claudin低型乳腺癌亚型由基因表达特征定义，涵盖了范围广泛的乳腺癌。在这里，我们调查克劳丁低乳腺肿瘤的基因组，转录组学和临床特征。我们显示claudin-low不仅像先前描述的那样类似于内在亚型（基底样，富含HER2的，管腔A，管腔B和正常样）的亚型，而且还可能是复杂的其他表型，可能会渗入乳腺肿瘤各种内在亚型。克劳丁低肿瘤的特点是基因组不稳定性低，突变负担和增殖水平高，免疫和基质细胞浸润水平高。在其他方面，低claudin的肿瘤反映了其固有亚型的特征。最后，我们探索了另一种鉴定低克劳定蛋白的方法，从而揭示了已建立的克劳定蛋白低分类器的潜在弱点。总之，这些发现阐明了克劳丁低乳腺肿瘤的异质性，并证实了克劳丁低乳腺作为癌症表型的重新定义。
五个乳腺癌固有亚型最初鉴定的基因在不同的乳腺肿瘤比配对的肿瘤样品之间表达显著更大的变化的分级聚类前和化疗后1，2。在此分析中，克劳丁低度乳腺肿瘤并未独立出现。克劳丁低乳腺癌亚型是在7年后的人类和鼠类乳腺肿瘤3的综合分析中发现的。这种亚型的存在后来被几个独立的乳腺癌队列观察到的4，5，6，7，8，9和类似的蛋白-低亚型已经在膀胱癌中鉴定10，11。
claudin-low乳腺癌亚型由基因表达特征定义，最突出的是：细胞-细胞粘附基因的低表达，上皮-间质转化（EMT）基因的高表达以及干细胞样/分化程度较低的基因表达模式12。除了这些基因表达特征，蛋白-低的肿瘤具有显着的免疫和基质细胞浸润9，12，但在其它许多方面显着异质性。没有特定的基因组畸变能准确地描述克劳丁低肿瘤，并且突变负担和拷贝数畸变程度（CNA）的变异要比其他乳腺癌亚型更大13。然而密蛋白-低肿瘤，往往基因组稳定，这可能是由于它们的分化程度较低的状态和保护作用由EMT相关的转录因子介导的ZEB1 14，15。克劳丁低乳腺肿瘤据报道主要是雌激素受体（ER）阴性，孕激素受体（PR）阴性和人表皮生长因子受体2（HER2）阴性（三联阴性），并且与不良预后相关12，16。的蛋白-低乳腺癌显示引人注目的变化，范围从1.5％至在乳腺癌队列肿瘤的14％的患病率5，7，8，12。
描述了一种识别克劳丁低肿瘤的算法（预测因子），其原始特征为亚型12。简而言之，通过对52个细胞系中的1906个乳腺癌内在基因17的基因表达值进行层次聚类，鉴定出9个claudin低细胞系。细胞系用于构建claudin低预测因子，而不是大量肿瘤样品，以最大程度地减少免疫和基质浸润作为混杂因素12。然后定义了两个质心：一个用于具有claudin低基因表达特征的细胞系，另一个用于所有其他乳腺癌细胞系。通过将肿瘤的基因表达值与这两个质心相关联，并将肿瘤的基因表达值与其他质心的相关性更强，可以将克劳丁低肿瘤定义为克劳丁低蛋白。重要的是，首先使用PAM50预测子17识别内在的亚型（基底样，富含HER2的腔A，腔B和正常样），然后作为分离的第二步12进行claudin低亚型分析。在已发表的研究中，claudin-low被视为第六种内在亚型，因此，PAM50分配的亚型在claudin-low肿瘤中被覆盖5，8，9，12。因此，蛋白-低乳腺肿瘤已经迄今为止，被表征为一个单一的基，但不限于下面的本征亚型的在给定蛋白-低的肿瘤的分布方面 8，9，12，13。
在这项研究中，我们旨在阐明在克劳丁低乳腺癌中观察到的异质性。通过根据内在亚型对低claudin肿瘤进行分层，我们表明claudin低肿瘤的特征反映了最初分配给它们的固有亚型。此外，我们探索了另一种鉴定低claudin-low肿瘤的方法，并证明了九细胞系claudin-low的预测因子12可能在将具有明显免疫和基质浸润的肿瘤分类为claudin-low时过于包容。
我们确定了87密蛋白-低肿瘤（4.6％）在METABRIC队列4，5使用九细胞系蛋白-低预测器12，18（补充数据 1）。根据内在亚型，大多数被分为基底样（51.7％，n = 45），正常样（32.2％，n = 28）或腔A（LumA; 10.3％，n = 9）（图。 图1A，表 1）。在所有基底样和正常样肿瘤中，分别有14.6％和15.3％被确定为claudin-low。剩下的所有三种亚型均以克劳丁低度肿瘤为一组，但患病率较低，占每种亚型肿瘤的0.6-1.3％。固有亚型的组蛋白-低的肿瘤内的分布从固有亚型的非蛋白-低的肿瘤分布显著差异（P <0.001，χ2 -test）。基底样和正常样肿瘤在claudin-low肿瘤组中明显过量表达，而其余固有亚型则明显不足（ 对于富含HER2的患者，P = 0.001，P <其他所有<0.001，Fisher精确检验）。仅将两个富含HER2的肿瘤和三个腔B（LumB）肿瘤分类为claudin-low。由于样本数量少，因此未进一步分析这两个亚型。克劳丁低度肿瘤广泛显示出与非克劳丁低度肿瘤相似的组织学（补充数据1），其中70％的肿瘤被归类为非 特殊类型（NST）。在该队列中发现了一种化生性肿瘤，分类为claudin-low。
一个固有亚型在全部肿瘤的METABRIC队列（顶栏，配送Ñ = 1886）和蛋白-低肿瘤只（底杆，Ñ = 87）。b雌激素受体状态。58％的claudin低肿瘤是ER阳性的。ER患病由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间差异（P <0.001，χ 2 -test）。c 173个测序基因组中的突变数。克劳丁低度肿瘤的突变率低于相同亚型的非 克劳丁低度肿瘤（基础样P <0.001，LumA P = 0.004，正常样P <0.001，两尾Wilcoxon秩和检验）。d基因组不稳定性指数（GII）。与相同亚型的非claudin低肿瘤相比，基底样和正常样claudin低肿瘤显示出较低的基因组不稳定性水平（基底样P <0.001，LumA P = 0.83，正常样P <0.001，两个尾Wilcoxon秩和检验）。e IntClust4。克劳丁含量低的肿瘤中有75％被归类为IntClust4。IntClust4分类由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间差异（P <0.001，χ 2 -test）。f TP53突变。38％的claudin低肿瘤携带TP53突变。TP53的速率突变由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间差异（P <0.001，χ 2 -test）。g PIK3CA突变。克劳丁含量低的肿瘤中有24％携带PIK3CA突变。由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间差异无统计学显著（P = 0.19，χ 2 -test）ħ MYC增益。克劳丁含量低的肿瘤中有26％表现出MYC增加。的速率MYC由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间差异增益（P <0.001，χ 2 -test）。我 MDM4获得。克劳丁含量低的肿瘤中有30％表现出MDM4增高。的速率MDM4由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间差异增益（P = 0.006，χ 2 -test）。j MKI67基因表达（log2）。与低claudin低对应物相比，Claudin低肿瘤始终表达较低的MKI67水平（基底样P = 0.01，LumA P = 0.03，正常样P <0.001，两尾Wilcoxon秩和检验）。所有 ns P > 0.05，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。表1中提供了样本量 。箱线图元素：中心线=中位数，框线限制=上下四分位数，晶须= 1.5×四分位间距。源数据作为源数据文件提供。
有在表达雌激素受体时蛋白-低肿瘤通过固有亚型分层肿瘤的比例显著差异（图 1B ; P <0.001，χ 2 -test）。基底样，LumA和正常样claudin低肿瘤分别有28.6％，100％和85.7％呈ER阳性，紧密反映了在非claudin低肿瘤中观察到的模式（图 1b）。这些结果表明，ER的蛋白-低肿瘤中的表达反映在其固有亚型，而且表征蛋白-低的肿瘤如乳腺癌的三阴性亚群9，12是过于简单化。
密蛋白-低的肿瘤，作为一个整体，先前已报道具有低突变负担和基因组不稳定的低水平相比其他亚型13，14。从173与癌症相关的基因中的面板的全基因组拷贝数数据和序列数据是可用于METABRIC队列4，5。当克劳丁低肿瘤按内在亚型分层时，与非克劳丁低肿瘤相比，它们始终显示出较低的突变负担和基因组不稳定性（图 1c，d），除了LumA肿瘤中的基因组不稳定性。但是，突变负担（P = 0.002，Kruskal–Wallis检验）和基因组不稳定性（P= 0.002）也存在显着差异。 不同内在亚型的claudin-low肿瘤之间的P<0.001，Kruskal–Wallis检验。尽管存在一定程度的亚型特异性变异，但这些发现表明，由于真正的claudin低特征，其突变率较低，基因组不稳定水平较低。
Curtis等。4种引入的乳腺癌亚型（IntClust）由与基因表达顺式相关的CNA模式定义。该基因组稳定IntClust4亚型显示出重叠的密蛋白-低肿瘤4，5，14。在我们的分析中，METABRIC队列中所有claudin低的肿瘤中有75％被归类为IntClust4。按内在亚型分层，与相同亚型的非claudin低肿瘤相比，claudin低肿瘤始终被归为IntClust4（图 1e）。有在列为IntClust4（蛋白-低的肿瘤的比例然而显著变化P <0.001，χ 2-test），范围从基底样低克劳丁低肿瘤的60％到正常样克劳丁低肿瘤的100％。此外，IntClust4肿瘤已被分离成ER阳性和ER阴性组由于它们的生物和临床特点主要区别，尽管基因表达模式的相似性强和CNA的相关低的水平4，5，19。分类为IntClust4ER +的克劳丁低度肿瘤主要为LumA和正常样，而分类为IntClust4ER-的克劳丁低度肿瘤主要为基底样（补充图 1a，b）。
分类为IntClust4的克劳定蛋白低肿瘤的高频率支持了克劳定蛋白低基因表达特征与基因组稳定性之间的关联。但是，METABRIC队列中只有21％的IntClust4肿瘤被归类为克劳丁低，而基因组不稳定性指数（GII）不能准确预测与克劳丁低质心的相关性，这是由九细胞株预测因子12（补充图 2）。因此，尽管大多数claudin-low肿瘤是基因组稳定的，但是只有一部分基因组稳定的肿瘤是claudin-low的。
在按固有亚型分层的克劳定低肿瘤中，没有发现推定的驱动程序20突变或CNA显着高于相同亚型的非克劳定低肿瘤（Fisher精确检验，Bonferroni校正;补充数据 2）。相反，低claudin的肿瘤倾向于表现出与其内在亚型相关的突变/ CNA模式。反映低水平的基因组不稳定和突变负担，低克劳定的肿瘤与非克劳定的低肿瘤相比，通常具有较低的驾驶员潜在畸变发生率。为了说明克劳丁低和非克劳丁低肿瘤中驱动程序畸变的相对频率，我们选择了四个早期基因组驱动程序畸变进行进一步分析：TP53突变，PIK3CA突变，MYC增益（位于8q24）和MDM4增益（位于1q32）。与观察到的ER阳性模式相似，claudin低型肿瘤中TP53突变的发生率很大程度上遵循了肿瘤固有亚型中的发生率（图 1f）。在差异TP53突变由固有亚型分层蛋白-低肿瘤之间率在统计学上显著（P <0.001，χ 2 -test）。其他三个像差也有相似的趋势（图 1g–i）。按固有亚型分层的克劳丁低度肿瘤显示出明显不同的MYC发生率和MDM4增益（P <0.001和P = 0.006，χ 2 -test），但不PIK3CA突变（P = 0.19，χ 2 -test）。
紧密连接蛋白低肿瘤先前已表征为较慢的循环，与增殖水平比在基底样肿瘤降低，但比在亮度和正常样肿瘤更高8，12。由MKI67基因编码的Ki-67 是常用的增殖标记。当按固有亚型对低克劳定低肿瘤进行分层时，亚型之间的MKI67表达水平存在显着差异（图 1j；P <0.001，Kruskal–Wallis检验），基底样低克劳定低肿瘤表现出明显较高的MKI67水平。表达水平低于LumA克劳丁低肿瘤和正常人的克劳丁低肿瘤（P 均<0.001，Wilcoxon秩和检验。然而，在所有内在亚型中，克劳丁低肿瘤的确显示出比非claudin低的对应物低得多的MKI67表达水平（图 1j； 与非claudin低相比，P = 0.01、0.03和<0.001 claudin低分别在基底样，LumA和正常样肿瘤中进行Wilcoxon秩和检验。因此，MKI67基因表达水平表明低claudin肿瘤反映了其内在亚型的增殖水平，但与非claudin低的肿瘤相比，其循环也较慢。
蛋白-低的肿瘤先前已与预后差8，12。当克劳定蛋白低的肿瘤被视为一个单一组时，这一特征是准确的（补充图 1c）。但是，当按固有亚型对低克劳定低肿瘤患者的生存进行分层时，通常会出现非克劳定低乳腺癌患者2中普遍观察到的生存模式（图 2a）。此外，每种内在亚型内克劳丁低和非克劳丁低的肿瘤患者的生存率无显着差异（图 2b-d）。因此，我们没有发现证据表明claudin水平低会影响乳腺癌患者的生存。
一个疾病特异生存基底样蛋白-低，亮度蛋白-低，正常，像METABRIC队列蛋白-低的肿瘤。生存趋势概括了非claudin低肿瘤中的模式。 当测试按固有亚型分层的克劳定低瘤之间的差异时，P = 0.056。b – d在克劳丁低和非克劳丁低的基底样（b），LumA（c）和正常样（d）肿瘤中的疾病特异性生存率。未发现 克劳丁低和非克劳丁低的肿瘤之间存在显着差异（基底样P = 0.54，LumA P = 0.59，正常样P = 0.17）。所有两尾对数秩检验用于重要性检验。特定疾病的死亡和样本量：基底样claudin-low n = 45（19），基底样非claudin-low n = 263（98），LumA claudin-low n = 9，3，LumA non-claudin-low n = 684（共144个），正常类claudin-low n = 28（共5个），正常类非claudin-low- n = 50（155）。源数据作为源数据文件提供。
蛋白-低的肿瘤已报告多发生于年轻患者，诊断时年龄比基底细胞样肿瘤略高，但比其余亚型降低8，9。然而，当按固有亚型对低克劳定低肿瘤进行分层时，诊断时的平均年龄存在显着差异（P = 0.01，Kruskal–Wallis检验；补充图 1d），其中基底样低克劳定低肿瘤被诊断为与LumA克劳丁低和正常人的克劳丁低肿瘤相比，其年龄要低得多（ Wilcoxon秩和检验分别为P = 0.03和0.01）。相同内在亚型的克劳丁低和非claudin低肿瘤在诊断时显示相似的年龄（基底样P = 0.67，LumA P = 0.53，法线P = 0.052，两尾Wilcoxon秩和检验）。
紧密连接蛋白低的肿瘤已显示表现出高度的免疫和基质浸润的9，12。同样，当按内在亚型分层时，与非claudin低肿瘤相比，METABRIC队列中claudin低肿瘤始终具有较高的免疫细胞和基质细胞浸润（由ESTIMATE确定，ESTIMATE是一种基于基因表达的推断正常细胞浸润的工具）在肿瘤21中）（补充图 3a，b）。九细胞系claudin-low预测子使用807个基因，Prat等人。承认仅由于基质浸润[ 12]可能会不适当地将某些肿瘤识别为claudin-low 。肿瘤的推断21与肿瘤之间有很强的相关性，从而支持了这一观点基质浸润和与九细胞系克劳丁-低质心的亲密性（R 2 = 0.76，线性回归；补充图 3c，d）。推断的21种免疫细胞浸润也观察到类似但较弱的趋势（R 2 = 0.27，线性回归；补充图 3e，f）。因此，我们考虑是否可以将更具针对性的基因列表用于claudin低分类，以便更准确地分离claudin低肿瘤固有的特征。
我们创建了一个精简的claudin-low基因列表（补充表1），该列表 由19个基因组成，这些基因仅代表claudin-low肿瘤的病理基因表达特征：细胞-细胞粘附基因的低表达，EMT基因的高表达以及基因表达图案典型干细胞样/更少分化的细胞的3，8，9，12，14。在METABRIC队列中，使用浓缩的基因清单对基因表达值进行层次聚类，揭示了一个具有基因表达特征的肿瘤簇，该特征与先前在 克劳丁低肿瘤中描述的一致（图 3 ; P = 0.006，SigClust 22）。我们将这个簇中的肿瘤称为核心claudin-low（CoreCL），而CoreCL簇以外的claudin-low肿瘤（由九细胞株预测因子定义）被称为其他claudin-low（OtherCL）。单独检查基因表达值表明，OtherCL肿瘤表现出某些claudin-low特征，尽管程度比CoreCL肿瘤要小（补充图 4）。
METABRIC队列（n = 1886个生物学独立的样本）中浓缩的claudin-low基因列表的基因表达值（log2）的热图。出现簇，标记为核心claudin低（n = 79），具有转录组和基因组claudin低的特征（P = 0.006，SigClust 22）。源数据作为源数据文件提供。
CoreCL簇由79个肿瘤（占该群肿瘤的4.2％）组成，其中有9个细胞系预测因子将其中的57个（72.2％）确定为claudin低（补充数据 1）。虽然在CoreCL肿瘤组中突出显示了几种内在亚型，但OtherCL（n = 30）肿瘤主要是基底样肿瘤（n = 23；图 4a）。因此，我们的克劳丁低肿瘤识别方法主要不同于九细胞系预测因子，其方法是滤除一组具有高水平的基质和免疫浸润的基底样肿瘤（补充图 5a，b），但没有病理性克劳丁-低基因表达特征（补充图 6）。
METABRIC队列中CoreCL和OtherCL肿瘤中亚型的分布。紧凑型克劳丁低基因列表的层次聚类过滤掉了具有弱克劳丁低特征的基底样克劳丁低肿瘤（如九细胞系预测因子所定义）的子集。b 173个测序基因组中突变基因的数量。基底样CoreCL肿瘤的突变明显少于基底样OtherCL肿瘤和基底样非claudin-low肿瘤（分别为P = 0.02和P <0.001，两尾Wilcoxon秩和检验）。C基因组不稳定指数的分布。基底样CoreCL肿瘤的基因组不稳定性水平显着低于基底样OtherCL肿瘤和非claudin低基底样肿瘤（ 两尾Wilcoxon秩和检验均为P <0.001）。d IntClust4中肿瘤的比例。80％的基底样CoreCL肿瘤被分类为IntClust4。È MKI67基因表达（LOG2）。基底样CoreCL肿瘤表达的MKI67水平明显低于基底样OtherCL和非claudin低的肿瘤（ 两尾Wilcoxon秩和检验均P <0.001）。F基底样CoreCL，基底样OtherCL和非claudin-low基底样肿瘤的疾病特异性生存率。当按claudin低状态分层时（两尾对数秩检验），基底样乳腺肿瘤的疾病特异性生存率无明显差异。特定疾病的死亡：基底样CoreCL n = 25中的8，基底样OtherCL n = 23 23中的12，基底样非claudin-low n = 260中的97。所有 ns P > 0.05，* P <0.05， ** P <0.01，*** P <0.001。箱线图元素：中心线=中位数，框线限制=上下四分位数，晶须= 1.5×四分位间距。基础类CoreCL n = 25，基础类OtherCLn = 23，基底样非claudin-low n = 260，富含HER2的CoreCL n = 2，LumA CoreCL n = 13，LumA OtherCL n = 1，LumB OtherCL n = 3，普通类CoreCL n = 39，正常类OtherCL n = 3个生物学独立的样本。源数据作为源数据文件提供。
基底样CoreCL肿瘤（n = 25），基底样OtherCL肿瘤（n = 23）和非claudin低基底样肿瘤（n = 260）之间存在明显的对比。基底样CoreCL肿瘤的突变明显少于基底样OtherCL肿瘤和非claudin低基底样肿瘤（图 4b； Wilcoxon秩和检验分别为P = 0.015＆P <0.001）。基底样CoreCL肿瘤还显示出比基底样OtherCL肿瘤和非claudin低基底样肿瘤低的基因组不稳定性水平（图 4c；P 均<0.001，Wilcoxon秩和检验。基底样OtherCL肿瘤与非claudin低基底样肿瘤之间的GII没有显着差异（图 4c，P = 0.082，Wilcoxon秩和检验）。在IntClust4中，基底样CoreCL肿瘤的比例也比基底样OtherCL和非claudin-low基底样肿瘤的比例更高（图 4d，补充图 5c，d）。共有80％的基底样CoreCL肿瘤被归类为IntClust4，而43％的基底样OtherCL肿瘤和10％的基底样非claudin-low肿瘤被归类为IntClust4。TP53突变，MYC增益和MDM4的发生率也较低与基底样OtherCL和基底样非claudin-low肿瘤相比，基底样CoreCL肿瘤的增高，反映出较低的突变负担和GII（补充图 5e，g）。但是，对于PIK3CA，这种趋势并不明显（补充图 5h）。基底样CoreCL肿瘤表达的MKI67水平显着低于基底样OtherCL和基底样非claudin低的肿瘤（图 4e； Wilcoxon秩和检验，两者均P <0.001）。基底样OtherCL和基底样非claudin-low肿瘤之间的MKI67表达没有显着差异（P = 0.63，Wilcoxon秩和检验）。总之，与基底样CoreCL肿瘤相比，基底样OtherCL肿瘤的特征与claudin-low肿瘤特征的一致性较弱。因此，很可能的是OtherCL肿瘤被分类为通过九细胞系预测蛋白-低由于它们的基质浸润（补充图 3 C，5B），且这些肿瘤的蛋白-低的分类可以是可疑。
尽管在基因组和转录组特征以及免疫和基质浸润方面存在差异，但基底样CoreCL，基底样OtherCL和非claudin-low基底样肿瘤的生存率无显着差异（图 4f）。这些发现加强了我们的观察结果，表明claudin低状态不是乳腺癌患者生存的主要决定因素。
几乎没有其他CL分类为基底样的样品（ LumA，LumB和正常样肿瘤分别为n = 1、3和3；图 4a）。正常类CoreCL（n = 39）和LumA CoreCL（n = 13）肿瘤的特征与九细胞系预测因子鉴定的正常类claudin-low和LumA claudin-low肿瘤的特征相似（补充图。 7，8）。这些发现表明，九细胞系预测因子将基质浸润肿瘤的混杂分类定为claudin-low，可能是基底样肿瘤中最令人关注的问题。
为了验证我们的发现，我们询问了Oslo2队列23，其基因表达数据和ER / HER2状态可用。队列中有29种按九细胞株预测的定义的低claudin肿瘤（7.6％），其中大多数被分类为基底样，LumA或正常样（n = 7、5 和11）。分别；补充图 9a，补充数据 3）。当使用浓缩的claudin-low基因列表进行聚类时，存在一个具有claudin-low基因表达特征且免疫和基质细胞浸润水平较高的聚类（补充图 9b；P <0.001，SigClust 22）。队列中的28个肿瘤（7.3％）位于低克劳丁核心簇中（补充图 9c），其中9个细胞系预测因子将其中16个（57％）确定为低克劳丁。九细胞系预测因子将七种基底样肿瘤归为claudin-low。其中两个是CoreCL，两个都是IntClust4，其余五个是OtherCL，一个都不是IntClust4。使用IntClust4作为用于基因组不稳定性的低含量的替代标记4，19，24这些发现强调，九细胞系预测因子可能在将基底样肿瘤识别为claudin-low时过于包容。但是，Oslo2队列中的OtherCL肿瘤比METABRIC队列中的多样化，在12种其他CL肿瘤中，有7例是非基底样的（ 富含HER2，LumA和LumB的n = 1、4和2 ）。总共，在Oslo2队列中将89％的CoreCL肿瘤归为IntClust4，相比之下，其他CL肿瘤为38％，低claudin低肿瘤为20％。因此，Oslo2队列中低claudin肿瘤的特征与METABRIC队列中观察到的特征基本一致。
最后，我们探讨了TCGA乳癌队列7，25。108个肿瘤中有32个（3.0％）被9个细胞系预测因子归为claudin-low（补充数据 4）；然而，没有核心的claudin低簇出现（补充图 10）。如前所述，非肿瘤细胞浸润是claudin低肿瘤的主要特征。TCGA协议中的纳入标准是肿瘤细胞超过60％7。METABRIC队列最初被分为具有40％的细胞关闭率的发现队列（具有3.6％的claudin低患病率）和没有细胞关闭的验证队列4，其claudin低患病率为5.6％。在Oslo2队列23中，细胞密度没有下降，其claudin低患病率为7.6％。因此，队列中的细胞数量减少与克劳丁低患病率之间可能存在关联（图 5）。这加强了对非肿瘤细胞浸润作为基本的claudin低特征的观察，并且可以解释TCGA-BRCA队列中没有核心claudin低簇。
队列中肿瘤细胞形成的临界值与克劳丁低肿瘤患病率之间的关系（由九细胞株预测因子确定）。与没有细胞排斥标准的人群相比，由于细胞密度低而排除肿瘤的人群的claudin-低患病率较低。MB-Discov .: METABRIC发现队列，MB-Val .: METABRIC验证队列。MB-Discov。n = 957，MB-Val。n = 929，Oslo2 n = 381，TCGA-BRCA n = 1082生物独立样品。源数据作为源数据文件提供。
TCGA乳腺癌队列中的克劳丁低度肿瘤大多数表现出与非claudin低度肿瘤一致的组织学特征（补充数据 4）。该队列中有8个化生性肿瘤，其中6个分类为claudin-low，证实大多数化生肿瘤为claudin-low 26。
在这里，我们从claudin-low作为可能渗透到内在亚型的表型的角度，重新评估了claudin-low乳腺癌的特征。通过对基因组，转录组学和临床数据的分析，我们显示了克劳丁低肿瘤的特征反映了其内在亚型。与claudin低状态相关的特征包括明显的免疫和基质细胞浸润，低水平的基因组不稳定和突变负担以及降低的增殖水平。最后，我们探索了另一种识别低克劳定蛋白的肿瘤的方法，从而表明，已建立的克劳定蛋白低的预测因子12将具有明显免疫力和基质浸润的肿瘤子集不适当地分类为克劳定蛋白低。
我们通过内在亚型对克劳丁低肿瘤进行分层，并在几乎所有方面分析了不同内在亚型的克劳丁低肿瘤之间的差异。也许最令人惊讶的，我们没有发现任何证据表明，蛋白-低状态会影响疾病特异性生存，以蛋白-低以前的报告作为不良预后亚型对比8，12。这些发现表明，以前报道的克劳定低肿瘤的特征的大部分不是真正的克劳定低特征，而是几种内在亚型的平均特征。因此，在不考虑内在亚型的情况下将克劳丁低肿瘤作为单个实体进行分析的既定实践可能会掩盖归因于克劳丁低状态的特征。
紧密连接蛋白低乳腺癌先前已被认为是一个单一的疾病实体，类似于固有乳腺癌亚型8，9，12，13（图 6A）。然而，我们的发现表明，乳腺肿瘤不是claudin-low而是PAM50预测因子分配给它们的内在亚型，而是它们除了内在亚型外还可以携带claudin-low表型（图 6b）。 。根据该解释，claudin-low是一组生物学特征的量度，其不同于通过固有亚型测量的一组生物学特征。
a在建立的模型中，claudin-low被解释为第六种亚型，类似于内在亚型。b当按内在亚型分层时，克劳丁低肿瘤显示出与其内在亚型相关的特征。这暗示着肿瘤不是claudin-low而是其固有亚型，而是肿瘤除了其固有亚型外还可以携带claudin-low表型。在二元模型中，肿瘤被分类为claudin低或非claudin低。C由九细胞系预测因子鉴定的CoreCL肿瘤和克劳丁低肿瘤的比较分析表明，克劳丁低实际上可能是连续的特征。因此，单个肿瘤可表现出不同程度的claudin低度，而不是简单地为claudin低或非claudin低。在该模型中，平均而言，CoreCL肿瘤比由九细胞株预测因子鉴定的低claudin肿瘤具有更高的claudin-lowness程度。连续模型为纯克劳丁低肿瘤的可能性打开了大门，与内在亚型无关。
我们探索了一种使用浓缩基因清单鉴定低claudin的肿瘤的方法。使用这种方法（CoreCL）鉴定的低claudin肿瘤显示出比通过九细胞株预测因子鉴定的claudin低肿瘤更一致的性状。其他CL肿瘤可以解释为不是真正的claudin低肿瘤。但是，其他CL肿瘤确实表现出一些基因组和转录组特征，这些特征与claudin低表型一致，尽管程度比CoreCL肿瘤要小。令人信服的解释可能是，claudin-low是一个连续体（“ claudin-lowness”的程度，图 6c），而不是二进制特征（claudin-low与non-claudin-low，图 6b））。根据这种解释，乳腺肿瘤可能存在于claudin-lowness范围内，它们位于以下两者之间：（1）非claudin-low，与内在亚型完全一致，（2）claudin-low中等，具有明显的烙印（3）广泛的claudin-low，内在亚型的印记有限（以平均CoreCL肿瘤为例），或（4）内在亚型（以九细胞系预测因子鉴定的平均claudin-low肿瘤为例）， ）纯蛋白-低，没有压印固有亚型（可能通过特殊的组织学亚型例举26，27）。这种模式是在癌症局部EMT表型的最近描述一致的28，29和蜂窝柔顺作为用于蛋白-低表型的病因说明14，15。
克劳丁低度肿瘤的非肿瘤细胞浸润水平很高，并且队列中克劳丁低度肿瘤的患病率较低，并且肿瘤细胞的形成截止。还已知的是EMT样基因表达在肿瘤特征类似于基质组织的基因表达特征29，和正常乳腺组织样品的一个子集显示出显着的相似性蛋白-低样基因表达模式30，31。在这些观察的背景下，有必要提出以下问题：claudin低表型有多少是基质浸润的结果，claudin低表型可以简单地是基质浸润的产物吗？如果低claudin表型只是一个抽样假象，与肿瘤的生物学无关，那么人们就会期望低claudin表型的肿瘤在内在亚型中分布相似。克劳丁低度肿瘤在基底样和正常样肿瘤中过分表达，而在其余固有亚型中表达不足。此外，如果仅通过基质浸润来介导claudin-lowness，那么应该仅基于基质浸润就可以准确地鉴定claudin-low的肿瘤。但是，虽然几乎所有克劳丁含量低的肿瘤都具有高水平的基质浸润， 1，3，和4）。最后，大量的研究已经确定在蛋白-低肿瘤（人，鼠和细胞系），它们是直接归因于蛋白-低肿瘤细胞的特征6，9，12，14，32。因此，非肿瘤细胞浸润无疑是一个重要的特征，密蛋白-低肿瘤微环境33，34，35，36，并且甚至可以是特征在于诱导蛋白-低肿瘤起始细胞EMT 15。然而，在克劳丁低肿瘤中观察到的特征不能仅归因于非肿瘤细胞浸润。
尽管我们没有发现低克劳定状态会影响生存的证据，但某些低克劳定特性可能仍具有临床意义和/或可操作性。例如，蛋白-低的肿瘤表现出高水平的免疫细胞浸润的8，12，表达高水平的PD-L1 13，由T调节细胞免疫抑制33，并进行低突变负担; 13，14，这些因素都可能是相关的免疫治疗剂在蛋白-低的肿瘤的功效。克劳丁低肿瘤中的EMT表型本身可能是治疗靶点，也可能对化学耐药性有影响37。由于非肿瘤细胞浸润的重大影响，很可能是免疫活性动物模型将是特别重要的功能评估如何将这些功能可以治疗针对性3，13，38，39。
应该注意这项研究的一些局限性。尽管分析了三千多种乳腺肿瘤，我们仍发现相对较少的claudin-low肿瘤。因此，必须谨慎地解释本文中提出的发现。尽管METABRIC队列的Kaplan-Meier曲线（图 2，补充图 8）与非claudin低队列肿瘤2观察到的相似，但claudin低队列人群无统计学意义。 。此外，很难确定从大量肿瘤样品中观察到的结果在多大程度上代表了肿瘤细胞或非肿瘤细胞的特征29。因此，可能需要进行单细胞转录组分析，以有效区分肿瘤细胞的特征并浸润免疫细胞和基质细胞。最后，必须强调的是，我们特意选择了一种偏向的方法来构建浓缩的claudin-low基因列表。这种选择是通过我们的研究结果（补充图动机 3）和通过的当代研究获知密蛋白-低肿瘤6，9，14，15，32。因此，我们强调指出，目前尚无用于鉴定克劳丁含量低的肿瘤的金标准，并且此处介绍的方法可能缺乏外部概括性。可以与九细胞系预测因子或此处介绍的方法结合使用的改进claudin-low分类的其他方法可能包括：EMT相关蛋白标记物的免疫组织化学染色，为最大允许的GII设置临界值，或检查是否与IntClust4状态重叠。
总之，我们已经全面分析了claudin-low乳腺肿瘤，并通过这些分析证实了claudin-low的重新定义为乳腺癌表型。我们的发现解释了在克劳丁低乳腺肿瘤中观察到的高度异质性，从而使人们对这种鲜为人知的癌症形式进行了更加准确和细致的研究。
的METABRIC 4，5，Oslo2 23，和TCGA-BRCA 7，25组群在该研究中进行分析。来自METABRIC队列的处理后的数据可从cBioportal下载；40，41查询的数据包括激素受体状态，IntClust亚型，具体疾病存活，突变状态中的173种测序的基因面板5，基因为中心的拷贝数状态，以及归一化的基因表达值。从Curtis等人的补充文件中检索了METABRIC队列的内在亚型（使用PAM50预测因子17识别）。4。从与Pereira等人有关的资料库中检索出拷贝数片段和肿瘤倍性。5。在METABRIC队列中有1886个肿瘤，并且可获得上述数据。Elena Provenzano博士42提供了集中审查的组织学分类。组织学分类可用于数据集中的1575个肿瘤。
对于Oslo2队列，可从基因表达综合（GEO），登录号GSE80999下载归一化的基因表达值，内在亚型（使用PAM50鉴定）和激素受体状态。该队列的所有381个样本都包括在分析中。使用GEOquery 43和Biobase 44进行分析。拷贝数数据仅可用于7个克劳定蛋白低的肿瘤，因此在分析中未使用。
归一化的基因表达值，固有亚型（使用PAM50标识）和组织学分类从TCGA-BRCA队列肿瘤从cBioportal下载7，25，40，41。分析了来自TCGA-BRCA队列的所有1082个肿瘤。
基因表达数据的生成和预处理在队列各自出版物中描述4，5，7，23，25。基因表达值是平均居中和定标的（z评分）。在Oslo2队列中，通过查找代表给定基因的所有探针的平均值，将由多个探针代表的基因还原为单个基因表达值。
使用Genefu 18 R 45包中的九细胞系claudin-low预言者12的实施鉴定出克劳丁低瘤。欧几里德距离用作克劳丁-低分类的距离度量。Oslo2和TCGA-BRCA队列中的IntClust亚型使用在Genefu 18中实现的基于基因表达的IntClust分类器24确定。免疫和基质浸润是从基因表达数据推断出来的，使用的是由ESTIMATE 21衍生的ImmuneScore和StromalScore。
我们观察到九细胞系claudin-low预测因子受非肿瘤细胞浸润的影响严重（补充图 3）。这可以涉及在蛋白-低的肿瘤标记的基质细胞和免疫浸润12，并在基因表达的部分重叠的基质组织和肿瘤之间设有一个带EMT表型29，30，31。鉴于这些挑战是由Prat等人使用的无偏方法引起的。12，并且在的理解取得了进展密蛋白-低肿瘤6，14，15，32，我们选择探索一种偏向的方法来鉴定低克劳定的肿瘤。用于鉴定核心蛋白-低肿瘤（补充表减小基因组 1）的蛋白-低的基因表达特征和预付款出版表征的基础上是手动选定在理解蛋白-低的肿瘤的病因学基础3，6，8，9，12，14，15，32。我们认为这些基因应该具有克劳丁低肿瘤所特有的特征：细胞-细胞粘附基因的低表达，EMT基因的高表达以及干细胞样/未分化基因的表达模式。此外，我们认为基因列表中不应包括克劳丁含量低的肿瘤所不具有的特征，例如管腔上皮相关基因的低表达。包含此类基因将有可能重述内在亚型。通过使用欧几里德距离作为距离度量完全链接，使用简化的基因列表进行层次聚类。使用ComplexHeatmap软件包46进行R的聚类和可视化。使用SigClust 22评估核心claudin-low聚类的重要性。
通过将拷贝数异常核苷酸的数目除以基因组中核苷酸的总数来得出GII。如果拷贝数状态偏离最近的倍性整数值，则通过将片段定义为拷贝数异常来对GII进行倍性校正。所有GII值均经过倍性校正。
根据以下标准选择单独分析的基因组畸变：（1）已知为早期驾驶员事件的功能；20，47（2）在乳腺癌中最频繁观察到的像差中; 4，5固有亚型（3）之间显著不同发生率（χ 2 -test P <0.05）; 4，5（4）与其他选定的事件（即，只有一个CNA位于8q24上）非重叠。TP53突变，PIK3CA突变，MYC扩增（8q24）和MDM4 根据这些标准，选择扩增（1q32）进行进一步分析。
使用R 的生存软件包48进行生存分析，并使用Survminer软件包生成Kaplan–Meier图。
所有显着性检验（在适用的情况下）都是两尾的。对于连续变量，分别使用Wilcoxon秩和检验和Kruskal–Wallis检验来检验两组或两组以上的差异。分类变量，Fisher精确检验和χ 2 -test被用来测试对两个或两个以上的组，分别之间的差异。生存分析的意义通过对数秩检验确定。在补充数据2中详述的分析中对多种假设检验进行了调整。 （邦费罗尼校正）; 没有对多个假设检验进行其他更正。箱须图中的晶须是使用Tukey方法生成的；没有绘制单个数据点，因为组之间样本数量的不平衡（表 1）倾向于掩盖总体趋势。
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