炎症性肠病患者罹患结肠炎相关结肠癌（CAC）的风险大大增加；但是，尚不清楚炎症诱导的肿瘤形成所需的遗传损伤的基础。使用三种模型的CAC，我们发现持续的炎症会触发8-氧代鸟嘌呤DNA损伤。令人惊讶的是，抗氧化剂或iNOS抑制剂可在CAC模型中减少8-氧代鸟嘌呤和息肉。由于失配修复（MMR）系统修复了8-氧鸟嘌呤并且经常在结直肠癌（CRC）中存在缺陷，因此我们测试了8-氧鸟嘌呤是否在Lynch综合征（MMR缺陷）模型中介导了肿瘤发生。我们表明，微生物群在MMR缺陷结肠中生成8-氧鸟嘌呤损伤的积累。因此，我们发现，与匹配的未转化组织或非林奇综合征的肿瘤组织相比，林奇综合征患者的肿瘤组织中的8-氧鸟嘌呤升高。虽然抗氧化剂可以减少8-氧代鸟嘌呤，但它们不会减少Lynch综合征模型中的CRC。因此，微生物诱导的氧化/亚硝化DNA损伤在炎症性CRC模型中起因果作用，而在Lynch综合征模型中则不起作用。
炎性肠病（IBD），例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，与结肠炎相关的结肠癌（CAC）1正相关。确实，在遗传性综合征（例如家族性腺瘤性息肉病和林奇综合征）之后，结肠中的慢性炎症被认为是结直肠癌（CRC）发展的最大已知危险因素之一。虽然已知癌症是一种遗传性疾病，但未知由CAC中的炎症引起的遗传损伤的来源。
可能直接介导炎性环境中遗传损伤的因素包括活性免疫细胞产生的活性氧（ROS）和活性氮中间体（RNI）。在炎症过程中丰富量的超氧化物（O 2 • -），和高扩散性和膜渗透的一氧化氮自由基（•否）由NADPH氧化酶以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生，分别2，3。但是，破坏DNA的ROS也可能来自内源性线粒体呼吸作用，细胞氧化酶和过氧化物酶2。不会直接破坏DNA的超氧化物可以歧化为过氧化氢（H 2 O 2），它可以通过Fenton化学物质扩散并与自由过渡金属发生反应，从而产生高反应性的羟基2。• NO本身是与DNA反应性很差，但是，它可以结合带O 2 • -以产生高反应性的过氧化亚硝酸盐同类（ONOO - ）4。这些产物可通过链断裂或鸟嘌呤氧化破坏DNA，鸟嘌呤是具有最高氧化电位的核苷酸4。鸟嘌呤氧化生成8-羟基-2'-脱氧鸟苷或8-oxo-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxoG）是诱变的。ROS产生氧化性DNA损伤8-oxoG，而一氧化氮则产生多种形式的DNA损伤，包括8-oxoG（参考文献4）。，5）。
修复DNA氧化损伤的细胞系统包括碱基切除修复（BER），由8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）和MutY DNA糖基化酶（MUTYH）进行，以及错配修复（MMR）6。ROS导致鸟嘌呤氧化形成C：8-oxoG对，这是OGG1引发的BER的底物。复制期间，可以将腺嘌呤插入8-oxoG的对面，生成A：8-oxoG对，并通过MUTYH启动的BER处理。MMR途径也可以识别并修复这些错配，但是如果不修复这种错配，第二轮复制将产生A：T对，从而导致C：G> A：T转化突变。该MMR系统的主要作用是发生作为复制错误和特定类型的失配的，包括A的结果修复DNA损伤：8-氧鸟嘌呤碱基对6，7，8。值得注意的是，MMR缺陷与CRC密切相关。具有MMR基因突变（例如MSH2）的林奇综合征患者，MSH6，PMS2，或MLH1，占所有病例CRC〜5％9。此外，另有15％的散发性CRC肿瘤带有突变或表观遗传上沉默的MMR基因。
一些研究集中在细菌毒素可能在直接破坏宿主DNA中发挥作用。但是，CAC也可能是肠道炎症期间免疫产生的ROS和RNI产生的更普遍的结果。在正常情况下，由此产生的DNA损伤可由MMR系统修复。缺乏MMR的细胞可能对氧化损伤异常敏感，并且缺乏适当的凋亡反应，因此会进一步积累驱动肿瘤形成所必需的突变。从该模型可验证的预测是，减少ROS或RNI诱导的遗传性损伤的治疗将足以防止发炎的结肠癌的发生。一些临床试验表明，抗氧化剂中和ROS可能降低CRC（参考文献10，11），虽然不是所有的研究是一致的12，13。但是，这些研究中只有一项基于患者或肿瘤遗传学对患者进行分层[ 11]，而没有一项研究评估抗氧化剂是否会影响IBD患者的致癌作用。重要的是，一项临床试验发现，维生素C（VitC）可以减轻IBD患者的氧化应激[ 14]，因此可能有效中和由ROS引起的DNA损伤并降低CAC。
病原体和肠道相关微生物对结肠直肠炎症以及肠道ROS和RNI的产生影响最大。Colibactin生产大肠杆菌（即，大肠杆菌 NC101），产肠毒素的脆弱拟杆菌（ETBF），和肝螺杆菌（肝螺杆）引起的肿瘤发生的小鼠通过刺激的慢性炎症反应15，16，17，18。在本报告中，我们研究了微生物群，遗传学和炎症之间的相互作用，以剖析肠道微生物群诱导CRC的机制。使用IL10 -/-小鼠，我们发现感染大肠杆菌 NC101，ETBF或幽门螺杆菌或葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的组织损伤导致炎症，从而在结肠组织中产生氧化DNA损伤的积累。因为MMR系统修复了8-oxoG，所以我们测试了氧化DNA损伤是否是Lynch综合征结肠癌模型的致癌介质。我们显示肠道微生物群，部分通过丁酸盐的产生，诱导ROS和MMR缺陷细胞中8-oxoG损伤和双链DNA断裂的积累。值得注意的是，在炎性小鼠模型中，通过用抗氧化剂VitC或N-乙酰半胱氨酸（NAC）或抑制RNI产生的化合物治疗，可减少DNA损伤和肿瘤发生。另一方面，在Lynch综合征模型中，VitC和NAC治疗可减少氧化性DNA损伤，但不能减少肿瘤发生。
我们利用了不同的CAC鼠模型。两种细菌感染模型和一种非生物DSS处理，以评估每种模型中的致癌机理是否相似。在第一个模型中，我们用肠肝幽门螺杆菌感染了IL10 -/-小鼠，其中一些已被证明诱导CRC 19。感染了两种幽门螺杆菌（IL10 -/- I）的IL10 -/-小鼠，即台风幽门螺杆菌（H. typhlonius）和乳杆菌幽门螺杆菌（H. mastomyrinus；补充图 1a）的组合，发展为结肠炎（图 1a， b）和结肠肿瘤（图。 1c，补充图 1b）。同窝对照IL10 +/-或未感染IL10 - / -小鼠没有开发结肠炎或肿瘤发生的主要征兆（图 1A-1C）。在单独的实验中，我们还对4周龄的IL10 -/-和IL10 +/-小鼠感染了H. hepaticus（补充图 1c）。与其他Helicobacter感染一样，H。hepaticus感染在IL10 -/-小鼠中引发结肠炎和肿瘤发生（图 1d-f，补充图 1d）。另一方面，感染了4周大的IL10 -/-啮齿类柠檬酸杆菌（C. rodentium）（补充图 1e）的小鼠未导致结肠炎或结肠息肉形成（图 1d，f）。结肠炎的发展与感染肝炎性肝炎的IL10 -/-小鼠的粪便细菌菌群组成的逐渐变化（即“营养不良”）有关（图 1g，补充图 1f）。随生的对照IL10 +/-小鼠在感染后未发展为结肠炎或结肠息肉（图 1d–f），也未发展为营养不良（图 1h，补充图 1f））。总体而言，这些数据表明，肠肝幽门螺杆菌可以触发IL10 -/-小鼠持续的炎症和营养不良，从而导致结肠肿瘤的发展。考虑到杂合子小鼠既没有发展成结肠炎也没有发展成瘤，这些发现支持了一个模型，即单个病原体+易感基因=结肠炎20，并最终导致了肿瘤的发生。
a IL10 -/-小鼠的结肠炎评分与感染了两种幽门螺杆菌（H. typhlonius和H. mastomyrinus）的IL10 -/-（IL10 -/- I）和IL10 +/-（IL10 +/- I）相比。为了说明疾病，将以下每个参数的值设为0或1：粪便排泄出粘液，直肠炎症，直肠脱垂，大便带血，体重减轻5％以上和垂死，导致最高等级为6 。ñ = 33只小鼠进行检测。数据表示为平均值+ SEM。两向方差分析p <0.0001。b以9周龄测量的结肠长度感染或未感染幽门螺杆菌的 IL10 -/-小鼠。结肠缩短表示结肠炎。N ＝ 30只小鼠。c在感染了9周大的Helicobacter感染（IL10 -/-和IL10 +/-同窝仔）或未感染的IL10 -/-小鼠的结肠中分析了息肉数目。N ＝ 35只小鼠。d 3-或4-周龄IL10 - / -或IL-10 +/-小鼠通过用口服管饲法接种肝螺杆或啮齿类柠檬酸杆菌，和结肠炎6周进行监控。ñ =检查了34只小鼠。数据表示为平均值±SEM。e从指定的基因型和治疗方法在10周龄小鼠上测量结肠长度。N ＝ 24只小鼠。f分析了来自所示基因型和治疗方法的10周龄小鼠结肠的息肉数目。N ＝ 30只小鼠。g对从感染了肝炎链球菌的IL10 -/-小鼠获得的粪便细菌进行16 S rRNA基因测序的主坐标分析。连续四个星期在肝炎H.感染之前（第0天）和之后获取粪便样品。每个点代表一只鼠标。ñ =检查了8只小鼠。h除使用IL10 +/-小鼠外，与g相同。 检查了N＝ 3只小鼠。数据b，Ç，È和˚F使用双面非参数分析吨 -test曼-惠特尼; * p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。
为了测试ROS或RNI是否导致遗传损伤，在感染了鼠伤寒杆菌和乳杆菌的IL10 -/-小鼠体内给予了iNOS抑制剂LN 6-（1-Iminoethyl）赖氨酸二盐酸盐（L-NIL）或抗氧化剂NAC。感染后8周内要喝水。值得注意的是，两种治疗方法均不影响炎症的各种指标，包括结肠长度，中性粒细胞和淋巴细胞粘膜浸润（图 2a，b）。然而，令人惊讶的是，L-NIL和NAC减少了感染了鼠伤寒沙门氏菌和乳杆菌的组合小鼠的息肉病（图 2c，d）。抗体染色显示，通过L-NIL或NAC处理，IL10 -/- I小鼠结肠上皮细胞核中的8-oxoG水平显着降低（图 2e，补充图 3a，b）。使用单独感染了鼠伤寒沙门氏菌或乳腺嗜血杆菌的小鼠，我们发现VitC治疗还可以减轻IL10 -/-小鼠的息肉病（图 2c，d）和8-oxoG水平（补充图3c-e）。 对炎症或幽门螺杆菌定植的影响（图 2a，补充图 2）。总之，这些数据表明由ROS和RNI诱导的氧化DNA损伤在IL10 -/-小鼠中由幽门螺杆菌引起的息肉诱导中起着核心作用。
在未治疗或未用L-NIL，NAC或VitC治疗的12周龄感染Helicobacter感染的IL10 -/-小鼠中测得的结肠长度。IL10 -/- I表示小鼠感染了乳腺嗜血杆菌和台风嗜血杆菌。 检查了N＝ 57只小鼠。b急性和慢性炎症进行评估组织病理学在螺杆菌感染的或未感染IL10 - / -小鼠。N ＝ 17只小鼠被检查。c在12周大的幽门螺杆菌感染的IL10 -/-结肠中分析息肉数目未经L-NIL，NAC或VitC治疗或治疗的小鼠。 检查了N＝ 57只小鼠。d c中计数的息肉根据其大小分级。e给予L-NIL或NAC的幽门螺杆菌感染的IL10 -/-小鼠结肠中8-oxoG和MitoTracker的免疫荧光。描述了每组涉及至少一只小鼠的四个独立实验的代表性图像。放大倍数100倍。比例尺= 10 µm。右图：一个点代表每只小鼠40个核的荧光中值强度。使用双面非参数分析了a，b，c和e中的数据t检验曼·惠特尼；* p <0.05，** p <0.01; ns不重要。
为了确定是否响应非生物炎症源而产生了氧化性DNA损伤，我们在饮用水中用1％DSS 处理IL10 -/-和IL10 +/-小鼠1周，然后用5周常规饮用水处理。此后，测量炎症，营养不良和息肉。尽管DSS治疗最初在IL10 -/-和IL10 +/-小鼠中均引发结肠炎，但结肠炎得分在对照IL10 +/-小鼠中恢复至基线，而在IL10 -/-小鼠中它们仍保持高水平，直到6-结束。一周实验（图 3a，b，补充图 4a）。DSS治疗在反映炎症评分的IL10 +/-和IL10 -/-小鼠中均引起微生物组成的瞬时变化（图 3c，d，补充图 4c）。然而，结肠息肉仅在经DSS处理的IL10 -/-小鼠中观察到，而在经DSS处理的IL10 +/-小鼠中未观察到（图 3e，补充图 4b）。
一只四周大的IL10 +/-和IL10 -/-小鼠用1％DSS处理1周，然后用5周的常规饮用水处理，如图1a所示监测结肠炎的发生 。 检查N＝ 20只小鼠。数据表示为平均值±SEM。b在指定基因型和治疗的9周龄小鼠中测量结肠长度。N ＝ 26只小鼠。c从DSS处理的IL10 -/-小鼠获得的粪便细菌的16 S rRNA基因测序的加权UniFrac主坐标分析。在DSS处理之前（第0天），第1、5周获得粪便样品。ñ =检查了13只小鼠。d与c相同，除了使用IL10 +/-小鼠。 检查了N＝ 7只小鼠。È息肉数目在指定的基因型和治疗的9周龄的小鼠的结肠进行了分析。N ＝ 26只小鼠。b和e中的数据使用双面非参数t检验Mann-Whitney进行了分析；* p <0.05，** p <0.01，**** p <0.0001。
为了测试DSS IL10 -/-模型中的致癌机制是否与感染幽门螺杆菌的IL10 -/-小鼠相似，我们用1％DSS 处理IL10 -/-小鼠1周，然后用L-NIL处理小鼠， NAC或VitC，持续4周。L-NIL或抗氧化剂不会影响炎症（图 4a–c）；然而，NAC，VitC和L-NIL在较小程度上减少了结肠上皮细胞核中的结肠肿瘤和8-oxoG（图 4d，e，补充图 4d，e）。因此，氧化DNA损伤是非生物CAC模型中瘤形成的主要机制之一。
将四周大的IL10 -/-小鼠用1％DSS处理1周，然后用水，L-NIL，NAC或VitC施用4周。通过qPCR定量指示的炎性细胞因子的cDNA水平。未治疗的IL10 -/-小鼠的相对mRNA表达标准化为1 。 检查N＝ 20只小鼠。b分析了9周龄小鼠的结肠长度。N ＝ 39只小鼠。c使用指定的治疗方法，对9周龄IL10 -/-小鼠的结肠进行了病理学和病理学评估。N ＝ 16只小鼠。d在9周龄小鼠的结肠中分析息肉数目。N ＝ 40只小鼠被检查。e给予抗氧化剂的DSS治疗的IL10 -/-小鼠结肠中的8-oxoG和MitoTracker的免疫荧光。描述了每组涉及至少一只小鼠的四个独立实验的代表性图像。放大倍数100倍。比例尺= 10 µm。右图：8-oxoG免疫荧光的定量。一个点代表每只小鼠40个核的荧光强度的中值，如补充图4e所示 。所有数据均使用两面非参数t检验Mann-Whitney进行了分析；* p <0.05，** p <0.01; ns不重要。
为了研究这些发现是否可以应用于另一种CAC感染模型，我们用两种细菌菌株的混合物定植了IL10 -/-小鼠，这些细菌菌株富含家族性腺瘤性息肉病患者的肿瘤18。将四周大的IL10 -/-小鼠与表达大肠杆菌素的大肠杆菌 NC101和表达易碎芽孢杆菌毒素的ETBF共克隆，并用L-NIL或VitC治疗或不治疗8周。通过PCR确认了持续的共定殖，并且不受L-NIL或VitC处理的影响（补充图 5a）。定居的小鼠在肠道中显示促炎性细胞因子的表达增加（图 5a））。但是，定植并没有引起结肠长度的改变或炎症细胞浸润的改变（图 5b，c），尽管与未定殖的小鼠相比，定植的小鼠的盲肠尺寸减小了，这表明有轻度的炎症（图 5d）。 。引人注目的是，通过L-NIL或VitC处理可降低IL10 -/-小鼠大肠杆菌 NC101 + ETBF诱导的肿瘤发生（图 5e），而不会影响炎症（图 5a-d，补充图 5b）。VitC和L-NIL也减少了感染引起的氧化DNA损伤（图 5f，补充图 5c）。因此，在三种不同的CAC模型中，尽管存在炎症，但清除ROS或抑制iNOS可以减少DNA氧化损伤，防止息肉病。这些数据支持以下观点：ROS和RNI是导致结肠中肿瘤形成的遗传损伤的主要来源，而与最初的炎症损害无关。
一个四周龄的IL10 - / -小鼠通过口腔管饲法接种大肠杆菌 NC101和ETBF，和8周治疗或未治疗用L-NIL或VITC。通过qPCR定量指示的炎性细胞因子的cDNA水平。未治疗的IL10 -/-小鼠的相对mRNA表达标准化为1 。N ＝ 24只小鼠。在所示治疗的12周龄IL10 -/-小鼠中测量结肠长度b，急性炎症和慢性炎症c，盲肠重量d和结肠息肉数e。N ＝ 25只小鼠。F施用L-NIL或VitC的大肠杆菌 NC101和ETBF感染的IL10 -/-小鼠的结肠中8-oxoG和MitoTracker的免疫荧光。放大倍数100倍。比例尺= 10 µm。右图：左侧显示的8-oxoG免疫荧光定量。一个点代表每只小鼠40个核的荧光强度的中值，如补充图5c所示 。 在三个独立的实验中检查了N= 16个样品。所有数据均使用两面非参数t检验Mann-Whitney进行了分析；* p <0.05，** p <0.01; ns不重要。
正常的新陈代谢或健康组织发炎期间发生的DNA损伤可能被BER和MMR等系统修复。MMR在家族性（Lynch综合征）和散发性CRC中均存在缺陷。为了探讨MMR在预防CRC中的作用是否与其修复氧化性DNA损伤的能力有关，我们采用了林奇综合征的小鼠模型。我们较早的研究发现，常驻肠道微生物可以显着增强Lynch综合征小鼠的CRC进展，但尚无直接的潜在诱变机制21。在这项研究中，我们没有诱发炎症，而是检查了内源产生的ROS如何影响瘤形成。值得注意的是，从微生物产生的丁酸为结肠上皮细胞代谢的主要碳源并能诱导线粒体ROS产生在体外培养的肠上皮细胞22，23。因此，我们在Lynch综合征模型中测试了作为丁酸酯代谢副产物而产生的ROS是否对DNA损伤（特别是8-oxoG病变）和CRC有所贡献。
为了确认丁酸盐可以在肠道中诱导ROS，我们用丁酸盐的生理范围（0.5–2 mM）培养了Msh2 +/-和Msh2 --/-小鼠的结肠上皮细胞30分钟。然后用DCFDA处理细胞，当它与细胞内H 2 O 2反应时发出荧光，或使用Amplex Red处理细胞，当其与细胞外H 2 O 2反应时发出荧光。结果表明Msh2 -/-结肠上皮细胞比Msh2 +/-结肠上皮细胞产生更高的基础ROS水平，丁酸处理增加了这两种基因型的ROS产生（补充图。 6a，b）。如所期望的，用谷胱甘肽前体NAC处理比细胞外H 2 O 2减少细胞内H 2 O 2的量（补充图 6a，b）。
为了测试丁酸是通过组蛋白脱乙酰基酶（iHDAC）的抑制剂还是通过其氧化代谢来诱导ROS，我们从断奶后3周用抗生素鸡尾酒（氨苄青霉素，甲硝唑和新霉素）治疗的小鼠中提取了结肠上皮隐窝，这导致肠道菌群减少约10 3倍，结肠中缺乏丁酸21。然后，我们用丁酸酯，棕榈酸酯（通过β氧化代谢的另一种脂肪酸）和曲古抑菌素A（TSA； iHDAC）处理这些隐窝。我们发现丁酸和棕榈酸酯在两种基因型中均诱导线粒体ROS产生，而TSA并未诱导ROS的增加（补充图 6c）。这些数据表明，丁酸的线粒体氧化代谢是丁酸增加结肠上皮细胞中ROS的主要机制。
由于MMR修复了ROS诱导的8-oxoG损伤，因此我们接下来测试了具有完整微生物群的Msh2 -/-小鼠结肠上皮细胞中的8-oxoG水平是否升高。实际上，与对照相比，来自Msh2 -/-小鼠的结肠上皮细胞中的8-oxoG水平增加了（图 6a，补充图 7a）。该病变取决于微生物群，因为在断奶后用抗生素混合物治疗3周的小鼠没有这种遗传病变（图 6a，补充图 7a）。
a上图：概述针对8-oxoG的免疫荧光之前的实验干预措施的示意图。在饮用水中施用抗生素鸡尾酒3周。连续三天施用丁酸盐或PBS。左图：指定治疗和基因型小鼠结肠中DAPI，8-oxoG和MitoTracker的免疫荧光。放大倍数100倍。比例尺= 10 µm。右图：8-oxoG免疫荧光的定量。一个点代表每只小鼠40个核的荧光强度的中值，如补充图7a所示 。 在四个独立的实验中检查了N = 24个样品。b左图：来自四名Lynch综合征患者的结肠中DAPI和8-oxoG的免疫荧光。放大倍率63倍。比例尺= 10 µm。右图：显示了Lynch患者（b，左图）和非Lynch患者的8-oxoG免疫荧光的定量（补充图 8b）。一个点代表每位患者40个核的荧光强度的中值，如补充图8a所示 。 在两个独立的实验中检查了N = 12个活检（加上12个匹配的正常组织）。所有数据均使用两面非参数t检验Mann-Whitney进行了分析；* p ＜0.05。
为了测试单独的丁酸酯是否能在小鼠中产生8-oxoG，在断奶后3周（出生后3-6周），用抗生素鸡尾酒对Msh2 +/-和Msh2 -//-小鼠进行治疗，然后直肠滴注100 µL连续三天服用PBS或0.5 mM丁酸 抗生素治疗的Msh2 - / -用丁直肠灌输小鼠显示增加的8-氧鸟嘌呤相比抗生素/ PBS处理的Msh2 - / -小鼠或抗生素/丁酸处理的Msh2 +/-小鼠（图 6a中，补充图 7A） ，尽管8-oxoG的水平从未达到未处理的Msh2 -/-的水平老鼠。另外，丁酸酯灌肠剂在Msh2 -/ -小鼠的结肠中诱导了双链DNA断裂标记γH2AX的剂量依赖性增加（补充图 7b）。综上所述，这些结果表明，微生物产生的丁酸酯是ROS生成的至少一种来源，其导致Msh2 -/-结肠上皮细胞中氧化DNA损伤的积累。
为了评估在Lynch综合征患者的肿瘤中氧化性DNA损伤是否也有所升高（表 1），我们用8-oxoG抗体对赘生性组织和侧翼正常组织进行了染色。从Lynch综合征患者中的肿瘤通常灭活未突变的等位基因MMR 24，25，因此，肿瘤预期是MMR缺陷，但不能侧翼组织。我们发现，与来自同一患者的未转化组织相比，肿瘤组织中的8-oxoG升高（图 6b，补充图 8a）。此外，我们检查了非林奇患者的肿瘤组织（表 2），发现这些组织中的8-oxoG水平正常（图 6b）。右图，补充图 8a，b）。因此，氧化DNA损伤在MMR缺乏的鼠类和人体组织中积累到更高的水平，表明MMR系统是肠道中8-oxoG的主要DNA修复途径。
由于抗氧化剂降低了结肠上皮细胞中8-oxoG的水平，因此我们测试了抗氧化剂是否会影响Lynch综合征模型中的CRC。我们先前已经测试了L-NIL对MMR突变小鼠中CRC诱导的作用，但未发现作用26。因此，我们将精力集中在抗氧化剂VitC和NAC上。我们首先测试了断奶后3周服用VitC和NAC是否会影响Apc min / + Msh2 +/-和Apc min / + Msh2 -/-小鼠的息肉数量。我们发现，尽管降低了8-oxoG的水平（图7e），用VitC或NAC治疗3周对这些小鼠的结肠和小肠息肉数目没有影响（图 7a）。 ，补充图 9a）。当我们观察到VitC导致Apc min / + Msh2 +/-小鼠的小肠息肉有少量但微不足道的减少时，我们也用VitC 处理了Apc min / + Msh2 +/-小鼠12周，但再次没有观察到结肠或小肠息肉数目有显着差异（图 7b）。VitC对Apc min / + Mlh1 +/- Lynch模型（图 7c）或单独在Apc min / +小鼠中的息肉数目也没有影响（补充图 9b））。我们还测试了VitC处理是否会影响Apc min / + Msh2 flox / + villin CRE小鼠中的息肉数目，其中在肠上皮细胞中仅删除了一个Msh2等位基因。该模型产生的结肠息肉病水平与Apc + / min Msh2 +/-小鼠大致相同（补充图 9c）。我们发现VitC降低了8-oxoG水平（补充图 9d），结肠息肉略有减少，但小肠息肉却没有（图 7d）。总体而言，这些数据表明抗氧化剂可有效减少氧化性DNA损伤，但不能持续减少Lynch综合征临床前模型中的结肠或小肠息肉，这表明在这些遗传背景下，氧化性DNA损伤并不是CRC的关键介体。到结肠炎模型。
将三周大的Apc min / + Msh2 +/-和Apc min / + Msh2 -//-小鼠用NAC或VitC处理3周，并测量结肠和小肠的息肉数量（6周龄）老鼠）。 检查N＝ 50只小鼠。b用VitC处理4周龄的Apc min / + Msh2 +/-小鼠12周，并测量结肠和小肠的息肉数量。 检查N＝ 20只小鼠。c四周大的Apc 分钟/ + Mlh1 +/-将小鼠用VitC处理8周，并测量结肠和小肠中的息肉数目。N ＝ 11只小鼠。d用VitC治疗4周龄的Apc min / + Msh2flox / + villin CRE小鼠12周，并测量结肠和小肠的息肉数量。每个符号代表一只鼠标中息肉的数量。N ＝ 18只小鼠。Ë左图：所示治疗和基因型小鼠结肠中8-oxoG和MitoTracker的免疫荧光。描述了四个独立实验的代表性图像，每组涉及一只小鼠。放大倍数100倍。比例尺= 10 µm。右图：左图所示的8-oxoG免疫荧光定量。一个点代表每只小鼠40个核的荧光强度的中值，如补充图9a所示 。所有数据均使用两面非参数t检验Mann-Whitney进行了分析；* p <0.05，*** p <0.001，**** p <0.0001。
ROS和RNI被认为是促进炎症过程中癌症起始的介体之一。ROS和/或RNI可以通过影响ERK，Wnt信号，的活性和Notch途径可能增强肿瘤27，28，由瞬时氧化传感器的蛋白质的硫醇基团调节MAPK和NF-κβ通路28，或通过直接诱导DNA损伤4，17，29，30。但是，尚缺乏关于ROS和/或RNI导致CAC和CRC的致突变作用的正式证据。我们的发现表明，炎症过程中高水平产生的ROS和RNI可以产生使CAC沉淀的遗传损伤。我们发现，使用三种CAC模型（用幽门螺杆菌或大肠杆菌 / ETBF或DSS处理感染），抗氧化剂或iNOS抑制剂可降低结肠的肿瘤发生和8-oxoG水平，而不会影响炎症的其他方面，有效地将这两种现象分开。我们不能排除结肠中炎症诱导的肿瘤形成的其他机制，因为用抗氧化剂或L-NIL处理的大肠IL10 -/-小鼠的息肉计数高于非大肠IL10 -/-小鼠。
使用L-NIL，其中块的•由iNOS的NO产生（参考文献31），和NAC或维生素C，这降低均为O 2 • -和ONOO - ，允许我们解剖各基团的对DNA损伤的具体贡献。它还使我们能够推断正常代谢或炎症过程中遗传损伤的来源。事实上，我们发现，L-NIL减小CRC和8-氧鸟嘌呤以相同的程度作为NAC或维生素C（图 2，4和5），这表明• NO是由炎症引起的DNA损伤的主要来源。值得注意的是，iNOS在受到感染后强烈上调，并且•NO可以在生物膜上迅速扩散，这表明•免疫细胞产生的NO可以与结肠上皮细胞内产生的内源性ROS反应以触发突变。
Colibactin是大肠杆菌 NC101 产生的一种基因毒素，最近被证明可以将DNA烷基化（参考文献32）。为什么大肠杆菌素诱导的肿瘤发生取决于IL10 -/-小鼠的氧化性DNA损伤？我们的数据支持Wilson等人提出的模型。32，其中由ROS / RNI介导的氧化对于导致大肠菌素-DNA加合物形成的初始反应是必要的。通过产生不同的遗传改变（例如染色体易位和点突变），不同类型的DNA损伤（例如加合物和氧化性DNA损伤）也可能协同促进肿瘤发生。
值得注意的是，我们以前没有发现RNI在纯合无效缺陷Msh2小鼠26中的肿瘤形成中没有作用，这与CRC的Lynch综合征模型不需要炎症的观点是一致的。值得注意的是，尽管VitC抑制了8-oxoG，但在Lynch综合征模型中它并未对CRC产生影响。该现象与Msh2基因的一个拷贝是否被破坏或两个等位基因均被去除无关。我们假设与对照21相比，Msh2 - / -结肠上皮细胞的突变率增加了十倍，掩盖了Lynch综合征模型中减少氧化性DNA损伤对CRC的影响。，这主要是由于无法修复复制错误33。未修复的8-氧鸟嘌呤导致C：G> A：T颠换突变，占在仅〜10％的所有突变的Msh2 - / -细胞33，34。因此，在MMR缺陷小鼠，复制错误的和自发的胞苷脱氨支配氧化损伤的影响33，34，这或许可以解释为什么抗氧化剂不Lynch综合征车型降低CRC。另一种可能性是息肉病以Apc min / +计 MMR杂合小鼠纯粹受Apc杂合性丧失的影响，因此抗氧化剂的任何作用都可以被Apc丧失所掩盖，而与氧化性DNA损伤无关。
我们的工作表明，MMR系统是胃肠道中氧化DNA损伤的主要修复机制。从理论上讲，ROS或RNI生成的8-oxoG也可以由OGG1或MUTYH引发的BER修复（参考文献6）。尽管我们希望OGG1和MUTYH在Msh2 - / -小鼠中起作用，但我们的工作表明，结肠细胞中的BER系统不能弥补MMR的不足。MUTYH / OGG1缺陷型小鼠在肺和小肠中显示8-oxoG的年龄依赖性积累6，而Msh2 - / -小鼠在其他组织中的8-oxoG含量增加，这表明8-oxoG的修复是由不同组织6的修复途径的不同组合介导的。
我们注意到，在用DSS处理的小鼠中，8-oxoG看起来更强且更易打断，并位于线粒体内（图 4e）。我们推测这可能与被感染的小鼠相比，在经DSS处理的小鼠中观察到的炎症更高。较高的炎症可能导致组织中8-oxoG的含量较高，并且线粒体DNA发生突变（图 4e； 8-oxoG染色与MitoTracker FM共定位）。
我们观察到，尽管DSS处理的IL10 -/-小鼠中的细胞因子mRNA表达与抗氧化剂给药的DSS处理的IL10 -/-小鼠相比无显着差异，但与DSS处理的相比，未经DSS处理的小鼠中某些细胞因子没有显着差异给予抗氧化剂的IL10 -/-小鼠。虽然我们不知道产生此结果的原因，但一种可能性是抗氧化剂在化学性结肠炎模型中而不是在感染性结肠炎模型中可能具有某些抗炎作用。
总而言之，结肠细胞中的DNA损伤可能是由炎性细胞产生的ROS / RNI和微生物代谢产物（如丁酸盐）分解代谢过程中产生的内源性ROS引起的。MMR会不断修复这种氧化/亚硝化DNA损伤，这种损伤很可能会在结肠的整个生命中发生。虽然，我们的结果表明，结肠炎和MMR缺乏模型都易于积累氧化性遗传损伤，但仅在结肠炎模型中，抗氧化剂或抑制iNOS的分子才能减少息肉病，这表明IBD患者可能会受益于此类化合物的使用。未来评估抗氧化剂在CRC中的治疗价值的研究应谨慎对待，以将其潜在危险因素和遗传变化是否归因于氧化应激而对其研究小组进行分层。
所有小鼠均处于C57BL / 6 J背景。Apc +/-用于表示Apc Min / +小鼠，其在小鼠Apc基因的外显子15上携带无意义的突变。Apc Min / +小鼠在The Jackson Laboratories上购买。IL10 -/-小鼠和Msh2 +/-小鼠分别由多伦多大学的Ken Croitoru博士和Tak Wah Mak博士提供。MSH2 + / -绒毛CRE和MLH1 - / -小鼠由温弗里德·艾德曼博士提供。无胚小鼠购自麦克马斯特大学。IL10 +/-通过使IL10 -/-小鼠与无菌小鼠杂交，产生未感染的小鼠。IL10 - / -感染H. typhlonius和H. mastomyrinus小鼠（IL10 - / - I），通过交叉IL10获得- / -与感染这两种细菌菌株导致受感染的行从IL10单独维护小鼠- / −小鼠。IL10 -/- I小鼠未经任何治疗即会自发发展为结肠炎。对于DSS诱发的结肠炎模型，在饮用水中用1％（w / v）DSS（分子量范围36–50 kDa； MP BIOMEDICALS）治疗IL10 -/-或IL10 +/-小鼠1周。
要测量结肠炎，以下每个参数的值均设为0或1：粪便排泄出粘液，直肠发炎，直肠脱垂，大便带血，体重减轻5％以上和垂死，最高评分为6。为了直肠给药丁酸盐（西格玛），在其饮用水中将1 g / L氨苄青霉素，1 g / L甲硝唑和1 g / L新霉素治疗3周大的小鼠。每周更换两次水，直到实验结束。六周大的抗生素治疗小鼠连续三天接受100 µL含0.5 mM或PBS的直肠灌肠。为了进行抗氧化剂治疗，对三周大的小鼠在其饮用水中施用了0.5％NAC，330 mg / L VitC或500 µg / mL L-NIL（开曼化学公司）。过滤新鲜制备的抗氧化剂溶液，每周更换两次，直到实验结束。-/-在特定的无病原体条件下饲养，并饲喂Teklad Global 18％蛋白质啮齿动物食物（美国威斯康星州哈兰市）。在常规条件下饲养IL10 -/-小鼠。所有实验动物程序均由多伦多大学-大学动物护理委员会批准。
肝螺杆从ATCC获得菌株3B1（ATCC 51449）。肝螺杆在37生长在Brucella琼脂补充有5％去纤维蛋白的羊血，羊血 ö在微需氧的环境（85％N c ^ 2，10％CO 2和5％氧气2）。生长4天后收获肝嗜血杆菌，并重悬于PBS中。用细菌悬浮液接种小鼠，该悬浮液的光密度为600 nm（〜10 8 CFU）为1.0，体积为0.2 mL。大肠杆菌 NC101由Christian Jobin博士（美国佛罗里达大学）提供，而ETBF由Cynthia L. Sears博士（美国约翰霍普金斯大学）提供。大肠杆菌NC101在LB肉汤中于摇动条件下生长过夜，而ETBF在BHI肉汤（与Hemin，维生素K1和Clindamycin）中于37 ° C 厌氧生长 （参考文献18）。向四周大的IL10 -/-小鼠注射含有500 mg / L头孢西丁的水48小时，然后换水至少24 h，然后口服含有5×10 8 cfu每种细菌的混合物口服接种。 0.2 mL PBS。为了在整个实验过程中监测感染状况，每周收集一次粪便颗粒，并通过PCR评估是否存在H. hepaticus，C。rodentium，E。coli NC101和ETBF（补充表 1）。），qPCR（补充表 2）或从粪便样品（来自土壤试剂盒的基因组DNA，Macherey-Nagel）中分离的总gDNA的16S rRNA基因测序。
使用来自土壤试剂盒（Macherey-Nagel）的基因组DNA并按照制造商的说明从沉淀样品中提取总DNA。使用16 S rDNA引物（补充表2）通过qPCR分析总共20 ng /μL细菌DNA ，靶向幽门螺杆菌35组。根据以前的研究36计算了目标细菌群的相对丰度和细菌密度。简而言之，通过将每个目标组的ΔCt标准化为真细菌（管家）组来计算相对丰度，并根据每个样品的DNA浓度和重量从16个S rRNA基因拷贝总数（真细菌）计算细菌密度。
按照制造商的规程，使用TRIzol？（Life Technologies）从结肠组织的近端部分提取总RNA。使用Maxima H Minus逆转录酶（Thermo Fisher）将总共1μg的无DNA RNA用于cDNA合成。对于qPCR，使用SYBR FAST qPCR预混液（Kapa Biosystems）和特异性引物（补充表3）在CFX384 Touch™实时PCR检测系统（BioRad）中从cDNA扩增基因特异性mRNA转录物 。通过熔解曲线分析验证了PCR产物的特异性。相对定量通过比较CT方法进行。用HPRT表达标准化后，数据以倍数变化表示。
使用通用的正向测序引物和独特的条形码反向测序引物扩增16 S rRNA基因的V4高变区，以实现多重37。使用12.5μLKAPA2G Robust HotStart ReadyMix（KAPA Biosystems），1.5μL10μM正向和反向引物，7.5μL无菌水和2μLDNA进行扩增反应。通过在95°C下循环3分钟，95°C下15 s，50°C下15 s，72°C下15 s的24x循环，然后5分钟72°循环反应来扩增V4区。 C扩展名。所有扩增反应均一式三份进行，在1％琼脂糖TBE凝胶上检查，然后合并以降低扩增偏差。使用Quant-it PicoGreen dsDNA分析（Thermo Fisher Scientific）对合并的三份样品进行定量，并按均等浓度合并。使用Ampure XP磁珠（Agencourt）纯化最终文库，选择细菌V4扩增条带。根据制造商的说明（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚），使用Qubit dsDNA测定法（Thermo Fisher Scientific）对纯化的文库进行定量，并加载到Illumina MiSeq上进行测序。使用V2（150 bp×2）化学试剂进行测序。
可通过USEARCH版本9.2获得的UNOISE管道用于序列分析38。从所有序列中删除了最后一个通常容易出错的碱基。组装了序列，并使用–fastq_mergepairs和–fastq_filter对质量进行了修整，将–fastq_maxee分别设置为1.0和0.5。去除了<233 bp的组装序列。按照UNOISE的流程，然后使用vsearch软件39对合并的对进行重复复制和排序以删除单例。将序列去噪，并使用USEARCH v。9.2中的unoise2命令删除嵌合体。然后使用vsearch将装配好的序列以97％的OTU映射回无嵌合的去噪序列。分类法赋值使用USEx提供的utax和与UNOISE兼容的Ribosomal Database Project数据库版本16进行，最小置信度为0.9（参考40）。使用通过QIIME访问的PyNast（参考资料41）比对OTU序列。从数据集中删除未比对的序列，并使用FastTree 42制作经过过滤的比对序列数据的系统树。从OTU表中删除了低丰度OTU（<0.005％RA）43。使用QIIME计算了α多样性，β多样性和稀疏性（参考资料41）。数据被稀疏到每个样本10,000个序列的均匀深度。主坐标分析图是使用QIIME的稀有数据，并使用EMPeror 44绘制的。
将六周大的小鼠安乐死并解剖。将结肠倒置，置于3mm搅拌棒上，并与30mM EDTA在37℃温育30分钟。然后用PBS洗涤结肠，并通过在PBS中剧烈摇动结肠1分钟将隐窝重悬。洗涤结肠隐窝，并通过与1X TRYPLE express（Invitrogen）在37°C孵育10分钟而分裂成单细胞。使结肠细胞通过注射器，通过40μM细胞过滤器过滤，并重悬于不含苯酚的无血清抗生素的Advanced F12培养基（Thermo Fisher）中。细胞外H 2 O 2使用Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶含量测定试剂盒（Invitrogen）测量产量。简而言之，用0.1％NAC，0.5 mM丁酸钠或PBS处理结肠细胞。通过向100 µl反应缓冲液中加入20 µl 1.5×10 4结肠细胞来开始反应。使用酶标仪（SpectraMax 300）在30分钟内于530/590 nm激发/发射下测量荧光。使用CM-H 2DCFDA（Invitrogen）测量细胞内H 2 O 2的产生。简而言之，将结肠细胞与5 µM CM-DCFDA在37°C下孵育30分钟。用培养基洗涤结肠细胞，并以2×10 4接种每口井。用0.1％NAC，2 mM丁酸钠或PBS处理细胞，并在495/520 nm处测量荧光。
在丁酸盐处理后的6周龄或24 h，对小鼠实施安乐死，解剖并在OCT（最佳切割温度化合物，Thermo Scientific）中冷冻结肠。将Swiss-roll-frozen结肠切成5 µM切片，并置于微片上。为了独立于膜电位对线粒体染色，将结肠切片与200 nM的MitoTracker FM（Molecular Probes，USA）在室温（RT）下孵育15分钟。轻轻除去MitoTracker溶液，将切片用4％多聚甲醛固定，用TBS- 0.1％吐温洗涤，并用0.5％100X Triton渗透15分钟。为了检测氧化的DNA，将切片与100 µg / mL RNase A在37°C孵育1 h，并与10 µg / mL蛋白酶K孵育10 min 45。。通过用2 M HCl短暂孵育5分钟解开DNA，然后用1 M Tris-碱中和7分钟。通过与山羊F（ab）抗小鼠IgG H＆L在10％BSA（Abcam，1：100）中于室温孵育1小时，可以阻断非特异性结合。将切片与抗8-oxoG抗体（QED Bioscience，1：100）在室温下孵育过夜，然后与带有PE标签的抗小鼠IgG2b抗体（BioLegend，1：400）孵育。用DAPI对DNA染色，并用Fluoromount（Sigma）固定玻片。用AxioObserverZ1旋转盘共聚焦显微镜获得荧光图像。使用ImageJ分析每视野十个核和每小鼠四视野的荧光强度。为了检测双链DNA断裂，将结肠切片与抗γH2AXSer139抗体（EMD Millipore，1：100）在4°C孵育过夜，
新鲜的冷冻人CRC样本是从LTRI-生物样本存储库和处理实验室获得的，并经过处理后用于8-oxoG检测。
为了验证抗8-oxoG抗体的特异性，将五个寡核苷酸：ATCGx5，ATCCx5，AAAAx5，TTTTx5和CCCCx5用H 2 O 2处理，并在硝酸纤维素膜上以系列稀释液吸干。将该膜暴露于UV光5分钟以使寡核苷酸交联，并通过与10％BSA在RT温育1小时来封闭。用PBS洗涤后，将膜与抗8-oxoG抗体（1：1000）在室温孵育1小时，然后与HRP标记的山羊抗小鼠抗体（Southern Biotech，1：4000）孵育。将膜与Clarity Western ECL（Biorad）一起孵育，并用Microchemi 4.2 Bioimaging系统（DNR）检测发光。
用抗生素混合物治疗小鼠（参见小鼠和治疗部分）。在6周龄时，对小鼠实施安乐死并解剖。通过将结肠与30 mM EDTA（37°C，30分钟）在以下条件下孵育来提取地穴：0.5 mM丁酸酯，100 µM棕榈酸酯或2 µM TSA（三抗素A）。温育后，通过在PBS中摇动结肠提取隐窝。然后，将隐窝洗净并与含有200nM线粒体红色的CMXRos（Molecular Probes，USA）和100nM线粒体深红色FM（Molecular Probes，USA）的混合物在黑暗中孵育，该混合物对代谢活性的线粒体进行染色。温育15分钟后，将隐窝洗涤，细胞纺丝，固定并用DAPI复染以通过免疫荧光进行分析。每场15个细胞中CMXRos的荧光强度，
用冷PBS冲洗肠道，打开并测量息肉。然后，通过瑞士卷方法制备结肠，将其包埋在OCT中，并快速冷冻。在低温恒温器上切成5μm的切片，并用苏木精和曙红染色。通过盲法通过显微镜进行急性和慢性炎症的病理评估。急性炎症仅基于嗜中性粒细胞浸润，这在健康组织中非常罕见。慢性炎症是基于浆细胞和淋巴细胞的浸润。经过近端结肠后，深固有层中浆细胞很少。因此，慢性炎症是由粘膜固有层底部1/3的近端结肠附近的浆细胞（和淋巴细胞）的存在定义的。
使用GraphPad Prism 7.0版分析数据。除非另有说明，否则所有数据均使用非参数t检验（Mann-Whitney）进行分析；* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。所有误差条代表SEM。
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