢神经系统；Eso，食道；GBM，胶质母细胞瘤；HCC，肝细胞癌；髓质，髓母细胞瘤；胰腺，胰腺; 前列腺，前列腺；RCC，肾细胞癌；生殖器官 SCC，鳞状细胞癌；TCC，移行细胞癌；甲状腺 HIST1H2AM也称为H2AC17; 。阿拉TGC作为 TRA-TGC3-1 ; Met.CAT为TRM-CAT1-1 ; 和Gly.GCC作为TRG-GCC2-3。PTDSS1 / MTERF3表示5'UTR突变PTDSS1也重叠MTERF3启动子。
剩余的非编码热点可以归因于与乘客的事件相关联的以下的局部突变过程：（i）从紫外（UV）光并受损核苷酸切除修复损伤在黑色素瘤的位点处所占的转录因子5，18，19，20 ; （ii）在B细胞非霍奇金淋巴瘤（Lymph–BNHL）和慢性淋巴细胞性白血病（Lymph–CLL）中由激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（AID）引起的体细胞高突变；（iii）回文序列背景被认为可形成APOBEC酶靶向的发夹DNA结构（在GPR126的内含子（也称为ADGRG6）和PLEKHS1启动子中）10; （iv）假定的技术伪像（图1a，补充说明 1）。这些发现表明，除TERT启动子事件外，非编码单点热点驱动程序很少或落入检测突变敏感性较低的区域。
为了鉴定重复突变的基因组元件，我们首先分析了蛋白质编码区，RNA基因（长和短非编码RNA和microRNA（miRNA））和调节区（启动子，5'非翻译区（UTR））中的体细胞SNV和插入缺失。 ，3'UTR和增强子），约占基因组的4％（扩展数据图2a–c，方法，补充表1）。我们分析了来自27种个体肿瘤类型和15种按起源或器官系统将癌症分组的meta队列的2583例肿瘤（扩展数据图2d，方法）。我们确定了候选驱动因素，即队列元素与Q的组合 <0.1（10％的错误发现率（FDR）） -通过集成13种发现算法，绕过由任一方法引入偏见（扩展数据图2 E，11，补充表2，3，补充注释 2）。我们通过评估其检测603种已知癌症基因的能力（来自Cancer Gene Census（CGC）21，v.80）来对该方法进行基准测试，发现与单一算法相比，组合方法可以提高性能（Extended Data图3a，b，方法）。总体而言，我们确定了1,294，涉及520名唯一候选人（附表格显著命中4，5）。
即使在保守的FDR控制之后，由于背景模型不正确，测序和作图伪像，或者由于无法解释的突变过程而导致局部突变增加，假阳性的“驱动”基因位点仍然可以保留。因此，我们根据技术和生物学标准对候选驱动因素进行了系统筛选，然后进行了仔细审查（扩展数据图3c，方法，补充说明 3）。过滤元件的例子包括PIM1（淋巴瘤）和RPL13A（黑素瘤）的启动子，因为它们分别与局部AID和紫外线突变过程有关。PLEKHS1，GPR126，TBC1D12和LEPROTL1因为回文APOBEC靶序列的9，10 ; 和WDR74 5'5'UTR和启动子8，10，14，由于映射问题在下游人工审核（补充表检测到5，补充说明 4）。在组合中，过滤和重新施加FDR控制丢弃589出来的原始队列元件命中1294（46％）和341出520（66％）的独特元素（扩展数据图的图3c，补充表4，5）。
我们严格的组合和过滤策略在179个基因组元件中产生了705个命中：在143个蛋白质编码基因中有602个命中，在非编码元件中有103个命中。我们在泛癌元队列观察到很大的可变性在不同类型的癌症，从一个在击透明细胞肾癌细胞到80（图1b中，补充表4，5）。尽管大多数候选驱动因素在较大的荟萃队列中都具有重要意义，但某些基因，例如DAXX（胰腺内分泌肿瘤），NRAS（黑色素瘤），SPOP（前列腺腺癌），FGFR1（上皮性星形细胞瘤）和MIR142（淋巴瘤-BNHL）的得分更高个别肿瘤类型中的表达（扩展数据图。3d）。这些结果强调了将驾驶员发现分析限制在特定类型的肿瘤与最大队列规模之间的权衡。
我们确定的候选编码驱动程序与先前的结果一致：在至少1个队列中重要的143个基因中，有69％在CGC中，并且几乎所有以前都与癌症有关。与大型全外显子组测序数据集相比，此数据集中每种癌症类型的患者较少，提供的功能仅足以检测具有最强信号的基因。我们在84个独特的元素中发现了116个额外的匹配，这些元素“接近重要性”（0.1 < Q <0.25）。这组63个独特的蛋白质编码基因中有51％位于CGC中，这表明它们将在更大的队列中被发现（补充表4）。
为了指定重要的非编码元件作为候选驱动程序，我们审查了来自突变调用，其他基因组数据（染色体断点，拷贝数，杂合缺失和表达数据），癌症基因数据库和文献（方法，补充表6，10）。我们在下面以及补充说明4中描述了主要候选人 。
的TERT启动子是在该数据集（14个队列）（图中最频繁突变的非编码驱动器1b中），并且这些突变强烈具有较高相关TERT表达，如先前已报道9（扩展数据图4a中，补充表10）。突变在启动子和/或5'端非编码区MTG2（其编码参与线粒体核糖体GTP酶）用的表达相关MTG2这是轻微显著较低，在这两种泛癌（P = 0.036，倍数差异= 0.8）和癌（P = 0.029，倍差异= 0.8）的元组群（扩展数据图4 A，5A）。先前已显示5'UTR中的突变可降低MTG2的体外表达22。
在TOB1（癌和泛癌荟萃队列），NFKBIZ（淋巴瘤）和ALB（肝癌）的3'UTR中发现了复发的体细胞事件（图1b）。TOB1编码与ERBB2相关的抗增殖调节剂，也影响胃癌的迁移和侵袭23。TOB1通过与其他3'UTR结合并促进腺苷酸化来调节其他mRNA 24。TOB1中 3'UTR突变的肿瘤表现出表达降低的趋势（P = 0.053，倍数差= 0.7）。突变没有集中在已知的miRNA结合位点上。但是，该区域非常保守，因此可能具有功能（图2a）。TOB1及其邻近基因WFIKKN2在乳腺癌和泛癌中被局部扩增，表明在癌症中起着复杂的作用（扩展数据图4b）。NFKBIZ是一种转录因子，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中发生突变，并在原发性淋巴瘤中扩增25。在终止密码子附近和保守的miRNA结合位点上游的热点中积累的3'UTR突变（扩展数据图5b）。终止密码子旁的插入缺失的富集表明该热点并非归因于AID脱靶活性。先前的功能实验已将这些突变与NFKBIZ表达增加25相关联，我们在淋巴瘤队列中观察到了这一表达（P = 0.035，倍数差异= 3.2；校正拷贝数后，P = 0.03）（扩展数据图5b）。
a，高度保守的TOB1 3'UTR 中的反复突变和相关基因表达。显示保守度得分（PhyloP，灰色），miRNA结合位点（TargetScan（顶部轨道）和Ago-Clip（底部轨道））的轨道，以及观察到的SNV（蓝色）和插入缺失（绿色）。的表达TOB1在突变的（Ñ = 13）和野生型（Ñ = 886）的情况下（右）。P 值基于双面Wilcoxon秩和检验。条形代表平均值。CNA，副本号更改。b，Indel和SNV与TP53重叠5'区域及其对基因表达的影响。来自GM12878细胞系的H3K4me3（ENCODE）。事件编号与右侧面板中的基因表达匹配（红色点，突变的样本；黑色条形，中值）。P 值代表在每种肿瘤类型内的排列试验的费舍尔组合。ChRCC，发色肾细胞癌；FPKM，每百万个映射读取的转录本每千碱基片段。c，ALB，NEAT1和MALAT1基因组位点中indel和SNV的整体泛癌分布（由于AID，淋巴瘤样品被排除在外）。d，具有3'UTR显着突变的基因的平均插入缺失率的定量。误差棒代表95％的二项式置信区间。e，不同大小的插入缺失在以下方面的贡献：所有蛋白质编码和长非编码RNA基因；ALB ; NEAT1 ; MALAT1 ; MIR122 ; 其余基因富集2–5 bp插入缺失。f，SNV和插入缺失率（每位患者每Mb的事件总数）是18个蛋白质编码基因的不同功能区域中富含2–5 bp插入缺失（无ALB的 47％的插入缺失）。红线表示从所有蛋白质编码基因估计的背景插入缺失和SNV率。误差条如d ; 补充表18中提供的原始计数。c – f，在所有唯一情况下分析的突变（n = 2,583）。
非编码RNA RMRP的外显子和启动子在多种类型的癌症中均发生了显着突变（图1b，扩展数据图5c）。生殖系RMRP突变会导致软骨-头发发育不全，以前的体外研究表明，某些体细胞启动子突变具有功能性16。RMRP基因座在几种类型的肿瘤中也被局部扩增（扩展数据图4b）。可能影响二级结构的位点中突变的富集表明这些突变是有功能的（P = 0.011，置换测试）（扩展数据图5c）），尽管需要谨慎，因为该基因座似乎也受到制图假象或突变率增加的影响（补充说明 4）。
miR-142前体miRNA在Lymph–BNHL以及淋巴和造血队列中均具有重要意义（图1b；扩展数据图5d）。轨迹是已知的AID的脱靶区域在淋巴瘤12，26，但有7 8个突变的成熟miRNA 的mir-142-P3 -用于其中最大的功能效果，预计-未分配到AID，其中提示这些突变在选择中12。
为了通过集中于功能注释区域来测试是否错过了驱动程序，我们对所有不重叠的2kb窗口进行了无偏倚的全基因组调查，以发现多余的点突变。结果产生的67个重要窗口中有22个与已知的蛋白质编码驱动程序重叠，并且28个重叠的高度转录区域重叠了2-5 bp插入缺失（在下面的“与转录相关的插入缺失签名”部分中进行了描述）（扩展数据图5e，补充表9，补充说明 5）。其余的17个窗口与癌症没有明显的联系，其中一些似乎受到制图伪影的影响。对4,351个超保守的非编码区的单独分析没有产生新的候选驱动程序（扩展数据图5e），补充说明 5）。这两个屏幕都表明，本研究中发现的非编码点突变驱动程序的匮乏不是由于功能元素的注释。
最后，我们进行了严格的假设检验，以提高统计能力，以检测来自CGC 21的癌基因附近的顺式调控驱动子突变（补充表7）。癌症基因启动子的限制性假设测试显示TP53启动子突变显着复发（11例全癌患者，Q = 0.044），主要包括SNV和影响第一个非编码外显子转录起始位点或供体剪接位点的缺失。在11个病例中，有10个发生了突变并伴有杂合缺失，所有具有表达数据的样品均显示出mRNA水平降低（图2b）。这些患者没有一个包含其他编码突变，可能导致TP53的下调。据我们所知，这是关于非编码突变导致TP53失活相对少见但有影响的形式的首次报道。
选择癌症的局部增减来调节其靶基因的表达水平。将假设检验限制于此类基因的非编码元素（n = 216,986个队列元素组合，代表5,201个独特元素）（方法）仅产生了一个新发现，即 前列腺癌癌基因FOXA1的3'UTR （补充表）11）。
许多插入缺失打击了几个重要的非编码元素（ALB 3'UTR，NEAT1，MALAT1和MIR122）；所有先前已报道了癌症中发生突变10，15，27（图1个 B中，2C）。为了探讨是否选择了ALB 3'UTR事件，我们计算了该基因功能区域的插入缺失率。在整个UTR，内含子和外显子中，甚至在聚腺苷酸化位点的下游，插入缺失率都非常高，这种模式与选择不一致（图2c，d）。同样，FOXA1在其整个基因座中都有较高的插入缺失率，而NFKBIZ和TOB1中的插入缺失处于其3'UTR中，表明这些是驾驶员事件（图2d）。ALB，NEAT1和MALAT1突变与基因表达的变化无关（扩展数据图4a），并且与高癌细胞分数或双等位基因缺失无关（扩展数据图6a，b）。同样，MIR122中的插入缺失在成熟miRNA的下游，并且与该miRNA靶标的表达改变无关（补充注释 5）。
如果这些基因中的插入缺失是由于突变过程而非选择引起的，则它们可能表现出独特的特征。事实上，在插入缺失利落，MALAT1，MIR122和ALB在2-5-BP-长事件被强烈富集的（Fisher的P <6.8×10 -5，对于所有）（图2E）。系统地搜索编码和非编码基因（Q <0.1）显着提高2–5 bp插入缺失的速率，发现该突变过程影响了至少18种不同类型肿瘤中的其他基因，其中大多数基因高度表达且组织特异性的（如先前对某些基因的报道[ 15]）（扩展数据图6e，f）。SNV虽然富集程度较低，但在这些区域中也以较高的频率出现（图2f）。总体而言，我们的发现表明，MALAT1，NEAT1，ALB和MIR122中的插入缺失不是驱动程序事件，而是转录相关突变过程的结果。改变的先前报道的致癌效应MALAT1和利落表达27，28，29因此可以是不相关的这些突变。我们的发现还表明，尽管FOXA1蛋白编码插入缺失是驱动因素，但3'UTR插入缺失可能是乘客30。
驱动结构变异体可以通过破坏它们的一个或两个断点位点（例如，使肿瘤抑制物失活）或通过在位点之间产生新的并置而起作用。因此，我们既搜索具有SRB的基因组区域，也搜索具有SRJ的区域对（扩展数据图7）。
对于SRB，我们首先使用8个解释变量（方法，补充表13）并考虑了无法解释的变异源31（补充说明 6），定义了一个预测断点密度的背景模型。我们确定了53个具有SRB的不相交区域（Q <0.1）（图3a，补充表14），这些区域根据重排另一端的断点变异性干净地分为两组。八个SRB的伙伴断点紧密聚集（重排离散度分数低；方法），并代表已知的致癌融合物。其余的45个SRB具有分散的伙伴断点（具有较高的重排分散分数），并且与先前确定的体细胞拷贝数改变（SCNA）密切相关（图3b）。
a，20种最重要的SRB（圆圈大小）的每种肿瘤类型事件的相对富集（Fisher精确检验）。基因座由来自CGC 21的可能的驱动基因标记。对于由固相线分隔的基因符号，两个或两个基因都是预期的。b，重排分散分数与53个SRB的平均复制时间。颜色表示融合（紫色），类脆（绿色），缺失（蓝色），扩增（红色）或复制中性（黑色）事件。c，具有BRD4的卵巢肿瘤的肿瘤与正常阅读覆盖率微缺失 红色箭头指示重新排列（顶部）。PCAWG乳腺癌和卵巢癌的断点密度（中）。乳房（BRCA）和卵巢（OV）组织51（底部）的增强子位置。d，具有（SV +）和不具有（SV-）重排的乳腺癌和卵巢癌中BRD4和NOTCH3基因座的体细胞拷贝数。e，BRD4和NOTCH3每个绝对拷贝数的基因表达。F，这30种最重要的SRJ，每种肿瘤类型具有相对的富集度（圆圈大小），并以《癌症体细胞突变目录》（COSMIC）（左），CGC基因（中心）和蛋白质破坏（右）的致癌融合体为注释。 （方法）。ATP5E也称为ATP5F1E。G，表达与COSMIC（紫色），其他SRJ（粉红色）或未在任何SRJ（灰色）中的SRJ中的重排相关。对于每个重排（R），主要基因座（左）定义为在重排样品中最过量表达的基因100 kb以内的断裂点；次要位置（右侧）是另一个断点。相对于没有重排的样本，相对于没有重排的样本，具有重排的样本中主要基因座的表达要强于其他重排（左图）。相对于不同组织类型的样品，野生型（WT）样品在次级基因座处的组织特异性表达要比其他重排的SRJ大（右图）。P 值表示与“不在SRJ中”的比较。d，ê，克，箱形图显示了四分位数范围，中位数和95％置信区间；双面t检验。h，跨PCAWG黑色素瘤的TERT启动子突变和重排。一，TERT启动子与BASP1和MYO10基因座之间的重排导致了远端增强子向TERT的局部扩增和转移。AML，急性髓细胞性白血病；大肠，大肠；平滑肌肉瘤; MPN，骨髓增生性肿瘤；骨肉瘤，骨肉瘤; PiloAstro，毛细胞星形细胞瘤。
很难将经常性驾驶员SCNA与脆弱地点32的乘客事件区分开。在全基因组测序提供的分辨率下，较晚的复制时机预测的与脆弱性相关的SRB优于现有的脆弱位点注释（补充说明 7），从而确定了12个类似脆弱的SRB（图3b）。其余33个SCNA样SRB包括14个扩增，8个缺失和11个复制中性事件（补充表14）。
SRB的不同类别对邻近基因的影响不同。八个缺失相关的SRB中有五个与附近已知的肿瘤抑制因子的双等位基因失活相关，而12个脆性样SRB中没有一个（P = 0.039）（扩展数据图8a）。脆弱的类SRBs距组织匹配的增强子最远，并引起最弱的表达变化，与它们是乘客事件一致32。相比之下，融合样SRB比其他SRB更接近组织匹配的增强子（P <0.01）（扩展数据图8b），并且与扩增以外的所有其他SRB相比，其表达变化更大（P 对于所有类型，均<0.05）（扩展数据图8c，方法）。我们的分析表明，可以使用重排分散分数，复制时机和基因表达对SRB驱动程序事件进行分类。值得注意的是，重排分散分数或与复制时间的关联都不能从微阵列或全外显子组测序中准确确定，这突出了全基因组测序的重要性。我们总共在已知的致癌融合和复发性SCNA的34个位点鉴定了SRB，另外5个可能是由于DNA脆弱性引起的位点和14个新的候选驱动子（补充说明 8）。
尽管大多数类似SCNA的SRB通过改变基因拷贝数发挥作用，但其中一些似乎靶向调节元件。在确定 拷贝数后，我们确定了三个与附近基因表达变化显着相关的（Q <0.05）（方法），我们在这里讨论其中两个。首先是在10p15出现的结构变异，与7例肺鳞状细胞癌和2例肝肝细胞癌中AKR1C1，AKR1C2和AKR1C3的两倍以上上调相关（扩展数据图8d）。AKR1C蛋白是参与类固醇稳态的醛酮还原酶。异位表达变换细胞系，和种系突变先前已经连接到患肺癌的风险增加33，34。四分之三的断点接近（<10 kb）谱系特异性增强子，可能改变启动子与增强子的相互作用（进而改变基因表达）。但是，因为最高的断点密度位于两个长的反向重复序列之间，所以DNA二级结构可能已经诱导了结构变异。
第二个SRB包含复发性微缺失（<50 kb），涉及卵巢（8例，P <10 -7）和乳腺肿瘤（6例，P <0.04）中BRD4的5'端（图3c，扩展数据图。8e）。这些缺失在扩增包括BRD4和NOTCH3的片段的癌症中高度丰富（P <0.004）（图3d，扩展数据图8f），但不是这些扩增的直接结果（补充说明 9）。BRD4是染色质调节剂，是多种类型癌症的治疗靶标35，36，包括卵巢癌和三阴性乳腺癌 37，38。鉴于完整 BRD4基因的拷贝数增加，我们期望基因表达增加。然而，微缺失与乳腺癌（ P = 0.001）和卵巢肿瘤（ P = 0.04）中 BRD4的较低表达相关，而与邻近基因 NOTCH3的表达不相关（图 3e）。BRD4中的局灶性缺失与HMEC（正常乳腺）和MCF-7（乳腺癌）细胞中的显着外显子1 H3K4me3峰和内含子1增强子重叠（扩展数据图 8e）），这表明这些删除会破坏调控元素。据我们所知，这是循环微缺失限制扩增基因表达的第一个证据。
通过检测融合样SRB的动机，我们在控制了每个位点的断点率和它们之间的距离（方法）之后，专门寻找了比偶然偶然并存的基因组位点。我们鉴定了90种此类SRJ（图3f，补充表15），包括13种已知的致癌融合蛋白（包括所有8种融合样SRB）和77种新的命中基因，其中18种与至少一个已知的癌基因相关（补充说明 8）。）。以前报道的致癌性SRJ的发生频率更高（平均每次融合24例患者，范围2–98），而新患者（最常见的是每次融合2例患者，范围2-4）。由于并发不太可能偶然发生，因此即使观察到两个也变得非常重要。但是，某些SRJ可能会在我们的背景模型中反映出错误，而不是真实的驱动因素。因此，我们基于（i）一个“稳健性因子”进一步评估了SRJ，该“鲁棒性因子”表示在SRJ变得微不足道之前本底速率可以增加多少，以及（ii）在该条件下观察到的事件数与预期事件数之比。当前背景模型（“效果大小”）（扩展数据图9a）。26种SRJ（包括13个已知驱动程序中的11个和15个新近确定的SRJ）对于将预期的本底速率提高三倍非常有力，而其他22种将以两倍的速率保持显着水平。
最典型的驱动程序重排先前已在单个肿瘤类型，通常与组织特异性表达相关的发现39，40。我们发现，尽管搜索了30种不同类型的肿瘤，但我们的前10个SRJ中有9个是组织特异性的。对于受SCNA影响的癌症基因，未观察到这种组织特异性，对于这些基因而言，前十种在11.9种癌症类型中发生改变（平均），或者通过点突变（对于十种在6.7种癌症类型中发生改变的平均点突变）（补充表16）。
SRJs的组织特异性表明，它们是受表观遗传状态强烈影响的，这可能是由于机制原因（例如，两个DNA断裂点的组织特异性三维接近性），还是由于选择了将组织特异性调控元件与癌基因联系起来的原因13，41，42，43。后者似乎更可能是因为：（i）相对于随机选择的重排（主要基因座，P <10 -4），SRJ仅与一个重排伴侣（“主要基因座”）的显着过表达有关（图3g）左）;次要基因座，P > 0.05（扩展数据图9b剩下））; （ii）在次级基因座中，重排伴侣倾向于在该组织类型中相对于其他组织高表达（图3g，右）；（iii）SRJ的距离最近的组织特异性增强子的距离比总体重排的距离小（扩展数据图9b）。这些观察结果表明，SRJ通常通过将调节元件引入致癌基因来发挥作用，否则该致癌基因将以低水平表达。
在许多情况下，SRJ产生截短的或嵌合的蛋白，内含子或外显子内的断点确实过高（68％比预期的56％，P <10 -7）。然而，在所有样品中，最重要的30个SRJ中只有11个（37％）产生了新蛋白，而其他6个有时也产生了新蛋白。其余的要么是非破坏性的，要么是在被破坏基因的前两个内含子中包含了断点，使大多数蛋白质保持完整（44）（图3f）。而且，产生新蛋白的SRJs的表达变化与不产生新蛋白的SRJ相似（P = 0.4）（扩展数据图9c）。）。我们得出结论，改变基因表达是两类SRJ的关键功能，并且SRJ类似于作用于调节元件的非编码驱动点突变。
我们发现了几种涉及扩增的癌基因的SRJ，包括MDM2，EGFR和TERT（图3f，h，i，扩展数据图9d-f，补充表15）。该TERT启动子区域被并列四个黑素瘤（P <10 -7）的区域在BASP1（二者第5染色体）基因，以及一个区域附近NDUFC2（吨（5,11））两种黑素瘤和髓母细胞瘤一个（P ＜10 -8）。两个并列区域均标记有黑色素细胞增强剂，这表明它们可以驱动TERT。表达。在黑色素瘤中，这些重排与TERT启动子的C228T和C250T突变互斥（P <10 -3）（图3h）。由于并置始终是也会放大TERT的复杂事件的一部分，因此TERT表达的增加可能是由于扩增，并置或两者兼而有之。
我们对基因组热点，功能元件，基因组窗口和SRJ的分析都表明，与蛋白质编码驱动程序相比，非编码驱动程序很少见。这可能部分是由于缺乏发现能力3所致。因此，我们评估的突变负担测试发现功率在我们的肿瘤同伙在不同类型元素的复发事件，首先关注的点突变3，16。我们发现，驾驶员要达到90％的发现能力所需的突变患者的比例范围从背景突变密度低的大型队列的<1％到背景突变密度高的小型队列的25％（图4a））。类似地为不同类型的元素供电，这表明非编码元素与编码元素中缺乏驱动程序并不是由于缺乏电源。同样，在低重排率的大型队列中，我们检测SRJ的能力较高，而由于总体率较低，对于长染色体重排和染色体间重排（扩展数据，图10a）：我们仅能够检测5-20发生的事件在大多数类型的癌症中样本的百分比（图4b）。此外，从大约2500个肿瘤开始，我们期望每增加25个基因组就发现一个新的SRJ（图4c）。
a，热图显示发现功率≥90％的驱动器元件的最小频率。功效取决于背景突变频率（在热图上方），元件长度（在图2c的扩展数据中描述的中位长度）和具有突变的患者人数（细胞数）。例如，泛癌研究小组有能力发现＜1％的蛋白质编码驱动基因（编码序列（CDS））（18位患者），而膀胱癌-TCC研究小组仅能发现存在于1％的蛋白质驱动基因。至少27％（6名患者）。b，是检测每个90％的基因座对中90％的并发并进行检测所需的样品数，它是每个样品重排的中位数和融合发生于背景之上的速率（实线）的函数。垂直虚线表示每种癌症类型的中位重排率，这些线上的星号表示针对该癌症类型分析的整个基因组的数量。c，将数据下采样至各种样本大小后检测到的SRJ数量，分别表明重排发生在高于背景的高（≥12％；红色）和低（<12％；黑色）比率下；他们的总和（蓝色）。d，在顺式中观察到的突变（SNV和插入/缺失）数量603个编码蛋白质的癌症基因的调控区和编码区，预期的数字以浅色显示（左）。正确，过量突变的数量（即驱动程序突变的估计数量）（正确）。启动子突变的灰色部分表示TERT事件。误差线显示95％的二项式置信区间。仅包括具有高检测灵敏度的样品（n = 936）。
低序列覆盖率（例如，在富含GC的区域45中）也限制了驱动程序的发现。为了在PCAWG数据中测量这种影响，我们量化了检测癌症基因启动子中的16个突变（检测灵敏度）的能力。尽管启动子中的平均检测灵敏度很高（41.9％的基因组位置的平均检测灵敏度在整个肿瘤中> 80％），但只有4.1％的启动子在90％以上的碱基中检测灵敏度> 90％。特别是，两个典型的TERT启动子热点在患者和队列中的检测灵敏度差异很大，从中枢神经系统毛细血管星形细胞瘤队列中仅3％的患者到甲状腺腺癌队列中100％的患者（扩展数据图10b））。从这些数据中，我们推断出每种肿瘤类型中预期的TERT事件数（扩展数据，图10c），发现由于缺乏检测灵敏度，可能错过了大约263个（95％置信区间232–295）TERT热点突变。 。此外，每位患者肿瘤中平均9.9％（1.3-13.0％的四分位数间距）的癌症基因启动子区域功能严重不足（平均检测灵敏度<10％）。因此，启动子缺乏覆盖可能会导致缺乏非编码驱动程序。
为了确定到目前为止发现的非编码驱动程序的稀缺性是否可能是由于当前数据集的统计能力有限所致，我们估计了编码和顺式中高于背景的点突变（即预期的驱动程序事件数）的总体过量603个癌症基因46中的非调节性非编码序列（方法，补充表7，补充说明 11）。为了最大程度地降低检测灵敏度低的样品的影响，我们仅包括了两个TERT启动子热点处检测灵敏度> 90％的936个样品（扩展数据图10c，d，补充说明 11）。）。总体而言，该方法预测了这些癌症基因的蛋白质编码序列中超过1,475个驱动程序突变（95％置信区间1,410–1,687； 1,069个SNV和406 indels）（图4d），而只有96个（95％置信区间） 30–190）估计了启动子中的驱动程序突变（73个归因于TERT），5'UTRs中的22（95％置信区间0–88）和3'UTR中的68（95％置信区间0–178）。癌症基因启动子中的非编码突变通常也不与杂合性丧失或表达改变相关，因为人们期望它们富含驱动因子（补充注释 12）。这些结果共同表明，独立于统计能力的非编码顺式除TERT以外，已知癌症基因中的调节性驱动基因突变比蛋白质编码驱动基因少得多。
在肿瘤中准确，可靠地发现基因组驱动因素可能对癌症患者具有关键意义。我们的发现和此处介绍的用于发现点突变和结构变异驱动因素，方法集成，候选物审核以及鉴定局部超突变和易碎位点的方法，代表了对绘制所有驱动这些恶性变化的图表所做的集体努力的重要贡献。每个病人的癌症5。
在我们发现的最有趣的候选非编码驱动因子中，有TP53的5'端突变。NFKBIZ和TOB1中 3'UTR突变; 和涉及AKR1C基因和BRD4的重排。通过对全基因组测序数据的仔细分析，我们发现一些先前报道且经常更改的非编码元件可能不是真正的驱动程序，包括（i）非编码RNA，NEAT1和MALAT1（它们含有高密度的插入缺失，似乎是由于转录相关的突变过程造成的）和（ii）晚期复制区域中的周期性结构变异，表明DNA脆弱。
这项研究出乎意料地产生了很少的非编码驱动点突变和结构变异。SRJ似乎主要通过调节元件的重排来发挥作用，其频率比直接放大或删除编码序列的类似SCNA的SRB少。来自五项分析的结果-热点重复发生，驾驶员元素发现，结构变异，发现能力和总的突变过量-建议这种稀缺性不是由特定的分析策略引起的，但监管要素确实对其中的影响要小得多复发的癌症驱动事件要比蛋白质编码序列多。非编码驱动程序的这种缺乏与与复杂性状的遗传力相关的种系多态性分布形成对比，后者通常位于蛋白质编码基因之外47。
至少两个因素促成癌症中非编码驱动子突变的相对缺乏：（i）编码和非编码突变的差异适应性效应和（ii）功能元件的目标大小。完善的癌症基因中启动子驱动程序突变的缺乏表明点突变仅显着影响非编码调控元件的功能。这突显了TERT是一个明显的例外，也许是因为即使适度增加了TERT表达可能足以规避正常的端粒缩短。对于其他癌症基因，直接改变蛋白质编码序列或通过拷贝数变化来改变表达水平可能会提供更大的表型效应。例如，与无意义的突变或缺失相比，完全的功能丧失可能比破坏或转移调节区更容易实现。
技术缺陷（例如富含GC的启动子中的“盲点”和不同的过滤策略）可能会导致错过真正的驱动程序48。因此，非编码驱动程序的发现将受益于技术改进，包括均匀的序列覆盖，更长且准确的读取以及改进的变体调用方法。而且，对功能性非编码元素的更好注释将增加发现不频繁突变的驱动程序元素的能力及其可解释性。随着数据集的增长，针对特定基因组区域的尚未确定的突变机制将出现，并需要改进的背景模型，包括附加的协变量和更复杂的统计模型。结构变体的分析面临更大的挑战，因为（i）由于背景频率较低且驱动因素所占比例较高，因此准确建模其背景密度变得复杂（补充说明 6）; （ii）如在SCNA中一样，它们的靶基因可能离断点很远；（iii）SRJ的建模空间更大（基因组平方）；和（iv）多结构变异是复杂的事件常常涉及多个染色体的部分31，以使所得的拓扑离不开技术，例如长期或联读测序推导出49，50。由于这些原因，实验验证对于所有（尤其是非编码）候选驱动程序仍然很重要。
我们的工作表明，更大的数据集和技术进步将继续识别新的非编码驱动程序，尽管其频率远低于蛋白质编码驱动程序。我们预计，这里开发的方法将为从越来越多的癌症全基因组中发现驱动程序的初期时代提供坚实的基础。
没有使用统计方法来确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中也不会盲目分配。
详细方法作为补充方法提供 。
在2955个样本中，我们基于SNV质量控制（补充方法）选择了2583个独特的供体样本用于SNV和indel驾驶员发现分析。我们发现，尽管有SNV假象，另外110个髓样-AML样品仍具有稳健的结构变异体。我们将这些纳入结构变异分析中，共计2,693个样品。对于肿瘤类型的队列分析，我们仅使用了至少有20名患者的队列。通过起源细胞类型或器官系统（例如，肺腺癌和肺鳞状细胞癌的肺）定义肿瘤荟萃队列。通过合并除皮肤黑素瘤和淋巴样肿瘤以外的所有肿瘤队列，创建了一个全癌元队列（补充方法）。
我们选择了50个最频繁的SNV热点。对这些进行分析以识别已知的驾驶员事件；与序列回文，免疫球蛋白基因座等有关的突变特征偏倚；和可能的人工制品，包括区域制图问题（补充方法）。
我们使用了SignatureAnalyzer的贝叶斯非负矩阵分解方法52从头进行了全局签名发现和签名归因，该方法基于1,697个通道-包括用于单碱基替换的1,536个五核苷酸序列上下文，83个indel特征和78个双核苷酸替换类（补充方法）。
GENCODE第19节（参考文献53）和其他基因组资源用于定义功能基因组元素，包括编码蛋白质的基因（CDS，剪接位点，5'UTR，3'UTR和启动子），长的非编码RNA（基因体，剪接位点和启动子），短RNA，miRNA和增强子（补充方法）。
我们从13种驱动程序发现方法中获得了结果（P值），包括ActiveDriverWGS 54，CompositeDriver，DriverPower 55，dndscv 46，ExInAtor 56，LARVA 57，MutSig工具3，NBR 10，ncdDetect 58，ncDriver 59，OncodriveFML 60和regDriver 61。我们使用基于先前发布的方法（用于合并P）的自定义框架整合了所有这些方法的结果62价值观。个别方法的结果显示与预期的P值均匀零值分布有较大偏差，因此排除在外。该方法已在真实和模拟数据上进行了评估。通过将来自所有肿瘤类型队列的所有合并的Brown P值连接起来，并应用Benjamini-Hochberg程序63，我们控制了每个测试基因组元素内的FDR 。与队列元素的组合Q值<0.1被指定为显著命中，并用0.1≤组合 Q <0.25为“近意义”。补充方法中提供了大量详细信息 。此外，我们用NBR方法在跨越整个基因组的2kb区间和非编码超保守区64上测试了元素独立的复发。
我们应用了严格的过滤器来从技术文物和突变过程中识别出积极的选择。我们要求至少三名被测队列患者的候选要素中存在至少三个突变；可映射区域中超过50％的突变；回文DNA中少于50％的突变；不到50％的突变归因于APOBEC活性。对于淋巴样肿瘤和皮肤黑色素瘤，我们要求分别<35％和<50％的突变分别归因于AID和紫外光突变特征。后过滤后重新计算FDR。
我们应用了单独的分析来检测循环结构变异断点和循环并置。对于每个分析，我们首先对断点进行分箱，每个箱每个样本仅接受一个断点。然后，我们确定哪些垃圾箱的断点数量比偶然预期的要多（SRB分析），以及哪些垃圾箱对（或“瓦片”）的连接比偶然的预期（SRJ分析）要多。
我们基于考虑基因组协变量的Gamma-Poisson模型15计算了每个仓位的断点背景率，该断点数由每个仓位中具有足够可映射性以适合断点检测的碱基数标准化后的值，并且考虑了观察到的断点计数的过度分散，可能反映了未解释的协变量（补充方法）。我们使用Benjamini-Hochberg程序63校正了以下情况：我们使用Gamma-Poisson模型计算每个单元格的P值（即，每个单元格仅凭偶然机会表现出观察到的断点数量（或更大）的概率）。多重假设。
我们根据断点的平均复制时间对每个复发断点基因座进行了评分，并将得分> 0.5的那些基因座筛选为可能的脆弱位点65。
我们开发了一个背景模型来指示两个基因座连接的可能性，同时考虑到每个位点经历DNA断裂的观察速率（来自断裂点分析），它们之间的距离以及这些重排反映断裂的可能性。接下来是入侵，然后是两次休息。我们使用二项式检验确定了每个图块包含观察到的重排数目的概率，然后使用Benjamini-Hochberg程序63控制了多个假设检验。
基因表达数据由PCAWG Transcriptome Core Group 66提供，并且也使用相同的方法生成了一组扩展的非编码转录本（补充方法）。
除了突变或结构变异与表达之间的关联外，我们还使用GISTIC2算法67寻找了拷贝数改变重复的信号。我们还使用Fisher精确检验测试了候选驱动程序在突变样本中是否表现出明显更高的杂合丢失频率。我们使用以前的出版物68中的倍性和肿瘤纯度预测来计算癌症等位基因分数。
对于每个基因，我们计算了长度为2到5 bp的插入缺失在插入缺失总数中所占的比例。使用二项式检验将该比例与基因组背景比例进行比较。我们还比较了每个基因的插入缺失率（不区分长度）与背景。两组P值均使用FDR方法进行了校正。
我们估计我们的力量来发现人口在特定频率突变的传动元件如前所述3，16，但求解的最低频率在患者群体通电用于发现驱动元件（≥90％）。最低频率的计算考虑了（i）每个队列元素组合的平均背景突变频率；（ii）每种元素类型和患者队列大小的中位长度和平均检测灵敏度；（iii）总体期望的假阳性率为10％。元素长度的影响在补充说明10中讨论 ，详细信息在补充方法中提供 。除了将二维基因组融合图分为100×100-kb瓦片（补充方法）外，类似地执行用于检测并发并置的功效计算。我们首先根据断点之间的距离（扩展数据，图10a）进行此分析，然后根据每个样本的重排中位数进行此分析，所覆盖的值超过15个样本的组织学表示（图4b）。
使用保守的19,082个推定的过客基因清单作为背景，并使用NBR来估计整个癌症基因预期的背景突变率，并将其作为协变量，包括局部突变率，基因表达和平均拷贝数状态。结果模型预测了偶然出现的旅客SNV和插入/缺失的数量。通过汇总来自CGC 69（CGC v.80）的603个已知癌症基因的预期数量（补充表7），我们比较了观察到的和预期的突变数量。在此分析中，我们排除了检测灵敏度低的样品（补充方法）。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
与本文相关的数据可从https://dcc.icgc.org/releases/PCAWG/drivers获得。SRB和SRJ可在www.svscape.org上找到。补充表20提供了用于分析的数据文件列表。ICGC和TCGA PCAWG联盟生成的体细胞和种系变异调用，突变签名，亚克隆重建，转录本丰度，剪接调用和其他核心数据在随附的第5条中进行了描述，可以从https：//dcc.icgc下载.org / releases / PCAWG。有关访问数据（包括原始读取文件）的其他信息，请访问https://docs.icgc.org/pcawg/data/。根据ICGC和TCGA项目的数据访问政策，大多数分子，临床和标本数据处于开放层，不需要访问批准。为了访问可能识别参与者的信息，例如种系等位基因和潜在的测序数据，研究人员将需要通过dbGaP向https://dbgap.ncbi.nlm.nih.gov/aa/wga申请TCGA数据访问委员会。.cgi？page = login）以访问数据集的TCGA部分，并访问ICGC数据访问合规办公室（http://icgc.org/daco）以访问数据集的ICGC部分。此外，要访问源自TCGA供体的体细胞单核苷酸变体，研究人员还需要获得dbGaP授权。
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