与其他RCC亚型相比，TFE3 Xp11.2易位性肾细胞癌（TFE3-RCC）的进展通常更为积极，但是通过传统的病理影像学检查来诊断TFE3-RCC具有挑战性。在这项研究中，我们收集了74例TFE3-RCC病例（迄今为止最大的队列）和74例透明细胞RCC病例（ccRCC，最常见的RCC亚型）的苏木精和曙红染色的组织病理学全片图像，这些性别和肿瘤等级相匹配。实现了自动计算流水线以提取图像特征。比较研究确定了52个图像特征，TFE3-RCC和ccRCC之间存在显着差异。建立了机器学习模型以区分TFE3-RCC和ccRCC。在外部验证集上对分类模型进行的测试表明，ROC曲线下的面积为0，具有很高的准确性。842至0.894。我们的结果表明，自动导出的图像特征可以捕获TFE3-RCC和ccRCC之间的细微形态差异，并有助于TFE3-RCC诊断的潜在指南。
肾细胞癌（RCC）是由多个不同种类的亚型1，2和被标准地分为三种主要的组织学亚型：透明细胞RCC（肾透明细胞癌）（〜75％），乳头状肾细胞癌（15-20％），和嫌色细胞癌（〜 5％）3，4。除组织病理学定义的RCC亚型外，Xp11.2易位RCC是与TFE3基因融合相关的罕见亚型，在2004年WHO肾肿瘤分类中首次得到正式认可。的TFE3基因，该基因位于染色体Xp11.2，具有多种融合伴侣5，6，7。带有MALAT1-TFEB基因融合的t（6; 11）易位的肾细胞癌远不常见。
TFE3 Xp11.2易位RCC（TFE3-RCC）通常在晚期被诊断出来，与非Xp11.2易位RCC相比，具有更强的侵袭性和更差的预后。显著的进步已经为肾癌靶向疗法在近年来已经取得8，尤其是血管内皮生长因子靶向（舒尼替尼，索拉非尼等）和mTOR靶向（西罗莫司，依维莫司等）阻断血管生成活性疗法9，10，11。在过去的几年中，已经有许多研究调查靶向治疗的患者TFE3-RCC的疗效7，12，13，14，15，16。例如，Choueiri等。14的一项小型回顾性研究显示，靶向VEGF的药物在转移性TFE3-RCC患者中显示出一定疗效。改善这种罕见的RCC亚型的诊断不足，将有助于样品治疗，改善临床试验准入性，更重要的是，有助于开发针对此类患者的有效疗法。
但是，根据目视检查苏木精和曙红（H＆E）染色的病理图像，将TFE3-RCC与其他亚型区分开是非常具有挑战性的。TFE3-RCC的大体形态类似于肾透明细胞癌的5，6，7，17。在显微镜下，TFE3-RCC病例通常特征为上皮样透明细胞排列成分支状，具有纤维血管核心的乳头状结构和/或嵌套结构。尽管这些功能是TFE3-RCC的暗示，形态的光谱是相当易变的，并且可以与其他亚型RCC如肾透明细胞癌或乳头状肾癌重叠1，2。例如，在肾透明细胞癌和癌症基因组图谱（TCGA）项目的乳头状肾癌的数据集某些情况下都涉及到TFE3或TFEB转18，19。
由于难以鉴定TFE3-RCC的可辨别的和强大的形态特征，因此可以通过双色，分离荧光原位杂交来确定易位的诊断。但是，这需要额外的时间来测试此诊断，并且对于没有怀疑是TFE3-RCC的RCC患者，通常不进行常规检查。因此，极有可能将TFE3-RCC与其他RCC亚型误诊，从而延误了适当的治疗。我们想将机器学习应用于H＆E染色的数字化病理图像，并研究它是否可以帮助识别TFE3-RCC独特的图像特征并将TFE3-RCC与最常见的RCC亚型ccRCC区别开来。
随着数字载玻片扫描仪变得越来越可靠和流行，玻璃载玻片已经越来越多地数字化为全载玻片图像。近年来见证了应用机器学习H＆越来越感兴趣E染色的病理图片各种任务，包括预后预测20，21，22，癌症分类23，24，25，26，和遗传状况预测，如微卫星不稳定性27和基因突变28。值得注意的是，Campanella等。23报道了临床级计算病理学框架，该框架在44,732张全幻灯片图像的数据集上进行了评估。结合图像处理技术和机器学习模型，Yu等。26在区分正常与肿瘤玻片之间达到0.85的曲线下面积（AUC），在区分肺腺癌与鳞状细胞癌玻片之间获得0.75的曲线下面积。这些研究证明了计算病理学在临床决策支持中的功效。
在这项研究中，我们从多个来源收集了74例TFE3-RCC患者的H＆E染色全幻灯片图像（根据我们的知识，这是对TFE3-RCC的最大报道研究）以及74例性别和肿瘤等级相匹配的ccRCC患者。该研究的目的是（i）识别出明显的定量图像特征，这些特征显示出TFE3-RCC和ccRCC之间存在显着差异；（ii）根据这些功能建立和评估客观和全自动分类模型，以区分TFE3-RCC和ccRCC。
我们收集了两个全幻灯片图像数据集：数据集1和数据集2。数据集1从印第安纳大学获得，由50名TFE3-RCC患者和50名ccRCC患者组成，性别和肿瘤等级相匹配。使用五重交叉验证将数据集1随机分为五组训练（80％）和内部验证（20％）。数据集2从密歇根大学和TCGA获得。它用作外部验证集。它包含24名TFE3-RCC患者和24名ccRCC患者，并且具有相同的性别和肿瘤等级。表1总结了这两个数据集的患者人口统计学和临床特征 。
分析工作流程如图1所示 。148例活检病例的H＆E染色载玻片通过Leica Aperio扫描仪以×40放大倍率数字化（图 1a）。病理图像分析管道从全玻片图像21中提取了定量图像特征，表征了细胞核的大小，染色，形状和密度（图 1b）。为了研究图像特征与疾病亚型的关联（即TFE3-RCC与ccRCC；图 1c），首先使用Mann-Whitney U比较了两种亚型中每个图像特征的分布测试。然后，将图像特征进行组合，并建立四个机器学习模型（逻辑回归，线性核支持向量机，高斯核支持向量机和随机森林），以将患者分为TFE3-RCC或ccRCC组。
用扫描仪将H＆E染色的组织玻片数字化以获得全玻片图像。b提取了大量定量图像特征，以表征细胞核大小，染色，形状和密度。c使用Mann–Whitney U检验比较TFE3-RCC和ccRCC之间的图像特征，并基于图像特征开发了机器学习模型，以自动分类这两种癌症亚型。在c的方框图中，中心标记指示中位数，方框的底部和顶部边缘分别指示第25个百分位数和第75个百分位数（q 1和q 3）。上晶须从q 3延伸到q 3 + 1.5×（Q 3 - q 1）和晶须从q个延伸的下1到q 1 - 1.5×（Q 3 - q 1），而超出晶须的端数据是个别地绘出外围点。
特征提取流水线包括三个步骤：核分割，核级特征提取和图像级特征提取（图 2）。首先，通过分层多级阈值化方法29（图 2a）对全幻灯片图像中的细胞核进行了分割。接下来，对于每个分割的核，计算了10个核级特征（图 2b）。表2显示了10个核级特征的代表性图像补丁 。最后，由于每个完整的幻灯片图像都包含数百万个细胞核，因此通过结合10-bin直方图和5个分布统计信息（均值，std，偏度，峰度和峰度）将每种类型的核级特征分解为15个图像级特征。熵）（图 2c）。直方图的bin中心是聚类质心，是通过对从训练集中采样的每种类型的核级特征进行聚类而确定的；因此，直方图特征在患者之间是可比的。图2c中显示了15个图像级特征的命名规则 ，使用了核级特征（例如，比率）。总共，我们为每个完整幻灯片图像计算了150个图像级特征。可以在“方法”部分中找到更多详细信息。
a全幻灯片图像中的原子核会自动分割。b对于每个分割的细胞核，提取10个细胞核水平的特征，涉及细胞核的大小，染色强度，形状和密度。c对于同一张完整幻灯片图像中的每种类型的核级特征，使用10箱直方图和5种分布统计将它们分为15个图像级特征。比例尺：5毫米（一个全幻灯片图像）和50微米（一图像块）。
我们对每个特征应用了Mann-Whitney U检验，并在多次测试校正后（5％错误发现率；图3）确定了TFE3-RCC和ccRCC之间显着不同的52个特征 。据报告，相对于TFE3-RCC亚型，显着特征为代表过多或代表不足；即，如果TFE3-RCC组中此特征的中位数高于ccRCC组中的特征，则将该特征定义为过高。
对于每个特征，倍数变化定义为ccRCC和TFE3-RCC之间的中值特征值之比。使用双面Mann–Whitney U检验可以识别52个图像特征，这些图像特征显示TFE3-RCC和ccRCC之间存在显着差异。使用5％的错误发现率程序执行多重比较校正。
对于图3中与核大小相关的特征 ，我们发现TFE3-RCC中的area_bin1，area_bin9和area_bin10代表过多，而area_bin4，area_bin5和area_bin6代表不足。从area_bin1到area_bin10的图像特征代表大小从小到大变化的核比例。因此，这些重要特征表明，与ccRCC中的特征相比，TFE3-RCC中的核尺寸更加不均一，并且朝着两个极端方向发展，这也得到了代表性的特征area_std（核尺寸的标准偏差）的支持。
图3中以主要，次要和比率开头的名称的特征 来自拟合到分段核的椭圆。这些特征与细胞核形状有关。特别是，从ratio_bin1到ratio_bin10的特征直接描述了形状从圆形变为细长的原子核的百分比。正如我们在图3中看到的那样 ，ratio_bin1表示不足。相反，ratio_bin3，ratio_bin4，ratio_bin5和ratio_std表示过多。总之，这些观察结果表明ccRCC倾向于具有更多非常圆的核。
在红色和绿色通道中计算出的11个与核染色相关的特征显示TFE3-RCC和ccRCC之间存在显着差异。在这些功能中，对于TFE3-RCC案例，rMean_bin8，rMean_bin9，rMean_mean，rMean_skewness和gMean_mean被过度代表。rMean_bin8和rMean_bin9表示在红色通道中具有非常大的平均像素值的原子核比例。rMean_mean和gMean_mean分别表示红色和绿色通道中所有原子核的平均像素值的平均值。rMean_skewness被过度表示，这意味着TFE3-RCC中红色通道中核平均像素值的数据分布比ccRCC中的更加不对称。
在与核密度相关的15个重要特征中，我们发现五个特征被过度表达：distMin_bin1，distMin_bin2，distMean_bin1，distMean_bin2和distMax_bin1。这五个特征的过多表示表明，与ccRCC相比，TFE3-RCC倾向于呈现更多彼此非常靠近的核。换句话说，TFE3-RCC中的单元更加聚集在一起。
我们首先对从印第安纳大学获得的数据集1进行了五次交叉验证，对分类器进行了训练和评估（详细信息请参见表 1）。在这五个回合的每个回合中，数据集1随机分为两组：80％训练和20％内部验证。我们的结果表明，使用最小冗余最大相关性（mRMR）算法选择的30个功能，我们的最佳分类器，具有高斯核的SVM，平均AUC为0.886。四个分类器（逻辑回归，具有线性核的SVM，具有高斯核的SVM和随机森林）的性能没有显着差异（ANOVA测试P值= 0.77）。四个分类器的五重交叉验证结果的条形图如图4a所示 。
使用五重交叉验证对数据集1 的分类性能（ 每个模型n = 5个实验）。每种情况下，将80％的患者用作训练集，其余患者用作内部验证集。b接收机工作特性曲线，用于在外部验证集中（数据集2）对TFE3-RCC和ccRCC进行分类。使用数据集1训练模型，并使用数据集2进行模型评估。AUC的95％置信区间：LR（0.763-0.984），RF（0.736-0.960），SVM-L（0.725-0.959）和SVM-G（0.797 –0.991）。LR，逻辑回归；RF，随机森林；SVM-L，带有线性内核的SVM；SVM-G，具有高斯内核的SVM。数据被表示为平均值±SD 一个。
使用外部数据集（数据集2；表1）进一步验证了我们用于诊断分类的定量图像特征的实用性 。具体来说，我们使用数据集1训练了相同的四个分类器，然后使用数据集2验证了性能。所有分类器均获得了与上述内部交叉验证集相似的AUC（图 4b））。我们还观察到，除了随机森林分类器外，其他三个分类器在外部验证集上获得的AUC略高于使用数据集1进行五次交叉验证的平均AUC。这可能是因为数据集1中的所有患者均用于训练在数据集2上测试的分类模型。相反，在数据集1上进行五重交叉验证时，仅将数据集1中80％的患者用作训练集。由mRMR选择的最重要的定量特征（通过特征重要性得分衡量）包括ratio_bin3，rMean_mean，minor_std，area_bin5，rMean_skewness，distMin_bin5，rMean_std和ratio_std。
据我们所知，这是第一个提供计算模型的研究，该模型使用从H＆E染色的全幻灯片图像中提取的定量组织病理学特征来区分ccFEC和TFE3-RCC。在这项研究中，我们实施了自动工作流程，该工作流程从图像中计算出150个客观特征。从整个载玻片中提取图像特征，这些载玻片不仅覆盖了大的肿瘤区域，而且还覆盖了广泛的细胞核形态，包括来自异质癌组织的细胞核大小，染色，形状和密度。我们建立并评估了机器学习模型，以将患者分为TFE3-RCC或ccRCC。通过从不同来源收集的独立数据集可以确认此工作流程的有效性。
多数癌症是异质的，含有若干亚型1，2。这些亚型通常特征在于由不同的分子概况该驱动器的肿瘤发展和进展不同9，10，11。通常在诊断癌症时收集组织病理学幻灯片。我们的假设是可以通过人工智能算法定量检测肿瘤形态表型，该算法反映了潜在的遗传畸变，包括易位。TFE3-RCC由细胞带Xp11.2上的特定易位定义。据我们所知，我们报告了74例最大的TFE3-RCC队列，并使用计算病理图像分析对TFE3-RCC和ccRCC的微观外观进行了广泛分析。我们的结果证明了应用基于定量组织病理学特征的机器学习模型来区分TFE3-RCC和ccRCC的潜力，在外部验证集上具有令人印象深刻的准确性（AUC在0.842和0.894之间）。
我们确定了两个亚型之间显着不同的52个图像特征。例如，在与肾透明细胞癌的比较，TFE3-RCC具有非常小和非常大的细胞核的比例较高（参见area_bin1，area_bin9和area_bin10图 3），这是符合事实TFE3-RCC是更积极和与高等级肿瘤30相关，因为高等级肿瘤的细胞增殖速度更快。就显着不同的功能咨询了高级病理学家（LC）。尽管对于某些功能很难用人眼分辨出它们之间的差异，但可以从视觉上感知其他功能。例如，我们发现ccRCC的超圆核比例更高（请参见图3中的 ratio_bin1） ）比TFE3-RCC。病理学家证实，ccRCC确实比TFE3-RCC具有更圆的细胞核。另一个例子是我们特征的过度表示（即distMean_bin1和distMean_bin2；图 3）表明TFE3-RCC中的细胞团块多于ccRCC（补充图 1）。
由于TFE3易位引起TFE3蛋白的过表达，因此TFE3蛋白的免疫组织化学（IHC）被认为是该遗传事件的替代物。我们将我们的方法的性能与其他使用IHC的报道进行了比较。Sharain等。在一项两个实验室的研究中发现31个，TFE3 IHC对TFE3重排的肿瘤的总体敏感性和特异性在实验室A中分别为85％和57％，在实验室B中为70％和95％，导致尤登指数分别为0.42和0.65 ，分别（Youden指数=敏感性+特异性-1）。他们的数据集包含27个TFE3重排的肿瘤和98个对照。我们的具有高斯核的SVM分类器可以实现91.7％的灵敏度，79.2％的特异性和0.708的尤登指数（图 4b））。值得注意的是，我们基于病理图像的分类器仅依靠常规的H＆E染色，而不是特定分子的染色。
先前研究TFE3-RCC的临床病理特征经常受到小样本量的困扰32。我们基于病理图像的分类器可以帮助病理学家诊断新的TFE3-RCC病例，还可以帮助进行大规模的回顾性研究，以检索被误诊的TFE3-RCC旧病例。当以适当的阈值使用时，分类器可以以很高的灵敏度和相对较低的假阳性率从组织病理学幻灯片档案中自动发现TFE3-RCC病例（图 4b））。例如，我们的具有高斯核的SVM分类器可以达到91.7％的灵敏度，同时保留20.8％的假阳性率。鉴于大多数RCC是ccRCC，其临床应用将使病理学家排除许多真阴性结果（ccRCC）进行进一步评估，或提名可疑病例进行进一步评估。
我们还测试了机构之间H＆E载玻片染色的差异（因此，不同的扫描仪器或载玻片制备）是否会影响我们方法的泛化性能。我们的外部验证集（数据集2）中的幻灯片来自几个机构（密歇根大学和TCGA； TCGA案例本身也来自不同的机构），并且与数据集1中的幻灯片相比，它们具有不同的颜色外观。没有颜色归一化步骤的相同分析工作流程，并且在外部验证集上观察到泛化性能大幅下降（补充图 2）。这表明色彩标准化是处理来自不同来源的全幻灯片图像时的关键步骤。
另外，我们在数据集1上测试了卷积神经网络ResNet-18。将整个幻灯片图像的大小调整为224 x 224像素，以便馈入ResNet-18。ResNet-18接受了所有案例的80％的培训，并通过五次交叉验证对其余案例进行了验证。实施了两种培训策略，即从头开始培训网络和转移学习。对于基于预训练的ResNet-18网络的转移学习，仅更新最后两层（完全连接的层和softmax层）的权重，并保持较早层的权重冻结。五次交叉验证产生的平均AUC是从零开始训练的0.518，而从转移学习开始的0.696。迁移学习的表现更好，这可能是由于使用转移学习时需要学习的参数少得多。与我们的AUC在0.8到0.9之间的分类模型相比，ResNet-18的性能较差。众所周知，深度神经网络学到的特征难以解释。但是，我们的分类流程基于细胞图像特征，这些特征在细胞和组织形态学中具有明确的含义和明确的含义，因此在临床诊断中更易解释且更可取。
这项研究有几个局限性。瘤内的异质性是在RCC一个证据充分的现象9，10，11。由于我们无法从同一病例中收集多个福尔马林固定，石蜡包埋的组织块，因此我们无法准确评估肿瘤内异质性（ITH）。尽管如此，在我们的研究中，从手术切除标本中获得了全幻灯片图像。与针刺活检相比，手术切除标本覆盖更大的肿瘤区域。此外，我们的算法通过将形态特征值的分布（十个柱状图上的直方图）作为成像特征来考虑ITH。尽管内部和外部验证集的性能始终相似，证明了我们的成像特征和分类模型的稳定性和可重复性，但如果从同一肿瘤的多个部位进行评估，则证明这些特征是稳定的将更为严格。另一个重要限制是我们的研究使用匹配的ccRCC与TFE3-RCC进行比较。TFE3-RCC有多种形态学表现1，2，5。他们还模仿乳头状RCC，透明细胞乳头状RCC，未分类的RCC，发色团RCC，肿瘤细胞瘤和其他罕见的肾肿瘤。未来的研究应包括匹配病例中的其他肾肿瘤类型和组织学变异，以进行比较。
总之，我们证明了基于定量特征的组织病理学图像分类器可以在外部验证集上以高准确度（AUC为0.894）成功地将TFE3-RCC与ccRCC区别开来，这证实了我们的假设，即肿瘤组织学表型可以反映潜在的基因易位。我们的方法可以根据常规收集的H＆E染色的组织病理切片对TFE3-RCC进行诊断，从而有助于这种罕见且具有侵略性的癌症亚型的准确样本管理和治疗开发。
收集了两个H＆E染色的全幻灯片图像数据集（共148个图像）。TFE3-RCC患者与ccRCC患者的比例为1：1，并且两个亚型之间的性别和肿瘤分级信息匹配。数据集1由来自印第安纳大学的50例TFE3-RCC患者和50例ccRCC患者组成。收集数据集2作为外部验证集，其中包含来自密歇根大学的14位TFE3-RCC患者，来自TCGA 33的 10位TFE3-RCC患者，以及来自TCGA的24位ccRCC患者。通过手术切除收集所有肿瘤样品。组织玻片以×40放大倍数扫描。分析中未包括TFEB重排的易位RCC。我们没有尝试根据具有不同伴侣基因的TFE3的重排对TFE3-RCC进行亚分类。个人健康信息在我们的数据集中被取消标识，因此，这是一项机构审查委员会批准的豁免研究。
对所有肿瘤进行并描述在原位杂交测定间期荧光如下34，35，36。所有TFE3-RCC病例的诊断均通过FISH分析确认。具体来说，从含有肿瘤的缓冲福尔马林固定石蜡包埋的组织块中制备4μm厚的组织切片。用二甲苯洗涤两次将玻片脱蜡（每次15分钟），然后用无水乙醇洗涤两次（每次10分钟），然后在通风橱中风干。然后将玻片在95°C下用10 mm柠檬酸（pH 6.0）（Zymed，San Francisco，CA，USA）处理10分钟，在蒸馏水中冲洗3分钟，然后用2x SSC洗涤5分钟。通过在37°C下40分钟施用0.4 ml胃蛋白酶（在0.01 N HCl和0.9％NaCl中每ml 5 mg）（Sigma，St Louis，MO，USA）进行组织的消化。用蒸馏水漂洗载玻片3分钟，用2×SSC洗涤5分钟，然后风干。用于TFE3的分离探针组使用BAC克隆RP11-528A24（116 kbp，位于TFE3的同位异构体，标记有5个荧光素dUTP）和RP11-416B14（182 kbp，位于TFE3的端粒性末端，标记有5-ROX dUTP） （帝国基因组学，美国纽约州布法罗）。用DenHyb2以1:25的比例稀释TFE3的BAC克隆。将稀释的探针（5μl）在减光条件下应用于每个载玻片。然后用22×22毫米的盖玻片覆盖玻片，并用橡胶水泥密封。通过在湿箱中将玻片在83°C下孵育12分钟并在37°C杂交过夜来实现变性。除去盖玻片，将载玻片在45°C下用每1.5 M尿素的0.1×SSC洗涤两次（每次20分钟），然后用2×SSC洗涤20分钟，再用2×SSC洗涤每0.1％NP-40在45°C下放置10分钟。将载玻片进一步用室温2×SSC洗涤5分钟。将载玻片风干，并用10μl4'，6-二mid基-2-苯基吲哚（Insitus）复染，盖玻片，并用指甲油密封。
用Zeiss Axioplan 2显微镜（Zeiss，Göttingen，德国）检查载玻片。使用CMOS相机获取图像，并使用元系统软件（MetaSystem，贝尔蒙特，马萨诸塞州，美国）进行分析。采集了五个间隔为0.4 mm的连续对焦叠，然后将其集成到单个图像中以减少与厚度相关的伪影。对于每种情况，通过荧光显微镜以×1000的放大倍数检查至少100个肿瘤细胞核。仅评估不重叠的肿瘤核。TFE3融合导致分裂信号模式。当绿色和红色信号被两个或更多个信号直径分开时，信号被认为是分离的。在此基础上，并基于其他可商购的FISH分离检测和TFE3 FISH分离检测， 3）。
整个幻灯片图像的每个尺寸范围约为40,000至130,000像素。将图像细分为大小为2000×2000的图块，以方便处理。考虑到机构之间的颜色差异，在特征提取之前，我们使用保留结构的颜色归一化算法37将数据集2中图像的颜色外观转换为数据集1中图像的颜色外观。为了将从患者提取的核级特征汇总为患者级特征，使用了直方图和分布统计信息。用于构建直方图特征，袋的视觉词的模型被利用38，39，40。词袋模型是一种最初用于自然语言处理和信息检索的特征表示方法。在此模型中，文本表示为单词频率直方图（即，直方图的每个bin表示文本中出现的某个单词的频率）。该方法已被计算机视觉广泛采用，其中将图像特征视为单词。在这项研究中，对于每种类型的核水平特征，我们创建了核水平特征的直方图。在此直方图中，单词（即bin的中点）是通过对训练集中的核级特征进行聚类而获得的聚类质心。
具体而言，对于每种类型的核级特征，从训练集中的患者中收集了大量核级特征，并将其输入K-means算法以学习10个代表性词（即聚类质心）。使用交叉验证方法选择簇数（补充图 4））。此后，使用欧氏距离将从一张完整幻灯片图像中提取的核级特征分配给它们最近的分类，从而得出每个患者以及每种类型的核级特征的字数直方图。对获得的直方图进行L1归一化，以消除具有不同核数的全幻灯片图像的影响。至于分布统计，为每种类型的小区级特征计算了五个参数。即均值，标准差，偏度，峰度和熵。根据归一化的直方图计算熵。
为了确定哪些特定的图像特征在TFE3-RCC和ccRCC之间表现出明显的形态差异，我们使用双面Mann-Whitney U检验比较了两个亚型中每个图像特征的分布。为了校正多个比较，我们根据Benjamini＆Hochberg调整41通过错误发现率程序调整了P值。调整后的P值<0.05被认为具有统计学意义。
由于图像特征的高维数和相对较小的样本量，可能会过度拟合数据。因此，在建立分类模型之前，我们进行了特征选择以避免过度拟合问题。使用R包mRMRe 的mRMR算法42降低了特征维数。MRMR已经显示出在各种任务鲁棒特征选择算法43，44，45。对于样本的类别标签（即TFE3-RCC或ccRCC），将mRMR算法应用于所有图像特征，以选择信息量丰富且非冗余的特征集。
使用逻辑回归，具有线性或高斯核的SVM和随机森林进行监督的机器学习。R版本3.5用于训练和测试分类模型，glmnet软件包用于逻辑回归，randomForest软件包用于随机森林，e1071软件包用于SVM。在数据集1中，使用了五重交叉验证。为了使用外部验证集进一步验证我们的方法，使用数据集1训练分类模型，并使用数据集2评估分类模型。使用R包pROC计算AUC和置信区间。
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