免疫检查站封锁疗法已使患者在多个癌症谱系中的生存期延长，但是关于男性和女性患者的癌症免疫疗法功效是否存在争议。我们总结了现有的荟萃分析，以显示关于性别是否与免疫治疗反应相关的结论不一致。我们分析了来自ICB治疗患者的分子谱，以鉴定免疫治疗反应性的分子差异。我们对癌症基因组图谱（TCGA）的患者进行了综合分析，并揭示了多种癌症类型免疫功能的性别偏见模式。我们进一步验证了我们在多个独立数据集中的观察结果。考虑到大多数临床试验都在黑色素瘤和肺癌中，荟萃多种癌症类型的荟萃分析在分辨男性和女性患者的癌症免疫疗法功效是否有所不同方面存在局限性。未来的研究应包括组学分析，以研究免疫疗法中与性别相关的分子差异。
免疫检查点封锁（ICB）治疗，包括对程序性细胞死亡1（PD-1）或配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）的抑制，已使患者在多个癌症谱系中的生存期延长1。基于性别的免疫学差异可能会对免疫反应产生潜在影响2，但其对癌症免疫治疗的作用尚不清楚。有基于大型荟萃分析为癌症免疫疗法功效是否是男性和女性患者之间是不同的激烈的争论3，4，5，6。Conforti等。4，5据报道，通过随机临床试验的荟萃分析，接受免疫检查点抑制剂治疗的男性患者比女性患者具有更高的疗效。相比之下，其他两项研究提出了相互矛盾的，有与免疫治疗男性和女性患者之间疗效无显著差异导致3，6。这些荟萃分析基于已发表的临床试验的亚组危险比（HR），并且可能由于缺乏对单个患者的分析和/或他们在男女之间的分布特征（包括吸烟行为和临床病理亚型3，7。
已经进行了巨大的努力来鉴定一系列生物标志物以预测对免疫疗法的反应。肿瘤具有高的肿瘤突变负担（TMB）8，9，10，11趋向于呈现多种免疫原性新抗原来增强T细胞的识别和杀死肿瘤细胞的能力12。PD-L1在肿瘤细胞和抗原呈递细胞上均活跃表达，并且对PD-1的抑制可能会影响淋巴结早期的多个步骤以及随后在肿瘤微环境中的免疫反应13。T细胞发炎的基因表达谱（GEP），包括与IFN-γ相关的应答基因，细胞毒活性，趋化因子表达和适应性免疫抵抗，与对PD-1抑制剂pembrolizumab 14的应答相关。细胞溶解活性（CYT）15可以增强适应性转移T细胞的抗肿瘤活性，因此，从ICB治疗中获得临床益处的患者比从ICB治疗中获得最小益处的患者具有更高的CYT 10。其它潜在生物标志物也有报道，其中包括新抗原负载16，17和蛋白质表达或检查点介质的mRNA的表达（例如，CTLA-4）18。在这里，我们进行了全面的分析，以调查这些生物标记物在免疫成分中的性别相关分子差异，以更好地了解性别对免疫疗法功效的影响。
为了解决有关的癌症免疫疗法是否是性别之间不同的争论中，我们总结从提到ICB治疗试验中可用的数据性别效应以前荟萃分析3，4（补充表 1和补充图 1）。我们采用了灵巧的方法，使用随机效应模型19（请参阅补充方法）来计算HR和合并的HR的试验特定比率。 通过将两项荟萃分析的27项临床试验合并在一起，我们观察到合并的HR无关紧要（1.07； 95％置信区间（CI）：0.95-1.19；随机效应模型[REML]，p = 0.28）（图 1）。）。与Conforti等人相比，Wallis等人。使用不同的选择标准添加了8个临床试验（8个试验中有6个显示女性患者的总体生存[OS]优势），并删除了4个临床试验（所有男性患者均具有OS优势）。对于每个单独评估的临床试验，我们观察到7项临床试验中有6项显示男性黑色素瘤患者具有OS优势。有趣的是，在对非小细胞肺癌（NSCLC）患者的研究中，不一致的益处尤其明显，因为11项临床试验中有6项显示男性患者具有OS优势，而11项临床试验中有5项在男性中具有OS优势。女性患者（图 1）。这些结果表明，仅仅汇总不同的临床试验可能无法提供明确的结果。此外，考虑到先前荟萃分析的对照组的异质性，我们基于详细的对照组治疗方法（补充表1）分析了性别效应 ，包括5项多西他赛试验和4项安慰剂试验。我们采用了灵巧的方法来计算免疫疗法与多西他赛疗法的心率和合并心率的试验特异性比值（HR：1； 95％CI：0.85–1.2； REML，p = 0.23；补充图 2a），以及免疫疗法vs。安慰剂（HR：0.85; 95％CI：0.66-1.1; REML，p = 0.22;补充图 2b），并再次观察到不同控制臂的收益不一致。此外，我们还分别对抗PD-1 / PD-L1和抗CTLA-4治疗进行了灵巧分析。对于合并的抗PD-1 / PD-L1临床试验，我们观察到合并的HR无关紧要（HR：1.04； 95％CI：0.90–1.2； REML，p = 0.61；补充图 2c）和合并的抗CTLA-4临床试验（HR：1.20； 95％CI：0.95-1.51； REML，p = 0.12；补充图 2d），可能是由于每次试验的获益不一致。综上所述，我们的结果表明仅通过荟萃分析很难解决这一争论。
为了理解改变免疫应答性相关的分子机制，我们得到的ICB处理数据集以用于个别患者分子谱9，10，20，21，22，23，24（补充表 2）。比较女性患者和男性接受ICB治疗的OS的HR，我们观察到了差异模式（图 2a）。患有结肠直肠癌（COAD;对数秩检验，p = 0.041;补充图 3a）的男性患者或多形性胶质母细胞瘤（GBM;对数秩检验，p = 0.011;补充图 3b））使用抗PD-1 / PD-L1治疗显示出更好的OS。患有食管胃癌（ESCA）或NSCLC的女性患者往往有更好的OS。我们进一步观察到女性患者（16/32 = 50％）比男性患者（6/24 = 25％）有更高的缓解率趋势（补充图 3c）。这些数据集中的样本量或其他混杂因素可能会限制统计功效。我们进一步分析了这些免疫疗法数据集中报道的分子生物标志物，包括肿瘤突变负担（TMB），单个基因突变（PBRM1，BRCA2），T细胞炎症基因表达谱（GEP），新抗原负荷，溶细胞活性（CYT）和蛋白质检查站的表达（CTLA-4，PD-L1，PD-L2）9，10，20，21，22，23，24。我们观察到男性黑素瘤（Mann-Whitney-Wilcoxon [MWW]检验， p = 0.027； p = 0.00039；图 2b和补充图 3d，e）和膀胱癌（BLCA； MWW检验， p = 0.0024；图 2b和补充图 3 f）。与此相一致，我们观察到BLCA的男性患者倾向于具有更高的新抗原负荷（MWW试验， p = 0.0054；图 1c和补充图 3）。G）。我们在患有透明细胞肾细胞癌的男性患者中观察到PBRM1的突变率显着更高（ccRCC； MWW测试，p = 0.040；图 2b；补充图 3 h）。其他预测指标在性别之间没有显着差异，这可能是由于样本量有限所致。
Cox比例风险模型中接受免疫疗法治疗的女性患者与男性患者的单变量生存分析，来自五个数据集，涉及九种癌症类型。正方形颜色表示女性（红色）或男性（蓝色）的操作系统优势。正方形大小指示cox p值的重要性。黑色水平线表示95％CI。b在七个免疫疗法数据集中，报告了针对多种癌症类型（y轴）进行免疫治疗的分子生物标记物的性别差异（x轴）。连续变量使用双面Wilcoxon–Mann–Whitney检验，离散变量使用Fisher精确检验。蓝色单元格：p的男性偏见 <0.05，淡蓝色细胞：雄性偏置用0.05≤ p <0.2，粉红细胞：阴偏压0.05≤ p <0.2。空单元格表示数据不可用。补充表2中列出了每个数据集的样本量 。ccRCC透明细胞肾细胞癌，BLCA膀胱癌，COAD大肠癌，ESCA食管胃癌，GBM胶质瘤，HNSC，头颈癌，NSCLC非小细胞肺癌，PanCan多种小样本癌症。PD-L1 / PD-L2编程设定细胞死亡配体1/2，CTLA-4细胞毒性T淋巴细胞抗原4。GEP T细胞发炎的基因表达谱，CYT细胞溶解活性。
我们进一步利用了来自TCGA 25的大样本量和多组学数据，研究了男性和女性组中≥20个样本的22种癌症类型免疫成分的性别相关分子差异（图 3a和补充表 3） 。为了减少潜在的混杂影响，我们采用了倾向评分算法，这是控制观察研究混杂的重要统计工具，并已广泛应用于临床研究26，27，以reweight在一个多元的方式潜在的混杂影响26（例如，诊断时的年龄，种族，吸烟状况，肿瘤分期，组织学类型和肿瘤纯度；请参见方法；补充图。 4b）。我们可视化了男性和女性组的倾向得分分布，并观察到每种癌症类型中男性和女性之间的高度重叠（补充图 4c），表明适合使用MW方法28。我们纳入了接受ICB治疗的患者中使用的所有生物标志物（图 3b），以及其他用于免疫治疗的重要生物标志物29，包括免疫细胞群（图 3c），检查点（图 3d），TCR / BCR和非整倍性得分（通过体细胞拷贝数变化[SCNV]评估；补充图 5）。与ICB治疗数据集一致，我们观察到TMB（线性回归模型，p = 0.038；Benjamini和Hochberg校正，FDR = 0.17；补充图 6a；在此部分中对p和FDR进行了相同的统计分析），单核苷酸变异新抗原负荷（p = 0.0072; FDR = 0.12;补充图 6b）和PD-L1（p = 0.0036; FDR = 0.035;补充图。 图6c）在男性黑素瘤患者中（图 3b）。我们还观察到其他几种具有男性偏倚的免疫功能的癌症类型，包括肾肾乳头状细胞癌（KIRP），其表现出显着更高的TMB（p = 0.009; FDR = 0.099;补充图 6d）和CYT（p = 0.0061；FDR = 0.099；补充图 6e）（图 3b），免疫细胞的相对丰度较高（图 3c）和免疫检查点的mRNA表达较高（图 3d）。相反，几种癌症类型显示出女性偏向的免疫特征。例如，患有肺鳞状细胞癌（LUSC）的女性患者具有较高的生物标志物水平，包括CYT（p = 0.016; FDR = 0.099;图3 b;补充图 6 f），GEP（p = 0.0017; FDR = 0.038;图3 b;补充图 6 g），活化CD4 +的相对丰度 T细胞和活化的CD8 + T细胞（图 3c），34个免疫检查点中的20个（图 3d）和TCR丰富度（p = 0.0028； FDR = 0.062；补充图 6 h）。我们还观察到女性LUSC患者的非整倍性得分明显低于男性患者（p = 1.1×10 -4 ; FDR = 0.0023;补充图 6i）。有趣的是，我们在刺激性免疫检查点（例如TNFRSF4，TNFSF4，ICOS和CD27）和抑制性检查点（例如PDCD1，LAG3，CTLA-4和ADORA2A）上观察到女性偏见。免疫系统复杂，刺激性免疫检查点在免疫激活中起着重要作用，而抑制性免疫检查点的过表达为其他抗检查点和/或联合治疗提供了机会，因此可以改善免疫疗法的临床效果30。尽管如此，我们的观察结果表明，不同癌症类型的免疫特征存在不同的性别偏见（例如，黑色素瘤中的男性偏见与LUSC中的女性偏见）。
一个用来平衡混杂影响，包括年龄，种族，肿瘤纯度，肿瘤分期，亚型和吸烟史的倾向评分算法的概述，并评价性相关的免疫功能，包括TMB，新抗原负载，TCR / BCR，检查站，各种癌症类型的免疫细胞群和非整倍性。b在男性和女性患者的免疫治疗数据集中报告了分子生物标志物的差异，包括TMB，新抗原负荷，GEP，CYT和PD-L1蛋白表达。条形图表示显着的女性偏向特征数量减去显着的男性偏向特征数量。C六个免疫细胞群相对丰度的差异，包括活跃的CD4 / CD8 T细胞，效应记忆CD4 / CD8 T细胞，骨髓来源的抑制细胞和调节性T细胞。d 34个免疫检查点（包括LAG3，CTLA-4，PDCD1和CD274）的mRNA表达水平差异。X轴表示免疫特征。ÿ的轴线b - d表示由倾向评分算法来分析，并命令通过显著雌性偏置特征的数量减去在显著雄性偏置特征的数量22的癌症类型b。使用倾向评分算法进行统计分析以识别免疫相关特征（请参阅补充方法）。p通过线性回归模型计算-值，并通过Benjamini和Hochberg校正进行调整。FDR在b – d中标记为红点（女性偏见）和蓝点（男性偏见）。补充表3中列出了每个数据集的样本量 。
为了验证我们在TCGA数据中的观察结果，我们检查了多个其他独立数据集。我们观察到雄性偏置图案基于TMB（图黑色素瘤患者 3B）和在两个独立的黑色素瘤数据集的样本大小≥100证实这个模式中，与显著更高TMB（线性回归模型，p = 9.4×10 - 4；p ＝ 0.0031；补充图 7a）。我们根据免疫检查点（例如，CD28和CD86）和免疫细胞群（例如，活性CD4 + T细胞）观察了TCGA中患有肾性肾透明细胞癌（KIRC）的男性偏倚模式，并确认了这种模式在一个独立的数据集中标记为ccRCC的同一癌症31（补充图 7b）。相比之下，我们根据免疫检查点（例如BTLA和CD80）和免疫细胞群（例如激活的CD4 + / CD8 + T细胞）观察了TCGA中肺癌患者的女性偏向模式，并在一项独立数据中对此模式进行了验证设置（GSE47115）32（补充图 7b）。我们的结果进一步证实了多种癌症类型免疫功能的性别偏见的差异模式。
越来越多的证据表明，基于自身免疫疾病和对感染的免疫应答中存在基于性别的差异2，但尚不清楚这些差异是否有助于癌症免疫治疗。最近的大型荟萃分析表明矛盾的结果3，4，5，6。但是，荟萃分析的潜在局限性已经由研究团体进行了讨论。例如，荟萃分析依赖于已发表的结果而不是单个患者的数据7，荟萃分析中的选择标准可能会导致矛盾的结论33。此外，很难控制混杂的影响，例如男性和女性34之间的生活方式或行为差异。我们总结了现有的荟萃分析，以显示IO数据可能无法就性别是否与免疫治疗反应相关给出明确的结论。通过分析接受ICB治疗的患者，TCGA患者以及几个独立数据集的分子谱，我们证明了黑色素瘤和NSCLC在性别影响方面的差异。这两种癌症类型是荟萃分析中最常见的癌症类型，这是因为针对这些处于完全或活动状态的癌症类型进行的ICB临床试验数量最多（图 4）。因此，通过汇总所有癌症类型进行荟萃分析可能是不合适的。
抗PD-1 / PD-L1和抗CTLA-4跨癌症类型为2019年4月16的ICB临床试验次数，具有状态一完成，b活性，不招募。
以前的研究已审查的限定类型的免疫相关的生物标志物（例如，TMB和GEP）或男性和女性患者之间的样本数目的限制的，并报道雌雄偏置或非显著图案35，36。在这项研究中，我们不依赖单个生物标记物，而是对多种免疫特征进行了全面分析，包括ICB治疗患者和大量TCGA患者的免疫细胞群，检查点，TCR / BCR和非整倍性得分，从而提供了一个研究免疫疗法中性别偏见的更全面视角。我们观察到了不同癌症类型之间性别相关差异的出乎意料的差异模式，尤其是黑色素瘤和肺癌患者之间的相反模式。我们的分析中性别也表现出差异在临床试验中使用的其它免疫检查点（例如，LAG-3以及IDO1）37，38，表明了ICB试验中对性别影响的未来考虑。有趣的是，我们观察到PD-L1的mRNA表达和蛋白表达之间存在差异，这可能是由于mRNA和蛋白的中等相关性所致（补充图 8）。）。此外，我们使用了严格的计算方法，即倾向得分分析，以减少用于评估与性别相关的分子特征的混淆效应。值得注意的是，我们仅考虑了这些数据资源提供的混杂因素，而没有考虑其他未提供的因素，例如更年期状态。使用严格的计算方法对多组学数据进行综合分析将超过或至少补充荟萃分析的结果。据我们所知，我们的结果为解决关于男性和女性癌症患者在免疫治疗功效方面分子差异的激烈辩论提供了最全面的前景。我们的数据强调了在未来的临床试验中纳入分子谱数据的重要性，以了解性别对免疫治疗的影响。
27种ICB治疗八种癌症的临床试验（黑素瘤7种； NSCLC 11种；小细胞肺癌[SCLC]，头颈癌[HNSC]和ccRCC 2种；间皮瘤1种，尿路上皮癌和胃癌或胃食管交界处癌[GOJC]）从两个先前的荟萃分析研究中获得的3，4（详细信息是在补充表中所列 1）。我们进行了灵巧的方法19。简而言之，我们评估了每项试验中性别对免疫疗法疗效的影响，并使用随机效应模型的荟萃分析汇总了所有试验中的估计值。这些相互作用是女性患者和男性患者之间ICB治疗功效的差异。危险比（HR）> 1表示男性患者接受ICB治疗的OS优势，而HR <1表明女性患者接受ICB治疗的OS优势。
我们进行免疫治疗的数据集的分子谱综合分析，其中四个黑素瘤数据组，两个肺癌数据组，两个膀胱癌数据组，两个肾细胞癌的数据集和其它癌症类型9，10，20，21，22，23，24（补充表 2）。生存分析通过R包生存进行。通过Cox比例风险模型计算HR，并报告95％CI，并通过Survfit函数对Kaplan–Meier生存曲线进行建模。双面长期检验用于比较Kaplan–Meier生存曲线。男性和女性患者中受益和非受益百分比的比较是通过Fisher精确检验确定的。我们检查了这些研究中报告的潜在生物标志物的分子差异，以研究改变免疫疗法反应性的潜在机制，包括TMB，单个基因突变（PBRM1，BRCA2），GEP，新抗原负荷，CYT和检查点介体的蛋白表达（CTLA-4，PD） -L1，PD-L2）。
我们将我们的分析扩展为TCGA数据25，其中女性和男性组中22种癌症类型的样本均≥20个（补充表 3）。突变，基因表达和蛋白质表达可从TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）获得。非整倍体的值，T细胞受体/ B细胞受体的丰富度（TCR / BCR）和新抗原负荷量可从Thorsson等获得。39（https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/panimmune）。从Auslander等人获得在T细胞中具有已知的共同刺激或共同抑制作用的免疫检查点基因。40我们使用了基因组变异分析41（GSVA）可根据Charoentong等人的六个免疫细胞群的基因特征来计算每个样品中免疫细胞群的相对丰度和GEP水平。42和Ayers等人的GEP基因签名。14 CYT被计算为两个细胞溶解标记（GZMA和PRF1）43基因表达的几何平均值。为了平衡男性和女性患者之间潜在的混淆因素，包括诊断时的年龄，种族，吸烟状况，肿瘤分期，组织学类型和肿瘤纯度，我们使用倾向评分算法26。患者的年龄和肿瘤纯度是连续变量，而其余混杂因素是分类变量。简而言之，我们首先使用性别作为因变量的逻辑回归来计算倾向得分，并使用匹配权重方案44根据样本的倾向得分对样本进行加权。我们使用标准差对倾向得分加权后的协变量平衡进行了检查，该标准差由两个比较组之间的平均协变量差除以合并的标准差定义。然后，我们比较了这两个平衡基团之间的分子特征，并认为FDR <0.2是有意义的。
为了进一步证实背景性别偏见的影响，我们通过国际获得了两个独立的TMB数据，分别来自澳大利亚（皮肤癌-澳大利亚[MELA-AU]）和巴西（皮肤腺癌-巴西[SKCA-BR]）的黑色素瘤患者癌症基因组联盟项目（https://dcc.icgc.org/）。我们获得了两个独立的数据集，分别是肺癌（GSE47115）32和透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者（GSE73731）31的基因表达数据。使用上述倾向评分算法进行统计分析，我们认为FDR <0.2为显着性。
我们于2019年4月16日之前在ClinicalTrials.gov上搜索了所有癌症类型的“免疫检查点封锁临床试验”，以显示完成状态，活跃状态，而非募集状态。我们通过至少两项临床试验保留了癌症类型。我们对每种癌症类型中的治疗策略进行了分类，包括抗PD-1（派姆单抗，尼武单抗，西米普利单抗），抗PD-L1（阿佐利珠单抗，阿伐单抗，durvalumab）和抗CTLA-4（依皮单抗，特雷莫单抗）。
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