人们对多发性骨髓瘤及其前体随时间的演变和进展了解甚少。在这里，我们调查了由89个完整基因组和973个外显子组组成的大型队列中形成多发性骨髓瘤进化的突变过程的态势和时机。我们确定了八个过程，包括由暴露于美法仑引起的突变特征。重构每个突变特征的时间序列的活性，我们估计一个生发中心B细胞的初始变换前2期间通常发生ND -3 次几十年的生活。我们定义了随时间推移激活诱导脱氨酶（AID）和载脂蛋白B mRNA编辑催化性多肽样（APOBEC）诱变的四种主要模式，包括一部分在恶性前期有长期AID活性证据的患者，表明抗原-反应力和生发中心折返。我们的发现为研究多发性骨髓瘤的病因提供了框架，并探索了预防和早期发现的策略。
癌症通常是由可被检测几年进展前到明显的恶性无症状克隆实体之前1，2。这表明基因组驱动程序事件会随着时间的推移而积累，这是一个漫长的进化过程，赋予不同的亚克隆以优势，使其得以扩展和发展3。了解恶性前克隆起始和进展的时间表对于制定早期癌症诊断和预防策略至关重要。有趣的是，最近的报告中所示的不同癌症类型如何获取第一驱动程序事件大约20-40岁诊断之前，常时年龄在20和30岁之间的个体2，4，5。这样的研究已经进行了可以通过突变过程的存在，其活性随时间（即，时钟等）恒定，产生突变负担正比于癌细胞年龄4，6，7，8，9。
多发性骨髓瘤（MM）总是由克隆浆细胞的无症状扩张之前，临床上确认为未确定的意义（MGUS）的单克隆丙种球蛋白或郁积型骨髓瘤（SMM）10，11，12。在历史上，之间易位IGH轨迹和复发性癌基因和染色体奇（即，超二倍体）的三体已被视为始发事件13，14。在> 60％的MM患者中可检测到超二倍体，并且认为是由单个灾难性有丝分裂引起的13。在最近的全基因组测序（WGS）研究中，我们提供了证据，超二倍体细胞遗传学特征经常反映了在不同时间窗口15中获得的多个增益的总和。这个观察结果是基于重复，非重复的克隆点突变的内大染色体获得（即，分子的时间）校正后的比2，15，16。尽管这可以让我们重新构造事件发生的相对顺序，但无法将这些估计值转换为绝对时间标度，因为与某些实体癌5相比，MM在整体突变负担与患者年龄6岁，17岁。
在这里，我们描述了MM发病机制中涉及的突变过程的态势和时间活动，以在绝对时间内重建进化史，并最终估计了疾病发作时的患者年龄。
为了全面评估涉及MM发病机制的突变过程的目录，我们询问了来自52位患者的WGS数据（补充数据 1）。26位患者（50％）在不同时间点收集了> 1个样本，总共89个肿瘤样本（补充表 1）。为了提高从头准确性突变特征提取，我们集成了两个独立的方法：SigProfiler及层级狄利克雷过程（HDP;“办法”）9，18。鉴定出八个单碱基取代（SBS）签名，其中七个与最新突变签名目录中包括的一个兼容：SBS1，SBS2，SBS5，SBS8，SBS9，SBS13和SBS18（图 1a;https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures/SBS/）9。最终突变特征，这里命名SBS-MM1，不对应于任何COSMIC参考突变签名但兼容与最近报道病因不明的MM突变特征（图 1A和补充图 1A，B）9，17，18，19。SBS-MM1作为一个独特的突变过程的存在通过扩展突变特征分析以将两个侧翼碱基5'和3'包括到突变碱基（1536类或5个核苷酸的背景；补充图1C，D）中进一步得到了验证。 ）。
a从52个MM患者的89个WGS中提取了 8个突变特征。b，c每个患者每个突变特征的相对（b）和绝对（c）贡献。的X轴标签根据疾病分期和治疗史有色：红=治疗幼稚; 蓝色=没有完整临床注释的复发病例；黑色=大剂量美法仑移植后复发病例；紫色=从未接受过大剂量马法兰治疗的复发病例；灰色=缺少临床数据。d所有八个MM突变特征对诊断时（ND =新诊断）收集的外显子组数据的相对贡献，复发以及当该病对硼替佐米和来那度胺均难治时（即双参考）。e有（顶部）和没有（底部）SBS-MM1证据的患者的转录链偏向谱。
尽管他们的统计的鲁棒性，在非均相类型的癌症如MM，从头提取算法可以通过突变签名样本，其中突变签名存在于数据集的仅一部分被错误地分配给每一个样品之间的出血偏置17，18。为了避免这种影响并准确地估计每个突变特征的贡献，我们设计了一种名为mmsig的算法，其中为每个患者拟合了MM中提取的八个突变特征。根据原始96类突变图谱与没有该突变签名的情况下生成的重构图谱之间的余弦相似度，校正了每个突变图谱的贡献（“方法”）。mmsig揭示只有9位患者（17％）在复发时获得的样本中SBS-MM1活性（图 1b，c和补充数据 2）。有趣的是，这种突变过程在暴露于高剂量马法兰和自体干细胞移植后尤其丰富（移植后5/9比其他疗法复发1/29； Fisher检验p = 0.001）。唯一有SBS-MM1活性证据的未移植患者（PD26414）在首次收集样品之前已接受了包括美法仑和环磷酰胺在内的多种干细胞动员治疗线。相比之下，所有预处理样品（即SMM和新诊断的MM）中都不存在SBS-MM1（0/20对5/9；p = 0.001，Fisher精确检验）。为了进一步研究治疗与SBS-MM1之间的关联，我们分析了来自两个独立验证队列的外显子组数据：（1）72例在诊断和复发时收集了配对样本的患者，其中70％的病例暴露于烷化剂（CoMMpass试验）；和（2）40名MM患者的所有以前暴露于烷化剂和耐火两者硼替佐米和来那度胺（图 1D）20，21。根据我们的观察，未治疗的样本中不存在SBS-MM1，但在复发和独立的复发/难治性队列中的同一患者中发现了SBS-MM1。除事先接触美法仑外，SBS-MM1没有明显的临床或复发基因组特征（补充表 2））。
几种与治疗相关的突变特征（例如，铂-SBS31 / SBS35，硫唑嘌呤-SBS32和SBS25）已与转录链偏向相关，反映了对受损DNA 9的转录偶联核苷酸切除修复活性。同样，SBS-MM1在C> T中显示出强烈的转录链偏向，涉及不同的三核苷酸（例如C [C> T] A，G [C> T] A，G [C> T] C，G [C> T] G，G [C> T] T）和五核苷酸上下文（例如GG [C> T] AA，GG [C> T] AC，GG [C> T] AG，GG [C> T] CA，GG [C> T] TA，GG [C> T] TG），支持该突变特征和化疗诱导的DNA损伤（图之间的关联。 1E和补充数据 2 - 4）。
最近的一项研究调查了79种已知或怀疑的环境致癌物在体外对人诱导的多能干细胞的诱变作用22。在这项研究中测试了美法仑的暴露。但是，由于信噪比<2 22，他们将该实验排除在进一步分析之外。通过两个独立的从头突变签名提取算法（hdp和SigProfiler）重新分析其发表的数据，我们确定了在暴露甲苯丙氨酸的细胞（即MSM0.10）中有重要的SBS-MM1贡献，但在15个对照细胞系中没有89例慢性淋巴细胞性白血病（CLL）（补充图 2））。这些阴性对照包括在从头提取中，以纠正不同样品之间18的潜在突变特征。进一步证实，MSM0.10的96类突变谱可以通过SBS-MM1和“对照”突变特征的结合得到最好的解释，该突变特征是在单细胞扩增中检测到的特征，与暴露无关，并归因于实验条件（补充数据 5和6）。最后，这些结果通过与mmsig的突变签名拟合得到了证实（补充图 3和4）。
总体而言，这些数据表明存在与美法仑暴露相关的独特突变特征，表明标准化学疗法可以改变MM中的肿瘤基因组。这是否有助于复发时的表型和随后的进化轨迹尚待解决。
调查参与MM发病机制的突变特征的地形，我们观察到SBS9，SBS8和SBS5在染色质可及性较低的晚期复制区域中大量富集，这与其他癌症的观察结果一致（补充图 5）23。对于SBS-MM1，发现了类似的富集模式。
两个时钟状突起（SBS1和SBS5）在所有患者中观察到，在与先前的工作（图线 1C，d）6，7，9，17，24，25，26。APOBEC（SBS2和SBS13）也被确认为一个重要的突变过程中，不存在于只有9例（17％）17，25，27，28。虽然SBS2始终是最常见的APOBEC签名（43/52; 83％），但有6例（11.5％）观察到SBS13活性（补充数据 2）。其中两个的特点是突变负荷高，APOBEC（SBS2 + SBS13）贡献超过20％。两例有IGH易位涉及MAFB和MAFA，确认它们之间的已知关联IGH易位和高APOBEC突变活性（补充数据 1）26，27。有趣的是，这两个案例是仅有的没有可检测到的非规范激活诱导的脱氨酶（AID）（SBS9）活性的案例。
癌症中的APOBEC突变活性可以通过两种主要的亚型得以维持：APOBEC3A和APOBEC3B。每个同工型的贡献可以通过考虑第二个碱基5'对突变的胞嘧啶（4-核苷酸上下文）29来估计。在实体癌中，APOBEC3A被认为是活性最高的同工型9。相比之下，我们发现所有MM患者的比例均为1：1，但值得注意的是MAFB / MAFA易位病例的比例较高（图 2a）。MAF易位与APOBEC3A活性高于APOBEC3B 的关联在来自692个新诊断的MM的外显子组数据中进一步得到了证实，其中包括可用的IGH易位数据（图7）。 2b，c）。因此，我们问是否可以通过总APOBEC突变负担来类似地解释实体癌中APOBEC3A / 3B比的变化。分析PCAWG ICGC联盟中APOBEC活性的证据，分析了27种肿瘤类型中788个WGS的4核苷酸背景，我们观察到APOBEC3A / APOBEC3B比率与APOBEC突变负担之间有很强的正相关性（线性回归p <0.0001；图 2d） ，）。相反，当整体APOBEC突变率较低时，APOBEC 3A / 3B的比率接近1：1。总体而言，这表明在全基因组水平上存在两种不同的APOBEC突变模式：一种是数百种突变是由APOBEC3A和APOBEC3B引起的，另一种是APOBEC突变负担较高，并且主要由APOBEC3A维持。具有高APOBEC活性的肿瘤在MM和实体瘤中表现出相似的模式，表明潜在的共同机制。
a，b在所有多个骨髓瘤全基因组（a）和具有高APOBEC突变负担和可用结构变异数据（b）的CoMMpass外显子组中，APOBEC3A / APOBEC3B之比。红色和黑色x标记分别用于突出显示有和没有MAF易位的患者。c具有（n = 40）和没有MAF（n = 652）易位的患者之间的APOBEC3A / APOBEC3B差异比率（ 通过wilcoxon.text R函数p <0.0001 ）。箱线图显示中位数和四分位数范围；在此间隔之外的观察结果显示为点。d在我们的MM病例以及PCAWG协会中包括的所有肿瘤中，APOBEC3A / APOBEC3B的比率具有APOBEC活性的证据。红点表示每种癌症类型的中位APOBEC3A / 3B比率。e APOBEC突变负担（对数刻度）与APOBEC3A / APOBEC3B之比之间的相关性。 使用线性回归（lm R函数）估计R平方和p值（p <0.0001 ）。
经典和非经典的AID活动（c-AID-SBS84和NC-AID-SBS9，分别地）一直在kataegis区域在MM和其他后生发中心淋巴增殖性疾病中描述从免疫球蛋白基因座9，17，24，30，31。SigProfiler或hdp并未在全基因组范围内提取c-AID活性，这与其在特定热点（例如免疫球蛋白基因座）上的局部突变活性一致（补充图 6）18。这两个过程都在突变簇中起作用，反映了最重要的生发中心（GC）过程之一：体细胞超突变（SHM）32。在免疫球蛋白基因座之外，提取了127个kataegis事件（每位患者中位数2个；范围0-13），主要由nc-AID或APOBEC引起（图 3a-d）。从至少一个结构变异（SV）断点起，有47个非免疫球蛋白Kategis（37％）位于<1 Mb的位置。有趣的是，这些事件中有95％是由APOBEC引起的（图 3c–e）。相比之下，nc-AID角化事件通常与SV不相关（图 3d–f）。总体而言，这表明MM的免疫球蛋白基因座之外的两个获取扇形藻的主要途径是：一种是由AID活性引起的，可能反映了GC的暴露。另一个是由APOBEC引起的，通常与结构染色体的改变同时发生。
a在52例MM患者中提取的所有kataegis事件的分布，每种颜色反映了不同的患者。b每位患者的卡塔吉斯病事件数。c在至少接近一个SV断点的Kategis事件中，APOBEC（SBS2和SBS13）是主要的突变过程。d与nc断点无关的其他kataegis事件由nc-AID控制。e APOBEC介导的与嗜铬菌病相关的角斑的例子。fnc-AID分类示例与SV不相关。在ê，˚F，黑点代表染色体倍性状态。黑色，蓝色，绿色和红色垂直线分别反映了易位，倒置，串联重复和缺失。在每个拷贝数/结构变异图的下方，我们报告了所有SNV的变异距离，这些变异按类别进行了颜色编码（蓝色：C> A，黑色C> G，红色C> T，灰色T> A，绿色T> C，粉红色T> G）。
为了研究在每个突变处理时间的活性，我们重构的系统发生树用于与一个以上的样本的每个患者在不同时间点（收集Ñ = 26）和细分所有突变分为三大类15，17：（1）早期克隆的（即，在所有样品中都鉴定为克隆的突变）；（2）晚期克隆（即至少在一个样本中克隆但并非全部在克隆中）；（3）亚克隆（在任何样品中都不是克隆）（图 4a）。与晚期克隆和亚克隆相比，早期克隆突变中nc-AID的含量很高（p <0.0001; 成对的Wilcoxon检验）。在18例（69％）中，仅在早期克隆突变中检测到nc-AID。有趣的是，仍在8位（31％）患者的晚期克隆和亚克隆突变中观察到了持久的nc-AID贡献，表明在最近的共同祖先（MRCA）之后，GC暴露和AID驱动的亚克隆多样化（图 4a）。
一个热图，显示了三个进化阶段（早期克隆，晚期克隆和亚克隆）中突变特征的相对贡献。仅考虑在不同时间点采集了一个以上样本的患者（n = 26）。b来自29个新诊断的患者和11个对照供体的20,586个单个骨髓浆细胞中特定基因的单细胞基因表达盒图。每个框代表0.25-0.75％的唯一分子标识符（UMI）计数，且行扩展到0.1-0.9％；点代表平均UMI计数。患者按疾病进行颜色区分（灰色-髋关节置换手术（髋关节CTRL），黄色-MGUS，浅红色-SMM，红色-MM，深红色-AL淀粉样变性）。C具有在不同时间点收集的多个样本的患者的每个系统发育树的突变特征组成以及SBS-MM1的证据。星号表示在SBS-MM1单核苷酸，三核苷酸和五核苷酸上下文中存在转录链偏向。d CoMMpass患者的突变特征贡献，在基线和首次复发时收集样本，并通过全外显子组和低覆盖率长插入WGS进行调查（n = 24）。根据突变在每个患者系统树中的位置进行分组。通过移植和高剂量马法兰状态着色的x轴标签：黑色表示高剂量马法兰（HDM）暴露，紫色表示未暴露。e，f相对（e）和（f）对788名CoMMpass MM患者的克隆和亚克隆突变的APOBEC（SBS2和SBS13）的绝对贡献。 使用wilcoxon.text R函数计算p值（p<0.001）。g从CoMMpass和WGS数据中，新诊断的MM患者与非同义（Nonsyn）突变相比，非编码的突变签名贡献。
我们继续寻找在MRCA后AID活性的其他证据，无论是在有限的时间内还是在MM诊断时仍在持续。首先，我们在IGH基因座中搜索c-AID活性的突变足迹。在26个配对的WGS样品中，我们鉴定出196个独特突变，这些突变在同一位患者的所有样品中未共享，显示出c-AID贡献的明确证据（补充图 7A）。通过全外显子组测序，在来自CoMMpass研究的72位患者的连续样本中证实了这些结果（补充图 7B，C）。接下来，我们从26个配对样本中的WGS数据重建了IGH的第三互补决定区（CDR3）（补充表 3）。）。有趣的是，所有患者的样本对之间的CDR3序列均相同。高度保守的CDR3序列随时间的MM是一致的与先前的研究33，包括从在CoMMpass顺序采样的RNA测序CDR3重建队列34。
为了确定MM诊断时AID突变活性是否仍在进行，我们分析了AICDA基因的表达（编码AID）。目前还没有任何证据AICDA散装RNA测序（表达Ñ 在CoMMpass研究= 792;补充图 7D）或在单细胞水平（图 4B），与先前的报道该AID蛋白不以mm表示一致细胞35。此外，免疫球蛋白CDR3序列的单细胞分析未显示克隆内变异36。综上所述，这些观察结果表明，AID突变活性在疾病开始后会持续一段时间，从而在部分患者中推动晚期克隆和亚克隆诱变，但在MM诊断时不再活跃。我们假设骨髓瘤前体细胞可能是抗原反应性的，导致重复进入GC的循环，直到该疾病变成抗原和GC独立。
仅在暴露于美法仑的患者的晚期克隆和亚克隆突变中检测到SBS-MM1及其转录链偏向的特征性模式，这与治疗相关联（图 4c和补充图 8）。患者PD26403是与疾病进展和治疗相关的随时间变化的突变特征格局变化的标志性示例（补充图 9）。该患者是唯一在闷烧阶段，发展为有症状的MM以及大剂量美法仑治疗后复发的患者。两种进展均以分支进化为特征，但仅在治疗后选择的突变中检测到SBS-MM1，而不是从SMM到MM的自然进展。为了进一步研究美法仑暴露与SBS-MM1之间的关联，我们分析了参加CoMMpass试验的24位患者的突变特征图谱，这些患者在基线和首次复发时进行了全外显子组和低覆盖WGS的研究（补充数据 7）。重建每个患者的系统树，我们将突变分为四个主要组：克隆（即系统树的树干）和从诊断到复发的三种选择模式之一：阴性，阳性和中性（即不变）癌细胞分数）（“方法”）。通过暴露于高剂量马法兰来进一步分离每组。根据与治疗相关的病因，仅在美法仑暴露后阳性选择的突变中鉴定出SBS-MM1（图 4d）。
与AID相比，APOBEC在晚期克隆和亚克隆突变中显着富集（p <0.0001；成对Wilcoxon检验），其中8名患者（31％）在早期克隆变体中没有可检测到的APOBEC（图 4a）。在CoMMpass外显子组队列中也证实了APOBEC在癌症发展晚期的活性增加（图 4e，f；p <0.001 Wilcoxon检验）。有趣的是，在这个大型外显子组系列中，与非编码突变相比，SBS2和SBS13在非同义词中特别丰富（21.3％对11.6％; Fisher检验p <0.001），证实了APOBEC在MM进展和亚克隆多样化中的作用（图。 4克）37。SBS8和SBS18分别在45（86％）和6（11％）例中检测到，通常在晚期克隆和亚克隆突变中有较高的贡献。
早期的克隆簇通常占总突变负担的50％以上（中位数为70.6％；范围为33-100％），其组成反映了临床前阶段不同时间段内活跃的不同突变过程的总和。为了研究早期克隆突变中每个突变过程的时间活性，我们利用33名患者的主要和次要染色体增益，将早期克隆突变可分为重复突变（即，存在于两个等位基因上，因此在重复之前获得）或非重复突变（即，在一个等位基因上检测到），反映了次要等位基因的增益前或后突变或在一个重复等位基因之一上获得的增益后突变（“方法”）15。尽管SBS1和SBS5在两组突变中均有效（前和后增益），但nc-AID（SBS9）在前突变中显着富集（p <0.0001），突显其参与了MM的最早阶段发病机理（图 5a，b）。在一个等位基因上也检测到归因于nc-AID的突变。这可以通过持续的AID活性引起重复后的突变或在次要等位基因获得之前获得的突变来解释。为了解决这种歧义，我们将分析限制在16位患者的大面积复制中性杂合性丧失（LOH）中，其中次要的等位基因丢失了，主要的重复了。在这些情况下，必须在获得增益后获取单个等位基因上存在的所有突变。虽然在发生LOH事件之前nc-AID活性更为主要，但在LOH事件发生之后仍可以检测到（图 5c）。同样，我们表征了在同一等位基因的两个独立增益之间获得的突变（即，四体性）。在10例患者中观察到16个克隆四倍体。使用我们的分子时间的方法，我们估计，六名患者曾在两个不同的时间窗口获得的一个或多个四体2，15。在其中三个中，在两次重复之间鉴定出nc-AID（即，四个等位基因中的两个等位基因发生突变）（图 5d）。值得注意的是，在没有亚克隆nc-AID突变的12例患者中，有2例具有配对样本的患者显示出首次获得nc-AID活性延长的证据。总体而言，这些数据进一步支持了这样的观念，即发生转化时，AID突变活性并不局限于最初的GC接触，而是在大多数情况下会在相当长的时间跨度内继续塑造基因组。
大量染色体获得前后，SBS2和SBS9 的相对贡献。每个患者的克隆突变目录分为两组：获得前获得的突变（VAF校正为正常污染= 66％），单个等位基因上存在的突变（VAF校正为正常污染33％）。p使用wilcoxon.text R函数估计值。b热图显示了每个患者在不同时间窗口内所有突变特征的相对贡献。c复制中性LOH之前（顶部）和之后（底部）获得的所有突变的96类突变谱。d在第二次重复之前在一个重复的等位基因上获得的所有突变的96类突变谱。e随时间推移的四个主要突变特征码模式的示意图。在右下方的面板中，APOBEC被涂成棕色，以反映APOBEC的高贡献。
有趣的是， 除了两名MAFA / MAFB MM患者外，在获得染色体之前，APOBEC活性通常较低（n = 8）或不存在（n = 20）。在这里，APOBEC在最早阶段就已经非常活跃，在任何阶段都无法检测到nc-AID。为了调查在这两种情况下AID是否都具有活性，我们分析了其免疫球蛋白基因座的突变谱。尽管突变数量有限，但仍检测到最小的c-AID活性（补充图 10A）。为了进一步确认具有高APOBEC突变负担的MM患者对免疫球蛋白基因座的c-AID活性，我们分别询问了70名和863名新诊断的具有高和低APOBEC活性的MM患者的外显子组数据26。两组之间未观察到差异（补充图 10B，C），证实所有MM病例均已发生SHM。
尽管SBS5在肿瘤发展的所有阶段引起大多数突变，但AID和APOBEC诱变的不同时间模式可能代表着细胞进程的足迹和向MM进化的过程中的暴露。我们的数据至少提出了四种模式（图 5e）：（1）APOBEC在包括癌症发作在内的所有进化阶段均起主要作用，而AID的贡献最小。（二）APOBEC不参与任何阶段的；（3）AID仅在癌症发生的早期阶段才起作用；（4）自从癌症发展的最初阶段以来，AID是主要的突变过程，并且仍在晚期亚克隆多样化中发挥作用。
类似于其他癌症2，6，9，我们发现SBS1和SBS5是活跃在所有患者MM的所有阶段。在许多癌症和正常组织中，这些突变签名与患者年龄相关4，6，7，8，38，39。一小部分MM外显子组（n = 68）的先前结果显示，SBS1具有适度的相关性，而SBS5 6没有。在这里，我们采用了几种方法来确定MM是否确实具有类似于时钟的突变过程，并将我们的WGS队列与大型外显子组序列整合在一起。
首先，我们 使用线性回归模型评估了CoMMpass外显子组数据集（n = 764）中MM诊断时患者年龄与归因于每个突变特征的突变负担之间的关系。确定了SBS5的重要关系[斜率1.55（95％置信区间（CI）0.97-2.14）；p <0.0001]和SBS1 [斜率0.29（95％CI 0.13–0.45）；p = 0.0003]，但没有其他突变特征（图 6a和补充数据 8））。尽管有很强的相关性，但个别患者之间SBS1和SBS5突变负荷的差异很大，不能仅凭年龄来解释。接下来，我们将线性混合效应（LME）模型应用于具有配对诊断和复发外显子组的CoMMpass数据集中的72位患者，使每位患者以不同的速率积累突变5。LME模型证实了SBS5与年龄之间存在强线性关系（p <0.0001），而SBS1的关联性较弱（图 6b和补充数据 8）。最后，为了更详细地解决随时间变化的SBS5突变率，我们对WGS队列应用了类似的LME模型（整个计算流程在补充数据9中进行了报告。 ）。在这里，由于WGS数据的分辨率更高，我们能够量化每个亚克隆中的SBS5突变活性并定义主要的进化轨迹（“方法”）5。这是必需的，因为突变是在不同的亚克隆中独立获得的。因此，将所有亚克隆折叠在一起会高估突变率。再次，我们观察到SBS5突变负荷随患者年龄呈线性增加，整个队列平均每年38.8个突变（95％CI 35.74–41.78），患者间标准偏差为7.1。（图 6c，补充图 11和补充数据 9）。我们研究中的患者之间差异与Mitchell等人观察到的差异相似。在肾脏癌中使用类似的方法，报告的平均突变率为每年89，患者间标准差为17 5。
764个CoMMpass全外显子组测序病例中SBS5突变负担和年龄的线性回归模型（p <0.0001，具有lm R函数）。b具有72个CoMMpass患者的SBS5突变率的线性混合效应模型，该患者在不同时间点采集了连续样本（p <0.0001，具有lmer R函数）。点代表在系统发生分支中观察到的SBS5突变负担，由患者着色。彩色线表示患者特定的SBS5突变率（即斜率），总体平均值为黑色线，周围为阴影的95％置信区间。C我们多发性骨髓瘤基因组队列中SBS5突变率的线性混合效应模型；b中的图例（ 带有lmer R功能的p <0.0001 ）。d线性回归模型，用于PCAWG协会中包括的非超突变B细胞淋巴瘤和CLL WGS中SBS5突变的负担和年龄（p <0.0001，具有lm R功能）。
几个因素可能会影响WGS识别肿瘤样品中突变的能力，例如测序范围，肿瘤纯度和倍性。如果这些因素混淆了SBS5突变负荷的估计，则在LME模型中对其进行调整可能会提供更准确的分子时钟。此外，在肿瘤进化和亚克隆多样化的晚期阶段，SBS5突变率可能会加速。我们通过在LME模型中加入年龄的二次项来测试这种效果，有效地使突变率随年龄5而抛物线地增加。调整上述功能并不能改善LME模型的拟合度，并且估计的SBS5突变率仍保持基本不变（补充图 12，补充数据 9）此外，估计的SBS5突变率与疾病阶段无关（即SMM，新诊断的MM或复发的MM； 通过成对的Wilcoxon检验将Bonferroni-Holm调整为p = 1；补充图 11，补充数据 9）。总之，我们的数据表明，突变SBS5积聚在每个MM肿瘤，类似于其他癌症和正常组织的恒定速率4，5，6，7，38，39。
考虑到MM中SBS5的时钟状行为，我们预期在其他B细胞衍生的淋巴增生性疾病中也有类似的模式。为了证实这一点，我们询问了ICGC / PCAWG联盟中包括的89个CLL和107个B细胞淋巴瘤基因组。通过线性回归分析在两个非超突变的B细胞淋巴瘤中证实了SBS5突变负担与患者年龄之间的相关性[斜率28.21（标准误4.87）；p <0.0001]和CLL [斜率18.6（标准误差4.8）; p = 0.0006]（图 6d和“方法”）。有趣的是，突变和未突变的CLL表现出相似的斜率，这表明与确定随后的环境暴露（例如，GC中的抗原驱动选择）相比，潜在的生物学在确定SBS5突变率随时间变化时更为重要。
有SBS5建立在MM的分子钟，我们应用它来估计每个病人的绝对年龄当肿瘤发展过程中具有里程碑意义的事件发生2，4，5。这包括一级和二级染色体的获得以及MRCA的出现。根据每位患者每年的SBS5突变率，我们将每个标志性事件发生之前累积的SBS5突变数转换为该事件发生时的患者年龄估计值。基于具有多个可用样本的患者的早期克隆SBS5突变负担，估算MRCA时机。MRCA年龄与首次采集样本之间的中值时间差变化很大（14.2岁；范围为0-45）（补充图 13和补充数据） 9）。在某些患者中，出现MRCA的估计年龄与样本收集时间非常接近，这也可能反映出克隆突变负担的高估。当由于缺少空间和基因组异质性以及采样偏差40而将肿瘤系统树的分支不适当地指定为树干时，可能会发生这种情况。
为了评估第一个MM驾驶员事件发生时的患者年龄，我们利用了MM染色体高发病率及其在癌症发作中的参与。28位患者（54％）至少发生了一次多增益事件，其中有6位患者有证据表明在两个不同的时间窗口中获得了收益（图 7，“方法”和补充数据 9）2，15。使用针对患者的SBS5突变率，我们估计了发生这些事件时的患者年龄，这与针对MRCA的情况类似。有趣的是，在样本采集之前，平均37.5年（范围8-66）获得了第一次染色体重复。在21/27（78％）的病例中，第一次多增益事件发生在30岁之前，而12/27（44％）的病例则在20岁之前发生（图 7b和补充数据 9）。）。总体而言，第二个多收益事件倾向于发生在更接近第一个样本集合的地方（中位数8，范围0-37），这反映了一个长期的进化过程，随着时间的流逝，驾驶员不断积累并经历选择。最后，我们测试了绝对时序估计对突变签名拟合（“方法”）不确定性的鲁棒性。这证实了我们的结论，即多数患者中的第一个多增益事件发生在30岁之前（补充数据 9，补充图 14）。
在同一时间窗口（上图）中出现的具有较大染色体增益的重复（CN = 2）和非重复（CN = 1）等位基因上的 SBS5突变负担，以及基于重复和非重复的校正比率的分子时间估计突变（下面的点）。上部面板中95％的置信区间基于突变签名拟合的不确定性，这些不确定性会传播到底部面板中的不同估计值（颜色）。下部面板中95％的置信区间条表示给定许多重复和非重复的SBS5突变时分子时间估计的不确定性。b在具有95％CI的第一次（深绿色）和第二次（绿色）多增益事件中的估计患者年龄。蓝色和红色圆点分别代表MRCA出现和第一次采样时的年龄。仅针对具有多个样本的患者显示MRCA时序。
在这项研究中，我们利用了大型的WGS和全外显子组测序数据集来重建塑造MM基因组的突变过程的时间表，从而提供了有关其起源和进化轨迹的新见识。
我们确定了与复发性MM中的美法仑暴露相关的突变特征，表明该药在克隆性浆细胞中具有诱变作用。考虑到高剂量美法仑被认为是合格患者的标准一线治疗的一部分，这一点很重要41。有趣的是，并非所有接触美法仑的患者都显示出SBS-MM1的证据。对于这种观察，我们提出了两种可能的解释。首先，根据最近提出的单细胞扩增模型，获得马法兰诱导的突变的细胞必须进行克隆扩增，以使这些突变能够被大批WGS 42检测到。相反，在中性进化的背景下25在没有单个细胞具有主要生长优势的地方，新获得的突变不会达到WGS检测的阈值（图 8a）。其次，melphalan后的复发可能源于肿瘤细胞污染了自体干细胞移植物43。自体干细胞在大剂量马法兰治疗之前收集，并在之后重新注入，因此不会暴露于马法兰（图 8a）。未来的研究将揭示由美法仑引起的突变是否影响复发性疾病的发展或继发性恶性肿瘤的发展，例如急性髓细胞性白血病44。
一幅动画片，概述了美法仑对MM患者的诱变影响。如果是移植后的肿瘤细胞，MM细胞将不会有任何由木香素诱导的突变（上图）。当癌细胞暴露于美法仑时，它会获得独特的突变，只有在单个肿瘤细胞扩展（中心）的情况下才能检测到。在没有单细胞扩增的情况下，美法仑诱导的突变将出现在每个暴露的肿瘤细胞中，但是由于癌细胞比例低而无法检测到。b MM发展的恶变前阶段的GC依赖性克隆扩增和AID介导的高突变模型。最后，单个细胞变得独立于GC，继续扩展并产生MM克隆。
在MM发病机理中，与AID和APOBEC活性有关的突变过程显示出至少四个不同的时间模式。有趣的是，我们的数据表明AID活性不仅限于第一次GC反应，而且至少在一部分患者中持续存在，可能影响疾病的发展。这表明前恶性MM细胞行为类似于记忆B细胞，其能够再进入GC经历MM诊断（图之前克隆扩增几十年的 8B）45，46。事实上，在MM延长的抗原应答相的概念是由脂质反应性丙种球蛋白病，其中抗原刺激导致克隆浆细胞扩增并在小鼠中号尖峰增加了研究的支持47，48。
根据患者特定的SBS5突变率和分子时间推断，我们估计MM患者中的首次染色体重复通常是在30岁之前获得的。尽管我们的估计，类似于以前的报告不确定性4，6，7，8，38，我们观察到跨患者早期建议获得收益的一个清晰的模式。此外，我们的发现与流行病学数据一致。大规模人群研究表明，MGUS开始变得能检测在30岁，此后患病率继续增加49，50。进一步缩小了起始和临床可检测实体之间的窗口，使用高灵敏度质谱分析的新兴研究已经鉴定了长达10年的血清单克隆蛋白，然后才可以通过常规方法进行检测51。
我们的分析提供了对骨髓瘤形成的早期阶段的了解，在该阶段中，获得第一个关键驱动因素要比癌症诊断早几十年。定义转化发生的时间窗口为新的研究途径开辟了道路：确定疾病引发和演变的原因机制，更好地定义开始治疗的最佳时间，并最终制定早期的预防策略。
该研究涉及人类样本的使用，这些样本是在获得书面知情同意后收集的（WTSI协议编号15/046）15。根据赫尔辛基宣言获得并管理了样品和数据。从30例患者的骨髓中纯化的CD138 +细胞中提取DNA。二十六（86％）位患者在不同时间点收集了一个以上的样本，总共67份肿瘤样本和30份从外周血单核细胞中收集到的正常人（补充表 1）。在不同的临床时间点收集样本：SMM（n = 11），新诊断的MM（n = 15）和复发性MM（n = 41）（补充表 1）。
构建了短插入500 bp基因组文库，制备了流通池，并根据Illumina规程生成了测序簇。我们在HiSeq X10基因组分析仪上进行了108个碱基/ 100个碱基（基因组）的配对末端测序。平均序列覆盖率为38.7倍。使用Burrows-Wheeler Aligner，BWA（v0.5.9），将短插入片段的配对末端读数与参考人类基因组（GRCh37）进行比对。测序数据已以登录号EGAD00001001898保存在欧洲基因组表型档案库（EGA）中。
在该队列中，我们增加了22位具有可用WGS数据（dbGap：phs000348.v2.p1）的MM患者。原始数据的下载和处理类似于内部样本。
来自两个队列的所有89个MM样本均在Wellcome Sanger Institute 15中进行了统一分析。简而言之，使用以下已发布的工具分析了重复数据消除的对齐BAM文件：（1）ASCAT和Battenberg用于克隆和亚克隆拷贝数变体；（2）黄铜的SV；（3）穴居人的单核苷酸变体（SNV）；（4）小插入的Pindel –缺失；（5）Dirichlet过程，以确定肿瘤的克隆结构。系统发育树的重建是通过将鸽子洞原理应用于Dirichlet过程15定义的突变簇而进行的。MRCA被定义为在所有采样器（即系统发育树的树干）中检测为克隆的突变簇。
Kataegis或局部超突变灶定义为≥6个连续突变，平均突变间隔≤1 Kb。
该研究包括两个队列的外显子组数据。其中一项由933名MM患者组成，参加了CoMMpass试验（NCT01454297; phs000748.v1.p1）。CoMMpass数据是多发性骨髓瘤研究基金会个性化医学计划（https://research.themmrf.org）的一部分。PhyloWGS 52用于从788位患者的全外显子组测序中重建系统发育树结构，并从低覆盖率的长插入WGS（中位数4-8x）获得可用的拷贝数数据。有72位患者在基线和首次复发时收集了样本，并进行了整个外显子组测序。这些患者中有24位还具有低覆盖率的长插入WGS数据（补充数据 7）。对于后24位患者，将突变分为（i）在两个样本中均为克隆突变（系统进化树树干）；（ii）在复发时阳性或阴性选择的突变；（iii）从诊断到复发（中性）的癌细胞分数无任何差异的亚克隆突变。
第二队列由40名MM患者包含耐火到两个免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂（INT 15/14; EGAS00001003709）20，21。从40名患者（共80个样本）中处理了肿瘤（CD138 +骨髓浆细胞）和匹配的种系样本（颊拭子的DNA）。使用SureSelect All Exon V6试剂盒（Agilent Technologies）富集了DNA的基因组编码部分，并使用NextSeq500机器（Illumina）在75 bp配对末端的方案中对每个患者平均测序了15.63 Gb。样品被测序到平均深度为97倍。使用Burrows-Wheeler Aligner，BWAmem（v0.7.12）将配对末端的读段与参考人类基因组（GRCh37）进行比对，并按照GATK最佳做法3.7进行后处理。与CoMMpass工作流程类似，使用三种不同的变体调用方调用了体型SNV：MuTect2 53，CaVEMan 54和MuSE 55。小插入-删除被称为MuTect2。为了创建可信的变体列表，我们选择了至少两种算法调用的变体。
最近对29位浆细胞异常的患者和11位对照的单细胞RNA测序队列进行了查询，以了解单细胞中AID的表达（GSE117156）36。
VDJ基因片段的使用和HCDR3序列是使用自定义脚本（补充方法）从短读数据中重建的。
使用最近发布的R包mol_time（https://github.com/nicos-angelopoulos/mol_time）15估计每个多增益事件的相对时间。简而言之，我们选择了由Dirichlet Process（DP）估计具有> 50个克隆突变的所有染色体重复。使用混合模型（mclustR函数）一式两份（即，存在于多个等位基因上）和非重复（即，在一个等位基因上存在）。接下来，我们使用重复和非重复之间的校正比率来估计每个大染色体增益采集的相对时间（即分子时间）。使用自举函数估算每个分子时间的相对置信区间。为了定义获取不同增益的时间窗口，我们为每个自举解决方案（hclust R函数）执行了多个层次的聚类，并将最有可能的结果与随时间变化的Battenberg CNA进行了集成。
相同等位基因（四倍体）的两个重复副本的存在可以通过在紧密的时间序列或两个不同的时间窗口中发生的两个增益来解释。可以根据是否存在不同的中间阶段来区分这些情况，其中三个等位基因中有两个存在突变（中间变异等位基因分数为50％）。中间阶段的存在表明在两次获得之间已经经过了足够的时间来获得可区分的突变簇。相反，没有中间阶段则表明两种收益都发生在同一时间窗口内。
按照最近描述的三个步骤，针对SBS进行了突变特征分析：18（1）从头开始进行突变特征提取；（2）分配和（3）拟合。第一步，我们同时运行了分级Dirichlet流程（hdp：https : //github.com/nicolaroberts/hdp）和SigProfiler 9提取涉及的已知和潜在未知的SBS突变特征的工作流程。使用四个独立的后验采样链运行hdp，然后进行20,000次老化迭代，并从每个链中收集200个后验样本，每个采样之间进行200次迭代。SigProfiler运行了1000次总迭代。为了进一步验证MM中涉及哪些标记的定义以及提取的突变过程的鲁棒性，我们使用这两种方法分析了五核苷酸的背景。
第二步骤包括在每个所提取的过程中分配给一个特定的突变特征为SBS包括在最近更新的目录COSMIC（https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures/SBS/）9。突变签名分配方法包括两个步骤18。首先，将hdp和SigProfiler提取的所有突变签名分配给一个或两个COSMIC签名9的组合。为此，提取的突变签名与每个COSMIC签名之间的余弦相似性，或两个COSMIC签名的线性组合（使用非负最小二乘R包NNLS），进行了计算。在第二步中，我们确定排除每个提取的突变特征是否会影响重建误差，即原始目录与每个样品的突变特征的线性拟合组合之间的差异。
在最后一步中，我们创建了一个拟合算法，该算法将每个患者的整个突变目录与通过前两个步骤选择的突变特征相匹配。在此过程中，我们为每个样品重建了96个突变谱，但不包括一个接一个的突变特征。如果去除去除余弦相似度<0.01，则对该样品贡献最小的突变特征被顺序检查。作为SBS-MM1的参考，我们使用了hdp de novo提取中的96类配置文件。尽管SigProfiler和hdp提取的配置文件高度相似，但hdp的配置文件具有较低的背景贡献。因此，使用hdp定义的配置文件可避免其他突变特征引起的出血，从而提高了SBS-MM1调用的特异性。始终包含SBS1和SBS5，考虑到据报道它们在所有正常和肿瘤组织类型中均具有活性。通过这种方式，我们减少了样本之间突变特征的流失，并使用最新的参考文献量化了每个突变过程的贡献9。重要的是，由于每个样本都经过单独分析，因此无论该队列中是否包含其他样本，结果都是可重复的。通过从多项式分布中绘制1000个突变概况，每次重复突变特征拟合过程，最后为每个突变特征取2.5％和97.5个百分位数，生成了CI。突变签名转录链偏倚分析是通过将R的Poisson测试函数应用于 mmsig来进行的。mmsig的源代码可在GitHub上找到： https ://github.com/evenrus/mmsig。
突变特征分析的所有三个步骤（从头提取，赋值和拟合）均应用于最近公布的来自暴露于美法仑的人多能干细胞系和15个对照的数据22。
为了描述每个突变特征的时间轴，我们对在不同时间窗口内获得的不同突变组进行了mmsig运算。首先，我们分析了由DP定义的克隆与亚克隆突变。此后，我们只关注克隆突变。使用分子时间函数将它们分为重复和非重复。仅对于第一次分析，考虑具有多个样本的患者。总体而言，仅考虑具有> 50个突变的簇。
我们询问了ICGC / PCAWG财团（EGAS00001001692）56中包括的89个CLL和107个B细胞淋巴瘤基因组的突变特征和SBS5贡献。为了量化每个涉及的突变特征的贡献，我们运行了mmsig，仅包括在这些癌症9中活跃的突变过程。在淋巴瘤中，> 10,000个突变的患者中年龄与SBS5之间的相关性完全消失8。
为了在高和低APOBEC中划分CoMMpass数据，我们在有APOBEC活动证据的患者（49个突变）中使用了APOBEC突变负担的第4四分位数26。
为了证明MM中存在钟样突变过程，我们通过线性回归模型（lm R函数）探索了一大批新患者的SBS5 / SBS1与患者年龄之间的关联，这些患者具有可用的全外显子组测序数据（ CoMMpass; NCT01454297）以及来自B细胞淋巴增生性疾病（即CLL，MM和B细胞非霍奇金淋巴瘤）的WGS数据。其次，继最近公布的统计工作流程4，5，38，39，我们使用了LME模型（11聚物R函数），以在72个患者的不同时间点使用CoMMpass样本估算每年的突变率。在我们的WGS队列中使用了相同的统计方法。在这里，我们基于系统树重建独立地考虑了每个进化轨迹。这一点很重要，可以通过将累积了平行突变的克隆集中在一起来避免高估突变率。接下来，我们使用LME模型为MRCA和不同的多增益时间窗口计时，估计每个患者每年的突变率。我们的患者中有两个肿瘤的SNV> 10,000（MRC006BBM和V0D57H），因此被排除在分析之外。由于两次独立的全基因组重复，考虑到其倍性> 4，排除了另一个样本（PD26414）15。对于MRCA，我们对每位患者使用克隆的和共享的SBS5变异体的分数，并在不同时间点（n = 25）收集多个样品。对于不同的多增益事件的计时，我们计算了第一个（和第二个）多增益事件的基于SBS的分子时间。为了将多增益事件的相对时间转换为绝对时间，我们仅使用增益前后的SBS5突变负担来重复分子时间工作流程。为了提高时序估计的准确性，我们将在同一时间窗口中获取的所有三体性折叠在一起，成为单个多增益事件，并且仅包括涉及> 100个SBS5突变的此类事件。
为了测试我们的方法对SBS5随时间恒定的假设的敏感性，我们加入了一个关于年龄的二次项，有效地使突变率随年龄抛物增加。
为了研究不确定性的突变特征反褶积的影响，我们列入11聚物和时间估计都是由生成的每个SBS5估计的2.5％和97.5％CI mmsig。
合并来自所有WGS患者的突变目录，并将其分成整个基因组的1-Mb箱。对于每个垃圾箱，如上所述，mmsig用于突变特征拟合。皮尔逊相关性用于评估每个突变特征的突变计数与所有区域中标准化基因组特征之间的成对关系。染色质可访问性（GM12878），复制时间（GM06990）和易碎站点数据是从ENCODE获得的；来自repeatmasker的ALU元素；和原发性骨髓瘤H3K27ac数据如先前发表57。
数据分析是在R版本3.6.1中进行的。标准统计测试在手稿中相继提及，而上面介绍了更复杂的分析。所有报告的p值均为两侧，显着性阈值<0.05。
序列文件可从欧洲基因组-现象学档案库中获得，登录号为：EGAD00001003309来自30名多发性骨髓瘤患者的WGS数据；来自22位多发性骨髓瘤患者的phs000348.v2.p1 WGS数据；EGAS00001001692：来自89例慢性淋巴细胞白血病和107例B细胞淋巴瘤的WGS数据；phs000748.v1.p1：分别来自933名和792名多发性骨髓瘤患者的WXS和大量RNA测序数据（CoMMpass试验）；EGAS00001003709 40例复发/难治性多发性骨髓瘤患者的WXS数据；GSE117156：来自29位新诊断的患者和11位对照供体的单细胞RNA测序数据。
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