用于预测黑色素瘤患者对PD-1阻断反应的转录组学特征已有报道，但很少得到证实。现在我们显示，患者对PD-1抑制反应的异质性限制了这些特征的预测性能。我们认为耐药机制将反映肿瘤的微环境，因此我们在基线和PD-1抑制剂进展时收集的94例黑色素瘤肿瘤中检测了PD-1抑制剂相对于T细胞活性的抵抗力。使用RNA测序和流式细胞仪分析肿瘤，并进行功能验证。这些分析证实，主要的组织相容性复合物（MHC）I类下调是对PD-1抑制剂耐药的标志，并且与MITF 低 / AXL 高有关去分化表型和癌症相关的成纤维细胞特征。我们证明，TGFβ驱动治疗耐药性表型（MITF 低 / AXL 高），并促进黑色素瘤中MHC I类下调。抗PD-1与靶向TGFβ信号通路和/或逆转黑色素瘤去分化的药物的组合可能是未来有效的治疗策略。
免疫疗法已经改变了黑色素瘤患者的治疗方法，其单克隆抗体阻断了免疫调节剂编程的细胞死亡蛋白1（PD-1； pembrolizumab和nivolumab），与化学疗法和细胞毒性T淋巴细胞相比，具有生存优势，并获得了FDA的快速批准。相关蛋白4（CTLA-4）抑制剂，易普利姆玛1，2，3。尽管响应的耐久性，PD-1抑制先天抗性发生在黑素瘤患者的30％的4，5，6和应答患者将发展的获得性抗性，被定义为疾病进展以下初始客观响应两年PD内的约25％ -1抑制剂治疗4。
尽管已经在一小部分患者中发现了耐药效应子，但造成PD-1抑制失败的机制却是多种多样的，人们对此还没有完全了解。这些包括替代免疫检查点抑制剂（TIM-3和LAG-3）的表达7，8，主要组织相容性复合体（MHC）I类表达的丧失，异常干扰素γ（IFNγ）免疫效应信号传导途径（JAK1，JAK2，IFNGR1，STAT1突变）9，10，11，12，13，致癌信号（升高的SS连接素/ WNT），导致免疫排斥14，T细胞诱导分泌的免疫抑制集落刺激因子1 15和缺氧的肿瘤微环境，可能损害T细胞功能16。此外，一些免疫和基因表达特征预测PD-1抑制剂响应的已有报道，但很少有在独立患者队列被验证11，17，18，19。例如，先天性PD-1抑制剂抗性（IPRES）签名（包括26个与去分化和BRAF / MEK抑制剂抗性相关的基因签名）与治疗前黑色素瘤活检中PD-1抑制剂缺乏响应有关。研究17，但没有与其他黑素瘤队列PD-1抑制剂响应相关联的11，19。
在这项研究中，我们对接受PD-1抑制剂的大量黑色素瘤患者进行94例纵向黑色素瘤活检，进行了转录组和流式细胞仪分析。分析治疗前和治疗中的肿瘤，包括对治疗有反应的肿瘤（RES）和因先天或获得性耐药而进展的肿瘤（PROG）。我们提供了对单个转移灶对PD-1抑制的复杂和异质反应以及在同步和纵向活检中观察到的异质免疫转录组概况的见解。此外，我们证明了黑色素瘤中MHC I类表达的下调而不是MHC I类分子的完全丧失是常见的，并且受TGFβ信号传导和去分化的驱动。
对RNA序列数据（n = 79例肿瘤； 55例患者）进行转录组分析，对 来自94例用PD-1抑制剂治疗的94例黑素瘤肿瘤中的单细胞悬液（n = 31例； 24例）进行流式细胞术分析单一疗法（补充数据 1）。总共进行了53次肿瘤活检（PRE），在治疗时进行了41次活检（图 1A）。随后根据irRC标准20接受完全缓解（CR）或部分缓解（PR）的患者的PRE肿瘤被称为缓解-PRE （n = 31），以及患有稳定疾病（SD）或进行性疾病（PD）的患者的PRE活检）由irRC（n = 22）被称为无响应PRE。在这41例接受治疗的肿瘤标本中，从临床反应性病变（RES）中采集了6份活检样本，在进展时（PROG）进行了35份活检。所有PROG病变均以先天性PROG肿瘤（n = 22）或获得性PROG肿瘤（n = 13）为特征。先天性PROG被定义为在开始治疗后的6个月内未发生肿瘤缩小或新转移的既往转移灶，而获得性PROG被定义为最初反应但随后在PD-1抑制剂或新转移灶上进展的既往肿瘤。在开始治疗6个月后被确认（图 1A）。
a 本研究中分析的94例黑色素瘤活组织检查的详细信息，包括53个治疗前（PRE）和41个治疗中样品。在分析的53种治疗前肿瘤样本中，有31例患者是根据irRC标准进行了完全缓解（CR）或部分缓解（PR）的患者，而从疾病或疾病稳定（SD）或稳定的患者中获得了22种治疗前的活检。 irRC进行性疾病（PD）。b Venn图显示了该研究中包括的68例患者以及治疗前，反应中和进展中的肿瘤标本的分布（n = 94）。c 每次治疗前黑色素瘤活检的免疫预测转录组评分（n = 44），并使用患者反应数据生成接收者操作员特征（ROC）曲线，该曲线测量每个指示信号在预测我们患者队列中PD-1抑制剂反应中的性能。将所得的AUC和p值制成表格。应用于我们的数据集的签名来自以下参考文献：IPRES签名17，IMPRES签名21，CD8A / CSF1R比率15、18个免疫基因组18，TIDE 22，CYT得分24和CIBERSORT估计的CD8 + T细胞相对比例74（请参阅补充数据6）。d 显示了来自患者45的CT扫描。显示了CT图像测量的肿瘤转移治疗前和PD-1抑制剂治疗（第12和24周）时的情况。CT图像中感兴趣的区域以红色圈出。上面的图像显示了在第12周出现的新病变，并在第24周继续扩大。中间的图像显示了经过部分反应的核心活检病变。下部图像显示先前存在的病变，最初在第12周时有所反应，但在第24周时有所进展。e 来自患者49的CT扫描。CT图像中感兴趣的区域以红色圈出，显示治疗前腹股沟LN转移发炎的大炎症部分反应（上部图像）以及治疗后出现新的皮下臀部转移（第8周） ；较低的图片）。尽管切除了新的转移灶，但在第二次再分期时，在骨和淋巴结中仍有多个新的转移灶。显示比例尺。
患者中位年龄为67岁（范围38-88），之前接受过MAPK抑制剂治疗的患者为23/68（34％）（表 1）。在68位患者中，只有41位（60％）仅接受治疗前活检，15位（22％）仅接受治疗前活检，12位（18％）患者具有可用于分析的匹配的治疗前和治疗活检（图 1B）。
我们最初研究的临床响应相关联的PD-1抑制转录7个签名预测准确性11，15，17，18，19，21，22在44个PRE肿瘤具有可用RNA序列数据（补充数据 1）。没有公开的免疫预测特征，包括指示炎症的特征（即，CD8 + T细胞，CYT评分和18个免疫基因组）准确定义了反应（CR / PR）或无反应的患者（SD / PD）在我们的队列中（图 1C，补充数据 2）。此外，我们发现在三个单独的免疫检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者RNA-seq数据集中，这些预测性转录组特征均未与irRC反应一致且显着相关（补充图 1）。此外，我们在我们的队列中未检测到应答者和非应答者之间任何显着差异表达的基因（FDR调整的p值 <0.05）或基因特征（两组之间的ssGSEA得分差异； FDR调整的p值 <0.05）。 。
我们假设仅基于单个预处理活检的特性可通过的患者内的异质性混淆到PD-1抑制剂治疗的是精确地预测黑素瘤患者响应23。对PD-1抑制的病变特异性反应的检查显示，有16/68（24％）的患者具有异质性肿瘤反应（补充数据 1）。在这16例患者中，有5例进行了PRE核心活检，从而可以对病变进行特异性评估。有趣的是，有irRC PD的4例患者在基线时进行了活组织检查，分别有CR，PR，PR和SD，而有irRC PR的1例患者在活组织中进行了PD检查（表 2，图 1D）。/ E）。然而，当这些病变特异性反应包括在ROC分析中时，这七个抗PD-1预测转录组标记的预测准确性并没有提高（补充图 2A）。
我们 通过RNA测序数据将转录组分析扩展到了所有患者（n = 55）和肿瘤（n = 79），包括44例PRE，6 RES和29例PROG黑色素瘤（11例获得性，18例先天性）。我们最初检查了每个肿瘤的肿瘤内溶细胞活性（CYT）评分，基于两种溶细胞效应因子，颗粒酶A（GZMA）和穿孔素（PRF1）24的转录水平对免疫溶细胞活性的定量测量。如预期的那样，CYT分数与免疫细胞分数和免疫激活特征的计算估计值相关（补充图 2B，2C）。在RES活检中，CYT评分最高，但并非唯一升高（图 2A））。在44例（34％）PRE和15/29例（52％）PROG肿瘤中，有15例（获得性6/11，先天性9/18）表现出活跃的转录组证据（即CYT得分在6个RES肿瘤的CYT得分范围内） ）（图 2A）。
一个 CYT分数为44 PRE，6个RES和29个PROG黑素瘤活检。箱形图显示了中位数和四分位数范围，并且使用Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较测试比较了CYT分数。虚线与最低的RES肿瘤CYT得分一致。ns，不重要。b显示了79例黑色素瘤活检样本中的每一个的CYT评分，临床病理学和反应细节，以及来自55位患者的RNA序列数据。框出对PD-1抑制剂治疗活检有反应的6种。如果患者有多个接受治疗的肿瘤活检，则在“ On PD-1”和“活检部位”行中以单独的彩色框显示。
在已配对成PRE和PROG肿瘤的8位患者（患者21、24、31、44、46、47、48、49）中探讨了肿瘤炎症的模式和演变（图 2B）。我们注意到在4/8位患者（患者24、31、46、48）中，PRE和PROG之间或同一患者中的多个PROG之间存在不一致。例如，来自患者31的PRE和三个先天性PROG肿瘤未发炎，而来自该患者的与其他三个PROG肿瘤同时采集的第四个先天性PROG肿瘤发炎（图 2B）。其余四名患者（图 2；患者21、44、47、49）在PRE和PROG活检中的CYT分数持续升高（图 2B）。）。对治疗前，治疗初期和进展中接受序贯CTLA-4和PD-1抑制治疗的患者进行的一系列纵向黑色素瘤活检的重新分析证实了患者体内肿瘤炎症的异质性（补充图 2D）19。
我们推论PD-1抑制剂的抗性的各种机制反映免疫细胞浸润的程度，因此，我们探索黑素瘤转录由CYT得分所定义的信令相对于T细胞活性的水平24。如预期的那样，CYT得分与79例黑色素瘤活检样本中带有RNA序列数据的MHC I类基因的表达呈正相关（HLA-A，-B，-C和B2M的皮尔森相关性分别为0.61、0.77、0.74和0.74 ）。但是，与PRE和RES肿瘤相比，PD-1进展性活检中HLA-A转录物表达与CYT评分的相关性降低了（图 3A，补充图 3A）。我们没有发现B2M中有任何明显的变化，来自79例黑色素瘤活检的转录组数据中的HLA-A，-B或-C基因，以及与抗原呈递和IFNγ信号传导相关的其他基因（即JAK1，JAK2，STAT1，STAT2，IFNGR1，IFNGR2，TAP1，TAP2）并非在不良反应者或PROG活检组织中专门鉴定出来（补充数据 3）。因此，在我们的患者队列中，通过CYT评分测量的T细胞活性与PD-1进展性肿瘤中的HLA-A转录表达并不强烈相关。
一个散点图显示用的MHC I类基因的表达，CYT得分的Pearson相关系数HLA-A，-B，-C和B2M在响应（RES; ñ = 6），和前处理（PRE; ñ = 44）和进行性活检（PROG；n = 29）。b显示HLA-A和SNAI1在 具有高或低HLA-A转录表达的CYT评分匹配肿瘤中的表达（n = 38）。使用limma测试计算出的FDR调整后的p值（q）。在HLA-A发现源自患者53的低黑色素瘤肿瘤表达STAT1 S316L突变（突出显示）。c热图显示在 具有低或高HLA-A转录表达的CYT评分匹配的肿瘤（n = 38）之间差异表达的基因（显示FDR调整的p值<0.001）。还显示了CYT得分，并突出显示了HLA-A，SNAI1和NGFR基因。还显示了最佳的irRC响应。d的相关矩阵SNAI1与ssGSEA得分基因表达从印记基因组收集和基质细胞特异性转录签名衍生25，26在79例黑色素瘤活检中。Spearman等级相关系数显示在矩阵中，对于所示的所有特征，错误发现调整后的p值<0.01（请参阅补充数据7）。È最高得分genesets的子集;（GSEA PreRanked印记基因组收集和基质细胞特异性转录签名25，26在具有低肿瘤中上调）HLA-A转录物表达相对于HLA-A高表达的肿瘤。
为了检查独立于CYT评分可能会影响HLA基因表达的机制，我们根据CYT评分对肿瘤进行分层，并鉴定了19个CYT匹配的肿瘤对（补充图 3B），它们具有可变的HLA-A转录表达（图7B）。 3B）。这些低表达HLA-A（n = 19）与高 表达HLA-A（n = 19）的肿瘤的基因表达谱比较显示530个差异表达的基因（q <0.01）（图 3C；补充数据 4）。
的SNAI1基因，其编码E-钙粘蛋白和上皮至间质转变的转录调节（EMT）是最高度上调的基因（登录2 FC = 3.7，q <0.001）在HLA-A -低的肿瘤（图 3乙，3C）。SNAI1转录物表达与表明EMT，基质，内皮和癌症相关的成纤维细胞的转录组标记呈正相关，而与我们队列中的HLA-A转录表达呈负相关（图 3D）和TCGA皮肤黑素瘤数据集（补充图 3C）。）。Geneset富集分析（GSEA PreRanked;印记基因组的分子签名数据库（MSigDb）和基质细胞的签名25，26）也证实增加EMT，与泛成纤维细胞的TGFβ响应签名一起的TGFβ信号传导，成纤维细胞和内皮细胞的签名25在HLA -在我们的数据集中的低肿瘤（图 3E，补充数据 5）。
在这些CYT评分匹配的肿瘤中HLA-A的下调与CD8 + T细胞含量减少（补充图 4A）或其他白细胞亚群频率的改变无关（基于CIBERSORT分析;补充图 4B和补充数据 6）。HLA-A的下调也与IFN-γ基因集无关，尽管我们在许多HLA-A较低的肿瘤中检测到B2M的下调，但这没有统计学意义（补充图 4C）。还值得注意的是，HLA-A水平下调的PRE肿瘤在抗PD-1治疗之前接受MAPK抑制剂治疗（补充数据1）的患者中，转录本的表达并不丰富 （Fisher精确检验，p > 0.99）。有趣的是，在源自患者53的具有预先存在的，功能异常的STAT1 S316L突变27的PROG肿瘤中（补充图 5），在不存在升高的SNAI1表达的情况下发生了HLA-A的低转录表达（图 3）。源自患者53的第二个PROG肿瘤（也具有STAT1 316L突变，补充图 5）表达的HLA-A水平较低（HLA-A患者53中的log 2表达PROG1 = 5.2，PROG2 = 4.5）。
为了探讨HLA-A下调对免疫治疗抵抗的频率和贡献，我们分析了PD-1 PRE衍生的31个肿瘤解离体（n = 15，包括6个具有RNA序列数据；补充数据 1）和PD-1 PROG肿瘤（n = 16个，其中包括10个来自RNA序列的数据）。使用流式细胞仪，相对于来自同一活检样本的匹配肿瘤浸润淋巴细胞，黑素瘤HLA-ABC表达被分类为正常或下调（比率<0.65）。免疫细胞作为内部对照，可标准化微环境中的调节作用。代表性的门控策略如图6所示。 。我们在11/31（35％）黑素瘤肿瘤（PRE 6/15（40％）和PROG 5/16（31％）样品）中观察到了不同程度的细胞表面HLA-ABC下调（图 4A，B）。这11种肿瘤中有8种具有激活的BRAF或NRAS突变，尽管BRAF V600E与细胞表面HLA-ABC的内在化有关，但我们并未在HLA-A 细胞表面表达中发现任何与基因型相关的差异28 31种黑色素瘤肿瘤中的ABC（补充图 7A）。值得注意的是，这些样本中有16例黑色素瘤PRE和PROG活检具有相匹配的流式细胞术和RNA序列数据，并且HLA-ABC细胞表面表达和HLA-A转录表达一致（Spearman相关系数0.67，p <0.01；补充图 7B）。我们还检查了15个PRE肿瘤中HLA-ABC和HLA-DR的细胞表面表达，最近发现它们与对PD-1抑制的反应29相关。尽管肿瘤数目很少，但PRE时HLA-ABC或HLA-DR的细胞表面表达不能准确反映患者的反应（补充图 7C和D）。
新鲜的离体肿瘤离体的黑色素瘤细胞中HLA-ABC（相对于肿瘤浸润淋巴细胞中的HLA-ABC）的细胞表面表达，其经过PD-1抑制后获得了预处理（PRE）和进展（PROG）。实线代表设定为Y ＝ 1的中位数和虚线。患者匹配的PRE和PROG肿瘤用虚线连接。b代表性直方图显示了黑素瘤中HLA-ABC表达的水平以及PRE和PROG肿瘤中肿瘤浸润的免疫细胞解离。红色直方图显示黑素瘤细胞中HLA-ABC的表达，肿瘤浸润性肿瘤（TILs）显示蓝色直方图。还指示了每种肿瘤驱动癌基因。C代表性直方图显示WMD-084黑色素瘤细胞中B2M和HLA-ABC在B2M特异性shRNA分子转导后72小时的细胞表面表达水平（左图）。B2M沉默的WMD-084黑色素瘤细胞与患者匹配的肿瘤浸润淋巴细胞共培养72小时后，IFNγ的产生来自同一肿瘤活检组织。通过ELISA测量IFNγ（右图）。数据为均值±sd，单个数据点代表技术重复数据的平均值。使用单向方差分析与Geisser-Greenhouse校正比较数据，* p <0.05。dWMD-084黑色素瘤细胞与患者匹配的TILs共培养72小时后，IFNγ的产生来自同一肿瘤活检。在共培养之前，将淋巴细胞用10μg/ ml HLA-ABC封闭或同种型匹配的抗体预处理1小时。使用配对t检验，将同型抗体处理的对照细胞与HLA-ABC阻断抗体处理的数据进行比较，* p <0.05。
使用黑色素瘤细胞和自体肿瘤浸润淋巴细胞的短期共培养模型证实了HLA-ABC下调的重要性。HLA-ABC的表达降低（表达降低约80％；图 4C）是由两个靶向B2M的独立沉默分子驱动的，这显着降低了黑素瘤细胞的免疫识别能力，导致黑素瘤细胞水平降低了约70％。 IFNγ的产生（图 4C）。作为比较，用HLA-ABC阻断抗体预处理黑素瘤细胞可使免疫细胞的IFNγ分泌降低95％以上（图 4D）。
接下来，我们研究了衍生自PROG肿瘤的一系列黑色素瘤细胞系中去分化对HLA-ABC表达的直接作用。我们注意到通常表示效应和去分化的标志物PD-1 PROG黑色素瘤细胞系30，31，32，包括受体酪氨酸激酶AXL的累积33的micropthalmia相关转录因子（MITF）的和下调34（7 / 16； 44％PD-1 PROG细胞系）（补充图 8A，9）。重要的是，我们确认黑素瘤去分化表型通常在肿瘤活检（由NGFR阳性定义）和相应的PD1 PROG细胞模型之间是一致的（补充图 8B）。这些MITF 低 / AXL 高的 PROG细胞显示出通过外源IFNγ处理减少了HLA-ABC诱导（图 5A）。此外，在比较CYT评分匹配的HLA-A低（n = 19）和HLA-A高（n = 19）肿瘤时，我们观察到了MITF 低 / AXL 高去分化细胞状态的标志物，包括下调了MITF / SOX10调节基因，MITF，TYR，DCT和MLANA转录本（补充数据 4）以及TGFß调节基因上调，包括AXL（q = 0.06），TAGLN，NGFR，SERPINE1，BGN转录本（补充数据 4）。
一个 IFNγ介导的诱导在MITF细胞表面HLA-ABC的（IFNγ处理/媒介物处理的对照）高 / AXL 低或/ MITF 低 / AXL 高短期PD-1 PROG黑色素瘤细胞系。每个点代表一个细胞系，并在用载体对照或1000 U / mlIFNγ处理培养物后24小时，通过流式细胞仪测量HLA-ABC诱导。箱形图显示了中位数和四分位数范围，并使用Mann-Whitney检验比较了数据。b用媒介物（对照），1000 U / mlIFNγ和/或10 ng / mlTGFβ处理的WMD-084，SCC14-0257和SMU17-0132黑色素瘤细胞中HLA-ABC的细胞表面表达（中值荧光强度； MFI）为72 H。使用单向方差分析与Geisser-Greenhouse校正比较数据（平均值±sd）。c去分化标记AXL，N-钙粘着蛋白和SNAIL在用媒介物（对照），1000 U / mlIFNγ和/或10 ng / mlTGFβ处理的WMD-084，SCC14-0257和SMU17-0132黑色素瘤细胞中的表达72小时 d将TGFβ预处理（10 ng / ml，持续72 h）的黑素瘤细胞与患者匹配的肿瘤浸润淋巴细胞共培养后，IFNγ的产生来自同一肿瘤活检。通过流式细胞术测量IFNγ。数据（均值±sd）显示了背景扣除（仅免疫细胞培养物中自发产生的IFNγ）后T细胞（TGFβ预处理/ BSA预处理）中相对IFNγ的表达。使用配对t检验比较配对的BSA处理和TGFβ处理的数据，** p <0.01，* p <0.05。
接下来在两个PD-1 PROG黑色素瘤细胞（WMD-084，SMU17-0132）和一个PRE（SCC14-0257）黑色素瘤细胞系中探讨了TGFβ对HLA-ABC表达和去分化的影响。外源性TGFβ降低了基线时HLA-ABC的细胞表面表达，并且在某些情况下，足以减少黑素瘤细胞系中IFNγ诱导的HLA-ABC的表达（图 5B）。TGFβ暴露促进了去分化标记物N-钙黏着蛋白，AXL和SNAIL的可变水平，所有测试的三种黑色素瘤细胞系均显示了TGF-β介导的至少一种这些标记物的诱导（图 5C和补充图 10）。此外，TGFβ减少了自体免疫细胞对黑素瘤细胞的识别，从而导致IFNγ的产生减少（图 5D）。
这项研究证实，与去分化表型相关的MHC I类下调是先天性和获得性对PD-1抑制剂的标志。尽管在免疫检查点抑制剂，先天和获得性抗性黑色素瘤的治疗最新进展仍然是一个重大的挑战，与第二线疗法打捞仅观察到适度改善35，36。在抗原呈递的遗传改变（B2M，HLA-A）和IFNγ信令（IFNGR，STAT1和JAK1 / 2）在非响应黑素瘤患者9，11，12，13是罕见的，并且不限制于非响应-患者13，37，38。现在我们已经表明，发生MHC I类下调在PROG肿瘤的31％，而不管电阻是否是先天或后天的，与的TGFβ活性，SNAI1上调，癌相关成纤维细胞的签名和MITF相关的MHC I类的下调低 / AXL 高黑色素瘤表型。在单药抗PD-1失败的患者中选择后续联合免疫疗法时，这具有重要意义，因为依赖于T细胞介导的抗肿瘤免疫力的挽救策略可能无效。
所述AXL 高去分化黑素瘤程序已被链接到黑素瘤侵袭34，BRAF和MEK抑制剂的抗性39，40，41，并且与固有电阻在黑素瘤患者相关联的PD-1单一疗法抑制剂17。AXL 高黑色素瘤是BRAF / MEK和PD-1抑制剂治疗期间富集41，并经由微环境线索包括T细胞诱导的炎性刺激（例如，TNFα）诱导42，43和癌相关成纤维细胞活性（例如，的TGFβ信号传导）41，44，45。然而，去分化的黑色素瘤中的MAPK抑制剂和免疫抵抗效应子可能是不同的。特别地，多个受体酪氨酸激酶，包括AXL，PDGFRß和EGFR驱动MAPK抑制剂抗性的上调39而黑色素细胞抗原的全球下调42，43和MHC I类表达（本报告）介导免疫逃避的减少上调。
与我们的数据一致，AXL表达减少了小鼠乳腺肿瘤模型46中的STAT1磷酸化和MHC I类表达，并通过TGFβ/ SNAI1信号传导诱导了间充质转化，从而导致前列腺癌中MHC I类表达的下调47。虽然，缺乏MHC I类分子的正常表达应该激活，并通过自然杀伤细胞被清除肿瘤细胞，这些免疫细胞的活化和功能可能是由基质的TGFβ存在障48，49。
最近的数据还证实，成纤维细胞衍生的TGFβ通过限制微环境中的T细胞运动来抑制抗尿路上皮癌细胞的免疫力和PD-1反应25和升高的TGFβ1降低了T细胞浸润对黑素瘤患者生存结果的积极作用22。此外，PD-1 / PD-L1阻断调用在临床前结肠癌和乳腺癌的小鼠模型响应于与的TGFβ激活基质25，50。PD-1 / PD-L1的组合抑制与受体的TGFβ激酶抑制剂也已显示增强的肿瘤消退在临床前肿瘤模型51，52和双功能融合蛋白在实体肿瘤靶向PD-L1和表现出的TGFβ鼓励在最近的I期临床试验的疗效53。这些数据共同证明，环境TGFβ提示通过限制T细胞浸润并下调MHC I类表达而有助于免疫逃逸和PD-1抑制剂逃逸。
在我们大量患者的经过仔细注解的PROG样本中，在进展时进行了活检，证实是从进展中的转移灶中进行活检，我们发现先前描述的抗原呈递（B2M，HLA-A丢失）和IFNγ信号传导（IFNGR，STAT1和JAK1 / 2个改变）是治疗失败的罕见机制9，11，12，13。我们的所有PROG肿瘤均未表达B2M，IFNGR1，JAK1或JAK2突变，尽管我们鉴定出5个源自STAT3突变的PROG肿瘤，它们均具有STAT1突变（患者25-STAT1 S735F，患者40-STAT1 S316L和患者50-STAT1 P633L） ，只有患者40显示并发STAT1突变和HLA-A下调。
最后，我们无法定义准确分类临床响应于PD-1抑制剂的基线转录签名我们也可以确认先前报道的基因表达特征的预测值11，15，17，18。最近的一些报道也无法验证已发表的免疫疗法反应的预测因子。例如，IPRES基因表达签名没有准确地预测在几个独立的黑素瘤队列PD-1抑制剂响应11，19，21。CIBERSORT，细胞溶解活性和IFN-γ的基因表达特征是PD-1和CTLA-4抑制剂响应的差的预测跨越几个公开可用的患者的数据集21，54和有效性和IMPRES基因表达特征的再现性在预测免疫关卡抑制剂响应尚有争议55，56。
尽管热切希望寻求基线预测信息来指导一线免疫治疗的选择，但我们的发现表明，单点，强大的治疗前生物标志物不太可能代表癌症的异质性，也无法预测肿瘤的快速发展态势在免疫疗法的选择压力下。需要对来自不同部位的多个预处理活检进行纵向分析，以验证肿瘤异质性对临床结果和基线预测特征的准确性的影响。在这项研究中，我们观察到黑色素瘤患者个体病变对免疫检查点抑制的反应存在显着差异，23，57。这种异质性可能反映了遗传，分子和细胞变量，其中可能包括新抗原仅存在于一部分肿瘤克隆中，PD-L1在小部分肿瘤细胞中的表达，PD-1在免疫细胞上的可变表达以及在T细胞密度和克隆性肿瘤内的差异 58，59，60。这将是有趣探索这些限制是否影响肿瘤突变载荷，这已被证明以预测多种癌症的免疫检查点封锁，包括黑素瘤的临床益处的预测值 61，62，63。最近的数据表明肿瘤突变负担可能不显著治疗期间改变64虽然的患者内变异负担异质性已被观察到，65。此外，当根据黑色素瘤亚型（即皮肤，隐匿性，端或粘膜）将肿瘤样品分层时，肿瘤突变负荷不能预测对基于抗PD-1的免疫检查点疗法的反应66。不幸的是，这项研究无法获得种系变异数据，因此无法准确估算这项研究中的肿瘤突变负担，
我们得出的结论是，与去分化表型相关的MHC I类下调是对PD-1抑制剂耐药的常见机制。有了来自黑素瘤患者的同步和纵向收集的活检样品的可用性，我们能够解决免疫和患者内异质性的问题，这是确定预测特征和制定克服免疫检查点抑制剂耐药性的策略的重要限制因素。不过，组合免疫疗法的策略，例如添加利用其他抗免疫途径而不仅仅依赖T细胞介导的抗肿瘤免疫的CTLA-4抑制剂，以及通过抑制TGFβ信号来恢复抗原呈递的机制，
这项研究纳入了68例转移性黑色素瘤患者，这些患者在澳大利亚黑素瘤研究所（MIA）和附属医院接受过PD-1抑制剂（派姆单抗或nivolumab）治疗。获得所有患者的书面同意（皇家阿尔弗雷德医院的人类研究伦理委员会规程；规程X15-0454和HREC / 11 / RPAH / 444）。使用免疫相关反应标准（irRC 20）评估肿瘤反应，异质反应定义为进行中和/或新转移的存在，以及首次再分期成像时至少有一个反应转移。记录了包括美国癌症联合委员会（AJCC）分期，乳酸脱氢酶（LDH）和突变状态在内的临床病理特征（补充资料 1），并从首次全身治疗之日起至以下三个日期计算随访时间：死亡日期，失访日期或2018年11月30 日。
使用AllPrep DNA / RNA / miRNA通用试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）16从79个新鲜的冷冻组织切片中分离出总RNA 。使用TruSeq RNA文库制备试剂盒（Illumina）和配对末端100 bp测序进行cDNA合成和文库构建，每个样品可读取40-50百万。测序在墨尔本澳大利亚基因组研究中心的Illumina Hiseq 2500平台上进行。
使用cutadapt 67对Illumina TruSeq配对末端测序适配器序列和碱基的质量进行修剪，每个末端质量<20 。修剪后少于50个碱基长的读数将从随后的分析中删除。使用允许的10％错配的STAR，将过滤的读数定位到参考基因组hg38。均等地映射到一个以上基因组位置的读段将被丢弃。使用GenomicAligments读取的GAlignmentPairs函数将读取导入R中。strandMode设置为2。GENCODE基因版本26被用作基因参考数据库。与每个基因的外显子区域重叠的读数的计数是通过GenomicAligments的countOverlaps函数完成的。
RNA计数数据使用M值（TMM）的均值进行标准化，并通过voom转换为具有相关精确权重的log2百万分之68。为了鉴定与可变水平的HLA-A转录物表达相关的差异表达基因，我们比较了所有PRE和PROG肿瘤对的CYT得分，并比较了具有相似CYT得分的肿瘤对（比率在0.9-1.1之间）。根据HLA-A转录本差异对它们进行排序，并选择HLA-A表达差异大于两倍的肿瘤对。相对于CYT评分和高HLA-A，有 19对肿瘤分类为低HLA-A转录本相对于CYT分数的成绩单。使用基于经验贝叶斯方法的适度化的t-检验（R中包版本3.6.0 LIMMA版本3.40.2实现）以估计基因表达的变化进行了测定这两个组之间差异表达的基因69。同样，我们将患者分为反应者（完全和部分反应）和非反应者（稳定和进行性疾病），并应用中度t检验（在limma中实施）以鉴定与反应相关的基因表达。
使用用于微阵列模块的线性模型（R / Bioconductor中的limma封装）69进行TMM-voom转化基因表达数据的排名排序，并使用GenePattern 70提供的预排名模式下的基因集富集分析进行分析。的印记基因组71的分子库版本6.2 72，与基质和细胞IPRES基因标记17，25，26进行了审议。伪发现（FDR）校正的p值<0.05用于CYT匹配的黑色素瘤肿瘤之间的比较。
为了获得单样本基因集富集分析（ssGSEA 73）所要求的针对转录本长度进行校正的丰度值，使用GENCODE基因版本26作为参考转录本数据库，使用RSEM得出FPKM估计值。使用GenePattern 70提供的具有上述基因集的ssGSEA（版本9.1.1）实施方案确定绝对标记富集得分。随后，使用温和的t检验（R / Bioconductor中的limma包）69对ssGSEA富集得分进行差异表达分析。甲假发现（FDR）调整p＜0.05的值用于肿瘤组之间的比较。使用CIBERSORT网站门户（http://cibersort.stanford.edu/），相同的FPKM值也可用于推断22种浸润免疫细胞的相对比例。将这22个细胞亚群进一步分组为11种主要白细胞亚型74，并应用中度t检验（在limma中实施）以鉴定与HLA-A转录物表达相关的细胞亚群。
使用基于Morpheus网络工具（https://software.broadinstitute.org/morpheus/）中的最近邻算法中的Spearman秩相关系数，计算成绩单表达与ssGSEA富集得分之间的相关性。
适用于我们的数据集的PD-1预测特征如下：IPRES特征（IPRES特征中基因组的ssGSEA得分的平均Z分数17），IMPRES特征21，CD8A / CSF1R比（TMM-voom转换后的数字差异）CD8A和CSF1R表达数据15），18个免疫基因签名（免疫签名18中18个基因的ssGSEA得分）TIDE（使用TMM-voom测序计数对每个基因进行归一化计算，方法是减去http ：//tide.dfci.harvard.edu 22，CYT得分（TMM-voom转换GZMA和PRF1表达数据24）和CIBERSORT估计使用FPKM表达式估计（CD8 + T细胞的相对比例http://cibersort.stanford.edu 74）。这些预测性评分是针对每次治疗前黑色素瘤活检（n = 44），并与患者反应数据（完全（CR）和部分反应（PR）相对稳定（SD）和进行性疾病（PD））一起使用，以生成接收者操作员特征（ROC）曲线，以测量每个指示的性能预测患者队列中PD-1抑制剂反应的信号。还通过三个公开的治疗前黑色素瘤RNA-seq数据集（含反应数据）评估了这七个PD-1预测特征在预测反应中的表现（irRC：CR和PR）：( 1）49例接受PD-治疗的患者1抑制剂，nivolumab 11，26例患者治疗PD-1抑制剂或nivolumab pembrolizumab 17和41例抗CTLA4处理75。ROC曲线下的面积是使用8.2.1版的GraphPad，基于Wilson和Brown 76的混合方法，使用非参数估计和95％置信区间来计算的。
使用VarScan2针对参考基因组调用SNV。最小变体频率设置为20％，其他参数保留为默认值。简要地说，SAMtools mpileup实用程序提供了读取覆盖率的摘要，并且使用VarScan2处理了mpileup输出，以调用变体并生成带有通过最小读取和等位基因频率阈值的变体的VCF格式文件。由于位置不明确且对齐精度较低，因此不包括插入和删除调用77。通过使用Qiagen 的Ingenuity Variant Analysis软件（https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-variant-analysis），可以对生成的VCF文件进行可视化和分析。
根据制造商的说明书，将肿瘤活检物手动切碎并进行酶处理，然后使用人肿瘤解离试剂盒和gentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotec）解离为单细胞悬液。
将单细胞悬液在人血清中从男性AB血浆（Sigma）中在10％DMSO中的肿瘤中解离（TD，1×10 6个细胞/小瓶）进行冷冻，然后接种到24孔板中（1×10 6个细胞/孔）分离短期黑色素瘤和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）培养物。
在补充有10％热灭活的胎牛血清（FBS；美国密苏里州圣路易斯的Sigma Aldrich），4 mM谷氨酰胺（Gibco，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Dulbecco改良Eagle培养基中维持短期黑素瘤培养。 ）和20 mM HEPES（Gibco），在37°C下于5％CO 2中。使用来自Promega的StemElite ID系统，可以对已建立的细胞系和新产生的细胞系进行细胞认证和分析。所有细胞均检测为支原体阴性（MycoAlert支原体检测试剂盒，Lonza，巴塞尔）
在TIL培养基（Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中补充了来自雄性AB血浆（Sigma）的10％热灭活的人血清），25 mM HEPES，100 U / ml青霉素，100 µg / ml链霉素，10中培养TIL µg / ml庆大霉素，2 mM 1-谷氨酰胺和1000 U / mL IL-2（Peprotech），并通过添加Dynabeads人T激活剂CD3 / CD28（ThermoFisher，25 µl / ml培养基）进行扩增。
对于IFNγ和TGFβ处理，将6×10 5黑色素瘤细胞接种在T75 cm烧瓶中。过夜孵育后，补充培养基，将细胞用1000 U / mlIFNγ（Peprotech，Rocky Hill，美国新泽西州），10 ng / mlTGFβ（Peprotech，Rocky Hill，美国新泽西州），或载体对照（磷酸盐缓冲液（PBS，Gibco）中的0.1％牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich））。收集细胞，用PBS洗涤，并通过流式细胞仪和免疫印迹进行分析。
通过ELISA或流式细胞术分析黑素瘤：TIL共培养物中的IFNγ产生。为了测量IFNγ的释放，将1×10 4黑色素瘤细胞与1×10 4 TIL（效应子与肿瘤的比例为1：1）一起在96孔板中以100 µl TIL培养基的总体积进行培养，并进行每种实验设置一式三份。培养两天后，收集上清液，离心除去细胞碎片，并保存在-20°C下，以使用人IFNγDuoSet ELISA（R＆D Systems）进行IFNγ分析。ELISA根据制造商的方案进行。或者，通过流式细胞术测量产生IFNγ的CD8 + T细胞的频率。对于流式细胞术，将1×10 5黑色素瘤细胞与1×10 5培养。在0.5 ml TIL培养基中的24孔板中培养自体TIL。共培养四小时后，加入5 µg / ml布雷菲德菌素A和5 µg / ml莫能菌素（均来自Sigma）以停止细胞因子释放，并将共培养物孵育过夜，然后染色（参见下文）。对于TGFβ处理，在与TILs共培养之前，先用10 ng / mlTGFβ或溶媒对照对黑素瘤细胞进行72小时的预处理。
对于B2M沉默实验，如上所述，首先先用阴性对照shRNA或B2M shRNA转导黑素瘤细胞，然后再与自体TIL共培养。使用单克隆小鼠抗HLA-ABC抗体（克隆W6 / 32，目录号311409，Biolegend）进行HLA-ABC阻断。在与自体TIL共同培养之前，将黑素瘤细胞用20 µg / ml抗HLA-ABC抗体或小鼠IgG2a同种型对照抗体（Biolegend）预处理1。
B2M shRNA构建体对应于核苷酸144-162和402-420（基因库登录号NM_004048.2）78。非沉默阴性对照shRNA没有显示出与任何已知人类转录本的完全同源性，并具有以下序列：5-TTAGAGGCGAGCAAGACTA-3。将shRNA克隆到pSIH-H1-puro（System Biosciences）慢病毒载体中。如先前所述，在HEK293T细胞中产生了慢病毒79。使用5的多重感染来感染细胞，以提供90％以上的感染效率。转导后72小时使用细胞。
使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（Roche）的RIPA裂解缓冲液在4°C提取总细胞蛋白。蛋白质（15–40 µg）在8-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至Immobilon-FL膜（Millipore）。用抗体MLANA（1：1000; Cell Signaling Technology; Cat.No.34511），SOX10（1：1000; D5V9L; Cell Signaling Technology; Cat No.89356），AXL（1：200; R＆D System;目录号AF154），MITF（1：1000; C5; Calbiochem;目录号OP126L），N-钙粘着蛋白（1：2000; 3B9; Invitrogen;目录号33-3900），SNAIL（1：1000; C15D3;细胞信号技术；目录号3879）和ß-肌动蛋白（1：6000； AC-74； Sigma-Aldrich；目录号A5316）。如有指示，将膜与REVERT 700总蛋白染色剂（LI-COR，Lincoln，NE）一起孵育，并使用Odyssey CLx成像系统成像，
将MITF的蛋白质表达数据标准化为ß-肌动蛋白，将N-钙粘蛋白标准化，将AXL，MLANA，SOX10，SNAIL标准化为REVERT 700总蛋白质染色剂（LI-COR）。从衍生自每个独立生物学复制品的归一化表达数据计算每种蛋白质的Z值。
在流式细胞仪缓冲液（补充有5％FBS，10 mM EDTA和0.05％叠氮化钠的PBS）中进行染色。单元格（2×10 5）与结合了藻红蛋白（PE）（1：100;货号311406）的抗HLA-ABC的小鼠抗人抗体（克隆W6 / 32; BioLegend，San Diego，CA）在冰上孵育30分钟氟700（1:80;目录号311438）; HLA-DR，DP，DQ（克隆Tu39; BD Biosciences）与Brilliant Ultraviolet（BUV）395（1：200; Cat.No.740302）结合，CD45（克隆HI30; BioLegend）与Brilliant Violent（BV）711结合（ 1：200;货号304050）; SOX10（克隆A2；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术）与Alexa Fluor（AF）488（1:50；目录号sc-365692）缀合，CD271 /神经生长因子受体（克隆ME20.4； BioLegend）与PE-花青（Cy）7（PE-Cy7）（1：100;货号345110）偶联的β-微球蛋白（克隆2M2; BioLegend）与PE-Cy7（1：200;货号316318）。Fc阻滞（1：200; BD Biosciences;目录号 564220）用于防止由于抗体与Fc受体结合而引起的非特异性染色。采集前，通过用5 µM 4'6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）或活死近红外（NIR）固定染料（Invitrogen，Thermo）对细胞染色来确定细胞活力Fisher Scientific）。使用细胞内染色分析黑色素瘤：TIL共培养物中产生IFNγ的细胞的频率。简要地，收集细胞并用可固定的Live Dead NIR（ThermoFisher）和Fc块染色，然后用抗CD3（1：100;克隆UCHT1; BD Biosciences，Cat。No. 565491），CD8（1：100;克隆SK1）的抗体染色； BD Biosciences；目录号561617）和CD4（1：100；克隆SK3； BioLegend；目录号344604），分别与BV786，V500和异硫氰酸荧光素（FITC）偶联。
所有样品均在BD LSRFortessa X20流式细胞仪（BD Biosciences）上采集，并使用FlowJo v10.4或更高版本（TreeStar，Ashland，OR）进行分析。至少采集了10,000个现场事件，同时收集了所有事件用于分离的肿瘤样品。除非另有说明，否则通过将抗体染色的样品的中值荧光强度（MFI）除以未染色的对照来计算相对标志物的表达水平。对于解离的肿瘤样品，相对于TIL计算黑素瘤HLA-ABC表达（几何平均荧光强度，MFI HLA-ABC黑素瘤/ MFI HLA-ABC TIL）。
为了进行统计分析，我们使用了GraphPad Prism软件v8.1.1。图例指定使用的统计分析并定义误差线。
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