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瓜氨酸化LL-37的研究:在人气道中的检测,抗菌作用和生物物理特性

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发表时间:2020-02-11 15:45作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

瓜氨酸化LL-37的研究:在人气道中的检测,抗菌作用和生物物理特性

摘要

抗菌肽LL-37的精氨酸残基可以被肽基精氨酸去亚氨酶瓜氨酸化,从而减少该肽的正电荷。值得注意的是,尚未在人类样品中检测到瓜氨酸化的LL-37。此外,瓜氨酸化的LL-37的功能和生物物理特性尚未得到充分研究。这项研究的目的是检测人支气管肺泡灌洗液中的瓜氨酸化LL-37,并确定瓜氨酸化LL-37的抗菌和生物物理特性。支气管内暴露于脂多糖后,从健康的人类志愿者获得BAL液。合成肽用于细菌杀灭测定,透射电子显微镜,等温滴定量热法,质谱和圆二色性。使用靶向蛋白质组学,我们能够检测BAL液中的天然和瓜氨酸化的LL-37。瓜氨酸肽没有杀死大肠杆菌也不会裂解人的红细胞。两种肽都具有相似的α-螺旋二级结构,但瓜氨酸化的LL-37在较高温度下更稳定,如圆二色性所示。总之,瓜氨酸化的LL-37存在于人的气道中,瓜氨酸化会破坏细菌的杀灭力,这表明净正电荷对于抗菌和膜裂解作用很重要。瓜氨酸化可能通过改变关键功能而充当AMP功能的稳态调节器。

介绍

抗菌肽和蛋白质(AMP)是先天免疫的重要组成部分,具有针对细菌,真菌和病毒的广谱抗菌活性1AMPs由上皮细胞和吞噬细胞主动产生和分泌,并有助于清除病原微生物的粘膜表面并消除细胞内病原体2此外,由于AMP具有免疫调节活性,例如起信号分子的作用,并具有将嗜中性粒细胞和巨噬细胞募集到感染部位的能力,因此它们也被称为宿主防御肽(HPD)。的HDP取决于上下文同时显示亲和抗炎活性34

在目前研究的所有哺乳动物中都检测到了AMP的cathelicidin家族。cathelicidin家族的AMPs具有保守的N末端cathelin域和可变的C末端域,它们在蛋白水解后构成了活性抗菌肽5直到日期,LL-37是在人类中的唯一的导管素已经鉴定并且它具有对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗微生物活性678LL-37是一种阳离子和两亲性肽,由37个氨基酸组成(表   1),它与细菌带负电荷的膜结合,导致细菌膜完整性受到破坏,进而导致细菌死亡910在由大单层磷脂囊泡(LUVs)组成的模型膜系统中,发现LL-37引起带负电荷的囊泡的膜渗漏,但不引起两性离子囊泡 11的渗漏此外,LL-37具有免疫调节特性,如脂多糖的中和(LPS) -诱导的巨噬细胞活化,细胞趋化活性朝免疫细胞 1213和自体吞噬的活化 14

表1本研究中使用的合成LL-37肽的序列及其理化特性。

值得注意的是,在炎症条件下,钙依赖性肽基精氨酸脱亚氨酶(PADs)在与人cathelicidin LL-37 15相同的位置表达这些酶催化瓜氨酸化,翻译后修饰(PTM),其中带正电荷的精氨酸残基转化为瓜氨酸,从而减少了目标蛋白质或肽12的电荷在人类中,有五种同型的PAD(PAD1、2、3、4和6),它们的组织分布不同16PAD2和PAD4均在嗜中性粒细胞中表达,其中PAD2位于细胞质中,而PAD4主要位于细胞核中17PAD4通过瓜氨酸化带正电荷的组蛋白,参与嗜中性粒细胞胞外捕获(NETs)和NETosis的形成,从而导致染色质的缩聚18重要的是,在体外研究已经表明,重组PAD2和PAD4导致不同程度的瓜氨酸化的精氨酸残基在LL-37,这导致其LPS中和活性的降低的总肽充电和废除1519

考虑到PAD酶的广泛特异性及其在肺部炎症过程中的共表达,有理由建议LL-37可以作为肺中PAD活性的底物。但是,尚未在人肺样品中检测到瓜氨酸化的LL-37,而瓜氨酸化的LL-37的推定作用仍然不清楚。因此,我们假设瓜氨酸化可能发生在人的肺部,并且该PTM改变了LL-37的微生物学和生物物理功能。因此,我们设计了一系列实验,通过将靶向蛋白分析应用于从健康人类志愿者中支气管内暴露于LPS后的人支气管肺泡灌洗(BAL)液中,以验证这一假设,目的是鉴定瓜氨酸化的LL-37 。此外,

结果

支气管内暴露于LPS后健康志愿者的BAL液中存在瓜氨酸化的LL-37

鉴于本地LL-37和PAD4在人的肺部炎症过程中高度表达1520,我们设置了识别这些条件下,LL-37的瓜氨酸的变体。我们利用健康志愿者(n = 10)从支气管内暴露于LPS的无细胞BAL液样本中收集并使用反相色谱将其分离成62个馏分(F1-F62)(图   1A)。为了筛选LL-37肽的变体,利用单克隆抗LL-37抗体或针对LL-37 Cit5的多克隆血清对组分进行斑点印迹分析(图   1B)。在馏分F26 – F30中检测到与天然LL-37相对应的信号。值得注意的是,筛选还显示了在级分F22-F24和F28-F30中对应于LL-37 Cit5的信号为了验证这些发现并排除交叉反应性,使用目标LC-MS / MS方法进一步处理了馏分F22-F31。首先,通过ESI-MS-PRM对合成的LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5进行了分析,以研究其电离和碎片化特性。基于这些观察结果,选择了一组15个具有高电荷态的独特碎片离子来监测更长的碎片离子(表   2)。碎片离子组用于鉴定瓜氨酸化的LL-37肽的天然和不同变体(图   1C)。结果表明在馏分F26-F29中可以清楚地检测到天然LL-37,而在相同馏分中则检测到LL-37 Cit3和LL-37 Cit5在级分F22-F24中也发现了与天然LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5相对应的碎片离子,但强度低得多(图1C中的星号   ,表   S1)。因此,基于MS分析,在从暴露于LPS的健康志愿者那里获得的无细胞BAL液中检测到LL-37肽的天然和瓜氨酸化形式。

图1
图1

Identification of citrullinated LL-37 in BAL fluid from healthy volunteers exposed to LPS in the lungs. Healthy human volunteers were exposed to LPS and after 24 h, BAL fluid samples were collected. (A) Reversed-phase chromatography of 0.5 mg peptide/protein extract from the BAL fluid samples. Absorbance at 214 nm is indicated on the left Y-axis and concentration of acetonitrile (ACN) on the right Y-axis. The blue shaded area indicates fractions F22 to F31. (B) Dot blot detection of native and citrullinated LL-37 in the fractions of the BAL fluid extract using a monoclonal antibody against native LL-37 and a polyclonal serum raised against LL-37Cit5. (C)使用LC-ESI-MS-PRM方法分析BAL液提取物的馏分(F22-F31)。在具有不同强度的每种肽的级分(F22-F31)中清楚地检测到了天然LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5特有的内源碎片离子(表   2)。星号(*)表示以非常低的强度检测对应于天然LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5的碎片离子(请参见表   S1)。

表2通过LC-ESI-MS-PRM方法分析的15种天然和瓜氨酸化LL-37肽的最强片段离子。

瓜氨酸消除了LL-37的抗微生物和膜干扰作用

知道人类BAL液21中存在天然LL-37 ,我们确定了瓜氨酸化对细菌杀灭的影响。如所期望的,合成的天然LL-37(表   1)显示出对大肠杆菌的有效抗菌活性,并且以剂量依赖性方式降低了菌落计数单位(CFU)水平。相反,完全瓜氨酸化的肽LL-37 Cit5缺乏抗菌活性(图   2A)。值得注意的是,一个精氨酸残基的瓜氨酸化足以消除40μM时的抗菌活性,但是在浓度增加(80μM)时,具有一个单一瓜氨酸化的肽会使细菌的生长减少3 log个单位(图   2B)。)。在本研究的以下实验中,除非另有说明,否则我们将天然肽与完全瓜氨酸化的肽(LL-37 Cit5)进行了比较。接下来,使用检测核酸的通透性标记物sytox green测试了肽诱导膜泄漏的能力。大肠杆菌中,天然LL-37以剂量依赖性方式引起膜通透性,从2.5μM到80μM。相反,在2.5–10μM的浓度下,瓜氨酸化的LL-37不会引起泄漏,而在20–80μM的浓度下,则观察到轻微的渗透性(图   2C)。为了可视化天然和瓜氨酸化的LL-37肽如何与大肠杆菌相互作用,进行了透射电子显微镜(TEM)研究(图。 2D)。总体而言,未经处理的细菌在细胞质中具有完整的膜以及DNA和核糖体的均匀胞内分布(分别为亮区和暗区)。30分钟后,与未处理细菌相比,暴露于50μM天然LL-37会导致膜小泡释放并引起细胞内变化,例如DNA聚集和核糖体缩合。处理2小时后,观察到明显的DNA分离进入细胞中心,而核糖体簇变得更密集并指向内膜。在200μM的肽浓度下,天然LL-37损害了膜的完整性,并增加了核糖体的聚集和细胞裂解。相反,用50μMLL -37 Cit5处理在30分钟和2小时内,没有导致任何形态变化。仅在高浓度(200μM)的LL-37 Cit5中,在某些细菌中观察到一些核糖体簇,表明细胞受到压力(图   2D)。为了评估LL-37 Cit5结合完整细菌表面的能力,将荧光标记的肽与大肠杆菌一起孵育1小时。5-FAM-LL-37相比,若丹明-B-LL-37 Cit5无法与大肠杆菌相互作用,这也导致了细胞破裂和细胞碎片的释放,如在共聚焦显微镜图像合并图中所看到的(图   2E))。为了研究瓜氨酸化LL-37对真核细胞膜的影响,使用人红细胞测定了瓜氨酸化LL-37的溶血活性。天然LL-37在20μM时会溶血约8%的红细胞,而瓜氨酸化的LL-37不会引起任何溶血(图   S1)。

图2
图2

天然和瓜氨酸化的LL-37的抗菌和破坏膜性能。(A)将 大肠杆菌 ATCC 29522(5×10 7 CFU / ml)与不同浓度的天然LL-37和完全瓜氨酸化的LL-37肽或(B)部分瓜氨酸化的肽在37°C 共同孵育3小时然后通过CFU确定杀菌活性(3个独立实验的数据代表)。(C)将 大肠杆菌(5×10 7 CFU / ml)与天然LL-37或LL-37 Cit5(0–80 µM)混合,然后通过Sytox Green核酸染色分析内膜通透性(代表3个独立实验的数据)。(D)未经处理或用天然LL-37或LL-37 Cit5(50和200 µM)处理0.5小时或2小时的大肠杆菌的5×10 8 CFU / mL的透射电镜图像比例尺,500 nm。(E)在LB 中将 10 6 CFU / mL的大肠杆菌与荧光标记的LL-37或LL-37 Cit5在40 µM下混合1小时(数据代表2个独立实验)。误差线显示SEM。统计显着性通过双向ANOVA评价(A)或多个t-检验():对-通过分表示的值; (<0.05 *,<0.01 **,<0.001 ***,<0.0001 ****)。

天然LL-37和LL-37Cit5表现出不同的LPS结合特性

由于细菌膜的完整性明显受天然LL-37的影响,而不受LL-37 Cit5的影响,因此我们检查了这些肽与LPS之间相互作用的内在差异是否可以解释这种作用。为了表征LL-37和LL-37 Cit5与LPS 的体外结合,在0.1%TFA中进行了ITC。将LL-37或LL-37 Cit5滴定到LPS溶液中,表明LPS与天然LL-37(图3A)和LL-37 Cit5(图   3B之间都有清晰的结合 )。对热成像图的进一步分析表明,结合由多个步骤组成,在相对较低的肽浓度下发生初始结合事件,然后在较高的肽浓度下发生第二次结合事件(下图)。结合曲线分析表明,两种肽在第一次和第二次结合过程中均表现出相似的亲和力,但是,第二次结合事件显示的LL-37 Cit5的化学计量比天然LL-37(n = 0.5)高0.2)。结合能的分析表明,与LL-37 Cit5相比,天然LL-37的结合更受焓驱动,提示天然LL-37上带电残基起这种结合作用。此外,与第二次结合事件相比,第一次结合事件对天然LL-37和LL-37 Cit5均表现出更高的焓,这表明低浓度下的初始结合涉及与LPS胶束表面上带电残基的相互作用,而第二次结合事件最可能涉及与LPS疏水性内部脂质的相互作用增加(表   3)。

图3
图3

天然和瓜氨酸化的LL-37与LPS的相互作用。通过将天然LL-37(A)或LL-37 Cit5B滴定到LPS-O111:B4溶液中对ITC实验进行分析每300秒,将2 µL肽的0.1%TFA溶液(200 µM)滴定到164 µL LPS溶液(62.5 µM)中。测量热速率(上图)和归一化积分热量对LPS和肽之间的摩尔比(下图)。拟合两个独立实验的数据以计算解离常数(K d)。拟合参数的值在表3中显示  

表3由ITC测定的天然或瓜氨酸化LL-37与LPS之间相互作用的结合亲和力,焓变和熵变。

瓜氨酸化的LL-37对阴离子磷脂的结合亲和力降低

接下来,我们评估了瓜氨酸化对LL-37的结构和膜结合特性的影响。使用天然质谱,我们研究了瓜氨酸化是否会影响LL-37与常见细菌膜脂质结合的能力(图   4)。简而言之,将同时包含LL-37和LL-37 Cit5的溶液与包含POPE,POPC或POPG的两性离子胶束混合,并进行MS分析。使用温和的电离条件,可以通过质谱检测溶液中形成的肽-脂质复合物,这使我们能够直接确定LL-37和LL-37 Cit5的脂质结合和无脂质肽的比例(图   4A)。)。我们观察到,两种肽都容易在相同程度上结合两性离子去污剂以及两性离子脂质POPE和POPC。然而,瓜氨酸化肽与天然LL-37相比,带负电荷的POPG产生的复合物更少(图   4B)。为了更好地了解脂质结合能力差异的起源,我们分析了天然LL-37和两种瓜氨酸化形式(部分瓜氨酸化LL-37 Cit3和完全瓜氨酸化LL-37 Cit5)在生理(pH 7.5)和酸性(pH 4.5)条件下使用质谱进行分析。在生理pH下,所有三种肽均显示相同的平均电荷。然而,在酸性pH下,未修饰的肽获得明显更高的电荷数量,而瓜氨酸化形式保持相同的低电荷状态(图   4C)。总之,我们的数据表明通过精氨酸瓜氨酸化降低肽的净电荷会干扰其与带负电荷的磷脂头基相互作用的能力。

图4
图4

分析脂质与天然和瓜氨酸化的LL-37的结合。A)研究脂质与肽结合的实验设计的示意图。将由一种磷脂(POPC,POPE,POPG)和去污剂LDAO组成的胶束与天然和瓜氨酸化的LL-37混合。(B)从微团释放的LL-37和LL-37 Cit5之间的结合能力的比较,显示了游离肽和与磷脂结合的肽。C)在生理(绿色圆圈)和酸性(黄色圆圈)pH下肽的平均电荷对具有相等方差的配对样本执行了学生t检验(数据代表3个独立实验)。-以星号表示的值;(<0.05 *,<0.01 **,<0.001 ***,<0.0001 ****)。

与天然LL-37相比,瓜氨酸化LL-37显示出更高的热稳定性

为了进一步了解LL-37和LL-37 Cit5的折叠,二级结构和热稳定性,使用了CD光谱法。CD谱在25℃下记录在单独的Milli-Q水,无任何缓冲器,用于两种肽在协议揭示LL-37的主要无规卷曲光谱与以前的研究结果1011和一个α螺旋频谱LL-37 Cit5与在195 nm处有一个最大值,在222和208 nm处有两个最小值,这是α螺旋二级结构的特征(图   5A22在25°C下添加10 mM PBS pH 7.4的缓冲液后,天然LL-37和LL-37 Cit5在三个不同浓度(15、50和100μM)下,α-螺旋二级结构(图   5B和表   S2)与早期研究10一致在10 mM pH 7.4的缓冲液中于95°C时,两种肽均展开为随机螺旋结构,并在冷却至25°C后能够在缓冲液中重新折回到原始的α螺旋结构(图   5B)。熔融温度(T m)是通过记录在25到95°C,pH 7.4下在222 nm处的单个波长下的强度来估算的。对于100μMLL-37,T m估计约为69°C。较低浓度的LL-37(15μM和50μM)分别将熔融温度降低至47°C和55°C(图   5C),反映了寡聚肽聚集体9的浓度依赖性形成100μMLL -37 Cit5的熔化温度通常比天然LL-37高,熔点为73°C(图   5D),而LL-37 Cit5的浓度较低15μM和50μM)。分别降低至54°C和67°C,这再次表明存在寡聚肽形式。在4.6的低pH下观察到类似的α-螺旋二级结构和热稳定性的结果(图   S2)。一般而言,我们观察到较高的肽浓度会导致较高的解链温度。此外,瓜氨酸化提高了LL-37在pH 7.4下的热稳定性。总体而言,这些结果表明,失去5个正电荷的LL-37 Cit5在其螺旋构型中温度稳定性更高,这可能是由于肽内和肽间疏水相互作用增强的结果。

图5
图5

通过圆二色谱法分析不同条件下LL-37和LL-37 Cit5的构象变化(A)仅在无缓冲液作用的水中记录50 µM LL-37和50 µM LL-37 Cit5肽的CD光谱在这些条件下,与LL-37 Cit5相反,天然LL-37显示出无规卷曲结构当添加缓冲液(10 mM,pH 7.4)时,天然LL-37立即形成α-螺旋二级结构。B在10 mM PBS缓冲液(pH 7.4)中记录了100 µM LL-37和100 µM LL-37 Cit5肽的CD光谱B中的数据点带有灰色阴影区域)由于缓冲液的高吸光度而不可靠。将7点的平滑函数应用于光谱。天然LL-37(C)和LL-37 Cit5D的温度熔解曲线的一阶导数在25–95°C的222 nm处的一个单一波长下记录了肽的热解链图,以追踪在PBS和磷酸钠缓冲液中pH 7.4时展开的温度依赖性。熔解曲线的一阶导数的最大值对应于信号熔解曲线的中点,并且被解释为熔解温度(T m)。

带负电荷的LUV增加了瓜氨酸化LL-37的螺旋含量

制备具有不同脂质组成的大单层囊泡(LUV),模拟原核膜,以研究模型膜对天然和瓜氨酸化LL-37肽二级结构的影响。LL-37和LL-37 Cit5的二级结构由有无LUV的CD确定。α-螺旋含量由222nm处的信号强度确定。在两性离子POPC LUV的存在下,肽的CD光谱显示LL-37的α-螺旋含量从34%降至31%(图   6A)和LL-37 Cit5的从37%降至36%略有下降。(图   6B),但θ 222208比例没有变化。脂质体的负电荷增加至30%(POPC / POPG,7:3)不会改变天然LL-37的α-螺旋含量(图   6A),而对于LL-37 Cit5,α-螺旋含量从36%略增至41%(图   6B)。然而,θ之间的比例222208为天然LL-37增加了30%的脂质体。当脂质体的负电荷增加到70%(POPC / POPG,3:7)时,两种肽的α-螺旋含量都增加了,从LL-37的36%增加到38%(图   6A),从40对于LL-37 Cit5(图   6B为%至45%同样,θ 222208本地LL-37的比例增加。总体上,我们观察到带负电荷的脂质体的存在对α-螺旋含量的影响较小,尽管瓜氨酸化LL-37的螺旋含量比天然肽的升高程度更高。革兰氏阴性菌的外部小叶主要由LPS组成,因此,我们研究了在LPS分子存在下这两种肽的二级结构。两种肽均通过增加LPS浓度而显示出螺旋度的轻微增加(图   6C,D)。然而,在LL-37上滴定LPS改变了主要的一种典型的α-螺旋最小值(208 nm)的强度,而在LL-37 Cit5上滴定LPS 并没有引起208 nm下最小值的任何实质性变化。一般而言θ的变化222208比建议在α螺旋结构的微小变化,有时通过所谓的螺旋超螺旋引起23从理论上讲,这可能意味着LL-37肽会在LPS表面发生聚集,而LL-37 Cit5不会。在最后的滴定步骤之后,将两种肽在存在LPS的情况下随时间孵育。LL-37 Cit5肽在孵育时间内是稳定的,而天然LL-37肽的光谱显示在208 nm处信号强度的增加很小(图   S3)。

图6
图6

圆二色谱法分析LUV和LPS 中LL-37和LL-37 Cit5的构象变化在室温下,在不存在或存在1 mM LUV的情况下,在10 mM磷酸钾缓冲液pH 7.4中记录50 µM LL-37 (A)和50 µM LL-37 Cit5 (B)的 CD光谱LUV由POPC:POPG(10:0),POPC:POPG(7:3)或POPC:POPG(3:7)组成。用CD光谱仪在25°C的10 mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中,在50 µM LL-37 (C)和50 µM LL-37 Cit5 (D)上滴定LPS 对所有光谱应用3点的平滑功能。

讨论区

在这里我们可以证明瓜氨酸化的LL-37确实存在于人的气道中。这已被假定在以前的工作,但没有正式证实1524为了检测瓜氨酸LL-37,我们利用无细胞BAL帧内支气管暴露于LPS之后从健康人类志愿者获得流体2125我们发现,暴露于LPS的肺中的BAL液含有低水平但清晰可检测的瓜氨酸化LL-37,这可通过使用针对LL-37 Cit5的内部多克隆血清来证明与灵敏的目标LC-MS / MS分析相结合进行验证。尽管LL-37的片段化模式相当复杂,但我们能够区分BAL流体馏分中的两种瓜氨酸化形式的LL-37(LL-37 Cit3和LL-37 Cit5)。重要的是要注意,斑点印迹分析和LC-MS / MS分析都不能被认为是完全定量的,而应该用来确定样品中肽的存在与否。因此,我们的数据提供了第一个概念验证研究,其中直接在生物样品中检测到真正的瓜氨酸化形式的LL-37肽。但是,应该指出的是,针对LL-37 Cit5的多克隆抗血清对LL-37 Cit3具有交叉反应性(数据未显示)。因此,不能排除最初的筛选揭示了瓜氨酸化LL-37的其他形式,由于分析的限制,我们无法用LC-MS / MS分析来区分。实际上,以前的论文表明,LL-37的几种蛋白水解变体存在于人类表皮中26结合瓜氨酸化增加LL-37的蛋白水解裂解的知识,我们也检测到瓜氨酸化LL-37 15的几种变体并不奇怪

天然LL-37对多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌12表现出抗菌活性但是,对瓜氨酸化LL-37的研究是有限的。先前的研究表明LL-37 Cit5对革兰氏阳性细菌肺炎链球菌金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的非典型流感嗜血杆菌显示出弱的抗菌活性此外,LL-37 Cit5表现出对铜绿假单胞菌的杀灭作用,但与天然LL-37 15相比,其作用略低在这里,我们发现在多个精氨酸残基上瓜氨酸化LL-37严重损害了对大肠杆菌的抗菌活性甚至在浓度较高的情况下也能阻止细菌内膜的通透性(图   2)。另外,我们发现,使用共聚焦显微镜,与天然的LL-37相比,荧光标记的LL-37 Cit5表现出与大肠杆菌结合的强烈降低(图   2)。在这项研究中,我们还表明LL-37 Cit5甚至不会引起人红细胞裂解,甚至高达20μM(图   S1)。)。这表明天然肽中的正电荷对于抗菌活性至关重要。一般来说,AMP的细胞裂解活性的机理,主要是由于其结合到细胞表面,并以透导致细胞内容物的泄漏的膜,从而导致细胞死亡的能力1127通过一系列的生化和生物物理实验,我们试图剖析天然和瓜氨酸化的LL-37之间的差异。

首先,考虑到LL-37和细菌膜之间的初始相互作用被认为是静电相互作用,我们研究了瓜氨酸化LL-37与LPS(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)之间的相互作用。尽管瓜氨酸化减少了肽的净正电荷,但我们的ITC分析表明,天然和瓜氨酸化肽对LPS的结合亲和力相似。但是,LL-37 Cit5和LPS 之间的相互作用略微转变为较少的焓驱动结合以及较高的化学计量,这表明LL-37 Cit5的结合与天然LL-37和LPS之间的相互作用相比,LPS的本质上具有更大的疏水性并发生了变化。然而,这些结果与使用斑点印迹和共聚焦于活的完整细菌的结合研究不一致,这与大肠杆菌的杀死一致来自ITC实验的LPS结合数据可以通过LPS胶束与实际细菌膜不同的事实来解释。另一个解释可能是LPS的区域-可能是疏水区域,例如脂质A-可能会暴露于肽段,但不会附着在细菌膜上。因此,与LPS的结合似乎不足以杀死细菌,因为该肽需要向内膜移动才能引起透化作用。因此,我们的数据表明LL-37由于净电荷的丢失,Cit5可能无法杀死大肠杆菌,从而阻止了肽在细菌外膜上的积累。但是,应注意,还有其他生物物理参数可能会影响肽对细菌的活性,例如疏水性,两亲性,低聚物形成以及靶膜的组成,这为肽-膜相互作用增加了另一层复杂性。

值得注意的是,其他研究表明瓜氨酸可改变LL-37的免疫调节活性,因为其中和巨噬细胞中和LPS诱导的促炎细胞因子的能力降低了15据推测,这种活动减少是因为LL-37 Cit5不佳脂多糖结合,由于其净电荷的损失,但直接LPS结合的形式证明未提供1519因此,LL-37 Cit5可能主要通过疏水相互作用结合LPS,并且由于失去净电荷而仍然缺乏抗菌活性。在未来的研究中,研究LL-37 Cit5的结合位置可能会很有趣将LPS与天然LL-37进行比较,以进一步了解LL-37 Cit5大肠杆菌杀伤的抑制作用

接下来,我们检查了LL-37 Cit5与细菌磷脂(细菌膜的另一个重要组成部分)的相互作用利用质谱技术,与天然LL-37相比,我们发现LL-37 Cit5与细菌膜的带负电荷的磷脂的结合程度更低(如被POPG模仿)。CD对LL-37 Cit5的 CD分析表明,它在7.4的生理pH和4.6的较低pH均采用典型的α-螺旋结构,这表明单独的电荷对于α-螺旋二级结构不是必需的。值得注意的是,天然LL-37需要螺旋折叠才能具有抗菌活性10,但是,LL-37 Cit5形成的螺旋不足以保留对大肠杆菌

革兰氏阴性细菌的外膜小叶主要由LPS组成,乳白细胞质膜由POPE制成,在较小程度上由POPG制成,这有助于细菌膜28的负净电荷以前的数据表明,LL-37与细菌仿膜相互作用并采用螺旋二级结构911152930与这些结果一致,我们发现LL-37 Cit5以与肽的天然形式相似的方式与膜模型相互作用。综合来看,我们的结果清楚地表明LL-37 Cit5大肠杆菌的活性不足,这很可能是由于净费用减少所致。然而,尽管电荷减少,我们仍然观察到LL-37 Cit5能够结合LPS和细菌模仿磷脂。这个有点出乎意料的发现与瓜氨酸化肽的疏水性增加是一致的。

总之,我们在支气管内暴露于LPS后,在健康志愿者的呼吸道中发现了LL-37的瓜氨酸化变体。实际上,这是首次在人类生物样品中发现瓜氨酸化的LL-37。瓜氨酸化LL-37严重削弱了其对大肠杆菌的抗菌活性,最有可能是由于净费用减少了。然而,瓜氨酸化的肽形成典型的α-螺旋结构并以类似于天然LL-37的方式结合LPS和细菌模拟膜,这可能是由于疏水相互作用。瓜氨酸化在人类呼吸道中可能起什么作用?一方面是考虑组蛋白的瓜氨酸化,这是基因转录的关键过程,但对于NETosis来说也是必不可少的,NETosis是抵抗细菌18的重要宿主防御机制

先前的报道表明,LL-37可能在调节自身免疫性疾病(如牛皮癣,系统性红斑狼疮和关节炎)中的炎症中起作用31LL-37的瓜氨酸化已显示出增加了对白细胞的趋化活性,而其中和LPS诱导的巨噬细胞活化的能力被抑制。此外,瓜氨酸抑制了LL-37对通过TLR2和TLR3 19调控信号转导的抗炎作用此外,瓜氨酸化会降低LL-37与DNA形成复合物的能力,进而影响细菌DNA激活树突状细胞和巨噬细胞的能力24有趣的是,已经在银屑病关节炎患者的滑液和血浆中发现了针对天然和瓜氨酸化的LL-37的自身抗体,这表明LL-37在这种疾病中起自身抗原的作用32最近的一份报告显示,在早期炎症性关节炎中,循环中的LL-37与抗环瓜氨酸肽(anti-CCP)抗体相关,这表明LL-37可能与疾病的发展有关33因此,LL-37的瓜氨酸化有可能代表附带的和不想要的作用,从而大大改变该AMP的抗菌作用。另外,瓜氨酸化改变了LL-37的免疫调节功能,并且瓜氨酸化的LL-37有可能充当新抗原,从而破坏耐受性并驱动自身免疫过程。从积极的方面,可以相反地认为瓜氨酸化是“控制”基于AMP的过度反应的免疫系统的关键步骤。数据支持的假设表明,瓜氨酸化可以将LL-37变成蛋白水解酶的更好底物15总之,我们的结果可以为研究瓜氨酸化的LL-37在传染性和炎性疾病(例如肺炎,败血症,慢性阻塞性肺疾病,牛皮癣和囊性纤维化)中的作用铺平道路,也可以在正常生理学中发挥作用。

材料和方法

试剂种类

血琼脂平板,磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Luria Bertani(LB)从瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院的底物部门获得。冻干的合成LL-37,瓜氨酸化LL-37肽(表   1),5-FAM-LL-37和若丹明B-LL-37 Cit5肽购自Innovagen(瑞典隆德),并溶于0.1%三氟乙酸(TFA) ),分装并保存在−20°C直至使用。

支气管内LPS暴露和支气管肺泡灌洗液收集

无细胞BAL流体样品从11执行的临床研究的一部分,获得 2003年11月至3 2008年12月2125此样品收集构成的大项目的研究用和不用事先帧内支气管LPS暴露于LPS,从其他结果已经呈现健康人呼吸道先天免疫应答的一部分2125这项临床研究是在获得伦理委员会在瑞典哥德堡的区域伦理审查委员会的批准后根据赫尔辛基宣言进行的(Dr. 618-02、065-04和683-07)。在纳入研究之前,必须获得书面知情同意。简而言之,健康的志愿者通过支气管镜暴露于媒介物(,一只肺中的10 mL 0.9%PBS)和大肠杆菌E. coli)0113:H10(美国马里兰州罗克维尔)的LPS(4 ng / kg)),用PBS稀释,放在另一肺中。分别暴露于赋形剂和LPS后12或24小时后,分别在各自的肺中进行BAL(3×50 mL PBS,37°C)。之后如在别处所述附加的处理2125,将无细胞的BAL流体样品保存在-80°C直至进一步使用。对于当前的研究,我们仅使用了暴露于LPS的肺中的BAL样本。

从BAL液体样品中提取肽/蛋白质

将来自暴露于LPS的气道的BAL液样品收集在一起(n = 10名健康志愿者的材料,总计14 mL),通过离心(5,000 rpm,15分钟)清除碎屑,并用0.1%TFA复溶。利用OASIS 1cc反相HLB色谱柱(沃特世公司,美国马萨诸塞州米尔福德),上清液富含肽和蛋白质。OASIS色谱柱用乙腈活化,并在上清液加样之前在0.1%TFA水溶液中平衡。未结合的物质用0.1%TFA洗去,结合的物质用在0.1%TFA中的80%乙腈洗脱。将洗脱的级分在-80℃冷冻,冻干过夜,并在-20℃保存直至进一步使用。

反相液相色谱

肽/蛋白质提取物(0.5 mg)在Vydac C 8(250×4.5 mm)反相柱(HiChrom Ltd,UK)上以0.3 mL / min的流速分离。乙腈在0.1%TFA中的梯度逐渐增加(0–20%的16.6分钟,20–60%的33.2分钟和60–80%的66.2分钟)进行洗脱。在214nm和280nm处监测吸光度。收集62 mL的1 mL馏分,立即冷冻(-80°C)并冻干。

LC-MS / MS分析

合成肽(LL-37和LL-37 Cit5)溶于2%乙腈/0.1%甲酸(溶剂A)中,并分别在线连接到Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific,德国,不莱梅,Thermo Scientific,德国不来梅)上德国不来梅)。天然和瓜氨酸化的LL-37的合成肽用作确定其电离和断裂特性的参考。在装有10厘米内径75 µm的PicoTip硅胶发射器(New Objective,Woburn,2000年)的ReproSil-Pur C8、3 µm颗粒(德国Ammerbuch的Maisch博士)填充的分析柱上完成肽的色谱分离。美国马萨诸塞州)。为了分离肽段,应用乙腈浓度递增的梯度(5分钟为4–25%,5分钟为25–70%,5分钟为70–95%,95%为8分钟)。 300 nL /分钟m / z 300到1650,同时针对包含物质量列表中定义的三个前体m / z值(LL-37:m / z 749.4365 [M + 6 H] 6+; LL-37 Cit3m / z 899.7128 [M + 5 H] 5+; LL-37 Cit5m / z 900.1064 [M + 5 H] 5+)。高碰撞解离(HCD)在35%归一化碰撞能量下的质量分辨率设置为17.500(在m / z 200处),以15 m / z 1.6的宽度分离出的15个最强前体离子碎片化,目标是10 5 离子。将冻干的BAL流体馏分溶于20 µL溶剂A中,并将2 µL注入色谱柱中。在Skyline v.4.2(华盛顿大学MacCoss实验室)中对获取的数据进行了分析。

色谱部分的斑点印迹分析

对于斑点印迹分析,将冻干的色谱级分溶解在30μL0.1%TFA中,并将每个级分中的1μL分散在Hybond Super C膜上(Amersham,GE Healthcare UK Ltd.,Little Chalfont,英国)。将膜在含0.25%Tween-20的5%脱脂牛奶中封闭,然后在4°C下与任一抗LL-37的一抗小鼠单克隆抗体(1.2 mg / mL;在PBS中以1:2000的比例稀释)孵育过夜5%无脂牛奶)34或具有针对LL-37 Cit5的亲和纯化多克隆血清(Innovagen(瑞典隆德)的PBS溶液(5.4毫克/毫升1:2000稀释,含5%无脂牛奶))。随后,在洗涤步骤之后,将膜与偶联至辣根过氧化物酶的二级抗体(Sigma-Aldrich,密苏里州圣路易斯,美国,美国)一起孵育(1小时,RT)。该信号由ECL主系统(Amersham,GE Healthcare UK Ltd.)开发,并由Syngene数字成像系统(Syngene,英国剑桥)检测。使用GeneSys软件(Syngene,英国剑桥)调整免疫印迹图像。

细菌培养

大肠杆菌 ATCC 29522(大肠杆菌)是从卡罗林斯卡大学医院的临床微生物学实验室获得的。细菌在37°C摇晃(200 rpm)下于Luria Bertani(LB)肉汤中生长,达到对数中期,此后,在每次实验前,将细菌悬浮液稀释到同一生长培养基中的起始细菌接种物中。

菌落计数测定

通过进行菌落计数测定来评估LL-37和瓜氨酸化的LL-37肽(表1的抗菌活性   大肠杆菌在LB中生长至对数中期,然后稀释至5×10 7 CFU / mL。将细菌与不同的肽浓度(0至80μM)在37°C下孵育3小时。随后,将混合物连续稀释并点样(20μL)在血琼脂平板上。在37°C过夜孵育后,对存活细菌进行计数。

Sytox绿色吸收测定

为了评估内膜通透性,将5×10 7 CFU / mL活或热杀死的大肠杆菌与LL-37或LL-37 Cit5在LB中于37°C 孵育 30分钟。孵育后,将细菌在4°C下以1200×g离心10分钟,然后在PBS中洗涤。接下来,将细菌用3μMSYTOX绿色核酸染色剂(Thermo Fisher Scientific,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)重悬于PBS中,并转移到黑色96孔板中。在室温下孵育5分钟后,使用TECAN微孔板读数器测量两个波长(λex 504 nm和λem 523 nm)的荧光强度

透射电子显微镜

使大肠杆菌生长至对数期,并在LB中稀释至5×10 8 CFU / mL。为了适应电子显微镜所需的更高细菌浓度,进行了额外的菌落计数测定,以定义在该细菌浓度下LL-37的抗菌能力。LL-37的最低抑菌浓度为50μM。相反,即使在较高浓度(200μM)下,LL-37 Cit5也没有表现出任何杀灭作用。未经处理的细菌用作对照,并与LL-37或LL-37 Cit5孵育在37°C下以不同浓度(50μM或200μM)混合0.5或2 h。将混合物在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的2.5%戊二醛中于室温固定30分钟,然后在0.1 M磷酸盐缓冲液中冲洗,然后在4°C下使用0.1%磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的2%四氧化os进行后固定。 C 2小时。接下来,样品先在乙醇中脱水,然后在丙酮中脱水,最后包埋在LX-112中。使用Leica EM UC7(德国Wetzlar的Leica Microsystems GmbH)制备超薄切片,然后使用醋酸铀酰作为对比剂,然后使用雷诺兹柠檬酸铅。在Tecnai Spirit G2 Bio TWIN电子显微镜(Tecnai High-Technologies)上以100 kV检查切片,并使用2kx2k Veleta CCD相机(德国明斯特的Olympus Soft Imaging Solutions GmbH)获取图像。

共聚焦显微镜

为了进行共聚焦显微镜检查,将10 7 CFU / ml 大肠杆菌与标记的肽5-FAM-LL-37或若丹明B-LL-37 Cit5(Innovagen)在LB中于37°C孵育1小时。孵育后,细菌以5,000× g离心 保持2分钟并在PBS中洗涤两次。接下来,将细菌在室温下于2%PFA(Sigma-Aldrich)中固定30分钟。洗涤细菌并将其重悬于PBS中,然后吸移到显微镜载玻片上,风干,热固定,并安装在ProLong Gold Antifade贴壁剂(Thermo Fisher Scientific)中。使用Olympus FluoView软件在Olympus FluoView FV1000共聚焦激光扫描显微镜上进行共聚焦成像。使用ImageJ / FIJI软件(美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院)进行图像分析。

溶血测定

人体血液收集在肝素钠血液收集管(英国普利茅斯的Becton Dickinson)中。将全血在室温下以800× g离心  10分钟。丢弃血浆,并用PBS(pH 7.4)洗涤红细胞3次,然后重悬于1%(体积/体积)的PBS溶液中。在U型底板上分析红细胞,将其与不同的肽浓度(1.25–20 µM)混合,并在37°C搅拌下孵育1小时。将板以800× g离心 10分钟后,将80 µL上清液转移至透明的平底96孔板中,以使用Tecan Infinite M200微孔板读数器测量在540 nm处释放的血红蛋白的吸光度。使用阴性(无肽)作为0%裂解和阳性对照(1%Triton X-100)作为100%裂解来计算溶血百分比。

等温滴定热法

用低体积NanoITC(TA Instruments-Waters LLC,New Castle,DE,美国)进行等温滴定热法(ITC)。在50 µL注射器中装满0.1%TFA(Sigma-Aldrich)中的200 µM LL-37或200 µM LL-37 Cit5,以滴定到164 µL的62.5 µM 大肠杆菌 O111:B4 LPS(InVivoGen,圣地亚哥,加利福尼亚) (美国)中加入0.1%TFA(Sigma-Aldrich)。以300 s的间隔注射2 µL滴定液,使其逐渐增加。实验在37°C下进行。使用NanoAnalyze软件(TA Instruments-Waters LLC,美国新城堡)分析数据。

质谱

在进行MS分析之前,将天然肽和瓜氨酸化肽均在1 M pH 7.5的乙酸铵或0.1%pH 4.5的乙酸中稀释十倍。对于脂质结合实验,将肽段稀释在1 M的乙酸铵(pH 7.5)中,其中含有4 mM的十二烷基二甲基胺N-氧化物(LDAO)清洁剂,最终浓度为5 µM。简而言之,两性离子(中性电荷)1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC),1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)和带负电荷从Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama,USA)获得1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3 [磷酸-rac-(1-甘油)](POPG),每种化合物的制备浓度为800 µM。 Milli-Q水。为了进行结合研究,将每种磷脂添加到LDAO中的肽混合物中,使其最终浓度为80 µM。在配备有离线纳米电喷雾源的Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific,马萨诸塞州沃尔瑟姆)上记录质谱。使用镀金的Proxeon硼硅酸盐毛细管(Thermo Scientific,Waltham,MA)引入样品。以正电离模式记录光谱,毛细管电压为1.8 kV,源温度为80°C。使用Xcalibur软件3.0软件包(Thermo Scientific)分析数据。在Microsoft Excel中对具有相等方差的配对样本进行了学生的T检验。8 kV,源温度为80°C。使用Xcalibur软件3.0软件包(Thermo Scientific)分析数据。在Microsoft Excel中对具有相等方差的配对样本进行了学生的T检验。8 kV,源温度为80°C。使用Xcalibur软件3.0软件包(Thermo Scientific)分析数据。在Microsoft Excel中对具有相等方差的配对样本进行了学生的T检验。

圆二色性(CD)

样品制备

将合成的冻干LL-37和LL-37 Cit5肽溶解在Milli-Q水中,该肽的浓度由干粉的重量确定。在10–50 mM PBS,柠檬酸缓冲液,磷酸钠或磷酸钾缓冲液中制备进一步的稀释液,以获得用于实验的最终肽浓度。

脂质体制剂

为了模拟生理膜中磷脂的功能,使用了大的单层磷脂囊泡(LUV)。LUVs是根据先前发布的方案制备的35简而言之,将中性POPC和带负电荷的POPG混合至最终磷脂浓度为5 mM(对于30%带负电荷的LUV,使用7:3的POPC / POPG摩尔比,对于70%带负电荷的LUV,POPC / POPG 3使用:7:100,对于100%中性LUV使用POPC 10:0。在氮气流下将氯仿蒸发至少一小时。然后将脂质膜重悬于50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中并涡旋10分钟以形成多层囊泡。为了获得单层囊泡,将脂质溶液在液氮中冷冻,并以五次冷冻/解冻循环在热水中解冻,然后通过100 nm的Avanti小型挤出机(Avanti Polar Lipids,Alabaster,阿拉巴马州,美国)聚碳酸酯孔径过滤器(Avanti极性脂质,Alabaster,Alabama,美国)至少21次。将LUVs溶液进一步在pH 7.4的磷酸钾缓冲液中稀释,以获得1 mM的最终浓度。

LPS胶束制备

来自大肠杆菌 O111:B4的冻干LPS 获自Sigma Aldrich。通过将冻干的LPS溶解在Milli-Q水中制备200 µM LPS胶束的储备溶液。将储备溶液涡旋一分半钟。使用20kDa的LPS分子量通过重量确定LPS浓度。

圆二色性(CD)光谱

CD光谱和温度扫描在具有Peltier温度控制系统的Chirascan CD光谱仪(Applied Photophysics,Leatherhead,UK)上记录。使用光程为1 mm的石英比色皿。通过在静止条件下记录190-260 nm光谱范围,带宽为1 nm,步长/分辨率为0.5或1 nm,每点时间为190 nm的CD光谱来研究肽的二级结构。 0.5或4 s。减去缓冲液的背景光谱,并将数据表示为平均残余物摩尔椭圆率。每点时间为0.5 s的所有数据都使用三点或七点的平滑功能进行处理。肽的浓度(15–100 µM),pH(4.6和7.4)和温度(5–95°C)均发生变化,并跟踪肽二级结构的变化。对于膜模拟实验,在室温下在10 mM磷酸钾缓冲液pH 7.4中使用1 mM LUV。在25 mC的10 mM磷酸钠缓冲液pH 7.35中,将LPS(10–50 µM)滴定到50 µM肽溶液中。在最终的50 µM LPS滴定步骤之后,将带有肽和LPS的样品在25°C下孵育70分钟,同时每十分之一分钟记录一次光谱。减去缓冲液中每个LPS浓度的背景光谱后显示光谱。计算α-螺旋含量(式 在最终的50 µM LPS滴定步骤之后,将带有肽和LPS的样品在25°C下孵育70分钟,同时每十分之一分钟记录一次光谱。减去缓冲液中每个LPS浓度的背景光谱后显示光谱。计算α-螺旋含量(式 在最终的50 µM LPS滴定步骤之后,将带有肽和LPS的样品在25°C下孵育70分钟,同时每十分之一分钟记录一次光谱。减去缓冲液中每个LPS浓度的背景光谱后显示光谱。计算α-螺旋含量(式1)被使用36

α-HË一世C一种CØñŤËñŤ[]=θ222ñ[R一种ñdØCØ一世-θ222ñØbsË[RvËdθ222ñ[R一种ñdØCØ一世-θ222ñα-HË一世X100
(1)

其中随机线圈结构(θ222 nm,随机线圈的平均椭圆率是3.900 deg cm 2 dmol -1和α螺旋(θ222 nm,α-helix的平均椭圆率是-35.700 deg cm 2 dmol -1

在不同的肽浓度和pH下LL-37和LL-37 Cit5肽的解链,随后是在25–95°C的温度范围内随温度变化的222 nm椭圆率。由于222 nm处的典型α螺旋最小值,因此选择了一个单一波长222 nm。椭圆率的测量步长为1°C,速率为5°C min -1或0.3°C min -1222 nm处的椭圆率变化可用于计算展开的热力学参数。通过数据点的S形曲线拟合(公式2确定每种条件   的熔化温度T m第t 从曲线的一阶导数计算出值,其中最大值对应于温度扫描中点(T m)。

FŤ=一种+-一种1个+经验值[Ť-Ťw]
(2)

其中,A是熔解曲线的幅度,B是基线,T m是熔解温度的中点,w是曲线的斜率。

统计分析

将CFU计数数据进行对数转换,并进行不成对的多重T检验。数据表示为平均值±SEM。一个p的≤0.05 -值被认为是统计上显著。使用GraphPad Prism 7.0e版(GraphPad,拉荷亚,CA)进行统计分析。



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