与原发性葡萄膜黑色素瘤相比，转移性葡萄膜黑色素瘤尚不为人所理解，与皮肤黑色素瘤相比，它具有独特的生物学特性，并且缺乏有效的治疗方法。在这里，我们从基因组上分析转移性肿瘤和浸润性淋巴细胞。BAP1变更被过分代表，并在29/32个案例中发现。将功能性BAP1等位基因重新引入到患者来源不足的细胞系中，揭示了向转录组亚型的广泛转变，该亚型以前与原发性疾病的更好预后相关。一种离群肿瘤具有与紫外线损伤相关的高突变负担。CDKN2A缺失也发生，这在原发中很少出现。集中的击倒筛选用于研究与拷贝数增加相关的过表达基因。在一些情况下，发现肿瘤浸润淋巴细胞具有肿瘤反应性，但免疫检查点受体TIM-3，TIGIT和LAG3的表达也丰富。这项研究代表了迄今为止葡萄膜黑色素瘤最大的全基因组分析，并提出了转移性疾病的最新观点。
葡萄膜黑色素瘤（UM）是一种罕见的黑色素瘤，但在成年人中最常见的是眼内癌1。眼球摘除或近距离可以提供良好的局部控制，但在50％的患者发生了转移，最常见的肝脏，并与致命的后果2，3。UM的遗传学主要在眼睛的原发性肿瘤中进行了研究，例如TCGA财团4进行的景观研究。在回复突变GNAQ或GNA11是常见的，而在突变PLCB4和CYSLTR2，下游和上游GNAQ/ 11，在偶然的情况下被视为5，6，7，8。这些驱动程序变异在很大程度上都是互斥的。增加的经常性突变中发现了 EIF1AX， SF3B1，和 BAP1，后者蕴含预后差，转移性疾病的发展 9，10。也可以使用基因表达分析预测转移性UM的发展，其中I类转录亚型肿瘤的预后良好，而II类与转移密切相关 11。然而，额外的预后亚群也可以被确定 4，12，13，14。
由于UM没有BRAF突变，因此预计UM转移患者不会与皮肤黑色素瘤患者对相同的靶向疗法产生反应。此外，对使用免疫检查点抑制剂后的结局进行回顾性分析表明，在多个中心2的反应率很差。在我们的中心，我们正在使用隔离的肝灌注和美法仑来治疗患有UM肝转移的患者。在进行灌注治疗的外科手术过程中，有可能为PDX模型的生成，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）培养以及转移的基因组学研究而进行新鲜的活检（图 1a）。）。在这里，我们描述了使用全基因组测序对32个转移性UM肿瘤进行分析的方法，并描述了浸润的淋巴细胞的特性，从而提供了对晚期UM涉及的基因组事件和免疫学的分子了解。
一个研究综述示意图。对32个样品进行了全基因组测序，对28个样品进行了RNA测序。比较了来自TCGA的80个肿瘤的拷贝数分析。来自15个肿瘤的TIL用于抗原反应性测定，其中5个以及其他3个肿瘤用于TIL表型的单细胞分析。b UM中经常改变的基因突变。指示3号染色体状态。ç内含子的非剪接位点突变在BAP1，与异常剪接有关。d与异常剪接相关的BAP1的内含子大缺失。ËCOSMIC突变特征的估计贡献。样本和签名通过聚集层次聚类排序。估计贡献小于30％的签名被排除。包括n = 32个独立的UM样本，并包括n = 2个同时测序的皮肤黑色素瘤（代表一名患者的两个转移），以进行比较。使用同义和非同义突变来推断签名。CM：皮肤黑色素瘤。f基于WGS数据的UM11总体突变谱。显示了与紫外线相关的“签名7”的规范轮廓以进行比较。g来自不相关的原发性虹膜黑色素瘤的外显子组数据的突变谱。
总共收集了UM的32个转移灶，6个皮下转移灶和26个肝脏转移灶（补充表 1），并进行了全基因组测序，其中28个进行了poly-A + RNA测序。病理上将28个肿瘤指定为起源于脉络膜，其中1个在睫状体中，1个在虹膜中，而2例患者尚无关于原发葡萄膜位置的信息。所有肝转移灶均来自活检时未经治疗的患者，其中24例已纳入SCANDIUM III期试验[ 15]。除一名患者外，所有皮肤活检均来自先前接受过化疗的患者（IHP，达卡巴嗪和/或紫杉烷类）。
变体与MuTect 2调用16显示突变BAP1，GNA11，GNAQ，SF3B1，CYSLTR2，和PLCB4（图 1b中，补充图 1A，B和补充数据 1），这是在UM反复改变5，6，7，8，9。我们未发现EIF1AX突变与预后良好相关[ 9]。总共发现29/32（91％）个转移灶具有BAP1突变。在绝大多数情况下，这些与染色体3的丢失配对（图 1b）。在一种情况下，3号杂合性的丧失以拷贝数中性的方式发生（补充图 1c）。值得注意的是，BAP1也是标准变体检出未检测到的改变的对象，包括横跨前三个外显子的一个大缺失。在另一种情况下，距离最近的剪接位点较远的内含子事件与新的剪接事件和突变点处的内含子保留相关（图 1c）。第三个肿瘤包含一个48 bp的完全内含子纯合子缺失，该缺失在剪接位点再次未发生，但与错接和内含子保留明显相关，与事件有关（图 1d）。）。这两个更改很可能会创建新的内含子剪接位点。先前的研究描述了激活BAP1 17外显子内隐蔽剪接位点的突变。就我们所知，尚未描述UM中从头产生剪接位点的内含子突变的病例。仅在外显子-内含子边界处破坏典型剪接位点的情况18。正如BAP1丢失预测转移3一样，这突出了需要研究内含子非剪接位点突变作为功能丧失事件的候选者，外显子组或靶向测序可能不足以揭示这一点。
在无法确定BAP1突变的三名患者中，有两名患有SF3B1突变。我们还检测到SF3B1突变发生在常见热点K666或R625之外。其中包括K700E和V577的帧内删除。据我们所知，第一个没有在UM中描述，但在其他癌症类型中很常见，包括乳腺癌19，慢性淋巴细胞性白血病20和胰腺腺癌21。一些SF3B1突变也与BAP1突变同时发生，说明这些事件之间的相互排斥性是不完善的5。
在没有BAP1突变的第三个肿瘤中，我们未在SF3B1或EIF1AX中发现突变。还通过免疫组织化学证实了BAP1核染色（补充图 4d）。该肿瘤（UM28）也是唯一被推断为四倍体的肿瘤（补充图 1d，e），并经常出现宽拷贝数丢失，影响1p，3、4q，6q，8p，9、11、14和9号染色体。 16.在这些区域中的突变基因包括YEATS2和ZMAT3 3号染色体和AKT1上14号染色体缺乏BAP1突变是I类亚型肿瘤的特征，其中只有一小部分易于转移。那些确实发生过转移的人已经显示出可通过升高的PRAME表达来区分13。这种特殊的肿瘤表现出PRAME表达的第二高水平（补充图 1f），表明它可能起源于此类I类肿瘤。
此外，我们在肿瘤抑制因子TET2中发现了两个转移突变的肿瘤，其中一个转移导致停止收益。第三肿瘤在TET1中具有移码缺失。TET1和TET2通过DNA去甲基化发挥后生控制22，23。一些转移灶在与BAP1相互作用的基因中也有突变，包括ASXL2和FOXK2 24（补充数据 1）。这些突变在TCGA原代UM样品中不存在（补充图 1g，h）。
背后UM的原因是到目前为止很大程度上是未知的，尽管这意味着对紫外线辐射的潜在作用的风险因素，没有明确的证据已经出现日期和字段这是否可以成为一个推动因素分为6，14，25，26，27岁。基因组中三核苷酸取代的模式可以提供有关潜在突变过程的信息。因此，我们估计了已建立的突变特征28对肿瘤中总突变负担的相对贡献。
与以前的观察结果一致6，14，占主导地位的是签名S1，S3，S5（COSMIC命名法），以及在较小程度上S16。S3已经与缺陷的DNA双链断裂修复相关，而S1和S5被称为时钟样和与老化相关联28，29（图 1E）。然而，一种肿瘤具有明显不同的特征，主要受S7的贡献（约63％），偏向未转录链（q <0.05，泊松试验），与同时测序的皮肤黑色素瘤更相似（图 1e，f）。已知S7是由于紫外线辐射引起的损坏而产生的28。我们可以从存在相同GNA11Q209L突变和RNA中的BAP1移码缺失的情况下，以及针对TCGA的约10,000个肿瘤的转录组分类中排除样本混合（补充图 2a–c）。
我们假设这种意外的特征可以解释为由于肿瘤起源于虹膜（补充图 2d–g），该部位仅发生3–5％的病例3，与不存在虹膜黑素瘤和紫外线兼容TCGA UM队列中的证据4。为了证实这一点，我们设法从没有转移的患者那里获得了第二个虹膜UM样本，这再次显示出明显的UV模式（图 1g）。因此，尽管罕见，但如果虹膜中可见紫外线，则紫外线可明显地引起UM。有趣的是，这与数量增加的所谓的新抗原有关，肽序列被预测为具有免疫原性（补充图 2h）。
UM的特征是影响整个染色体臂4的高重复性拷贝数畸变。与预后不良的肿瘤单体性3具有染色体8q的，已知的增益所有转移共同出现14，30（图 2A）。与通过TCGA研究的肿瘤相比，在转移性肿瘤中，许多手臂水平的变化也被明显地夸大了（Fisher的精确检验，q <0.05）。这些是17p，6q和3号染色体的丢失，以及8q和5p的增益（图 2a，b，补充数据 2）。以前的研究还发现，6Q和8P的损失转移性肿瘤中过多14，30。对UM16和UM24匹配的原发肿瘤进行测序显示，UM16中5p的增加和UM24中6q的丢失是仅在各自转移灶中才出现的晚期事件，而两种情况下原发中已经存在8q的增益和3的丢失（图。 2C）。先前已经发现6q的丢失与转移31有关。总体而言，与TCGA肿瘤中观察到的相比，这些转移中的基因组损失往往更常见。
每个肿瘤的拷贝数概况。颜色强度的差异取决于拷贝数幅度和肿瘤纯度。b 与TCGA肿瘤（n = 80）相比，广泛的拷贝数变化丰富了转移（n = 32 ）。两尾费舍尔精确检验，并使用本杰米尼-霍奇伯格方法进行了多次检验的调整。c与匹配转移相比，有两个原发肿瘤。d两个样品中CDKN2A的局部缺失。Ë RNA-SEQ从UM9转移和显示用焦的区域对应PDX CDKN2A删除。F复发性臂级拷贝数畸变中的基因按在该队列和TCGA肿瘤中一致的基因表达与拷贝数之间的关联进行排名，并进一步根据人蛋白质参考数据库（HPRD）中的蛋白质-蛋白质相互作用网络度进行排名存在任何与较差生存率相关的关联。每个区域显示前三名候选人。连接线代表每个区域中排名最高的基因的蛋白质相互作用。蓝色代表亏损区域，红色代表收益区域。每个区域的拷贝数概况的摘要表示显示了增益和丢失事件的相对数目，其中内部的圆圈代表TCGA样本，外部的队列代表我们的队列。对于转移性队列，n 包括28个具有匹配的DNA和RNA数据的样品。g通路在每个获胜或丧失区域的前10个基因的组合集合中富集。h siRNA对主要候选基因进行功能查询，这些主要候选基因的表达由于拷贝数改变而升高。siRNA库转染后，分别计数细胞系UM22，MP-41和92-1的细胞数，分别在72 h，96 h和96 h进行计数。 对于每个细胞系，独立转染n = 3个样品。数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。考虑到细胞系和靶基因均作为变量，使用双向ANOVA估计差异。q使用Benjamini-Hochberg校正计算值，并考虑了h中的所有基因以及补充图 3c中的基因，该图显示了其他感兴趣的候选基因。虚线表示q ＝ 0.05。
焦点事件非常罕见。但是，值得注意的是，我们在两个样本中发现了影响CDKN2A和附近基因MTAP的体细胞局灶性缺失（图 2d，补充图 3a，b）。CDKN2A编码肿瘤抑制基因p16 INK4a和p14 ARF，并在皮肤黑色素瘤32中普遍缺失。这里的缺失分别是纯合的和半合的。尽管在半合子病例中仍存在CDKN2A表达，但随后从患者体内建立了这种肿瘤的异种移植（PDX）模型（补充图 4）。）显示出完全丧失表达，甚至延伸到其他附近的基因（图 2e，补充图 3a）。这表明，由于在这种新环境中肿瘤建立了自身，因此选择了具有纯合缺失或第二个丢失事件的既存克隆，以支持CDKN2A丢失作为可能与转移性疾病有关的晚期事件33。
为了了解UM中反复发生的染色体事件如何影响转录组并通过影响肿瘤行为的潜能对基因进行排名，我们在该数据集和TCGA UM中搜索了拷贝数与基因表达之间的一致相关性，并按照它们的顺序对其进行了排序人类蛋白质参考数据库（HPRD）中已知的蛋白质与蛋白质相互作用的程度，然后与观察到的存活率相关联。每个区域的最高候选者显示在（图 2f，补充数据 3）中。使用MSigDB中的“化学和遗传扰动”集合进行的分析显示，增益区域富含II类UM中上调的类别基因（q <6.11×10 -14），而丢失的区域富含II类34（q <5.49×10 -11）下调的基因。II类转录亚型是UM的两个主要细分之一，与转移密切相关34。途径富集分析揭示了包括转录调控，应激反应，免疫信号传导和发育生物学的过程（图 2g，补充数据 3）。
丢失区域中排名靠前的基因包括CASP9，一种早期凋亡激活因子35和上述CDKN2A。增益区域的候选者包括MAPK14（p38α），一种在细胞周期进程，应激信号，免疫应答和分化相交处起作用的激酶36，以及最近提出的UM癌基因PTK2（FAK）37，一种与粘着相关的激酶已知用于在防止脱离相关的细胞凋亡（失巢凋亡）矩阵整联相互作用和从而介导的存活信号被激活38，39。在来自UM22肿瘤的细胞系中的三个细胞系中针对基于增益候选基因选择的基因列表进行的小RNAi筛选显示，大多数siRNA池对增殖（细胞计数）或生存力（生存力）产生负面影响与针对GNAQ的siRNA相似或更高的水平（图 2h，补充图 3c，d，补充数据 3）。因此，这些反复的臂水平拷贝数变化有助于形成UM的转录组亚型并调节基因，这可能有助于健身。
接下来，我们问BAP1突变在多大程度上可以影响转移性UM的转录组。为此，我们使用了UM22细胞系，该细胞系是从一种以PDX形式生长的转移中建立的，并且在BAP1中具有纯合的移码缺失，但在3号染色体上没有拷贝数损失（补充图 1c）。，补充图 4和补充图 5a）。突变并不总是会导致BAP1蛋白的完全丧失，在UM22中，突变在核定位信号之前产生了翻译终止。因此，该蛋白质主要存在于细胞质中，而不是在BAP1中常见的细胞核中。野生型肿瘤（补充图 4b，c）。使用逆转录病毒载体导入BAP1的功能拷贝，并在该载体和空载体对照样品上进行RNA测序（图 3a）。免疫组织化学（IHC）和RNA-seq比对显示野生型BAP1等位基因的成功整合和表达（图 3b，c，补充图 5b-e）。两种条件之间的差异表达分析显示了大的转录组反应，在绝对对数2倍变化> 1和q <0.05的情况下，下调了518个基因，上调了990个基因（共6707个，无倍数变化截止，图 3d）。，补充数据 4）。SLC7A11，由Zhang等人鉴定。40作为BAP1抑制肥大病作用的介质，尽管不是很严格的调节，却是显着的（log 2倍变化= -0.82，q = 5.42×10 -19）。重新引入后，在下调的基因中富集的途径包括GPCR信号传导，神经递质受体传导，干扰素α/β信号传导和趋化因子活性。上调的途径最明显地包括转录后和翻译机制（图 3e）。
实验的示意图。用含有BAP1野生型的病毒载体或空载体转导来自肿瘤UM22建立的PDX模型的细胞系，并进行RNA测序。b空载体对照和重新引入BAP1的细胞中的BAP1蛋白水平。显示了BAP1野生型细胞系MP-41和92-1，用于比较相同处理下表达的BAP1水平。完整的凝胶图像显示在补充图 5e中。使用生物学重复将蛋白质印迹重复两次，结果相似。Ctrl：控制。 在空载体对照和BAP1中 BAP1表达的PDX模型中的c IHC染色再引入的细胞。比例尺代表100 µm。显示的是在每个细胞系三只移植小鼠中的一只小鼠的肿瘤切片上对每个细胞系进行的一种染色。d差异表达的基因为q <0.05和绝对日志2倍数变化> 1 ñ = 3个从任一情况下，或对照细胞系衍生的细胞的生长的独立样品，分别使用，并且使用差异DESeq2进行了评估。来自临床试验的区分I类和II类UM亚型的基因用41表示，蓝色表示在BAP1重新引入的细胞中上调，红色表示下调。e前10个富集的Reactome基因集。f d中所示基因的RT-qPCR结果，n = 3个技术重复。克基因集富集分析相对于所述MSigDB化学和遗传扰动类别，与来自两组I和II类亚型之间进行鉴别所示的结果34，42。h重新导入BAP1后免疫检查点配体相关基因的下调，这取决于n的 RNA-seq数据 = 3个独立生长的细胞样品，分别来自于案例或对照细胞系。水平线表示框的中位数，下限和上限分别表示第一个和第三个四分位数，晶须分别表示从下限和上限到最多四分之一间距的最小/最大数据点。
值得注意的是，我们观察到了在分类器中用作区分特征的12个基因中的9个的显着调节，该分类器可区分高风险II类和I类亚型41，其中一些是黑素细胞谱系标记物，还发现了其中的一些消音器10兼容地进行调节（图 3d）。这些基因均以与II类肿瘤相反的方式表达，其中CDH1，ECM1和HTR2B在重新引入BAP1后降低，而LMCD1，LTA4H，MTUS1，ROBO1，SATB1和FXR1降低。增加，而其余三个基因RAB31，ID2和EIF1B并不重要。RT-qPCR测量证实了除FXR1以外所有基因的RNA测序数据（图 3f）。
为了调查向I类亚型的明显转录组迁移是否仅限于这些少数区分基因或代表更广泛的变化，我们使用“化学和遗传扰动”集合对整个差异表达基因列表进行了基因集富集分析来自MSigDB 42。我们发现在II类UM 34中低表达的基因签名在上调基因中显着富集（q <0.00031），在II类UM 34中高表达的基因在下调基因中富集（q <0.012），表明这种趋势是确实更广泛（图 3g，补充数据 5）。转向我的子类别BAP1重新引入意味着反向驱动细胞向转移性II类转录亚型转移，该亚型通常具有BAP1改变。我们通过质谱分析了两种情况下的三个重复进行了蛋白质组学研究，发现该主题在差异表达的蛋白质中具有相似的概括（补充图 5f–h，补充数据 6）。此外， 在BAP1突变和野生型TCGA肿瘤之间，有2358个基因（q <0.05）也有所不同，其方式与重新引入该基因时观察到的变化相对应（补充图 5i–l），进一步说明了与亚型之间体内差异相关的基因在实验中发生了变化。
除此之外，BAP1恢复还下调了TIM-3免疫检查点配体相关基因HMGB1和PTDSS1以及TIGIT和CD96配体PVR和PVRL2，这意味着在BAP1缺失的UM细胞中表达水平更高（图 3h，补充数据 4）。）。质谱蛋白质测量结果证实了除PVRL2以外的所有蛋白（补充图 5h）。类似地，在TCGA UM样本中，除PVRL2外的所有样本均以兼容的方式表达（补充图 5l）。
在观察到UM细胞中免疫相关途径的调节后，我们接下来研究了从转移灶中分离的TIL的表型。我们进行了冷冻保存的肿瘤单细胞制剂的流式细胞术，发现不同患者的活检样本中CD8 +和CD4 + T细胞的比例有所不同（图 4a）。已经提出PD-1和CD39的表达可以标记肿瘤反应性T细胞，而不是旁观者组织的驻留细胞43。在一部分样本中发现高比例的PD-1 + CD39 + CD8 +T细胞（图 4a，补充图6a，b中的门控策略） ）。抗原特异性可以通过使用肿瘤相关抗原肽：HLA右旋体的流式细胞仪检测。大多数获得的活检组织包含的细胞太少，无法检测许多不同的黑色素瘤相关抗原。然而，在收到活检，我们还扩大了许多样品所谓年轻的TIL（yTILs）在含介质，如IL-2，用于在黑色素瘤PDX机型过继性T细胞转移的研究44，45。15例HLA-A2：01阳性患者的yTIL培养物中有8例具有MART-1葡聚糖或gp100葡聚糖阳性细胞（图 4b，补充图 6d，补充数据 7）。为了深入了解TCR克隆型的异质性，我们通过单细胞RNA和TCR测序分析了8种yTIL培养物。在所有八种yTIL培养物中，我们均进行了单细胞测序，观察到CD8 + T细胞克隆表达PDCD1（PD-1）和ENTPD1（CD39）（图 4c）。基于表达的簇是由细胞类型和T细胞受体克隆型形成的（补充图 7a-c），后者由不同的激活状态部分解释（补充图 7d，e，补充图8）。除了PD-1和CD39（图 4c，补充图 6c，补充图 7d，e），其他抑制性受体也突出在两个活检和yTILs表示：TIM-3是在高，而TIGIT在yTILs比在活组织检查（图更高。 4d中，补充图 8 - 10）。而且，LAG3也在某些yTIL中表达（补充图 8b）。总体而言，我们的数据表明，在UM肿瘤中存在肿瘤反应性TIL，患者体内异质性较大，并且免疫检查点蛋白的表达较高。TIM-3（以及较小程度的TIGIT）以及与之相关的潜在配体的表达可能表明UM中的免疫逃逸方式与皮肤黑素瘤不同。
a活检材料中CD8 +和CD4 + T细胞的比例，以及对PD-1和CD39呈阳性的比例。样品UM22来自先前接受过化疗的患者，可能会影响该样品中TIL的比例。b评估yTIL培养物中针对MART-1，gp100和NY-ESO-1的T细胞反应性。指出发现是反应性的比例。测试的样品是具有HLA-A * 02：01基因型的样品，因为已知该基因型可提供MART-1和gp100。未测试的具有该基因型（补充数据 7）的样品也经过测试，结果为阴性。Ç的相对水平的分析PDCD1（PD-1）和ENTPD1（CD39）在不同CD8 + T细胞克隆型之间的表达，由yTIL的单细胞RNA序列确定。包括具有一对α和β链的克隆型，并且突出显示了两种标记均表达最大的克隆型。点大小与克隆型频率成正比。灰色表示对PDCD1或ENTPD1阴性的克隆，而其他颜色表示与补充图7e中的克隆型相对应的不同克隆型 。d在活组织检查的批量RNA 序列数据中表达T细胞标记物和检查点受体（批次校正的log 2 RPKM归一化值）。yTILs 年轻的TIL，从低剂量的IL-2活检中分离并扩增TIL。
由于缺乏有效的治疗选择，目前转移性UM的预后非常差3。局限于眼原发病的遗传学已经在几个标志研究调查4，5，6，9，10。但是，只有少数转移样品已通过外显子组或全基因组测序进行了测序，而我们的研究是迄今为止使用全基因组测序进行测序的最大样本队列。原发性UM的病史以及缺乏手术治疗的功效使得活检和转移性标本的手术切除变得罕见。通过在SCANDIUM试验或UM的皮肤转移中获得患者的肝转移活检，我们处于独特的位置，专注于转移性疾病，既可以通过基因组学分析新鲜的冷冻物质，又可以生成PDX，细胞系和TIL培养物转录组学分析。
UM中转移的关键事件是肿瘤抑制因子BAP1 10的丢失。与此兼容的是，我们在91％的转移灶中观察到BAP1突变。通过创建新的内含子剪接位点，其中两个似乎通过规范剪接区域之外的内含子事件改变了剪接。这说明了外显子组测序可能不足以进行检测的特殊情况。考虑到BAP1地位的含义，因此有人可能主张在这一基因座进行更全面的测序。
据报道，表观遗传调控子PBRM1和EZH2的突变可在UM 33转移发展的晚期发生。与这些观察结果一致，我们还在其中一个样品中发现了EZH2的突变。此外，我们发现在其它先前未牵连后生调节剂，包括突变TET1，TET2，和ASXL2，后者已知与交互BAP1 22，23，24。这可以支持这样的改变可以与转移期间肿瘤可能经受的额外选择压力有关。
我们还发现，在研究的两种虹膜亚型肿瘤中，均具有与紫外线引起的损伤相关的突变谱。先前尚未报道过UM中紫外线损伤的突变特征，并且以前的流行病学研究尚未达成紫外线参与UM的共识。尽管虹膜UM很少见，但此处研究的转移远高于平均突变负荷，并能预测新抗原的数量。这可能潜在地使此类肿瘤适于免疫治疗，否则其在UM中缺乏功效。有趣的是，此处涉及的虹膜UM转移也带有识别MART-1的T细胞。
与来自TCGA的原发性肿瘤相比，在所研究的转移灶中发现了一些较广泛的拷贝数事件，包括3号染色体，6q和17p染色体的丢失以及5p和8q的增加。值得注意的是，每个转移中都存在8q增益。通过对两个病例中匹配的原发肿瘤进行测序，我们可以确定，在其中一个肿瘤中，在转移过程中发生了5p增益和17p缺失，而在另一例中，发生了6q缺失。此外，两个肿瘤具有的焦距缺失CDKN2A，可具有在转移设置较大的相关性，因为它尚未在最近初级UM肿瘤的大规模研究检测到事件4，5，6，14，46并且由于在UM 33中也观察到它在转移过程中以逐步方式被删除。后者与我们的发现一致，即从具有半合子缺失的肿瘤建立的PDX模型被发现具有CDKN2A纯合子丢失，这提示了继发性失活事件的选择性优势。
我们还对该基因组和TCGA中的表达和臂级拷贝数变化之间具有相关性的基因进行了定位，并根据它们之间的蛋白质相互作用程度以及与存活的任何关联对它们进行排名，以了解受影响的中心过程和潜在目标。我们发现了一些有趣的候选物，包括最近提出的UM致癌基因PTK2 37，MAPK14，细胞凋亡介质CASP9 35以及CDKN2A。分别在8q增益，6p增益，1p损耗和9p损耗中排名第一。我们针对选定的基因进行了siRNA敲低实验，发现针对大多数基因时，增殖和活力降低是其结果。此外，我们发现由丢失事件介导的表达变化将丰富预后不良肿瘤中通常被下调的基因，而获得事件则被预后不良肿瘤中上调的基因所富集，表明这些广泛的事件有助于形成两个不同的转录组亚型。
为了增加我们对如何建立这些转录组亚型的理解，我们通过将功能性等位基因重新引入由这些转移灶之一建立的细胞系中，研究了BAP1丢失的影响。该细胞系在培养中增殖良好的意义上是不寻常的，而缺乏BAP1的UM细胞系通常具有极慢的生长特性47。实际上，这是我们唯一能够生长足以研究的BAP1缺陷UM细胞系。试图推测该细胞系的遗传组成，具有二倍体3号染色体和BAP1的下游突变损害核定位信号，但不影响蛋白质其余部分的是这种培养物良好生长的原因。然而，我们在这一可能具有独特性的细胞系中显示，野生型BAP1的重新导入导致转录组亚型从II类逆转为I类，这在蛋白质水平也可以看到。的转录变化是按照后的基因抑制中观察到的表型开关BAP1在BAP1野生型细胞48。恢复BAP1 功能后，TIM-3和TIGIT配体相关基因的下调也具有潜在的相关性，表明BAP1的潜在上调 丢失可能对肿瘤与免疫相互作用产生影响。
我们通过流式细胞仪分析了从某些转移中分离出的浸润肿瘤的淋巴细胞，并发现了在某些情况下存在的肿瘤反应性亚群。这表明缺乏免疫反应不是由于旁观者T细胞是肿瘤中唯一存在的。但是，我们还注意到了检查点受体PD-1，TIM-3，LAG3以及在一定程度上TIGIT的表达。潜在地，推断BAP后TIM-3和TIGIT的配体上调1丢失可能与这些受体在T细胞上的表达协同作用，从而干扰抗肿瘤免疫力。考虑到UM中抗PD-1和抗CTLA-4治疗的历史性失败，这可能有助于探索其他检查点受体。在发布我们的预印本之后，另一项在UM活检中进行TIL的scRNA-seq的研究发现了支持该结果的结果49。但是，总的来说，我们对TIL的分子分析表明，活检和扩展TIL中都存在较大的患者内异质性。这种异质性可能导致对检查点抑制剂的罕见或非持久性肿瘤反应以及TIL 3的过继T细胞转移。
总的来说，这些结果表明，外显子组测序可能不足以检测BAP1缺失，这是UM转移中最重要的事件，紫外线损伤可能是虹膜亚型中的重要突变过程，并且复发拷贝数畸变与BAP1缺失协同作用形成转移亚型的转录组。我们还描述了转移瘤中存在的T细胞的免疫特征，这些肿瘤表明肿瘤的识别以及T细胞克隆的异质激活状态，其中一些具有目前免疫疗法未靶向的检查点受体的表达。
患者接受了口头和书面信息，并根据区域伦理审查委员会的伦理批准签署了知情同意协议（＃289-12和＃144-13）。在SCANDIUM试验（NCT01785316）中，针对参与试验的人，从孤立的肝灌注过程中，从皮下转移或肝转移中提取活检样品。用于比较的两种皮肤黑色素瘤肿瘤来自先前描述的病例的皮下和脑转移50。肿瘤活检分为快速冷冻或切碎的切片，用于冷冻保存或浸润肿瘤的淋巴细胞培养。使用Bullet Blender（Next Advance，Troy，NY）将速冻的肿瘤碎片均质化。使用AllPrep DNA / RNA试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）提取DNA和RNA。在圣埃里克眼科医院病理生物库中，原发性眼部肿瘤采用福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）。
如所述从新鲜的冷冻活检组织，血液和肿瘤浸润淋巴细胞中提取DNA和RNA。将原发性眼部肿瘤切片并使用FFPE DNA试剂盒（Qiagen）进行处理。在某些情况下，可使用低输入量的材料，并使用位于斯德哥尔摩SciLifeLab的Illumina HiSeq X 10或位于哥德堡的GeneCore SU的Illumina NovaSeq 6000进行测序，使用Illumina TruSeq-free PCR试剂盒或Illumina TruSeq Nano制作全基因组DNA文库。使用具有poly-A选择的Illumina TruSeq链式mRNA试剂盒制作RNA文库，并在斯德哥尔摩SciLifeLab用Illumina HiSeq 2500或在哥德堡GeneCore SU用Illumina NextSeq 500进行测序。使用NextSeq 500 HighOutput Kit v2准备外显子组测序文库，并使用Illumina NextSeq 500进行测序。
将DNA测序读数与具有bwa 51（v。0.7.12；选项“ mem”和“ -M”）的GRCh37参考基因组的1000个基因组版本比对。重复项用Picard标记（版本1.109；https：//broadinstitute.github.io/picard）。使用来自dbSNP v138和1000个基因组的已知多态位点，使用GATK BaseRecalibrator（v.3.0.3）52重新校准生成的BAM文件。将PDX样品分别与人参考基因组和小鼠参考基因组的GRCm38版本比对。然后，使用带有参数“ -a bwa”的Disambiguate（v。2018.05.03）53区分源自人类的读取。
使用STAR 54（v。2.7.1a）将参数为“ –twopassMode Basic –outFilterType BySJout，–outSAMmapqUnique 60”的RNA测序读数与GRCh37参考基因组的1000个基因组版本进行比对。接头从Ensembl GRCh37.75参考注释中提供。基因表达使用htseq-count 55（v。0.6.0）进行量化，参数为“ -mintersection-strict-sreverse ”。将PDX样品分别与人参考基因组和带有STAR的小鼠参考基因组的GRCm38版本比对。然后使用Disambiguate（参数为-a star）区分来自人类的读物。
使用GRCh37参考基因组的1000个基因组版本和一组正常基因，通过MuTect 2（GATK v.4.1.11.0）进行变异调用。可用时使用匹配的正常样品。从基因组聚集数据库（gnomAD）提供了已知的种群变异。所使用的参数为：“ –资源中没有等位基因0.0000025 –禁用读取过滤器MateOnSameContigOrNoMappedMateReadFilter –基因型-种质位点true –基因型-pons位置true –all-site-pls true”。通过首先在每个法线上使用参数“ -disable-read-filter MateOnSameContigOrNoMappedMateReadFilter”运行MuTect 2，然后将结果列表与GATK CreateSomaticPanelOfNormals合并，构造法线面板。使用GATK FilterMutectCalls根据质量对MuTect 2调用进行了分类，删除了那些过滤器不合格的变体。GNA11，GNAQ，SF3B1，PLCB4，CYSLTR2和EIF1AX。进一步检查了BAP1中的低质量变体，以支持DNA和RNA比对。使用数据库COSMIC（v。79），ESP6500（“ siv2_all”），1000个基因组（“ 2015aug_all”）和VEP（v。91.3）和ANNOVAR 56（v。2016-05-11）进行了变体注释。dbSNP（“ snp138NonFlagged”）。对于其中的两个肿瘤，使用外显子组测序的正常体使用GATK SelectVariants进行进一步过滤。将TCGA UM突变与从GDC下载的突变列表进行了比较（2017年5月29日访问）。
为了确定突变谱，将不存在任何群体变异资源中且具有较小等位基因阅读支持≥10的所有体细胞常染色体突变（包括同义词），使用R包中的函数“ mut_matrix”转换为96-三核苷酸突变频率矩阵。 MutationalPatterns 57（v。1.10.0），参数为“ ref_genome ='Bsgenome.Hsapiens.UCSC.hg19'”。通过COSMIC获得的已知突变签名三核苷酸频率（http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/assets/signatures_probabilities.txt; 然后，使用来自同一R包的函数“ fit_to_signatures”将其拟合到观察到的突变中，并于2017年10月27日访问。该算法通过搜索最能解释给定样本中所有突变的预定义突变特征的非负线性组合来运行，这是通过解决非负最小二乘优化问题57来完成的。这样就可以估算每个样品中已知突变特征的相对贡献。
2015年12月18日从cgHub资料库下载了来自32种癌症类型的9,583个肿瘤的RNA测序数据，并与hg19人类基因组装配体（不包括其他单倍型区域）进行了比对，其Hisat 58为 0.1.6-beta（参数：“ – no-使用GENCODE（v。19）参考人类基因组注释中定义的剪接点，可以混合使用-no-discordant-no-unal-unknown-splicesite-infile”。基因读取计数是使用htseq-count 55（参数：“-m交集-严格-s no”）得出的。RPKM归一化值的计算，考虑到每个基因的最大成熟转录本长度，并使用通过中位数比方法计算得出的稳健大小因子59。对于相关性分析，使用我们针对TCGA数据描述的相同方法，重新排列感兴趣样本的读数，并对读数计数进行重新量化和归一化。但是，基于标准读取深度的尺寸因子用于该样品的RPKM归一化。然后，针对所有编码基因，在我们的样本与每个TCGA样本之间计算成对的Spearman相关系数（使用MATLAB R2018a中的“ corr”函数）。对于t-分布式随机邻居嵌入（叔SNE）分析，登录2转化所有编码基因的表达值（1加入pseudocount）用作输入到从同一个名字的R-包“Rtsne”功能60。使用k进行单独的分类最近基于Spearman相关性的近邻方法（使用k = 6），如先前基于TCGA队列50的留一法交叉验证发现的最佳方法。通过这种方法，在删除最差的相关样本后，通过进行多数表决来破坏任何联系。
使用polysolver（v。1.0）61对全基因组测序数据进行HLA基因分型，参数为“ Unknown 0 hg19 STDFQ”，对具有OptiType的RNA（v。1.3.2，默认参数）62进行HLA基因分型。对于新抗原预测，从每个群体变异资源中都没有的非同义点突变构建以每个突变为中心的突变的17-mer肽序列。然后使用netMHCpan 63（v。4.0 ，默认参数），仅考虑9个聚体，对每个样品的HLA I类基因型进行预测。保留了预测的亲和力<500 n M的肽，并去除了无表达的转录本衍生的肽。使用kallisto 64量化转录水平表达 （v。0.44.0，默认参数），基于与GRCh37人类参考基因组的Ensembl注释相对应的cDNA序列。
使用双目（https://sourceforge.net/projects/binocular），使用未经过滤的变体调用作为输入，以及对齐的肿瘤和正常样品读数。对于大多数样品，使用的参数为“ –delta = 90 –min-maf-delta = 0.05 –ai-cutoff = 0.001 –min-copy-ratio = 1.1”，尽管对于覆盖范围更大的样品，此阈值已提高。对于某些样本，需要对分割值进行重新居中，在这些样本中，估计值总体上偏离二倍体，并且对由于可变覆盖率或肿瘤和法线在不同平台上测序而产生噪声分割轮廓的样本执行了基于幅度的额外滤波。对于没有匹配法线的肿瘤，使用使用来自其他样本的法线定义的节段的相交。使用ichorCNA 65评估样品纯度和倍性，使用参数“ –倍体” c（2,3,4）” –正常“ c（0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9）” –maxCN 10”（带有肿瘤BAM文件）输入。使用CNVkit（v。0.9.6a0）66 “ scatter”命令确定拷贝数中性杂合性丧失，并输入与匹配正常DNA一致的变体。
TCGA原发肿瘤的分段拷贝数数据可从GDC数据门户网站下载（2017年10月6日访问）。副本数更改为绝对日志2从TCGA UM和我们的肿瘤中滤除相对于二倍体染色体<0.2且宽度小于最短染色体臂大小一半的比率。将要测试的一般区域定义为可以构建跨越所有转移样本中所有事件的连续变化区域的区域，这些区域具有所需的宽度和幅度，并且在任一数据集中至少存在一次。然后使用R 3.6.0中的“ fisher.test”函数，使用Fisher精确检验（两尾）对影响每个区域的同一方向（损失或收益）的变化进行评估，以使其与两个数据集相关联。由于产生的连续区域实际上跨越了每个受影响的染色体臂的整个长度，除了3号染色体（跨越整个染色体）之外，使用Benjamini-Hochberg方法对p值进行多次测试进行了校正。
使用TCGAbiolinks 67下载TCGA-UVM数据集（n = 80）的RNA-seq数据，参数为“ project ='TCGA-UVM'，data.category ='Transcriptome Profiling'，data.type ='Gene Expression Quantification '，workflow.type ='HTSeq–Counts'”。根据通过biomaRt和Ensembl数据库获得的每个基因的最大转录长度，使用“ edgeR”软件包中的“ rpkm”方法（“ log = FALSE，prior.count = 1”）对读取计数进行标准化。从GDC数据门户网站下载了每个样品的分段拷贝数概况。基因拷贝数状态定义为在给定样品中跨越基因的片段之间的最大绝对log 2比。保留同时分配了拷贝数和表达值的基因。
为了专注于反复出现拷贝数变化足以表明选择的基因组区域，使用了TCGA GISTIC结果4（从gdac.broadinstitute.org获得，于2017年7月4日获得）并保留了q值<0.05的广泛拷贝数变化。为了关注以相关频率改变的基因，并且更有可能是任何最小重叠区域的一部分，将绝对对数2拷贝数比<0.2的基因滤除，并且每个染色体臂事件仅在上四分之三的频率发生改变的基因被保留。选择第三四分位数，而不是选择更严格的阈值，因为某些区域可能会受到具有随机或人为性质的低频聚焦事件的影响。
使用拷贝数和表达之间的线性回归确定表达随拷贝数变化而改变的基因，根据已发表的估计68调整肿瘤纯度。去除表达变异太低而无法测试（回归无法收敛）的基因。使用变量“ vital_status”，“ days_to_death”和“ days_to_last_follow_up”，对使用TCGAbiolinks下载的临床数据进行了Cox回归单变量生存测试（“ survival” R包69中的 “ coxph”）。
对于转移数据集，分段的拷贝数值已如上所述映射到基因名称，并转换为log 2比率。转换之前的零值设置为最低的观察到的非零拷贝数值。如所描述的，用RPKM标准化基因表达值并批量校正（来自“ limma” R包的“ removeBatchEffect”）70。保留同时分配了拷贝数和表达值且还存在于过滤后的TCGA数据集中的基因。考虑到样品纯度，评估TCGA数据集的表达与拷贝数之间的关联。光伏使用Fisher方法将TCGA数据和转移数据集中的关联产生的假药合并，并使用Benjamini-Hochberg方法对FDR进行调整。保留每个数据集中的q值<0.05，独立原始p值<0.05的候选者，以及与评估的拷贝数事件的方向一致的相关性。保留样本中收益大于损失的地区的候选人被保留为收益的候选人，反之亦然。
，以评估给定基因可能对细胞行为有广泛影响的范围内，与在数据库HPRD（使用IREFRř包访问）中所定义的实验证据蛋白质-蛋白质相互作用71，72 中使用。然后根据HPRD连接的数量对候选者进行排名，然后根据是否存在 与评估的拷贝数事件的性质（增加或减少）相符的任何单变量生存关联（p <0.05）来暗示较差的生存。这样，生存关联就被赋予了较低的权重，其动机是这样的关联容易被多种基因组和临床因素所混淆。
使用siRNA在UM22，MP-41和92-1细胞中进行选定基因的体外敲低。使用模拟siRNA（对照），阳性对照siRNA（GNAQ）进行瞬时转染）或每个目的基因四个siRNA的集合。siRNA双链体购自Dharmacon（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国），基于脂质的转染用Lipofectamine-RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国），每孔96孔使用1 pmol siRNA。孔板按照制造商提供的指南进行。RNA-脂质复合物是在Opti-MEM还原血清培养基中制成的。将细胞一式三份接种在黑色96孔板（Corning）中。转染后（分别为72小时，96小时和96小时），使用CellTiter-Glo分析（Promega）通过ATP测量监测细胞和生存能力。用GloMax Discover酶标仪（Promega）测量发光。平行地，使用从12孔形式转染获得的细胞的锥虫蓝染色进行手动细胞计数。
根据欧盟指令2010/63（哥德堡区域动物伦理委员会批准的＃36-2014和＃1183-2018）进行动物实验。将冷冻保存的生物体解冻，并将单细胞移植到免疫功能低下的6-8周龄雌性非肥胖严重联合免疫缺陷白介素2链受体γ基因敲除小鼠（NOG小鼠）的腹侧（UM22）或肝脏（UM9）中； Taconic，丹麦）形成异种移植物。将小鼠饲养在哥德堡大学的无病原体动物设施中。将小鼠关在笼子里，在环境温度（21-23摄氏度）和20-40％的湿度下进行单独通风。给予小鼠自由的食物和水。暗光周期分别为暗光12 h和暗光7 pm至7 am。使用临床上使用的针对Melan-A的抗体（克隆A103，目录：IS63330-2，即用型溶液），PMEL（克隆：HMB45，目录：GA05261-2，用于即食型溶液）通过免疫组织化学分析肿瘤Autostainers）和S100（克隆：IR504，目录：IS50430-2，即用型解决方案），购自Agilent / Dako。为了产生细胞系，将PDX肿瘤切碎并以高密度接种在补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中的5cm培养板中。扩增存活细胞并用表达HA标签的BAP1的逆转录病毒或对照逆转录病毒（MSCV-IRES-GFP）转导，两者均使用来自Addgene的质粒制备。IR504，目录：IS50430-2，即用型解决方案），购自Agilent / Dako。为了产生细胞系，将PDX肿瘤切碎并以高密度接种在补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中的5cm培养板中。扩增存活细胞并用表达HA标签的BAP1的逆转录病毒或对照逆转录病毒（MSCV-IRES-GFP）转导，两者均使用来自Addgene的质粒制备。IR504，目录：IS50430-2，即用型解决方案），购自Agilent / Dako。为了产生细胞系，将PDX肿瘤切碎并以高密度接种在补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中的5cm培养板中。扩增存活细胞并用表达HA标签的BAP1的逆转录病毒或对照逆转录病毒（MSCV-IRES-GFP）转导，两者均使用来自Addgene的质粒制备。 然后通过RNA-seq对每个样品中的n＝ 3个独立生长的重复进行表征。可根据要求提供生成的UM22细胞系。使用购自Santa Cruz Biotechnology的抗体（克隆：C-4；目录：sc-28383），以1：1000的稀释度用IHC和IHC测量BAP1蛋白的表达，并使用1：100的稀释度进行蛋白质印迹分析。用于蛋白质印迹的β-肌动蛋白抗体购自Sigma（克隆AC-15，目录：A1978，稀释度为1：10000）。
如所述对RNA-seq数据进行比对和定量。使用DESeq2评估差异表达，参数“ alpha = 0.05”。使用参数“ minSize = 0，maxSize = 10000，nperm = 10 7 ” 的R包“ fgsea” 73从MSigDB 42获得基因集，进行基因集富集分析。q <0.05的基因和基因组被认为具有统计学意义。
使用Nucleospin RNA II试剂盒（Macherey-Nagel）从指定的细胞系中提取RNA，然后使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）将其转化为cDNA。使用2x qPCR SyGreen Mix（PCR Biosystems）和CFX Connect实时系统（Bio-Rad）进行qPCR。使用泛素作为参照基因，通过比较ΔCT值进行数据分析。n = 2个技术重复。
通过在2％十二烷基硫酸钠和50 m M碳酸氢三乙铵中的400μl超声处理裂解细胞沉淀。将样品以13,000 rpm离心10分钟，然后将上清液转移至干净的试管中。使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Scientific）和Benchmark Plus酶标仪（BIO-RAD），以牛血清白蛋白溶液为标准液，测定裂解物的蛋白质浓度。
从每个样品中取出总蛋白含量为30 µg的等分试样，并在裂解缓冲液中以DL-二硫苏糖醇终浓度为100 m M在56°C下还原30分钟，然后孵育。使用改进的过滤器辅助样品制备方法74处理减少的样品。简而言之，通过添加8 M尿素将还原的样品稀释至400 µl ，转移到Nanosep 30k Omega过滤器（颇尔生命科学公司）上，并用200 µl 8M尿素洗涤两次 。使用在消化缓冲液中稀释的10 m M甲硫代磺酸甲酯（1％脱氧胆酸钠（SDC），50 m M）进行半胱氨酸残基的烷基化TEAB）在室温下放置20分钟，然后用消化缓冲液反复洗涤滤膜。以相对于总蛋白质质量的1：100比例添加消化缓冲液中的胰蛋白酶（皮尔斯胰蛋白酶，MS级，Thermo Fisher Scientific），并将样品在37°C下孵育3小时；加入另一部分的胰蛋白酶（1：100）并孵育过夜。通过离心收集肽，并根据制造商的说明使用TMT试剂（Thermo Scientific）进行标记。合并标记的样品。使用真空离心浓缩合并的样品，并通过用10％三氟乙酸酸化并离心除去SDC。使用Dionex Ultimate 3000 UPLC系统（Thermo Fischer Scientific）通过碱性反相色谱将合并的TMT标记的样品分馏为40个主要馏分。使用反相XBridge BEH C18色谱柱（3.5μm，3.0×150 mm，Waters Corporation）进行肽分离，并在17分钟内从3％到40％的溶剂B进行线性梯度洗脱，然后在5分钟内将其增加到100％B分钟 溶剂A为10 m米甲酸铵缓冲液，pH 10.00且溶剂B为90％乙腈，10％10米米甲酸铵在pH 10的主级分连接成最终的级分20（1 + 21，2 + 22，... 20 + 40），蒸发并在15μl的3％乙腈，0.2％甲酸中重构，用于nLC MS分析。
在配备有FAIMS Pro Source并且与Easy-nLC1200液相色谱系统（均为Thermo Fisher Scientific）连接的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪上分析级分。将肽捕获在Acclaim Pepmap 100 C18捕集柱（100μm×2 cm，粒径5μm，Thermo Fisher Scientific）上，并在内部填充的分析柱（75μm×30 cm，粒径3μm，Reprosil）上分离-Pur C18，Maisch博士）在77分钟内使用从5％到33％B的线性梯度，然后以300 nL min -1的流量增加到100％B 3分钟，再增加100％B 10分钟。溶剂A为在水中的0.2％甲酸，溶剂B为80％的乙腈，0.2％的甲酸。在90分钟的分离过程中，对所有MS扫描以及顺序的MS2和MS3扫描并行进行了两个实验。一个实验使用-30 V的FAIMS补偿电压（CV），第二个实验使用-50 V的CV。MS 扫描的分辨率为120,000，m z -1范围为375-1375，MS / MS分析的条件为取决于数据，最强的双电荷或多电荷前体离子的最高速度循环为3 s。最强的前体在35碰撞能量下通过碰撞诱导的解离在MS2中破碎，最大注入时间为50 ms，并在离子阱中检测到，然后对前10个MS2碎片离子进行多陷波（同时）分离，m z -1400–1400，选择通过高能碰撞解离（HCD）在65％处进行碎片化（MS3），并在50,000分辨率下在Orbitrap中进行检测，m z -1范围为100–500。在具有0.7 m z -1隔离窗口的四极杆中隔离前体，并在45 s内将10 ppm内的动态排除用于已经选择用于片段化的m z -1值。
使用Proteome Discoverer v。2.2（Thermo Fisher Scientific）进行鉴定和相对定量。参考智人数据库已从SwissProt（2019年9月）下载。使用Mascot搜索引擎2.5.1版（Matrix Science，伦敦，英国）进行数据库搜索，MS肽耐量为5 ppm，碎片离子耐量为0.6 Da。胰蛋白酶肽只有0个缺失的裂解被接受。将甲硫氨酸氧化设置为可变修饰，将半胱氨酸甲硫醇化，赖氨酸上的TMT-6和肽N-末端设置为固定修饰。渗滤器用于严格的FDR阈值为1％的肽谱匹配验证。定量在Proteome Discoverer 2.2中进行。在3 mmu质量公差的MS3 HCD质谱图中鉴定出TMT报告离子，并在Proteome Discoverer 2.2中对总肽量对每个样品的TMT报告强度进行了标准化。
在log 2量级上，将已鉴定蛋白质的标准化丰度在RAP limma（v。3.40.6）的BAP1导入细胞和空载体处理的对照细胞之间进行比较，并使用Benjamini-Hochberg方法调整p值。 使用分别来自病例或对照细胞系的n＝ 3个独立生长的细胞样品。q <0.05（Benjamini–Hochberg校正）的蛋白质被认为具有统计学意义。对于相应的RNA-seq比较，进行基因组富集分析。
如上所述下载TCGA UM基因表达数据并进行标准化。名单BAP1突变的肿瘤是从较早的出版物编4，46和另外三个可能的情况下（补充图 5I）分别从GDC下载外显子组数据识别（访问2019年9月11日）。Ñ = 40个独立生物样品包含在每个状态。通过Wilcoxon秩和检验评估差异表达，并且 在本杰米尼-霍格伯格校正后q <0.05的基因被认为具有统计学意义。
在含有10％人血清和6000 U ml -1的 RPMI培养基中培养小块肿瘤活检样品2周。IL-2。然后在使用前将yTIL培养物冷冻保存。在进行单细胞实验的前两天，将yTIL培养物融化。计数细胞，并将7000个细胞注入单细胞文库制备仪器（10x Genomics）。根据试剂盒说明（10x Genomics），使用Single Cell V（D）J试剂盒进行以下步骤。在Illumina MiSeq上对V（D）J文库进行测序，而在Illumina NextSeq 500上运行基因表达文库。将单细胞转录组学数据与hg38参考基因组进行比对，并使用Cellranger管线进行预处理（v。2.1.1）。 ）由10x Genomics提供。使用Cellranger“计数”功能和默认参数估算表达水平。还使用Cellranger管道并使用默认参数执行了TCR链组装。使用Seurat（v。3.1.3）生成每个样品的t-SNE图，并使用Zheng等人的方法推断细胞类型。（https://github.com/10XGenomics/single-cell-3prime-paper）75，有一些修改：该错误分类一些CD4的码误差的校正+细胞; 将分类为记忆CD4 +不表达CD4但CD8A的细胞重新分类为最匹配的非CD4 +细胞类型；预测将TCR表示为最匹配的T细胞类型的非T细胞；预测将CD3G或NCAM1表达为最接近的非树突细胞类型的树突细胞。Doublet单元格定义为DoubletFinder 76预测的单元格（v。2.0.2，默认参数），以及表示两个以上alpha或beta链的那些参数。使用克隆型频率和“多样化” R包77中的“多样性”函数（类型=“ e”）评估CD8 +细胞的TCR克隆型多样性（归一化熵），得到香农熵，然后通过除以每个样本独特克隆型数的对数78。
将来自冷冻保存的肿瘤活检和yTIL的单细胞悬液在RT中表面染色30分钟。以下抗体用于表面染色：CD3（克隆：HIT3a，目录：300306，批次：B274310，稀释：1：200，荧光染料：AF488），CD4（克隆：A161A1，目录：357414，批次：B238830，稀释： 1：200，荧光染料：PerCP-Cy5.5），CD8（克隆：HIT8a，目录：300920，批次：B256905，稀释度：1：200，荧光染料：AlexaFluor700），CD45（克隆：2D1，目录：368516，批次： B251494，稀释度：1：200，荧光染料：APC-Cy7），CD69（克隆：FN50，目录：310933，批次：B251799，稀释度：1：200，荧光染料：BV650），CTLA-4（克隆：BNI13，目录： 369603，批号：B242857，稀释度：1：100，荧光染料：PE），PD-1（克隆：EH12.H7，目录：329920，批号：B255122，稀释度：1：200，荧光染料：BV421），TIGIT（克隆： A15153G，目录：747839，编号：8267685，稀释度：1：100，荧光染料：BV711）和TIM-3（克隆：F38-2E2，目录：345031，批次：B241708，稀释度1：1，荧光染料：BV785）来自BioLegend和CD39（克隆：eBioA1，目录： 25-0399-41，批次：4329374，稀释度：1：200，荧光染料：PE-Cy7）。为了检测黑色素瘤抗原特异性CD8 T细胞，使用Immudex的Melanoma Dextramer Collection 1试剂盒（目录：RX01，批号：20190611-KB）在37°C下对细胞进行表面染色45分钟。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。345031，批次：B241708，稀释度：1：100，荧光染料：BV785）来自BioLegend和CD39（克隆：eBioA1，目录：25-0399-41，批次：4329374，稀释度：1：200，荧光染料：PE-Cy7）电子生物科学。为了检测黑色素瘤抗原特异性CD8 T细胞，使用Immudex的Melanoma Dextramer Collection 1试剂盒（目录：RX01，批号：20190611-KB）在37°C下对细胞进行表面染色45分钟。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。345031，批次：B241708，稀释度：1：100，荧光染料：BV785）来自BioLegend和CD39（克隆：eBioA1，目录：25-0399-41，批次：4329374，稀释度：1：200，荧光染料：PE-Cy7）电子生物科学。为了检测黑色素瘤抗原特异性CD8 T细胞，使用Immudex的Melanoma Dextramer Collection 1试剂盒（目录：RX01，批号：20190611-KB）在37°C下对细胞进行表面染色45分钟。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。200，荧光染料：PE-Cy7），得自eBioscience。为了检测黑色素瘤抗原特异性CD8 T细胞，使用Immudex的Melanoma Dextramer Collection 1试剂盒（目录：RX01，批号：20190611-KB）在37°C下对细胞进行表面染色45分钟。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。200，荧光染料：PE-Cy7），得自eBioscience。为了检测黑色素瘤抗原特异性CD8 T细胞，使用Immudex的Melanoma Dextramer Collection 1试剂盒（目录：RX01，批号：20190611-KB）在37°C下对细胞进行表面染色45分钟。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。使用Live / Dead Aqua（Invitrogen）将死细胞排除在分析之外。使用BD Accuri C6（BD Biosciences），BD LSRFortessa X-20（BD Biosciences）或BD FACSARIA FUSION（BD Biosciences）获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。门控策略显示在补充图中。 6A，6B。测试了右旋聚合物结合的TIL是来自HLA-A * 02阳性肿瘤的TIL（补充数据 7），可提供具有MART-1，gp100和NY-ESO-1的商业右旋聚合物：UM1，UM2，UM9，UM11，UM13 ，UM21，UM22，UM24，UM25，UM26，UM27，UM29，UM30，UM31和UM32。具有对这些抗原具有反应性的TIL的样品显示在图 4b中，而其余的没有显示反应性的迹象。
|
|
