由克隆进化介导的耐药性可以说是当今癌症治疗中最大的问题。但是，对一种药物的抗药性可能会降低生育力或增加对另一种药物的敏感性。这些进化的权衡可以利用“进化导向”来控制肿瘤的数量和延迟抵抗力。然而，从实验上概括癌症进化动力学仍然具有挑战性。在这里，我们提出了一种基于单细胞条形码，10 8 –10 9大种群的组合的进化导向方法无需重新铺板即可生长的细胞，对癌症克隆的纵向无损监测以及肿瘤进化的数学模型。我们在肺癌模型中证明了进化指导，表明它改变了对我们有利的肿瘤克隆组成，从而导致附带敏感性和增殖成本。基因组分析揭示了一些驱动进化的敏感性的机制。这种方法可以模拟可能控制治疗耐药性的进化指导策略。
尽管靶向的癌症疗法在许多患者中有效1，但治疗抗性阻碍了疾病的彻底根除，目前，治疗抗性是癌症中一个棘手的问题。耐药性通常是由下游信号通路2的冗余，细胞表型可塑性3以及最重要的是肿瘤内异质性（ITH）4介导的。ITH，并在肿瘤细胞的数量庞大的高的水平，意味着预先存在的癌症的亚克隆是由于药物抗性遗传的遗传5或后生6，7个改变是不变地存在时开始治疗8，9从而导致达尔文式的适应10。治疗抗性也可以是多克隆的，多个不同的亚克隆具有不同的抗性机制驱动肿瘤的进展，从而使抗性更加难以控制11。此外，药物耐受性癌细胞或“persistors”才能生存并获得从头改变对于治疗期间或治疗后产生完全的耐药性亚克隆12，13。如细菌15的经典Luria-Delbruck实验首次证明，在治疗之前存在的种群在适应之前是健康中性的（甚至有害的）14，并通过干预被积极选择。
因此，癌症不可能用单一药物成功治疗16。尽管联合策略通常是剧毒且不切实际的，但对于最有效的药物序列知之甚少。施用药物可敏化癌细胞的第二种药物，被称为侧支灵敏度的现象，这已被证明在精液研究在细菌17，18，19，疟疾20和癌症14，21，22。这是基于以下观察结果：与生态系统一样，开发新特征（例如抗癌治疗）可能会以牺牲其他特征为代价23，24，导致折衷经常被称为“演化双重绑定” 25，26。实际上，电阻的费用已在不同的病原生物体观察 27以及在癌症 28，29。
进化指导是指使用药物干预以权衡取舍来控制肿瘤的发展。目的是使用达尔文式药物适应性来指导肿瘤种群的进化。当给药第二种药物时，无性系组合物是从一开始就不同，这会导致增加的灵敏度，或甚至完全消失30，31。在这种情况下，由于转向改变了人群的克隆结构，因此附带药物敏感性可能会持续存在，而不是短暂的。依靠合理的进化指导来控制克隆进化的治疗策略可能较少受到随机临时作用和细胞可塑性的影响，因此在临床上可能更可行。
在这里，我们介绍一种基于单细胞条形码，无需重新铺板即可生长的非常庞大的10 8 –10 9细胞种群，癌症克隆的纵向非破坏性监测以及肿瘤进化的数学模型的组合的进化指导方法。我们使用这种方法来定量研究进化导向，并证明了癌细胞群中附带药物敏感性的进化决定因素。
标准的实验方法不足以研究进化指导，因为它们仅限于无法概括人类恶性肿瘤中广泛存在的ITH的小种群32。目前研究耐药性的方法依赖于在低药物有效浓度（例如EC50）或递增剂量下反复传代细胞，直到6个月至一年后出现完全耐药表型为止33。尽管这些技术可用于产生完全抗性的品系，但这些系统中的时间进化动力学与患者不同。首先，当前的技术基于等待从头突变，而不是选择预先存在的亚克隆（图 1a）。）。这意味着在每个重复中，进化过程是不同的，这是由新突变的随机到达所驱动的，其等待时间非常可变，正如我们在图1b中的随机模拟所证明的那样 （请参见“方法”部分）。甚至不能保证在每个重复中都出现相同的抗性突变，因此使得重复比较困难并且难以概括。第二，重新电镀会导致难以控制的采样瓶颈，从而导致遗传漂移和ITH随时间的人为损失（补充图 1A）。每在癌症每细胞分裂碱基突变率是在10顺序-8 -10 -7（参考文献21，30，34），并使用标准384孔板或什至T175瓶，连10个传代（假设1:10重铺）不足以在种群中拥有单个突变体（补充图 1b），而是种群的10倍需要一个T175烧瓶（有关计算的详细信息，请参见“方法”部分）。因此，小型培养系统有可能将进化动力学推向很难预测和控制的高度随机的方案。此外，细胞可塑性和药物耐受性35是药物适应的重要机制，导致耐药性是不可继承的并且可能是可逆的6。可以通过上皮-间充质转换出现非遗传耐药27，36，37或药物外排泵上调 38。在由随机力和从头突变产生的小型养殖种群中，很难区分耐药性的遗传和非遗传成分。
a当前的方法是使用少量种群进行重新接种并逐步增加药物剂量，以产生6-12 m的从头耐药株。在这种情况下，进化动力学是高度随机的，在不同的时间以不同的重复出现不同的突变体。b的等待时间，以在目前的实验抗性克隆的出现随机建模方法表明，这是极其易变（再镀每2周，1:10，抗性突变率2×10 -8，10次4的模拟）。C容纳大量种群的系统更可能包含预先存在的抗性亚克隆，无需重新铺板即可生长，并导致抗性的进化动态，在很大程度上可以确定，可重现和可预测。d总结当前方法与我们提出的方法之间的差异。Ë可以将药物对异类种群的选择性作用可视化为适合度图。遗传上不同的细胞由水平面中的点表示，而它们在特定环境中的适合度为垂直轴。不同的药物具有不同的前景，针对不同的克隆进行选择。为简单起见，在此我们假设在没有药物的情况下所有克隆都一样适合（平坦景观）。药物1改变了格局，选择y和z，但选择x。药物2仅选择z，药物3仅选择y。f首先，基线时存在细胞群，此处为简单起见同样适合。G药物1选择克隆那些对药物2.耐ħ应用第一药物3个通向人口，其与普通以下值以药物2。这里基因型完全敏感的进化转向具有负健身和因此它们的频率将降低，直到他们去灭绝。
在这里，我们提出了一种实验方法，该方法利用包含可追踪的既有抗性亚克隆的大量种群（> 10 8），具有高度可复制的进化动力学（图 1c）来克服标准方法的局限性（图 1d）。
可遗传的遗传或表观遗传信息与相应的细胞表型之间的关系可以通过经典的适应度景观模型39来表示。表型是多方面的，是遗传因素与环境之间复杂相互作用的产物。如果我们通过单个值总结这些复杂表型相对于特定条件或环境的适应性，则基因型-表型关系可以表示为n +1维空间，等位基因位于n（epi）个遗传基因座被映射到它们赋予的相对适应性优势。因此，单个单元格可以由该格局中与其（epi）遗传状态相对应的点表示。随着种群的增殖和随机突变，细胞谱系在景观中移动。在一个简单的示例性无毒品场景中（图 1e），由于突变，多个细胞都散布在中立的“平坦”健身环境中，每个细胞均具有某种基因型（x，y和z）。当使用药物（例如药物1）时，适应性状况会发生变化，并且在新条件下（例如y和z），以前为中性（甚至略有毒害）的基因型可能会变得有利。），然后与其他竞争（例如x）。由于达尔文式的选择，处于较低适应度海拔的人群可能会灭绝，而处于“高峰”适应期的人群将会繁荣。这使种群“攀登”越来越高的适应峰，从而导致进化适应。
不同的药物可以选择不同的表型（例如，y和z由药物2和3进行差异选择-图 1e）。在不同的健身环境中使用药物是进化指导的中心思想。该概念在图1f中示出 。肿瘤尿形成引起癌细胞的异质群体，其是达尔文选择操作的底物。当使用药物1时（图 1g），只有新适应峰附近的种群存活，而适应谷中的药物敏感性细胞灭绝。如果然后将人群暴露于具有重叠的适应性峰的药物2中，我们选择双抗性表型z，药物1和2均无效。在这一点上，我们将失去对肿瘤的控制。相反，如果我们首先使用药物3（图 1h），则会导致选择y型。因为药物2相对于药物3表现出不同的适应性峰，所以药物3-药物2序列会导致进化陷阱，其中癌细胞群会灭绝31。这是进化指导的原理，可以利用它来延迟和潜在地控制耐药性，从而显着延长患者的生存期。
我们展示了使用HCC827非小细胞肺癌细胞系的进化指导。HCC827是对EGFR抑制敏感的EGFR exon19del突变肺癌细胞系40。我们之所以选择HCC827，是因为它是一个特性良好的品系，其对EGFR抑制的一些耐药机制已为人们所熟知，例如预先存在的MET扩增40。我们使用了两种小分子抑制剂进行操纵：吉非替尼（一种EGFR抑制剂）和曲美替尼（一种MEK1 / 2抑制剂）。概括大量人口的进化动力学，我们采用了HYPERflask ®细胞培养系统，其中每个烧瓶可容纳150-200百万个细胞，比普通T175烧瓶高约10倍（图 2a）。为了跟踪克隆进化我们使用高复杂性慢病毒条形编码41，一现在建立的技术研究药物抗性35，42。通过在基线处对细胞进行条形码处理并将其分成不同的重复（图 2b）），如果相同的条形码在不同的重复处理后被富集，我们可以确定是否存在抗性克隆。我们首先用一百万个不同的条形码对一百万个细胞群进行条形码编码，然后在HYPERflask中将其扩展到约1.2亿个（请参见“方法”部分）。我们称此初始基准人群为“ POT”（图 2b）。对于这两种药物中的每一种，我们除两个HYPERflask作为DMSO对照外，还接种了三个HYPERflask复制品。每个HYPERflask都从相同的POT上接种了约1500万个细胞（即，大多数条形码对所有烧瓶都是公用的），并扩展到80-90％的融合度。因此， 每个药臂的总人口为120×10 6 ×3 =〜4亿个细胞（图 2b））。随机数学建模表明，该实验设计导致每个重复都代表POT（请参见“方法”部分和补充图 2）。
一个康宁®高产性能瓶（HYPERflask ®）细胞培养容器是一个10层1720厘米2与聚苯乙烯气体可渗透的表面总面积生长系统，可以达到150-200百万个细胞的顺序。b先对 100万个HCC827肺癌细胞进行慢病毒条形码处理，然后再在HYPERflask中将其扩增为约1.2亿个细胞群（POT）。接种了8个重复样品，每个样品约有1200万个细胞，并扩增至1.2亿个。冷冻剩余的POT细胞用于随后的分析。在八份接种的复制品中，三份暴露于GI90剂量的吉非替尼（GEF1-3），三份暴露于GI90的曲美替尼（TRM4-6），两份用作对照（DMSO7-8）。C包含预先存在的抗性亚克隆的大量种群的克隆进化，这些亚克隆暴露于高药物浓度（GI90）而无需重新铺板。通过达尔文选择抗药性会产生克隆瓶颈。对耐药人群进行条形码富集分析，基因组分析和药物筛选。d吉非替尼（耐药人群再生长4周）和曲美替尼（耐药人群再生长9周）的生长曲线。媒体和药物每周更换一次。e细胞死亡时，它们会脱落并漂浮在培养基中。在每次更换培养基时（每周一次），从用过的培养基中收集上清细胞，并提取其DNA用于条形码分析和肿瘤进化的非破坏性跟踪。
这些庞大的种群使我们能够将细胞暴露于高浓度的药物而不会导致灭绝，也无需重新接种。这是因为大量人群具有高度异质性，并且可能包含可以抵抗高剂量药物暴露的现有抗性亚克隆。我们使用GI90浓度（90％生长抑制），直到抗性克隆恢复生长（图 2c和补充图 3）。）。3例HYPER药瓶用吉非替尼（40 nM）给药，而3例用曲美替尼（100 nM）给药。在吉非替尼治疗的GEF1-GEF3细胞系中，药物暴露引起广泛的细胞死亡，这是主要的人口瓶颈。在恒定的药物浓度下，抗性种群重新生长并在4周内再次达到汇合。经曲美替尼治疗的TRM4–TRM6细胞系中的药物暴露也诱导了广泛的细胞死亡，并且耐药菌群在9周内恢复到汇合状态（图 2d）。
我们认为，不仅实验结束时存活的抗性细胞对于分析非常重要，而且实验期间死亡的细胞也可以证明该系统的时间动态性。这个想法是，附着在板上的存活细胞与漂浮在培养基中的死细胞的总和将包含有关细胞群体整个进化史的信息。此外，我们假设死细胞可能是活种群的代表性样本，并且像癌症患者43中的循环肿瘤DNA一样，可以用于无损监测系统的时间动态。每周一次，每次更换培养基时，我们收集漂浮的（死）细胞作为沉淀，以提取DNA并进行条形码分析（图 2e）。，请参见“方法”部分）。
我们比较了基线（POT）与耐药株，并确认了吉非替尼（图3a）和曲美 替尼（图3b）的药物敏感性降低 。为了确定抗药性的可能遗传机制，我们在中值深度160倍进行了全外显子测序。我们在耐吉非替尼的品系中发现了MET的局部扩增（图 3c），与先前的结果40一致，并通过数字液滴PCR（ddPCR）进行了证实（补充图 4）。在耐曲美替尼的品系中未检测到MET的扩增，表明MET-扩增的亚克隆对吉非替尼具有耐药性，但对曲美替尼敏感。耐曲美替尼的品系共享chr1p的增益和chr9的缺失，包括CDKN2A（图 3c，S4，S5，S6和补充数据 1）。CDKN2A编码肿瘤抑制因子p16和p14ARF，该基因的缺失与对靶向药物的耐药性相关44，尽管在曲美替尼耐药的情况下从未如此。对单核苷酸变体（SNV）的分析显示，与POT相比，曲美替尼耐药株中明显富集了一小部分突变（图 3d，S7）。这些突变在耐吉非替尼的品系中也得到了丰富，尽管程度较小，这可能表明先前存在的亚克隆对吉非替尼和曲美替尼具有双重耐药性，尽管被曲美替尼更强烈地选择了。
a吉非替尼耐药细胞系和b雷替替尼耐药细胞系与DMSO 的剂量反应曲线表明获得性耐药。剂量反应曲线的误差线代表SEM。c与POT相比，抗性品系的相对拷贝数图谱突出显示GEF品系中的MET扩增和TRM品系中的1p增益，9p损失（包括CDKN2A）。d单核苷酸变体分析显示，在TRM中包含四个变体的亚克隆富集，在同一克隆的GEF中部分富集（VAF变体等位基因频率）。
基因组改变在进化的复制品之间是一致的，但对于两种药物却不同，这一事实表明，最初的种群中已经存在多个耐药亚克隆。这些亚克隆在两种药物下的差异进化和竞争也提出了指导目标。
接下来，我们试图更精确地量化耐药性的时间演化动力学。我们使用超深度测序对所有样品的条形码进行了分析（请参见“方法”部分和补充图 8）。与POT人群中鉴定出的2295个独特条形码相比，我们在吉非替尼治疗的品系中平均发现了872个独特条形码，在曲美替尼品系中发现了平均199个独特条形码（补充图 8）。），表明药物暴露引起强烈的选择性瓶颈。我们注意到，由于采用单细胞条形码，我们期望与每个预先存在的亚克隆相对应的多个条形码（即该亚克隆中的多个细胞已使用不同的条形码进行了条形码编码）。我们还应注意，由于测序的局限性，只能识别低至1-0.1％的单倍型频率，在POT中通过深度测序鉴定出的独特条形码的数量只是样品中条形码总数的一小部分。我们以300,000–600,000×的深度进行测序（请参见补充图 8B），因此考虑到每个条形码大约有150个单元格，我们最多只能拾取数千个独特的条形码。
当条形码的估计增长率相对于DMSO为正值时，我们认为条形码在给定的重复样本中为阳性选择（请参见“方法”部分）。我们将具有相似生长动态的条形码分组为“功能性亚克隆”。我们将预先存在的功能亚克隆定义为在多个重复中具有相似生长动态的亚克隆（图 4a，有关详细信息，请参见“方法”部分）。值得注意的是，我们不能排除每个功能性亚克隆可能由多个遗传上不同的亚克隆组成。这对于我们的分析并不重要，因为我们对药物反应表型感兴趣，而不是对单个基因型感兴趣。
一个地图相关联的药物的反应显示条形码的比例那名到两种药物敏感的条形码（在灰度左下角），对耐吉非替尼只（蓝色），trametinib只（紫色）或二者（橙色）。值表示在吉非替尼和曲美替尼暴露的给定重复次数中，具有正增长率的独特条形码的比例。b每个样本中的条形码频率分布。左侧的条形图显示每个唯一条形码的频率。复制之间的条形码颜色和顺序相同。右边的条表示分配给每个条形码的药物反应表型（请参见右边的图例）。表型由一组进化重复确定，其中条形码显示出正的生长速率（请参见“方法”部分）。重复之间的条形码和表型分布高度保守，表明可重复进化。c通过外显子组测序确定的四个SNV簇的癌细胞分数估计值与双抗性克隆的条形码频率匹配。d在吉非替尼（GEF1-3，左）和曲美替尼（TRM4-6，右）暴露下均显示了分配给GEF，TRM或双重耐药表型的每个条形码的增长率。点表示三个重复中的增长率，线连接这些点以突出差异。e代表性散点图显示了进化重复之间条形码增长率的一致性。点按照条形码表型上色，如b所示。f每个进化副本中浮动条形码的时间频率。行通过表型和标记颜色的彩色对应唯一的条形码作为一。POT和DM7测量是在最终时间点收获的（活的）种群，所有其他都是浮动条形码测量。在不同重复的时间点之间，时间频率动力学是保守的。此外，最终样本（已采集的种群）在很大程度上与最后一个浮动条形码样本匹配。
我们确定了五个具有不同生长动力学的功能亚克隆（图 4b）。第一组（灰色）最大（87.2％），代表了在两种药物下均死亡的克隆（敏感）以及由于在DMSO中找不到而无法确定生长速率的克隆（补充图 9）。）。第二组（蓝色）对吉非替尼有抗药性，但对曲美替尼敏感。第三组（紫色）对曲美替尼耐药，但对吉非替尼敏感。第四组（橙色）对两种药物均具有双重耐药性。最后，第五组（绿色）由一组条形码组成，这些条形码仅在曲美替尼或吉非替尼的一个重复样本中发现。该组可能对应于可能的从头抗性谱系。由于该组包含非常低频率的条形码，因此我们重点关注与进化控制相关的大多数现有抗性亚克隆。我们检查了POT与进化品系中条形码的频率和相关的表型。令人惊讶的是，药物复制之间的条形码频率非常相似， 4b）。重要的是，这些结果表明，在此系统中，动力学很大程度上是确定性的，因此是可预测的。
我们推断，使用外显子组测序分析，双重耐药（橙色）亚克隆可能是携带SNV的一种，该SNV高度富含TRM，部分富含GEF。我们将每个样本中橙色亚克隆的条形码频率与SNV癌细胞分数（CCF）进行了对比，发现这两个独立的测量值在包括POT在内的所有样本中均匹配，因此表明这些SNV与橙色条形码处于同一状态细胞（图 4c）。
使用数学建模，我们测量了每种条码在每种条件下的增长率（请参见“方法”部分）。该分析证实了对吉非替尼耐药的人群是多克隆的，具有大的MET扩增亚克隆（蓝色条形码组），构成了GEF1-GEF3人群的约32.8％（平均），而该人群中相对较大的初始人群（约2.4％）。 POT（见图 4b）。该亚克隆的特征是许多条形码，在吉非替尼下，条形码的增长率为正，而在曲美替尼下的条形码的增长率为负（图 4d）。—蓝色条形码）。我们还发现了对多药耐药的亚克隆（橙色条形码）的富集，在吉非替尼和曲美替尼的作用下均显示出正的增长率。这个亚克隆以在GEF线22.4％和86.1％，在TRM线（图平均频率发现 4D -橙色条形码）。此克隆比原始POT种群中的蓝色克隆小（〜0.91％），因此携带的条形码少得多。还有一个小组条形码的该只在trametinib线富集的（图 4D -紫色条形码，在〜TRM线4.2％的平均，在〜0.57 POT％）。属于初始种群中不同亚克隆的所有富集（抗性）条形码的组合频率为3.9％。重复样本的增长率非常相似（图 4e和补充图 10）。因此，条形码分析支持先前存在的多克隆耐药性的存在。
作为我们实验设计的一部分，为了避免随机漂移效应和采样偏差，我们绝不会在药物暴露后重新铺板细胞。因此，在整个实验过程中，我们无法提取等分的细胞进行分析。为了以无损方式跟踪时间变化，我们利用了每周更换的大量培养基（560毫升）。HCC827是一种粘附细胞系，细胞死亡后会从板表面分离。我们收集了由死亡细胞组成的沉淀，并从每个时间点提取了条形码。我们证实来自上清液收集的沉淀是凋亡/坏死细胞（补充图 11）。时程条形码使我们能够在不影响系统和高分辨率的情况下跟踪药物暴露下的演化（图 4f）。条形码分析清楚地显示了我们在最终种群中鉴定出的亚克隆的扩增，而从上清细胞衍生的条形码的最终时间点与最终收获的种群非常相似（图 4f）。，线条颜色表示表型，点颜色表示唯一的条形码）。这一结果似乎有些违反直觉，因为人们可能期望从死细胞中收获的条形码与抗性克隆不对应。但是，可以通过考虑潜在的进化动力学来理解这种现象。最初，许多条形码被迫灭绝，因为初始种群中的大多数细胞对药物敏感。在此阶段，收获的培养基中存在的那些细胞对应于成千上万种不同的敏感细胞条形码（灰色），在初始种群中没有一个是常见的，因此未检测到富集。随着抗性种群的增长，对漂浮介质的贡献变成了敏感细胞被驱赶灭绝和抗性细胞翻转的混合物。在实验结束时，主要是这些抗性细胞，大多数漂浮细胞（以及条形码）代表潜在的抗性种群分裂和翻身。吉非替尼暴露约3周和曲美替尼暴露6周后，克隆的频率稳定。通过比较复制之间的时间序列条形码动力学，我们再次看到时间进化动力学显着保守，这表明电阻动力学是高度可预测的（图2）。 4f）。
基因组分析显示在吉非替尼治疗的品系中有MET扩增的克隆，而在雷帕替尼治疗的品系中有单独的CDKN2A缺失克隆。我们在POT样品上进行了单细胞RNA测序，其中一个用吉非替尼处理过的复制品（GEF1），另外一个用雷帕替尼处理过的复制品（TRM4）。tSNE分析证实来自相同样品的细胞聚集在一起（图 5a）。基因表达模式证实了耐吉非替尼的人群（GEF1）主要由两个主要的亚克隆组成，一个亚克隆被MET扩增（图 5b，簇4和5），另一个是EPCAM- / VIM +，表明间质上皮过渡45或EMT（群集2）。确实，EMT与肺癌对吉非替尼的耐药性有关35。与这些亚克隆的预先存在的性质一致，在POT的细胞子集中检测到MET的过度表达（集群3-参见补充图 12和13）。一个EPCAM- / VIM +亚群也存在于POT（簇9-见补充图中 12和13）。耐曲美替尼的人群主要由单个CDKN2A缺失亚克隆（图 5b，簇1）和CDKN2A组成。在来自POT的细胞亚群中可检测到缺失（簇6，参见补充图 12和13）。因此，scRNA-seq数据证实了条形码所报告的克隆组成。没有检测到P-糖蛋白（PGP）（一种已知的多药耐药基因）的过表达（补充图 13），这支持了耐药克隆具有可遗传表型的观点。磷酸蛋白质组学结果证实了我们在药物对信号传导途径的功能作用方面的发现（补充图 14，请参见“方法”部分）。
样本（POT，TRM4和GEF1上色）对单细胞RNA测序的 tSNE图。b所有样品的tSNE分析共同确定了9个簇，具有不同的转录组谱。c在不存在药物的情况下，所有品系的增长率表明，在进化品系的增殖方面具有抗药性。箱形图显示了均值，四分位数值和范围。d第二代HDAC抑制剂Quisinostat的剂量反应曲线显示了TRM品系中的附带药物敏感性。e在MET抑制剂卡马替尼的作用下，来自耐吉非替尼耐药系的单个克隆的剂量反应曲线显示了对带有MET的克隆的附带敏感性放大（仅B8和F6）。f卡马替尼+吉非替尼的组合进一步提高了MET扩增克隆（特别是F6）的附带敏感性。g对485种化合物的高通量药物筛选显示出TRM克隆TRM4 E9（CDKN2A剩下1个拷贝）和TRM4 D6（CDKN2A剩下2个拷贝）的附带敏感性。在这里，我们显示了相对于DMSO7 F4具有最高％变化抑制的前5％（CDKN2A的三个副本，因为HCC827是三倍体系）。剂量反应曲线的误差线代表SEM。
我们想确定药物适应性是以增殖率还是增加对第二种药物的敏感性为代价。我们在没有药物的情况下测量了进化品系的生长速率，并证实它们的生长均明显慢于亲本品系和DMSO对照（图 5c和补充图 15）。因此，已经出现了以种群的基因型编码的增殖成本。这种进化上的取舍可以使用一种称为“缓冲疗法” 24的适应性疗法来开发，在这种疗法中，敏感人群可以用来通过竞争来控制耐药人群。
然后，我们寻求测试对其他化合物的附带药物敏感性，这些化合物已显示出对EGFR突变型NSCLC 有效的证据。组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）抑制剂是一类新的已显示出在NSCLC患者有希望的结果和到HCC827已知是敏感的药物，46，47。我们确实在耐曲贝替尼的品系中确定了第二代HDAC抑制剂Quisinostat的附带敏感性，相对于DMSO而言，其显示出的IC50小于200倍IC50（图 5d），而对于pan-HDAC抑制剂Panobinostat则没有（附带的图 16A）。NSCLC的另一类新的有希望的药物是Aurora A激酶抑制剂48。极光激酶也已显示出对第三代EGFR抑制剂的抵抗力49。但是，我们在我们的品系中未发现这些抑制剂的附带敏感性（补充图 16B，C）。
然后，我们认为对吉非替尼耐药的亚克隆可能会表现出对卡帕替尼对MET抑制的附带敏感性。但是，在吉非替尼的总体耐药人群中，敏感性并未增加（补充图 16D）。由于条形码（图 4b）和单细胞转录组学（图 5b）都显示了GEF群体中的多克隆耐药性，混合了MET扩增的和未扩增的克隆，我们从DMSO和DMSO中分离了单个单细胞衍生的亚克隆抗性系，并通过ddPCR 确认哪些被MET扩增并野生型（补充图 17A）。我们对曲美替尼耐药线进行了同样的操作并验证在分离的克隆中CDKN2A丢失（补充图 17B）。实际上，单个MET扩增的克隆（例如G1_B8和G1_F6）显示出对卡马替尼的敏感性增加，相对于DMSO，G1_B8的IC50降低> 255倍，G1_F6的IC50降低> 3.5倍（图 5e）。我们假设，假设两个克隆都包含> 13个拷贝的MET，则G1_F6敏感性增加的差异是由于残留的EGFR信号传导补偿了该克隆中卡帕替尼对MET的抑制作用。我们测试了对吉非替尼+卡帕替尼联合使用的附带敏感性，的确实现了G1_F6的IC50比DMSO低23,000倍的IC50（图 5f））。我们推测对POT卡马替尼+吉非替尼联合用药的敏感性下降可能是由于两种药物之间存在一定的拮抗作用。
对于曲美替尼，由于CDKN2A的丢失导致CDK4 / 6的上调，我们认为抑制CDKs可以证明对抗曲美替尼的人群有效。尽管单独使用CDK4 / 6抑制剂palbociclib无效（补充图 16E），但palbociclib +曲美替尼的组合对CDKN2A丧失最高的克隆（克隆TRM4 E9-参见补充图 17B）显示出一定程度的敏感性，IC50相对于DMSO减少了14倍（补充图 16F）。为了扩大我们对曲美替尼的附带敏感性的搜索范围，我们利用高通量药物筛选技术，以三种浓度（20、200和800 nM）中的每一种重复测定一组485种化合物（请参见“方法”部分）。克隆TRM4 D6和E9与DMSO7 F4。此屏幕显示了大量附带敏感化合物。在图5g中报道了具有最高％抑制变化的5％化合物 。
绝大多数转移性癌症仍基本上无法治愈。用标准方法治疗可以延长生存期1，但最终由于耐药细胞的出现而失败4。这是ITH 10推动的克隆进化过程的自然结果。在同一时间不同的药物结合在一起进行了研究，但通常只由几个月提高生存率，如果有50，51，和抗癌药物导致高毒性组合的治疗窗窄，限制了这种方法的实用性。相反，控制疾病而不是尝试治愈疾病可能是晚期癌症中唯一可行的选择24。虽然这种声音在肿瘤学中的自由基，抗性管理是公认的在诸如HIV 52，抗生素19和害虫控制53，54，55。在癌症中，不同的基团已经探索的“自适应疗法”的概念，首先由Gatenby开创24，其中药物的剂量响应调制到下属进化动力学56，57，以鼓励在临床试验的初步结果58。许多适应性方法都是基于“缓冲疗法”的，该疗法利用了这样的事实，即耐药性通常是以增生为代价的，因此耐药性亚群在无毒品的环境中可能胜过竞争27。这种演进双绑定25，26已经在结肠直肠癌患者前瞻性观察下EGFR抑制，其中KRAS驱动的阻力似乎暗示一个成本，和KRAS亚克隆在相对频率降低，如果药物悬浮28。我们还在用曲美替尼治疗的进化品系中观察到了这一点，该品系相对于基线显示出明显减慢的生长。当在无毒品的环境中以抗药性为代价时，对药物敏感的亚群可用于“控制”抗药性细胞24。这可以解释低患病率的的POT CDKN2A -Loss和MET -amplified克隆。此外，进化博弈论已被提出作为适应性疗法的概念框架，其中细胞表型被表示为博弈中的策略59。鉴于适应疗法的这些进展，在这项研究中，我们评估了进化双键，可通过进化控制来控制或预防耐药性。
尽管概念上的优雅和自适应疗法的前景，但当前的策略通常基于临时的经验法则。缺乏能够概括患者异质性和克隆进化的可靠实验模型系统，这是将适应性疗法引入临床的主要障碍。在这里，我们提出了一种克隆导向方法，其中可以使用药物严格控制，监测和改变进化。这有可能为多药适应性治疗铺平道路。
尽管我们已经尝试设计一种模型系统，专门针对患者中发生的治疗耐药性的进化动力学进行概括，但我们的研究仍然存在局限性。首先，我们确实承认已建立了具有EGFR克隆致癌驱动程序的细胞系可能无法概括患者的进化转向动力学。第二，我们使用了高浓度的药物，这些药物可能无法在患者体内始终获得。第三，将来需要结合肿瘤微环境因素，例如与癌症相关的基质细胞和免疫细胞，以及不同剂量的药物，进行研究。第四，这里我们着重研究作为已有抗性克隆的选择性压力的药物，但我们也承认从头突变体的重要性。例如，在没有预先存在的抗性的克隆细胞系中，人们会期望所有抗性动态都是由药物耐受性接着是从头抗性驱动的。这种现象通常通过对冲动态12来描述。。可以使用提出的平台对此进行潜在的研究，尽管人们可能期望在不同的重复样本中使用不同的条形码，从而使进化过程高度随机。另一方面，浮动条形码将使我们能够非常精确地确定从头突变的等待时间，因此可以在对冲的情况下测量时间动态，这对于理解突变率和动态非常关键抵抗。总之，在将这种类型的框架应用于临床试验设计之前，需要进行其他验证实验。第一步是将该框架应用于患者衍生的类器官模型，该模型已被证明可概括临床结果60。
尽管存在这些限制，但是复制人类癌症进化的时间动态的模型系统将为如何控制晚期癌症的耐药性提供新的思路，并为个性化的适应性药物治疗方案提供了机会，该方案可能在晚期人类恶性肿瘤中实现长期控制。
为了在典型的体外重铺实验中获得耐药突变发生的等待时间的预期分布，我们对原始细胞的生长和细胞采样过程进行了基于个体的随机模拟。我们从2×10 6非抗性单元开始仿真。随机选择细胞进行分裂，并将群体生长至4×10 7个细胞，与14天后的预期细胞群体大小相对应，平均细胞分裂率每3天一次。在每个分裂过程中，细胞击中抗性诱导突变，概率为μ = 2×10 -8。假设健康突变率为1×10 -9 bp /细胞分裂大约意味着20种不同的抗性诱导突变。一旦种群达到4×10 7个细胞，细胞就重新形成细胞，在我们的模拟中，这相当于将种群大小减少到2×10 6个细胞。重复生长和重采样过程，直到发生第一个耐药诱导突变。我们运行了10 4个独立的随机模拟并记录了电阻发生的时间，这使我们能够构建预期的等待时间分布。在图 1d中，我们使用以下方法估算了在不同情况下不断扩大的种群中预期出现的突变体数量：
其中，μ是抗性机制的突变率，N 0是烧瓶/孔中的接种种群，N max是重新接种前的最大细胞容量。
为了证明8个HYPERflask在条形码方面具有代表性，我们对整个分裂和生长步骤进行了随机种群模拟，以估计初始种群中条形码存在于N / 8个复制种群中的可能性。仿真包括两部分：
一种。
随机模拟POT从最初具有唯一条形码的细胞种群中生长出来的情况。
b。
将POT种群分为八个重复种群的随机模拟。
为了实现（a），我们假定初始种群中的每个细胞都进行了唯一条形码编码，并且每个唯一条形码化的种群都经历了随机指数增长，出生率b和死亡率d。我们实施了Gillespie算法来模拟指数增长（补充图 2A，有关详细信息，请参见参考资料61）。HCC827细胞系的出生率和死亡率先前已在参考资料中得出。62。对于与我们的实验设计相对应的20％的氧气浓度和2 g / L的培养基葡萄糖浓度，合适的值大约是b = 0.032，d = 0.002，我们将其用于参数化模型。补充图2B显示了单个细胞的10,000个实现的种群大小直方图，其中省略了灭绝实例（种群大小等于零）。
在这种随机指数增长模型下，不同条形码的种群不会相互作用，因此，通过结合随机过程的10,000个独立实现来计算POT条形码的频率分布。产生的条形码频率分布在补充图 2C中显示。
最后，为了模拟（b），我们对随机模拟生成的全部条形码进行了随机相等大小的8向拆分。为了确定条形码精确地出现在N / 8个重复样本中的可能性，我们对POT的随机增长进行了10次模拟，每次均进行了20次关联的拆分随机模拟，并对结果取平均值。预测在补充图 2D中显示。我们发现，在POT增长中幸存的条形码中约有90％出现在8/8个重复样本中，另外4％和2％分别出现在7/8和6/8中。大约0.01％的条形码正好出现一次重复。
该计算的确得到了以下事实的证实：所有重复样本均包含统计学上相似的条形码，这是由于在暴露于曲美替尼的所有三个重复样本和暴露于吉非替尼的所有三个重复样本中都显示出完全相同的一组条形码富集的事实，这种情况在锅。因此，所有稀有条形码在每个副本中都能很好地表示。有关条形码的其他统计分析，请参见补充方法。
将来自POT，DMSO7，DMSO8，GEF1-3和TRM4-6的HCC827细胞分别以每孔1000和3000的密度接种在96孔板和48孔板（Corning）中。使细胞在96孔板中以六个独立的重复培养，并在三个独立的48孔板中进行总共8天的培养。每三天将不包含媒介物对照或药物的培养基用作新鲜培养基。将板放置在S3活细胞分析系统（Sartorius）中，每2小时以×4和×10放大倍数拍摄图像。在8天结束时，将根据使用S3活细胞分析系统（Sartorius）获得的图像自动计算每个时间点的融合度确定。我们使用对数转换数据的线性拟合计算了每条线的增长率（请参见补充图。 15）。
HCC827细胞系在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich）的补充有10个％FBS（Sigma-Aldrich公司），4mM的培养升谷氨酰胺（Sigma-Aldrich公司），1％非必需氨基酸（Sigma-Aldrich公司），以及1％的青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich）。使用基于PCR的方法确认细胞系不含支原体。细胞系生长和高收率性能瓶（HYPERflask膨胀®）细胞培养容器中（Corning）中。每周更换一次培养基，并在达到〜85％汇合后收获细胞。
先前已描述了ClonTracer慢病毒条形码文库的构建和慢病毒的产生（38）。ClonTracer库是Frank Stegmeier（Addgene＃67267）的礼物。HCC827细胞系在正常生长培养基中培养，并使用0.8μg/ ml的聚乙烯通过慢病毒感染进行条形码编码。对于慢病毒滴定结果，对于大多数要用单个条形码感染的单细胞，选择0.1（对应于10％感染）的感染复数（MOI）。感染后，将2.5μg/ ml的嘌呤霉素用于选择被条形码感染的细胞。条形码过程的统计分析表明，<1％的细胞被双重条形码化，<0.1％的独特条形码被多个细胞接受（补充方法）。
将100万条带条形码的HCC827细胞扩增至约1.2亿个细胞，进行收获并冷冻。在这些冷冻细胞中，有400万个细胞被融化，并再次扩增为约1.2亿个细胞。将这些细胞均等地接种到八个HYPER烧瓶中。将两个HYPER烧瓶在DMSO小于0.0001％的条件下生长6天，达到约85％的汇合度，并作为对照收获。其余六只HYPER烧瓶在正常生长培养基下生长1周，然后分别暴露于GI90浓度的吉非替尼（Selleckchem）和曲美替尼（Selleckchem）（每个三个重复烧瓶）4周和9周。在此期间，每周补充一次培养基和抑制剂。吉非替尼和曲美替尼的GI90浓度先前确定为40和100 nM（补充图 1））。细胞计数是通过Countess II自动细胞计数仪（ThermoFisher）确定的。
收获条形码化的HCC827细胞系并沉淀。根据制造商的建议，使用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒（Qiagen）进行基因组DNA分离。将每个HYPERflask的一半条件培养基以1200 rpm离心并沉淀。使用Qubit（Life Technologies）进行基因组DNA的定量。使用2x Accuzyme混合物（Bioline）和20 ng DNA进行扩增子PCR反应，以使用先前发表的引物序列41扩增条形码：
转发：ACTGACTGCAGTCTGAGTCTGACAG。
反向：CTAGCATAGAGTGCGTAGCTCTGCT。
在检测到包括30 bp半随机条形码的80 bp PCR产物后，纯化后，根据制造商的建议，使用用于Ilumina的NEBnext Ultra II DNA库制备试剂盒（新英格兰生物实验室）制备NGS库。使用Qubit（Life Technologies）和KAPA库定量试剂盒（KAPA Biosystems）以及TapeStation（Agilent Genomics）对库进行定量。在四个漂浮细胞时间点（GEF2-F2，GEF3-F2，TRM5-F1和TRM6-F3）提取的DNA的文库制备不成功。NGS在室内使用MiSeq（Ilumina）进行。
首先对FastQ文件进行过滤，以提取所有位置的质量得分均大于20的读数。通过使用正向表达式匹配正向条形码引物的12个碱基，然后是30个碱基对，然后是反向条形码引物的12个碱基，从FastQ文件中提取与潜在条形码匹配的读物。为了解决由PCR扩增或突变引起的潜在错误，可通过一种方法（在补充方法中概述）合并相似的条形码，该方法通过考虑条形码之间的汉明距离将每个条形码分配给与已知弱/强碱基对模式匹配的代表。条形码频率在补充数据2中报告 。
为了给每个条形码分配一个表型，我们首先通过考虑频率来确定每种条件下的近似增长率。我们假设DMSO复制中每个条形码的频率代表了引入药物之前经过药物处理的复制GEF1-GEF3，TRM4-TRM6的频率。为确保对增长率进行保守估计，我们将初始频率估计为\（f_0 = {\ mathrm {{Max}}}（f _ {{\ mathrm {{D7}}}}，f _ {{\ mathrm {{ D ），其中\（f _ {\ mathrm {{{{D7}}}} \）表示DMSO7和DMSO8行中条形码的频率， 分别。用\（f _ {\ mathrm {{R}}} \）表示药物暴露，扩展和收获后给定重复中的条形码频率。我们估计条形码在药物暴露下的增长率为
其中，log表示自然对数和Ť表示药物暴露和收获的细胞（之间的时间Ť = 4周为吉非替尼，Ť = 9周为trametinib）。
然后根据吉非替尼和曲美替尼进化重复的数量分配表型，其中条形码显示出正的生长速率。由于条形码在给定的复制品中可能已经灭绝，或者是因为它的生长速度为负值，因为特定条形码从未接种到该复制品中，或者是由于漂移，所以我们按以下方式确定条形码的表型。如果条形码在1+ GEF和1+ TRM复制中均显示出正的增长率，则将条形码指定为双抗。如果条形码在2条以上的GEF品系中显示出正的增长率，但没有TRM品系，则将其指定为吉非替尼耐药/曲美替尼敏感。同样，当条形码在2个以上的TRM品系中显示出正的生长速率，但在GEF品系中却没有，则将其指定为抗雷米替尼/吉非替尼敏感。如果条形码在单个复制品（GEF或TRM）中显示出正的增长率，则将其指定为从头抗性。其他具有测量增长率的条形码被指定为敏感条形码。最后，某些条形码被指定为具有不确定的表型，其中无法在DMSO7或DMSO8中检测到条形码（可能是由于播种时的损失），但是由于无法确定生长速率，因此重复进行观察。数字 图4a示出了表型作图的示意图以及分配给每种表型的独特条形码的比例。此外，我们将先前的“ POT”基准样品与本实验中使用的POT进行了比较，然后将其冷冻，储存然后解冻。补充图 14显示，条形码在两个样本中的比例高度一致，一定比例的条形码始终被测序遗漏，这意味着条形码的二项式采样。
按照制造商的说明，使用Agilent SureSelect HT2 Human All Exon_V6试剂盒从200 ng基因组DNA制备九个完整外显子组测序文库。合并文库，并在Illumina NovaSeq平台上测序。达到的中位数（中位数）为161倍（最小43倍，最大218倍）（请参阅补充数据 3）。
使用Skewer v0.1.126进行修剪。保留修整前的平均质量值> 10的读数，修整后的最小读数长度为35。所有其他被丢弃。使用Burrows-Wheeler Aligner工具（bwa-mem，v0.7.15）将修剪后的读数与完整的人类参考基因组hg19进行比对。使用Picard工具（v2.8.1）标记PCR重复项。使用Platypus v0.8.1 63对所有样本共同呼吁进行突变。通过确定在POT品系上处理过的品系（GEF1-GEF3，TRM4-TRM6）中VAF富集10倍的SNV，可以确定选择的程度。该分析产生了四个SNV簇，这些簇展示了通过条形码富集分析预测的富集。见补充数据 4筛选的SNV呼叫的最小覆盖范围是所有样本的10个读数以及外显子组捕获面板目标区域内的位置。
使用等位基因v3.0.1（www.github.com/cancerit/alleleCount）鉴定了细胞系外显子组测序中的杂合单核苷酸多态性（SNP ）。在这里，我们在dbSNP构建132 64中计数的全局次要等位基因频率在0.1和0.2之间的碱基（最小基因组位置100,000 bp），并与所有常染色体的外显子组面板的目标区域重叠。我们通过将最高碱基对数除以SNP位点的总覆盖率来计算B等位基因频率（BAF）。从1中随机减去这些值，以模拟A和B等位基因的随机分配。通过减去全局中值LRR值，将对数R比（LRR）计算为每个SNP位点覆盖率的对数基数2。
为了确定拷贝数变化（CNA）的片段，我们使用DNAcopy对每个样品的LRR进行了平滑和分段（Seshan和Olshen，2016，“ DNAcopy：DNA拷贝数数据分析”，R包版本1.48.0）。为了计算每个片段中的平均杂合主要等位基因频率，我们需要进行测试以区分具有纯杂合子丢失（LOH）的片段和包含杂合SNP的片段。我们通过计数每个等位基因频率<0.9的每个片段中的SNP数量来鉴定具有杂合性的片段。然后，我们进行了精确的二项式检验，其中另一种假设是该段的5％以上包含杂合SNP（p <0.05）。对于无效假设被拒绝的那些片段，中位杂合主要等位基因频率值被用来代表该片段的等位基因（im）平衡。
使用ASCAT方程式65，我们假设每个样本都是纯的（rho = 1），并通过计算所有片段的连续主要和次要拷贝数值与其最近的整数状态在a上的距离来求解每个样本的倍性（psi）。对肿瘤倍性具有现实意义的psi值范围（1.5–5.5）。在所有段中与整数产生最小距离的psi值被视为倍性溶液。对于所有细胞系，这约为3，因为已知细胞系HCC827是三倍体40。有关复印号码的电话，请参阅补充数据1。
我们还使用Sequenza 66计算了每个处理过的细胞系与亲本种群（POT）之间的GC含量归一化深度比。为了计算差异拷贝数状态的片段，我们在dbSNP构建132中通过基因座的全局次要等位基因频率对基因座进行子集化，并使用DNAcopy分割深度比。如果深度比> 1.2，则将深度比分析中的细分视为收益；如果将<0.8，则将损耗视为损失。
根据制造商的建议，使用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒（Qiagen）对ddPCR进行基因组DNA分离。使用Qubit（Life Technologies）对gDNA进行定量。在QX200 ddPCR机（Bio-Rad）上进行数字液滴PCR（ddPCR）。使用3 ng gDNA作为模板并使用MET（dHSACP2500321，FAM，Bio-Rad），CDKN2A（dHSACP1000581，FAM，Bio-Rad）和NSUN3的市售探针进行拷贝数分析（dHSACP2506682，HEX，Bio-Rad）作为参考基因。使用3 ng DNA，10μl2xSupermix进行PCR反应，总体积为20μl。自动液滴生成器（Bio-Rad）用于生成〜20,000个液滴，用于PCR反应的分配。包括没有DNA的阴性对照和从具有先前报道的CN的细胞系中提取的阳性对照DNA。QuantaSoft v1.3.2.0软件用于MET和CDKN2A CN分析。假设NSUN3的拷贝数状态为3（三倍体），这已通过外显子组测序数据中的拷贝数分析得到了证实。
对来自DMSO7 F4，TRM4 D6和E9的细胞进行酪氨酰化和计数。将每孔120–600个细胞接种到384孔板（Corning）中。细胞在37°C和5％CO 2的培养箱中生长过夜。准备了三种不同浓度（20、200和800 nM）的一组485试剂（补充数据 5），并使用Echo 555液体处理器（Labcyte Inc.）在每孔中分配。用试剂处理5天后，将细胞与10％CellTiter-Blue细胞活力试剂（Promega）在37°C和5％CO 2细胞培养箱中孵育4小时。最后，使用EnVision（PerkinElmer）读板器获得读数。
针对三种药物浓度中的每一种分别进行命中鉴定，并且每行重复三次。首先，使用以下公式将原始荧光强度转换为估计的抑制百分比（PCI）：
其中I是原始荧光强度，c pos是板的阳性对照，c neg是板的阴性对照。板特异性阳性对照定义为接种有细胞但没有药物的14孔的平均荧光。板特异性阴性对照定义为14个空孔的平均荧光。
附带敏感的二线治疗被确定为相对于DMSO线而言，在多次重复和/或浓度下平均PCI表现出大幅增加的治疗。根据给定的重复数和浓度，根据化合物的平均PCI变化对化合物进行排名。在给定浓度下PCI变化<5％的那些被排除在外，剩下的前六种被认为是命中鉴定。潜在的打击被确定为出现在一种以上浓度或重复项的前六种中的化合物。
用胰蛋白酶消化抗性细胞系和单细胞克隆并计数。每孔300至10,000个细胞接种在96孔标准板（Corning）中。在37°C和5％CO 2细胞培养箱中孵育过夜后，使用每种抑制剂的10种浓度的平均10倍变化剂量。所有药物的抑制剂治疗后3天均有效，曲马替尼10天，卡马替尼7天。应用10％CellTiter-Blue细胞活力试剂（Promega）。在37°C和5％CO 2细胞培养箱中与10％CellTiter-Blue一起孵育过夜后，使用EnVision（PerkinElmer）平板阅读器获得读数。
为了得出剂量反应曲线，通过将OD值标准化为六个阳性对照（无药物生长）和六个阴性对照（空）孔，从OD读数得出标准化的百分比增长。然后通过非线性最小二乘回归将两个参数（ec50，希尔系数）的对数逻辑剂量响应曲线拟合到数据。
对酪氨酸激酶（POT），二甲基亚砜（DMSO7），GEF1和TRM4细胞系进行酪氨酰化和计数。在六孔板中每孔接种300,000个细胞，然后在37°C和5％CO 2中孵育细胞培养箱过夜，将每个细胞系的三个生物学复制品用DMSO，40 nM吉非替尼和100 nM曲美替尼处理1 h。在那些条件下温育后，将细胞酪氨酸化并以1500 rpm离心以产生细胞沉淀。使用含有磷酸酶抑制剂I（Sigma-Aldrich），磷酸酶抑制剂II（Sigma-Aldrich），蛋白酶抑制剂（Cell Signaling Technology）的MDS Tris Lysis Buffer（Meso Scale Diagnostics）裂解细胞沉淀。使用BCA分析（Sigma-Aldrich）对裂解样品的蛋白质含量进行定量。MILLIPLEX MAP Akt / mTOR磷酸化蛋白试剂盒，MILLIPLEX MAPK / SAPK信号转导试剂盒，MILLIPLEX MAP RTK磷酸化蛋白试剂盒（分别为48-611MAG，48-660MAG，HPRTKMAG-01K，默克（MerckMillipore）与以下单重磁珠组组合以产生三种多重Luminex分析；总HSP27，GAPDH（46-702MAG，46-710MAG，46-623MAG，46-641MAG，46-608MAG，46-667Mag，MerckMilipore）。Bio-Plex Pro荧光粉-PDGFRb和Akt（Thr308）（171-V50018M，171-（V50002，Bio-Rad）合并成三重测定。遵循制造商的建议。使用xPOTENT c3.1软件在Luminex 200系统上测量磷酸蛋白水平。
为了跟踪随时间的变化，我们利用每周必须更换的大量培养基（560毫升）来维持HYPERflask培养系统。HCC827是一种粘附细胞系，细胞死亡后会从板表面分离。通过将用过的培养基在1200 rpm的离心机中旋转10分钟，我们收集了由一周内死亡的细胞组成的沉淀。我们从这些中间时间点提取了每条吉非替尼暴露线（每周4周）和每条耐曲美替尼暴露线（每周9周）的条形码。这些条形码使我们能够跟踪每次药物暴露下每个细胞谱系的演变，而无需重新铺板，并且具有无与伦比的时间分辨率。
从POT，GEF1和TRM4细胞制备单细胞。离心后，将单细胞用PBS洗涤，并用1000细胞/ µl 的缓冲液（不含Ca ++ / Mg ++的 PBS + 0.04％BSA）重悬。
使用a啶橙/碘化丙啶染料和LUNA-FL双荧光细胞计数器（Logos Biosystems，L20001），确认所有样品中的活力均> 90％。将单细胞悬液加载到Chromium Single Cell 3'Chip（10X Genomics）上，并在Chromium Controller中运行，以按照制造商的说明使用10X genomics 3'Chromium v2.0平台生成单细胞凝胶微珠乳液。 。根据制造商的方案制备单细胞RNA-seq文库，并用Bioanalyzer高灵敏度DNA试剂盒（Agilent，5067-4627）和Qubit dsDNA HS分析试剂盒（ThermoFisher，Q32851）确认文库质量。收集样品至三份，并根据标准10X Genomics方案在Illumina HiSeq 4000上测序。
使用GRCh38批注（v1.2.0）对原始数据运行了CellRanger（v2.1.1）。从cellRanger输出被加载到统计计算环境有危害R V3（www.r-project.org）通过功能load_cellranger_matrix_h5从包cellranger（V1.1.0;基因组=“GRCh38”）。根据基因名称合并数据集。在归一化之前，执行了一系列过滤步骤。只有那些显示至少1500个检测到的基因和5000个UMI的细胞才被考虑作进一步分析67。排除了线粒体基因定位的读段。之后，将数据导入到Seurat（v2.3.4）68中并进行缩放（NormalizeData函数使用normalization.method =“ LogNormalize”，scale.factor = 10,000，后跟ScaleData函数）。根据三个管家基因（GAPDH，RPL26和RPL36）的累积表达水平（Seurat标度值的总和）执行进一步的过滤步骤69。手动检查这些值与每个细胞的UMI数量（或每个细胞中非零表达的基因数量）相比，发现两者之间没有显着相关性。然而，许多细胞显示这些基因的表达极低，因此，底部1％的细胞被排除在进一步分析之外。最后，还排除了在＜20个细胞中表达的基因。再次对过滤后的原始数据执行线性归一化和缩放。使用Seurat的FindVariableGenes函数识别可变基因（平均函数= ExpMean，分散函数= LogVMR，x.low.cutoff = 0.01，x.high.cutoff = 6，y.cutoff = 0.01，num.bin = 100 ）。主成分分析（PCA）使用可变基因作为输入并基于p-通过JackStraw函数估计的值，保留了前44个组件。这些组件被用作通过RunTSNE函数进一步降低尺寸（使用t分布随机邻居嵌入； t-SNE）的输入（困惑度= 50，do.fast = TRUE，seed.use = 44）。然后使用FindClusters（分辨率= 0.6）识别簇。
使用CellenONE™（Scienion，里昂）从DMSO7，GEF1和TRM4细胞系中分离出单细胞。将收获的细胞在PBS中稀释以产生细胞悬浮液。之后，在压电分配毛细管（PDC）中以光学方式控制悬浮液中的细胞数量，以控制每次分配中真正单个细胞的存在。最后，将每个单个细胞分配到已经装有100 µl完全生长培养基的96孔平底微孔板的特定位置。最终，收获在96孔板中生长的单细胞，并将其转移到细胞培养瓶中进行扩增。单细胞来源的细胞系是根据其在96孔板中的位置命名的。
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