Bryostatin 1是一种海洋天然产物，正在研究中，其目的是消除HIV / AIDS，治疗神经系统疾病以及增强CAR T / NK细胞免疫疗法。尽管其有前途的活性，但对于人类疾病的治疗，bryostatin 1既未进化也未优化。在这里，我们报告了几种抑菌素1的近距离类似物的设计，合成和生物学评估。使用一种功能导向的合成方法，我们合成了一系列旨在维持对抑菌素目标蛋白激酶C（PKC）亲和力的抑菌素类似物。能够探索其不同的生物学功能。我们的后期多元化策略可有效访问bryostatin类似物库，根据我们的设计，该库保留了对PKC的亲和力，但表现出可变的PKC易位动力学。
针对癌症的靶向生物制剂和细胞疗法，包括单克隆抗体（mAbs）1，抗体-药物结合物（ADC's）2，双特异性和三特异性抗体（biAbs，triAbs）3，嵌合抗原受体（CAR）T和NK细胞疗法，和新抗原定向细胞疗法4，5，6，彻底变革肿瘤学。通过靶向肿瘤特异性细胞表面抗原和新抗原，这些疗法提供了优于传统的治疗方案具有明显的优势，因为它们避免与细胞毒性化疗相关的全身毒性，同时有效地和选择性地清除恶性细胞7，8。尽管这些细胞疗法依赖于极为不同的作用机制，并利用不同的宿主生物系统清除肿瘤，但每种疗法基本上都是基于共同的需求，特别是足够且持续的靶标（新）抗原细胞表面表达。尽管这些免疫肿瘤学的最新进展具有临床前景，但由于靶标（新）抗原表面表达降低而导致的肿瘤逃逸和获得性耐药限制了这些方法的有效性，持久性和范围。实际上，响应和患者复发的耐久性差与变量相关联和降低的抗原密度跨越几个指示已经观察到4，5，9，10，11，12。鉴定能够增强和维持靶标（新）抗原表面表达的佐剂可以广泛解决该问题，并通过将冷肿瘤转变为热肿瘤来提高这些方法的疗效13，然后可以通过靶向生物制剂和细胞疗法更有效地清除因此，不仅可能增加患者反应者的数量，而且可能会增加他们反应的持久性。
蛋白激酶C（PKC）调节剂为这种抗原密度和持久性问题提供了潜在的通用解决方案。其中研究最多的PKC调节剂，植物来源的佛波醇酯（PES）人们早已知道在各种细胞系中影响抗原表达14，15，16，17，18。通过这样的调查结果以及与意图使用面向功能的合成（FOS）的策略，以确定简化PE类似物提示19，20，21，我们在1986年报道的PE的药效的基于计算机的分析和相关的PKC调节配体，其导致了第一个设计的PKC调节剂-3-（N-乙酰氨基）-5-（N-癸基-N-甲基氨基）-苄醇（ADMB）22。1992年，Leon等人。23显示ADMB像PE一样，增强了乳腺癌细胞中肿瘤相关抗原（BCA-225）的表达，但与PE不同，它不诱导抗原的脱落，这突出了受天然产物启发设计的类似物表现出差异性的潜力和卓越的生物活性。值得注意的是，PEs的免疫调节特性并不是该结构类别的PKC调节剂所独有的。例如，苔藓抑素1，海洋大环内酯和有效的PKC调制器24，25，也改变在肿瘤细胞系表面抗原的表达，使它们更具有免疫原性，因而更容易受到免疫或其他抗原靶向清除策略17，26，27，28，29，30。实际上，一些临床前和临床研究已经报道，抑菌素1可以改变急性淋巴细胞白血病（ALL），慢性淋巴细胞白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）中癌细胞的免疫表型并提高其免疫原性17，26，27，28，29，30，31。这些和相关研究通过Spaner-Wender合作开展CLL抗原表达以及Zack-Marsden-Wender合作开展CD4 + T细胞中CD69表达（后者与HIV消灭有关）表明，PKC调节剂可以增强某些抗原的表达和持久性潜在增强多种（NEO）抗原靶向疗法17，30，32，33，34。
在临床评估中的抗原靶向策略中，CAR T细胞疗法最近已成为治疗B细胞恶性肿瘤的有效方法。具体来说，靶向B细胞限制性抗原CD19的CAR T细胞（Tisagenlecleucel（Kymriah，Novartis），Axicabtagene ciloleucel（Yescarta，Gilead））在白血病和淋巴瘤的治疗中已产生了显着的临床反应35。然而，抗原损失已经观察到，如获得性抗性和患者复发的主要推动力4，5，11，35，36。为了解决这种肿瘤逃逸的机制，研究人员将其靶标组合扩展到了其他B细胞限制性抗原，最终达到了抗CD22 CAR T细胞疗法的最新发展11。来自一项针对幼稚或对CD19靶向CAR免疫治疗无反应或有抗药性的ALL患者的I期临床试验的初步数据是有希望的，约70％的患者在6个月的中位期间获得了完全缓解11。然而，在治疗后无反应或复发的部分患者中观察到了CD22表面表达水平降低和变化所驱动的耐药性。重要的是，苔藓抑素1已显示出在ALL，CLL和NHL细胞在体外和先体外后体内上调CD22表面表达26，28，31，37，和在体内在人类临床试验27，29。这表明，bryostatin 1及其类似物可与抗CD22 CAR T疗法联合使用，通过确保恶性细胞维持足够水平的CD22表面表达来有效清除，从而改善患者预后。实际上，Ramakrishna等人。31最近证实，在ALL的临床前模型中，天然的bryostatin 1可以改善CD22靶向的CAR T活性。
考虑到PKC调节剂具有增强靶向疗法的潜力，特别值得注意的是，过去几十年来，该领域的绝大多数研究仅集中于少数天然产物，更具体地讲是抑菌素1。这特别重要，因为这些药物尽管有前途的临床前景，但并未针对临床用途进行改进或优化。如从对紫杉烷类和除虫菌素，直接合成前体和天然产物的衍生物的研究中，所谓明显近距离类似物，通常提供优异的临床表现38，39。的确，虽然许多药物都是受天然产品启发的，但从1981年至2014年间报道的新化学实体中，几乎没有（约6％）天然产品本身40。这已日益动机近距离或简化结构的仿生和合成知情设计具有不同或优于功能19，20，21。
不幸的是，由于天然和合成材料的有限可获得性，无法获得接近于bryostatin 1类似物的类似物，而与修饰复杂的bryostatin支架相关的内在挑战进一步加剧了这种情况。原始的手工制取的天然抑菌素1为临床提供GMP物质，仅从14吨源生物Bugula neritina产生了18 g物质（收率为0.00014％），现在几乎耗尽了41。由于溴代他汀的贫乏和可变的自然可得性，从这种海洋资源中进行回收将增加成本，可持续性和环境问题42。已经进行了水产养殖和工程生物合成的研究，但前者遇到了资本化和产量问题，而后者在培养生产bryostatin 1 43所需的共生细菌方面遇到了困难。最近，我们报告了这种供应问题的解决方案，即可抑菌素1的可扩展合成方法，该方法可根据需要可持续获得克级量的天然产物，以确保进一步的研究及其持续的临床评估44。此外，如本文报道的那样，我们的化学合成还可以作为访问bryostatin类似物和探索结构-功能关系的平台，从而使设计和合成潜在的更易获得，更有效和耐受性更好的bryostatin启发的潜在客户。鉴于苔藓抑素1处于临床前和临床研究中用于广泛变化适应症，包括阿尔茨海默氏病的治疗45，46，47，AIDS的HIV /根除48，49，50，多发性硬化症51，尼曼-皮克病52，脆性X 53和增强免疫疗法17，25，30，31，鉴于许多迹象都涉及不同的PKC亚型，获得不同的类似物避免了一个尺寸适合所有的单一代理的方法来改变治疗指征，并提供更多的疾病具体的优化机会。
在这里，我们报告第一个近距离的bryostatin 1类似物的设计，合成和评估。我们的设计策略着重于对bryostatin支架进行化学修饰，以期保留化合物对PKC的亲和力，但可能影响PKC功能和下游信号转导结果，同时还可能根据需要用于调整配方和ADME特性。制备18点的类似物，它们的活动与合成苔藓抑素1基于一种FOS策略进行了比较，在设计这些化合物保留提出了PKC在我们最初的药效团模型结合药效功能22，54。与该模型一致的是，大多数这些近距离类似物显示出的个位数纳摩尔亲和力代表PKC同种型，可媲美苔藓抑素1 22，54。相比之下，我们在功能测定法中观察了各种各样的活性谱，这些测定法实时测量了活细胞中的PKC转运，表明这种修饰确实可以引起不同的生物学功能，而与无细胞结合亲和力无关。重要的是，我们还研究了这些类似物在ALL和AIDS相关淋巴瘤的体外模型中与新兴抗原靶向疗法相关的增加CD22表面表达的能力。我们发现几种类似物表现出与bryostatin 1类似的活性，表明这些化合物可作为癌症免疫疗法和其他治疗适应症的佐剂，更易获得，更有效，并且耐受性更好。
我们针对溴代他汀类似物的FOS设计策略是由我们先前提出的溴代他汀药效团模型54指导的，并得到了最近的分子动力学模拟55和REDOR NMR结构研究56的进一步支持。PKC是七个同源信号激酶家族，基于它们的子域结构57分为常规（α，β，γ）或新型（δ，ε，η，θ）。个别异构体，同种型的组合，和PKC的突变体同种型与许多疾病的病理的58，59。PKC成熟和活化是由高度磷酸化编排，构象改变的序列的约束，并最终易位到质膜，其中众多下游信号蛋白的影响它们磷酸化57，60。配体诱导的PKC激活的标志是形成质膜之间形成三元复合物的配体及蛋白激酶C（图 1B）57，58，60。在这种情况下，抑菌素支架可以被认为是具有不同但相互依赖的功能的两个亚基。我们的计算研究表明，在bryostatin支架的C环亚基周围的氢键官能团，特别是C1羰基，C26羟基和C19半缩醛，在空间上被A和B环预先组织成结合构象，模仿了PKC的内源配体， DAG（图 1A）54，55，56，61。确实，我们小组进行的开创性研究表明，对C1，C26和C19的任何功能进行修饰或缺失均会降低或消除PKC结合，而A环和B环的变化通常对结合几乎没有影响，甚至没有影响，这表明这些亚基可用于改变物理性质，生物学功能和生物分布，从而潜在地改善功效和耐受性20，54，61，62，63，64。因此，我们着手确定近距离类似物的哪些变化将证明性能更好的人将来向更先进的体内研究发展的合理性。
bryostatin支架具有蓝色突出显示的关键药效学元素（C1羰基，C19半缩酮，C26醇）的逆合成分析。C13（红色球体）突出显示为模拟合成的多样化节点。bPKC-抑菌素-膜三元复合物的绘制。Bryostatin 1以深蓝色显示。bryostatin支架（a）的C环亚基的药理元素直接与PKC（紫色）相互作用，而A和B环嵌入质膜中（青色）。经Yang等人的许可改编。（https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscentsci.7b00475）和美国化学学会（ACS）56。与摘录的材料有关的更多权限应直接提交给ACS。c与PKC结合的bryostatin支架的代表性构象体，其符合通过REDOR NMR测定的实验确定的分子内距离。经Yang等人的许可改编。（https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscentsci.7b00475）和ACS 56。与摘录的材料有关的更多权限应直接提交给ACS。d由酸1和Enal 2融合构建bryostatin支架。C13功能（以红色突出显示）为后期多样化提供了一个通用的功能化节点，避免了对C环的药效学元素的干扰（以蓝色突出显示a）。
除了在空间上限制抑菌素的C环亚基的药效成分限制在有效的PKC结合构象外，北部亚基还被认为会影响PKC的转运效率以及膜中配体-PKC复合物的深度和方向，正如最近的长时间尺度（400-500μs）分子动力学模拟所建议的55。具体而言，A和B环中的氧合作用与膜-细胞溶胶界面处的水分子相互作用，可能会导致bryostatin-PKC复合物相对于膜采取较浅的角度取向（图 1b）55。当建模其他有效的PKC配体（如佛波二丁酸（PDBu）和前列蛋白）时，就不会填充bryostatin 1-PKC复合物的这种独特方向，从而为它们的竞争性PKC结合提供了一个解释，但经常与下游活动形成对比55。在另一项研究中，REDOR NMR和分子动力学模拟相结合，确定了PKC结合的bryostatin构象异构体的分布（图 1c），这是bryostatin支架所独有的，在佛波酯衍生物中未观察到56。总之，这些研究表明，对于抑菌素支架而言，多个与PKC结合的构象异构体可以产生活化的PKC-配体复合物的不同方向，并影响PKC与下游效应蛋白的相互作用，从而解释了抑菌素的独特生物学活性。这反过来提示对bryostatin支架的A和B环的修饰可以通过影响活性PKC信号复合物的方向来影响化合物的功能。考虑到这一源自数十年的指导框架，我们设计了一系列化合物，这些化合物保留了bryostatin C环的药效学元素，但结合了bryostatin B环的修饰，重点是将C13作为一个多元化节点。选择该位点是因为我们的计算研究表明，在此非药效上的修饰将保留PKC结合亲和力，同时能够探索其对化合物功能的影响（例如易位，活性和耐受性）。通过利用后期合成中间体在此位置上发现的独特反应性，我们能够在该位置上生成一组具有不同化学功能的近亲溴代他汀类似物，以探索B环片段中的各种取代方式如何影响化合物通过影响膜结合，运输和下游信号转导功能来发挥作用。
最近我们报道了可扩展，苔藓抑素1的步骤，经济的合成，其允许所述会聚组件的可分散苔藓抑素大环骨架（外烯烃3，图 1D）从两个合成获得的构建块（图 1D）44。该研究提供了支持2合成研究所需的合成供应（> 2 g）的抑菌素1。在山口酯化反应中将抑菌素片段，羧酸1和烯醛2聚集在一起，产率为82％。然后通过采用我们先前报道的Prins驱动的大环化策略来实现bryostatin B环的形成和大环的闭合（图 1d），生成外烯烃3。利用烯烃和酮化学的丰富性，可以选择性地修饰外烯烃3以直接安装新的B环官能团，或通过我们小组开发的pi选择性化学计量臭氧分解程序将其转化为相应的酮（图 1d）。这两个官能团提供的化学反应性基本上与其余功能正交，并提供了探索bryostatin B环修饰如何影响PKC功能（亲和力，易位和信号传导）的起点。由于天然的bryostatin的成本极高（约1500美元/ mg），目前合成的bryostatin及其前体的数量有限，直到大规模生产合成完成为止，并且用有限的材料修饰这种复杂的支架存在固有的挑战，我们有意选择使用化学物质，这些化学物质会降低风险，从而减少珍贵材料的损失。此外，由于我们需要进行毫米级刻度（约5-10 mg）的工作，以便能够进行化合物表征和生物学评估，
在我们对C13的化学空间的初步探索中，我们试图利用C13外生烯烃与其他pi系统的差异反应性来生成一系列紧密的结构类似物。由于空间和电子原因，C13烯烃被认为是该高级中间体（图2，烯烃3）44中发现的四个pi系统中最具反应性的物质 。如前所述，外烯烃3的整体脱保护得到SUW200 44。令人欣慰的是，SUW200的二羟基化选择性地提供了邻位二醇SUW203在存在C16 / C17烯烃，C20链烷酸酯和C21烯酸酯的情况下。相比之下，并且符合我们对在这种复杂支架上甚至常规反应的选择性的担忧，用DMDO或mCPBA 环氧化烯烃3和溴代他汀1证明具有挑战性。此外，使用H 2和催化性Pd / C 还原C13烯烃的尝试也难以控制，常常提供还原产物的混合物。但是，我们最终能够通过减少反应时间和降低浓度来实现C13外链烯烃和C20链烷酸酯的干净还原，而无需还原C21烯酸酯或C16 / 17烯烃，生成化合物5，随后将其脱保护得到SUW226。
有关具体转换的详细过程，请参见《补充方法》。C 7 H 11 ＝ 2-庚炔基。
接下来，我们将重点介绍C13酮4的改性。这种高级中间体是理想的多元化节点，因为C13酮的化学反应性与该系列高级中间体中发现的其余功能正交（图 3）。为了节省材料，我们从有限系列的C13烷基烯酸酯的合成开始。从酮4中，我们生成了具有各种酯基的化合物，以探索取代基的大小和烯酸酯的几何形状如何影响化合物的功能。通过密集功能化的酮4的Horner-Wadsworth-Emmons（HWE）烯烃反应获得酯衍生物使用通过所需的醇与二乙基膦酰基乙酸的直接偶联制备的HWE试剂。与手性HWE试剂的使用相反，该手性HWE试剂可控制我们的bryostatin 1合成中所报道的双键几何形状，我们选择使用简单的非立体选择性HWE试剂进行这些反应，以同时获得HWE的（E）和（Z）异构体烯酸6。随后的烯醇盐非对映异构体的整体脱保护和HPLC分离提供了所示的类似物（图 3）。
有关具体转换的详细过程，请参见《补充方法》。
此外，在C13处安装醇有望为酯化后期的多样化提供便利的功能，并为探索C13杂交如何影响功能提供了机会。这很容易通过硼氢化物还原酮4和酯化所得的醇来实现（图 4），从而产生结构上多样的化合物，包括C13醇，脂族酯，吲哚酯，氨基甲酸苯酯和阳离子和阴离子部分。
酯是使用标准的酯化化学方法形成的，包括用酸酐进行酰化，碳二亚胺偶联以及用异氰酸苯酯（SUW208）进行氨基甲酰化。有关具体转换的详细过程，请参见《补充方法》。
通过一组在C13上具有多种功能的化合物，我们开始探索这些修饰如何影响PKC结合和生物学功能。因为PKC途径参与的一个明显的先决条件是与PKC的结合，所以首先用tri 化佛波二丁酸酯（[ 3 H] -PDBu）在无细胞竞争结合试验中评估了化合物的PKC亲和力。使用常规（PKCα）和新型（PKCδ）PKC家族的代表性成员进行测定。随后，使用光学测定法在活细胞中实时测定化合物的PKC同工型易位。易位到质膜是PKC活化的标志18，57，60因此，通过共聚焦显微镜监测PKCδ-GFP融合蛋白的亚细胞定位为确定化合物是否进入细胞并参与其PKC亚型靶标64提供了一种便捷的方法。最后的临床意义，并且我们还确定化合物对CD22表面表达在体外NALM6细胞的作用，先前结合CD22靶向CAR性T细胞疗法连接研究的ALL细胞系，和两个附加淋巴瘤细胞系11，31，65。PKC结合，易位和CD22表面表达数据总结在图 5和表 1中。
通过使用共聚焦显微镜监测PKCδ-GFP融合蛋白的胞浆荧光，实时确定了Bryostatin诱导的PKC从胞质溶胶向膜的移位。比例尺代表25μm。以n = 3个生物学重复进行实验。b – d归一化为t = 0（紧接在向介质添加化合物之前的时间）的胞质荧光，并相对于时间作图。为清楚起见，排除了误差线（数据表示为n = 3个生物学重复的平均值）。补充信息中包含带有误差条的单个曲线。表1中报道了PKCδ-GFP向质膜的最大移位 。
我们的目标是确定PKC亲和力和体外PKC激活（通过细胞内PKC易位性测量）是否相关，以及结合和易位如何影响下游功能（CD22表达）。与我们的计算机建模研究一致，几乎所有使用我们的药效团模型设计的化合物均保留了与bryostatin 1相当的有效PKC结合亲和力（<10 nM）（表 1）。然而，由于膜分配或配体空间效应的推定差异，某些C13功能性降低了PKC亲和力。例如，C13的带电荷取代基（SUW211，SUW212）将与PKC的亲和力降低约20-100倍（表 1），这与磷脂酰丝氨酸（PS）囊泡复合物（无细胞结合测定中使用的膜替代物）中这些基团分配的效率较低相符。另外，C13甲基- （取代Ž）-enoate用苄基- （ż）-enoate导致亲和力的〜30倍的降低，提示大小限制到组在该位点。在具有较大构象柔性接头的C13酯中未观察到类似的结合亲和力下降，所述接头带有较大的相对疏水的取代基（SUW209，SUW210，表 1）。除了这些例外，大多数测试的化合物均表现出与PKC的单位数纳摩尔结合亲和力，进一步支持了我们提出的药效团模型的预测价值，并促使这些化合物发展为更先进的体外PKC易位性检测方法。
无细胞配体与PKC的结合是引发功能的必要但不充分的先决条件，因为配体必须进入细胞并与PKC结合以形成功能性PKC-配体膜复合物。两个实验研究和分子动力学模拟表明，PKC-配体复合物可以假设多个束缚态，推定影响骨架蛋白和下游效应蛋白质的磷酸化的差分关联，从而导致不同的生物结果18，55，56，57，60。因此，我们的下一个目标是确定最有效的PKC结合剂是否进入细胞并显示与PKC相似或不同的动态相互作用。
重要的是，我们的研究表明，PKC结合的热力学以及配体细胞进入和PKC易位的动力学通常是不相关的，这一发现可用于控制同工型选择性信号传导。作为我们的阳性比较剂，合成的bryostatin 1（所有PKC亚型的一位数纳摩尔粘合剂）在5分钟内以200 nM的浓度将约70％的胞浆PKCδ-GFP转运至质膜（表 1，图 5） 。当在C13处引入亲水性取代基（SUW203，SUW204）时，生成的化合物以一位数纳摩尔的亲和力结合常规和新型PKC同工型，这些类似物在转运分析中的表现与溴代他汀 1不同（图 5b，c）。在200 nM时，SUW204在20分钟时仅将〜25％的胞浆PKC转移到质膜，而SUW203在浓度上需要1000 nM才能将〜50％的胞浆PKC转移。同样，在C13处带电荷取代基的化合物（SUW211，SUW212）在高达1000 nM的条件下也无法实现PKC的持续移位（表 1，图 5d）。这表明膜与bryostatin B环上的功能性相互作用对于化合物功能至关重要，并且PKC结合是必需的，但不足以实现体外化合物活性。在C13处具有亲水或带电修饰的化合物可能无效地穿过或嵌入质膜中，因此显示出减弱的活性。这从对结合的热力学的强调到易位动力学的另一问题，改变了人们对PKC调节剂的看法。
我们还研究了一系列不同大小，疏水性和不同结构基序（芳基，杂芳基，烷基，金刚烷基）的C13酯，所有这些都可以从C13醇中有效地获得（图 4）。尽管我们发现相对于PKC结合亲和力，该位置具有多种功能，但我们的类似物表现出截然不同的转运动力学。与游离醇SUW204相反，用较小的疏水取代基封端C13羟基生成的化合物在移位PKC时可与溴代他汀 1媲美（图 5d）。乙酸C13的两种非对映异构体（SUW206和SUW207）表现出彼此和对于bryostatin 1几乎相同的行为。尽管C13苯基氨基甲酸酯SUW208在200 nM时有效地将PKC转移到质膜上，但相对于其他类似物，它表现出延迟的时间过程，需要约15分钟的转移时间。在该测定中具有活性（图 5d），表明在该位置的大小和/或极性的微小变化可影响配体介导的PKC活化和信号传导和/或细胞进入的动力学和功效。
为了补充在C13处具有相对相似尺寸的取代基的化合物的合成，我们还安装了比天然产物中官能度大不相同的较大取代基。设计C13金刚烷基酯SUW209和C13吲哚基酯SUW210分别通过提高局部疏水性来增强潜在的膜相互作用，或分别与膜上阳离子脂质头基的阳离子pi接触。我们发现，虽然这两种化合物都是高亲和力PKC结合剂（表 1），但它们在PKC易位测定中在200 nM时无活性，需要1000 nM在约5分钟时将〜70％的胞浆PKC转运至质膜（图1）。 5d）。
通过一系列近距离类似物使这一发现成为可能，促使我们研究C13官能度如何影响整体化合物的性质以及化合物疏水性（使用cLogP测量）和活性（PKC易位）之间的相关性。在200 nM处绘制cLogP与膜相关PKCδ-GFP百分比的关系图（补充图 56）显示了有效转运所需的cLogP值的有效窗口。cLogP值介于1.0和4.0之间的化合物在200 nM时具有活性，这表明亲脂性必须有效平衡才能保持活性。还值得注意的是，在亲脂性有效范围内的化合物中，观察到了PKC活化的可变动力学。尽管大多数化合物均表现出对数激活曲线，但某些化合物仍显示出延迟的激活模式（SUW208，图 5d）或更持久的线性激活动力学（SUW218，SUW229，图 5c））。PKC-配体缔合动力学和复合物的细胞内分布的这些观察结果可以通过配体进入细胞的时间以及进入后配体控制的PKC-配体复合物在质膜和细胞质之间的分配来合理化，极性更强的化合物，其进入速度较慢，与质膜形成稳定络合物的能力有限。这是潜在的临床后果，因为它是众所周知，PKC活性的动力学具有深远影响的下游信号成果47，58。
C13烷基烯酸在（Z）和（E）的几何形状都很好的耐受，除了苄烯酸SUW219和SUW220。有趣的是，烯醇苄基酯SUW219与PKC的亲和力降低了约2倍，这表明（Z）烯烃的几何形状可能会将C13取代基定位在影响C环中药效学元素构象的方向上。然而，一般而言，较小的线性烷基烯酸酯在体外是PKC和活性配体的有效结合剂（表 1，图 5c），尽管它们确实影响PKC的转运动态。
在建立了我们类似物库成员的强大亲和力及其PKC易位动力学之后，我们接下来寻求在与布雷司他汀及其类似物作为佐剂的临床应用相关的测定中评估我们的近距离类似物，以增强靶向癌症免疫疗法。我们的方法集中在CD22-CAR的目标T细胞疗法，而那些谁不这样处理被认为有CD22的下表面密度已上报治愈ALL患者11，31，65。Fry等。65证明，在鼠肿瘤异种移植模型中，抗CD22 CAR T细胞的体外活化和肿瘤清除需要CD22表面密度的临界阈值11。最近，Ramakrishna等人。31证明天然的bryostatin 1促进CD22表面表达的增加可以改善ALL体内模型中CAR T介导的肿瘤清除的效力和持久性，表明bryostatin和尚待探索的类似物可用于改善患者的结局。结合抗CD22 CAR T治疗。为了研究合成的bryostatin 1和bryostatin类似物作为靶向CD22的CAR T治疗的佐剂，我们使用NALM6细胞开发了体外测定bryostatin诱导的ALL中CD22表面表达增加的方法。使用这种测定方法，我们试图确定合成的bryostatin 1和bryostatin类似物是否可以实现CD22靶向CAR T细胞介导的肿瘤清除所需的CD22表面密度的充分增加。将NALM6细胞与抑菌素1和抑菌素类似物孵育24小时，然后将化合物从培养基中洗出，并通过流式细胞术分析细胞的CD22表面表达。我们发现bryostatin 1诱导CD22表面密度增加> 2倍（图。 6）。有趣的是，治疗后长达7天，由bryostatin促进的CD22表面表达增加得以持续（图 6a），这一发现与最近的工作一致31。这进一步表明，依次施用bryostatin 1或bryolog以增强CD22靶密度，然后输注抗CD22 CAR T细胞可能是清除似乎驱动患者复发的CD22 lo肿瘤细胞的可行策略11。
一个合成苔藓抑素1促进增加CD22的表面表达。将NALM6细胞与10 nM bryostatin 1孵育24小时。洗出化合物，将细胞传代培养指定的时间。然后通过流式细胞术检测CD22表面表达（n = 3个生物学重复；数据以平均值±SE表示）。bNALM6细胞与1 nM（蓝色条）或10 nM（橙色条）化合物孵育24小时。将化合物洗出并将细胞传代培养24小时。然后通过流式细胞术检测CD22表面表达（n = 3个生物学重复；数据以平均值±SE表示）。C将JB细胞与1 nM（蓝色条）或10 nM（橙色条）的化合物孵育48小时。然后通过流式细胞术检测CD22表面表达（n = 6个生物学重复；数据以平均值±SE表示）。d 2F7细胞与1 nM（蓝色条形）或10 nM（橙色条形）化合物孵育48小时。然后通过流式细胞术检测CD22表面表达（n = 6个生物学重复；数据以平均值±SE表示）。
重要的是，由于C13修饰的抑菌素类似物在我们的CD22诱导检测中显示了一系列活性，因此选择的化合物被证明具有很高的活性，并且具有与抑菌素1相当的活性（图 6b）。出人意料的是，我们观察到C13烯酸酯几何形状对C13甲基和烯丙基烯酸酯中化合物功能的显着影响（图 6b）。（Z）-烯酸酯的活性比相应的（E）-烯酸酯的活性大得多，这进一步表明PKC信号传导动力学可以通过对bryostatin支架的B环的修饰来调节。如前所述，性能最佳的SUW229 相对于bryostatin 1，PKC的PKC激活谱不同，这表明PKC激活动力学的差异可能会影响生物学上重要的下游信号转导结果。
最后，为了确定在NALM6细胞中观察到的结果是否适用于其他细胞系，我们将AIDS相关淋巴瘤细胞系JB和2F7细胞与合成的bryostatin 1，SUW201和SUW229孵育（图 6c，d）。JB是一种Epstein-Barr病毒（EBV）阴性的AIDS-淋巴瘤细胞系，最初是从HIV +个体的骨髓样本中生长而来，该样本具有Burkitt淋巴瘤易位66。2F7是Burkitt亚型的与艾滋病相关的非霍奇金淋巴瘤细胞系，对EBV 67呈阳性。伯基特淋巴瘤是艾滋病最常见的亚型之一，非霍奇金淋巴瘤与霍奇金淋巴瘤一道，相对于普通人群，由于其细胞免疫功能受损，对艾滋病患者的危险要大得多68。值得注意的是，合成的bryostatin 1和类似物SUW201和SUW229在每个测试的细胞系中将 CD22表面表达上调了约2倍（图 6c，d），进一步突显了使用PKC调节剂增强针对CD22的癌症免疫治疗的潜在普遍性。
总而言之，我们报告了Bryostatin 1（一种目前具有临床意义的天然产物）的近距离类似物的设计，合成和生物学评估。我们以经济实惠且可扩展的方式获得bryostatin支架的方法已提供了足够的材料，以实现后期的多样化策略，从而导致了下一代的bryostatin衍生的先导化合物，并突出了化学合成在自然产物启发的药物发现中的重要性。使用FOS策略，我们设计并制备了一组结构多样的类似物，并评估了其结构变化如何影响它们与PKC的结合，其PKC融合蛋白的体外易位以及它们在体外模型中CD22抗原密度的增强。 ALL和与艾滋病有关的NHL。重要的是 虽然几乎所有类似物都符合我们的药效团模型，但与PKC的亲和力相似，但有些表现出明显不同的PKC亚型易位动力学，因此可作为与不同临床适应症相关的同工型选择性PKC调节的潜在先导，并用于鉴定潜在更好的耐受的导线。具有进一步潜在的临床意义，这些合成研究使人们能够获得一类有前途的线索，用于增强针对抗原的免疫疗法，包括增强针对CD22的CAR T疗法。鉴于灵感来自天然产物的类似物在人类治疗中的重要性，这些化合物可作为进一步治疗研究的线索，涉及众多适应症，迄今为止，这些适应症迄今仅主要集中在抑菌素1上。更普遍，
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