DNA损伤调节自噬调节剂1（DRAM1）是自噬和细胞死亡的应激诱导调节剂。DRAM1与癌症，心肌梗塞和传染性疾病有关，但对该跨膜蛋白的分子和细胞功能了解甚少。以前，我们已经提出DRAM1作为结核病（TB）的宿主抗性因子和宿主定向抗感染治疗的潜在靶标。在这项研究中，我们生成了一个斑马鱼dram1突变体，并研究了其在结核分枝杆菌研究中广泛使用的分枝杆菌分枝杆菌（Mm）感染过程中的功能丧失作用。与先前的击倒分析一致，dram1突变增加了斑马鱼幼虫对Mm感染的敏感性。RNA测序揭示了Dram1缺乏对Mm感染期间代谢，免疫反应和细胞死亡途径的主要影响，而在未感染条件下，对蛋白酶和代谢途径的影响很小。此外，不受挑战的dram1突变体未显示明显的自噬缺陷，但在不存在Dram1的情况下降低了Mm的自噬靶向。dram1中巨噬细胞的吞噬能力突变体未受影响，但含Mm的囊泡的酸化作用大大降低，表明Dram1是吞噬体成熟所必需的。通过体内成像，我们观察到Dram1缺陷型巨噬细胞不能在感染的早期阶段限制Mm。导致的细菌负担增加可以通过敲低炎症性胱天蛋白酶a（caspa）和加德明Eb（gsdmeb）来恢复，这表明焦磷酸化是dram1中受Mm感染的巨噬细胞过早死亡的潜在机制。突变体。总体而言，这些数据表明，在不存在Dram1的情况下，由于含分枝杆菌的囊泡成熟度降低，细胞内封闭失败以及随后感染的巨噬细胞的热解性死亡，促进了斑马鱼幼虫中分枝杆菌感染的传播。这些结果提供了新的证据，表明Dram1在宿主对细胞内感染的抗性中起着重要作用，在自噬和细胞死亡的十字路口起作用。
自噬是一种细胞内降解机理当动态平衡被扰动，其功能是维持内环境稳定和与相交的细胞死亡程序的启动1，2。自噬可由多种应激源诱导，例如营养缺乏和紫外线损伤，以及感染。通过先天免疫系统检测微生物入侵者，将激活自噬机制，以捕获双膜自噬体中的细胞内病原体，并将其靶向溶酶体降解3。当病原体被吞噬细胞吞噬时，自噬蛋白也可以募集到单膜区室3。这些自噬防御机制形成有希望的目标为新颖宿主定向疗法的发展为感染性疾病，其中有许多是目前由抗生素耐药性的增加发生复杂4，5。对于全球最致命的传染病结核病（TB）尤其如此。人结核病或TB样疾病的变温动物的病原体结核分枝杆菌（MTB）和海洋分枝杆菌（MM），被广泛研究，以提高自噬中的作用的理解宿主防御3，6，7，8，9，10。
DNA损伤调节自噬调节剂1（DRAM1）是自噬和细胞死亡的应激诱导调节剂。DRAM1和DRAM家族的其他成员已与癌症，心肌梗死，HIV感染，和肺结核，但它们的分子和细胞功能仍然知之甚少6，11，12，13，14，15，16。在五个DRAM家族成员中，人类DRAM1首先被鉴定为p53诱导的蛋白，主要定位于溶酶体并促进自噬通量以及紫外线损伤诱导的细胞凋亡11。响应分枝杆菌感染，由核因子κB（NFκB）诱导DRAM1转录，NFκB是调节免疫系统6的信号网络中枢。DRAM1在受感染的人类巨噬细胞中与Mtb共定位，是斑马鱼幼虫抵抗Mm感染的宿主抗性所必需的6。Mtb和Mm共享RD1毒力位点，这是ESX1依赖性从吞噬体逃逸到胞质溶胶17所需的。选择性自噬，依赖于泛素受体，如P62，可通过延迟逃跑过程或掩蔽胞质细菌抵消这种致病机制3，8。另外，已经表明选择性自噬可以将抗微生物的泛素化肽递送至含有细菌的隔室18。我们最近表明，选择性自噬受体需要控制毫米感染在斑马鱼和DRAM1的宿主保护功能需要在此感染模型P62 6，19。
分枝杆菌的胞质逃逸可能会加速宿主细胞死亡程序的启动8。在结核病中，被感染的巨噬细胞的死亡触发了其他巨噬细胞的吞噬作用，随后这些巨噬细胞也经历了细胞死亡，导致一系列细胞死亡事件和炎性感染灶的形成，称为肉芽肿20。因此，单个感染的巨噬细胞的命运是肉芽肿是否可以包含感染或促进感染传播的主要决定因素。先前已证明，分枝杆菌感染的巨噬细胞可经历多种类型的调节性细胞死亡，如凋亡，坏死性硬化和烧伤，导致不同的感染结果21。受感染的细胞凋亡被普遍认为是对分枝杆菌感染的主机保护防御机制，因此，毒力结核杆菌积极抑制细胞凋亡20，22，23。与此相反，坏死的和pyroptosis是产生炎性环境，其可以促进细胞外生长和疾病进展的细胞死亡的裂解形式24，25。
虽然我们以前的工作证明了Dram1在自噬防御分枝杆菌感染中的作用，但尚未探索其在结核病发病过程中调节细胞死亡的潜在意义。在这项研究中，我们生成了dram1突变斑马鱼线解决了这个问题。对突变鱼的分析表明，Dram1是含有Mm的囊泡成熟和限制Mm感染的巨噬细胞所必需的。如果没有功能性Dram1，受Mm感染的巨噬细胞会通过依赖于炎症性胱天蛋白酶a（Caspa）和Gasdermin eb（Gsmdeb）活性的机制过早死亡，这表明发生了凋亡。总体而言，我们的数据支持Dram1通过调节自噬靶向性和含Mm囊泡的成熟来防御分枝杆菌感染。在缺乏Dram1的情况下，被感染的巨噬细胞会迅速被细菌所负担，并引发焦细胞凋亡，从而导致感染的传播增加。
为了研究Dram1的宿主抗性功能，我们使用CRISPR / Cas9技术生成了一条斑马鱼突变体系（图S1a）。选定的dram1 ∆19n / ∆19n等位基因（指定为dram1 ibl53）包含一个21个核苷酸的缺失，并在第一个编码外显子中插入了两个核苷酸（图1a和S1b），这导致无法检测到Dram1蛋白的水平，这证明了这一点。代表无效等位基因（图1b）。该突变体与自噬报告基因Tg（CMV：GFP-map1lc3b）26或巨噬细胞标记Tg（mpeg1：mCherryF）27杂交到转基因品系，以下称为GFP-Lc3和mpeg1：mCherry。杂交杂合鱼的后代（dram1 + /Δ19n）严格遵循孟德尔遗传（图S1d，e），纯合突变体可育。体尺测量表明dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫之间没有明显的发育差异（图S1c）。此外，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析未揭示dram1突变对斑马鱼幼虫基础细胞死亡水平的影响（图1c，d）。在没有可检测到的发育畸变的情况下，我们着手研究dram1突变体对Mm感染的反应。与先前的击倒结果6一致，dram1 ∆19n / ∆19n幼虫对感染的敏感性显着提高（图1e，f）。此外，缺乏Dram1的幼虫显示出节间血管内部细菌的积累，表明细胞外细菌的生长（图1e）。我们检测到dram1 + / +和无关野生型之间的细菌负担没有差异，这表明遗传背景并未影响其对感染的敏感性（图1f）。）。接下来，我们表明，注射的DRAM1的mRNA可以挽救的感染易感性表型DRAM1 Δ19n/Δ19n，而控制mRNA的注射含有Δ19n缺失不能（图1克）。总的来说，我们对dram1 ∆19n / ∆19n斑马鱼幼虫的分析证实，Dmm1对于Mm感染期间的宿主防御是必需的。
斑马鱼dram1 / Dram1（ENSDARG00000045561 / ENSDARP0 0000066996.3）遗传和蛋白质域结构以及CRISPR / Cas9目标位点的示意图。Dram1（240个氨基酸）包含六个跨膜结构域（用方框表示，并用上面指出的氨基酸编号标记为T1-T6）。该基因的编码外显子为方框，内含子为实心黑线（内含子未按比例绘制）。显示了CRISPR / Cas9靶位点的位置和预测的截短蛋白的位置。b通过蛋白质印迹分析确认dram1突变。从4 dpf dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +中提取蛋白质样品幼虫（> 10个幼虫/样品）。用针对Dram1和肌动蛋白的抗体作为上样对照探查印迹。c尾部区域的代表性共聚焦显微照片显示在3 dpf的dram1∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫上进行TUNEL染色。比例尺，10μm。d在3 dpf（≥7个幼虫/组）的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫尾巴的指定区域中对TUNEL阳性细胞进行定量。数据由散点图和箱形图表示，如“方法”部分中所述。e受感染的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 +/- 3 dpi幼虫。箭头指示细菌在节间静脉中积累。˚F和克在3 dpi的细菌负担的定量DRAM1突变体，野生型同胞，和无关野生类型˚F或DRAM1和DRAM1 Δ19n的mRNA注射的个体克。的数据是从两个独立的实验（> 42幼虫/组用于积累˚F和> 62幼虫/对组克），并通过散射并如在方法部分中详细描述的箱图表示。
为了进一步开拓DRAM1 Δ19n/Δ19n表型，我们进行RNA测序。我们旨在确定基因表达网络中由功能性Dram1的缺乏引起的变化，而不是由突变体中感染水平的提高引起。因此，dram1Δ19n /Δ19n幼虫感染了两种不同剂量的细菌。与dram1 + / +相比，300 CFU的剂量导致较高的细菌负担，与150 FU的剂量相比，150 CFU的较低剂量导致与受300 CFU感染的dram1 + / +类似的细菌负担（图2a和S2a））。感染后4天的分析时间点（dpi）与分枝杆菌肉芽肿的形成和免疫应答的强转录激活有关28。主成分分析显示，感染Mm的幼虫和注射PBS的对照组之间以及dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +组之间存在明显差异（图S2b）。差异基因表达分析比较了PBS注射的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +组，结果表明在非感染条件下Dram1缺乏对基因调控网络的影响相对较小（图S2c）。基因本体论和基因集富集分析（GSEA）显示，未感染的dram1突变体中这些相对较小的转录组差异与代谢和蛋白水解途径的变化有关（表S1）。在毫米感染，我们发现受感染的野生型幼虫显示基因差异表达的显着水平（包括上调和下调的基因）相比，他们PBS注射野生型对照，与先前的结果一致28。相反，当将感染的dram1Δ19n /Δ19n突变体与注射PBS的突变体对照进行比较时，基因调节网络的变化不太明显，而不论它们感染了150还是300 CFU（图S2c））。
a已通过RNAseq分析的不同CFU剂量的Mm注射的幼虫的细菌负担。数据是从三个独立的样本集中以4 dpi（> 42个幼虫/组）累积的，并由散布图和箱形图表示，如方法部分所述。b Venn图显示了感染了Mm的幼虫的转录组中KEGG途径明显富集。富集比较是在dram1 ∆19n / ∆19n 150 CFU与dram1 ∆19n / ∆19n PBS，dram1 ∆19n / ∆19n 300 CFU与dram1 ∆19n / ∆19n以及dram1 + / + 300 CFU与dram1 + //之间进行的+ PBS。C裂解细胞死亡信号通路转录组的可视化显示受感染dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +的转录组中的响应不同。该途径改编自KEGG途径坏死病。在可视化中，比较dram1 ∆19n / ∆19n 150 CFU与dram1 ∆19n / ∆19n PBS，dram1 ∆19n / ∆19n 300 CFU与dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / + 300 CFU 的基因表达与dram1 + / +PBS用颜色梯度表示（黄色，上调，蓝色下调）。绘制RNA测序中存在的该途径所有基因的表达，与它们的重要性无关。虽然凋亡途径的效应基因没有显示出高表达变化，但来自裂解细胞死亡形式的基因（包括焦磷酸化）却显示出了高表达调节。
虽然之间的差异DRAM1 Δ19n/Δ19n在两个感染剂量中观察到的突变体和对照，感染了300突变体的转录响应CFU表明更多的重叠比感染了150 CFU突变体感染的控制，尽管其较高的细菌负荷。例如，虽然与宿主防御途径相关的基因（例如Nod样受体（NLR）信号传导，吞噬体相关过程，细胞因子信号传导和凋亡）的表达在所有受Mm感染的幼虫中均受到影响，但在其他免疫相关途径中却受到影响像Toll样受体（TLR）和RIG-I样受体信号一样，在感染了150 CFU Mm的dram1 ∆19n / ∆19n幼虫中未受到影响（图2b））。与其他两组相比，这种差异可能反映出只有一半接种量的针对感染的较轻的初始免疫反应。尽管这样，〜于感染应答基因的60％DRAM1 + / +（1170总分1971）没有差异表达DRAM1 Δ19n/Δ19n突变体（图S2d的）。dram1 ∆19n / ∆19n幼虫中明显缺乏与能量和碳代谢相关的代谢途径（例如，糖酵解，TCA循环）改变，这是分枝杆菌感染的特征29（图2b）。相比之下，感染DRAM1 Δ19n/Δ19n含有300 CFU的人影响了与其他代谢过程相关的基因的表达，例如胆固醇和氨基酸的生物合成（图2b）。为了进行进一步的分析，我们比较了三个受Mm感染组的基因差异表达，该差异表达是相关的《京都议定书基因和基因组百科全书》（KEGG）途径的一部分，与它们各自的对照相比。在TLR信号的KEGG途径中，可视化显示了野生型和dram1突变感染组之间几种TLR和下游基因的差异表达（图S3））。在与细胞死亡相关的KEGG途径中，Dram1缺乏症影响了感染过程中程序性细胞死亡的调控，从而导致涉及细胞死亡的裂解形式的基因表达增强（图2c）。
dram1突变体中代谢途径的改变可能是对自噬缺陷的补偿性反应。调查GFP-LC3斑点作为自噬体形成一个标记分析之间没有差别DRAM1 Δ19n/Δ19n和DRAM1 + / +不成问题的条件（图下幼虫3A）。但是，当我们施加细胞应激因子Bafilomycin A1（BafA1）时，与dram1 + / +相比，dram1Δ19n /Δ19n幼虫的反应不同，其积累的自噬体（Lc3-II）中掺入的GFP-Lc3和Lc3含量更高。抑制液泡H + ATPase（V-ATPase）阻止自噬溶酶体成熟（图3b，c）。一致的是，自噬30的底物泛素结合受体，p62和Optineurin的蛋白质水平在未受到挑战的dram1 ∆19n / ∆19n幼虫中未受影响，但与BafA1处理后的dram1 + / +水平相比有所升高（图。3D）。到BafA1处理类似，MM感染诱导的LC3-II到更高的水平在DRAM1 Δ19n/Δ19n比DRAM1 + / +（图3E）。但是，GFP-LC3和毫米之间的共定位分析表明，DRAM1 Δ19n/Δ19n幼虫显示的显著少GFP-LC3阳性毫米簇相比DRAM1+ / +（图3f，g），表明尽管Lc3-II积累总体增加，但在缺少Dram1的情况下Mm的自噬靶向性降低。综上所述，dram1突变体在不受挑战的条件下未显示明显的自噬缺陷，但在对细胞应激（包括Mm的细胞内感染）的自噬反应中受到影响。
a，b在未经刺激的情况下（基础自噬，a）并在BafA1处理后b，在dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫中的GFP-Lc3斑点的定量共聚焦显微照片和定量。每个幼虫在尾鳍的预定区域（≥11个幼虫/组）成像。结果是从两个独立的实验中累积的，分别由“方法”部分详细介绍的散点图和箱线图表示。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。比例尺，10μm。查找表（LUT）的强度校准栏显示在面板a中。c–e自噬的蛋白质印迹分析。从4 dpf dram1Δ19n /Δ19n和dram1 + / +幼虫（> 10个幼虫/样品）中获取蛋白质样品。在不存在或不存在BafA1，c和d或不存在Mm e的情况下，检测到Lc3 c和e或p62和Optineurin d蛋白水平。肌动蛋白被用作加载对照。Western Blot重复3个，c和d或两个e提取自独立实验的蛋白质提取物。相对于对照样品归一化的Lc3II /肌动蛋白或p62 /肌动蛋白和最佳神经元/肌动蛋白比率在印迹下方显示。f–g具有代表性的共聚焦显微照片，以及在受感染的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫中与Mm簇共定位的GFP-Lc3共定位。顶部图像˚F显示成像的整个区域，而底部图像˚F '和˚F在“MM簇的GFP-LC3的共存显示详情DRAM1 Δ19n/Δ19n和DRAM1 + / +幼虫。箭头指示GFP-Lc3阳性Mm簇。数据来自两个独立的实验（≥15个幼虫/组），并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。比例尺，10μm。
我们想排除的是，与Mm相关的GFP-Lc3减少可能是巨噬细胞吞噬作用缺陷的结果，巨噬细胞是细胞内Mm生长的主要利基[ 31]。首先，我们验证了Dram1缺陷并没有改变由mpeg1：mCherryF标记的巨噬细胞的总数（图4a）。同样，对斑马鱼幼虫的其他主要先天免疫细胞群中性粒细胞也没有影响（图4b）。接下来，我们评估了静脉注射Mm后1小时的吞噬活性。结果显示Mm被dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +中的巨噬细胞吞噬以相似的速率，如细胞内Mm的百分比所示（图4c）。然后，我们确定在感染期间的哪个时间点，首先检测到dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +之间的细菌负荷差异。我们发现Dram1缺乏症在2 dpi时显着增加Mm感染负担，但在1 dpi时尚未显着增加（图5a）。总之，这两种DRAM1 Δ19n/Δ19n和DRAM1 + / +可吞噬的Mm在第一小时内感染后的注射剂量，和DRAM1缺陷幼虫的免疫功能低下的状态第一变得明显在2天后。
整个尾巴区域中巨噬细胞的代表性立体显微照片以及该区域中巨噬细胞数量的量化。从杂交的dram1 + / ∆19n动物中获得3 dpf dram1Δ19n /Δ19n和dram1 + / + / mpeg1：mCherryF幼虫，并在确定基因型之前对每个幼虫的巨噬细胞计数。通过PCR和Sanger测序（≥28个幼虫/组）进行基因分型。数据来自两个独立的实验，并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。b遵循免疫组织化学过氧化物酶活性检测方案的3 dpf dram1Δ19n /Δ19n和dram1 + / +幼虫的整个尾部的代表性立体图像。每个幼虫（≥18个幼虫/组）对该区域中性粒细胞的数量进行定量。数据来自两个独立的实验，并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。c受感染的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +卵黄囊上方血液循环中巨噬细胞的典型共聚焦显微照片感染后1 h（hpi）在mpeg1：mCherryF背景中的胚胎。比例尺，10μm。1 hpi巨噬细胞对Mm的吞噬作用进行定量。mpeg1：mCherryF背景中的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +胚胎在30 hpf感染Mm，并在1 hpi固定。确定每个单个幼虫（≥16个幼虫/组）中具有吞噬Mm簇的巨噬细胞的百分比。结果是从两个独立的实验中累积的，分别由“方法”部分详细介绍的散点图和箱线图表示。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。
1和2 dpi时dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / + 的 Mm细菌负担。数据是从两个独立的实验（> 38个幼虫/组）中收集的，并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。b以1 dpi 对受感染的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +胚胎进行LysoTracker染色的共聚焦图像。箭头指示Lysotracker阳性（LysoTracker +）Mm簇。比例尺，10μm。c LysoTracker的百分比+在1 dpi的感染胚胎（≥15个胚胎/组）中确定Mm簇。确定每个感染的幼虫对LysoTracker染色呈阳性的Mm簇的百分比（LysoTracker +）。数据来自两个独立的实验，并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。d和f在mpeg1：mCherryF背景下受感染的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +胚胎/幼虫在1 dpi d和2 dpi f下的代表性共聚焦图像。对固定胚胎或幼虫的整个CHT区域进行成像。箭头指示细胞内Mm簇，星号（*）指示死的巨噬细胞残留物。比例尺，10μm。e和g限制在1 dpi e和2 dpi g（≥10个胚胎/组）的巨噬细胞内的Mm簇的百分比。确定每个单个胚胎的细胞内Mm簇的百分比。数据来自两个独立的实验，并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。
由于Dram1蛋白定位于溶酶体11，我们询问Dram1缺乏症是否影响了含Mm囊泡的成熟。我们使用LysoTracker来确定感染早期（1 dpi）之前Mm与酸性囊泡之间共定位的程度，然后才能检测出细菌负担的差异。在dram1 + / +中，大约60％的Mm簇为LysoTracker阳性，而在dram1 ∆19n / ∆19n中，这一浓度降低至20％（图5b，c）。接下来，我们问是否降低含Mm的囊泡的成熟度会限制dram1 ∆19n / ∆19n中巨噬细胞的能力宿主抵抗感染。我们发现，对于dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +主机，在1 dpi时，大多数Mm簇都被限制在巨噬细胞内部（图5d，e）。然而，在2 dpi时，大多数Mm（65％）驻留在dram1 + / +的巨噬细胞内部，而我们观察到dram1 ∆19n / ∆19n幼虫中Mm从巨噬细胞的逃逸增加，只有31％保留在细胞内（图。图5F，G）。此外，我们经常在dram1 ∆19n / ∆19n中的细菌簇附近观察到死亡巨噬细胞的残留物（图5f）。），最有可能在巨噬细胞死亡之前被包含在其中。在一起，这些数据表明Dram1是巨噬细胞遏制感染和防止细胞外细菌生长所必需的。
转录组分析表明，Dram1缺乏会影响裂解细胞的死亡途径，包括坏死病和发烧，而对细胞凋亡途径的影响相对较小。划定负责在MM-感染巨噬细胞的增加的细胞死亡的机理DRAM1突变体，我们进行了TUNEL染色，其检测DNA损伤同时存在于细胞凋亡和细胞pyroptotic 32，33。我们在dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +中都观察到Mm簇周围的TUNEL阳性细胞，但突变体中的频率大约高2.1倍（图6a，b）。我们观察到在活化（裂解）没有差异胱天蛋白酶3，细胞凋亡的重要执行者的34，35之间，DRAM1 Δ19n/Δ19n和DRAM1 + / +以mM感染的存在或不存在（图6C）。因此，我们询问被Mm感染的巨噬细胞dram1Δ19n/Δ19n增加的细胞死亡是否是由于细胞凋亡引起的。Pyroptotic细胞死亡与炎性胱天蛋白酶，胱天蛋白酶样1和Caspase 4/5/11的活性相关，并且其特征在于Gasdermin的形成孔在细胞膜36，37，38。我们最近发现，胱天蛋白酶A（CASPA）是胱天蛋白酶家族成员是通过Gasdermin EB（Gsdmeb）在斑马鱼MM-感染的巨噬细胞的诱导pyroptosis 39，40。因此，我们分析了2dpf时的Caspa活性，这是我们在dram1 ∆19n / ∆19n中观察到细胞死亡增加的时间点。与未感染的突变体相比，我们检测到受Mm感染的dram1Δ19n/Δ19n中整个幼虫Caspa水平有轻微但显着的增加，但是在dram1 + / +中未观察到这种依赖于感染的增加（图6d）。接下来，我们问是否缺乏Dram1的幼虫增加的细菌负担是否取决于Caspa活性。击倒caspa减少dram1 + / +中的细菌负担。此外，CASPA敲低也降低的增强细菌负荷DRAM1 Δ19/Δ19，带来在突变体和野生型感染的负担相当低的水平（图6E）。同样，gsdmeb的组合降低了dram1 + / +中的细菌负担，并挽救了dram1 ∆19 / ∆19的高敏感性表型（图6f）。总体而言，这些数据表明，在不存在Dram1的情况下，由于减少了细菌的包容并导致受感染的巨噬细胞发生热解，因此促进了斑马鱼胚胎中分枝杆菌感染的传播。
a dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫在2 dpi 时TUNEL染色的代表性共聚焦图像。拍摄了固定的2 dpi dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫的整个CHT区域。比例尺，10μm。b量化dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +幼虫中TUNEL染色阳性的Mm簇百分比（TUNEL +）。Mm集群的百分比TUNEL +每个受感染的幼虫（≥12个幼虫/组）在CHT区域中检测到。数据来自两个独立的实验，并由散点图和箱线图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。c在dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +胚胎中检测pro-Caspase 3和裂解的Caspase 3蛋白。从4 dpf受感染和未感染的dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +中提取蛋白质样品幼虫（> 10个幼虫/样品）。用针对Caspase 3的抗体和肌动蛋白作为上样对照探测蛋白质印迹。数据代表两个独立的实验。d检测dram1 ∆19n / ∆19n和dram1 + / +胚胎中的半胱天冬酶活性（YVAD-AFC）。从2个dpf对照和感染的dram1Δ19n /Δ19n和dram1 + / +胚胎在GFP-Lc3背景中获得蛋白质样品（每个样品35个胚胎）。数据是从两个独立的实验中累积的（n = 4个样本/条件）。击倒dram1中的caspa后2 dpi的e Mm细菌负担∆19n / ∆19n和dram1 + / +胚胎。数据是从两个独立的实验（> 44个幼虫/组）中收集的，并由散布图和箱形图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。f在敲除dram1 ∆19n / ∆19n和dram1+ / +胚胎中的gsmdeb之后，在2 dpi时的Mm细菌负担。数据来自两个独立的实验（> 56个幼虫/组），并由散点图和箱形图表示，如“方法”部分中所述。ns不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001突变的dram1。
溶酶体蛋白DRAM1 / Dram1在多种应激条件下调节自噬和细胞存活/死亡决定，包括癌症和感染等疾病。它的作用机理在很大程度上仍然未知。在这里，我们已经证明斑马鱼中的dram1突变会削弱对分枝杆菌感染的抵抗力。我们显示，Dram1缺乏症减少了Mm的自噬目标和含Mm的囊泡的酸化作用，最终导致感染的巨噬细胞的焦烧死亡，并在感染的早期增加了分枝杆菌的细胞外生长。
通过转录组分析对本研究产生的dram1突变体进行了表征。在不受挑战的条件下，我们发现Dram1的缺乏会在很大程度上影响基因调控网络，在蛋白酶和代谢途径方面存在可检测的差异。考虑到溶酶体在信号转导中起着中心调节单元的作用，这种转录反应可能是由于Dram1 41缺乏而导致的溶酶体功能缺陷的补偿机制。响应Mm感染，代谢途径基因的差异表达显着增强。最近的研究表明，巨噬细胞的代谢状态对其固有的宿主防御功能至关重要42。因此，新陈代谢异常dram1突变体可能有助于其对Mm感染的高度敏感性。在dram1突变体中必需的先天免疫信号传导途径（包括TLR信号传导）的调控改变也可能有助于这种表型。最后，裂解细胞死亡途径中基因的上调表达可能会导致病理性炎症，并且与dram1突变体中增加的细菌负担相一致。
DRAM1作为自噬调节剂的功能已在体外进行了很好的研究11。因此，我们测试了斑马鱼dram1突变体是否在自噬过程中显示缺陷。自噬是宿主对各种压力因素（包括饥饿）的反应。直到5 dpf的斑马鱼幼虫都可以依靠其卵黄蛋白获取营养43，因此我们假设它们的自噬过程不会在其发育阶段的正常水平以上被激活，除非由诸如感染等应激源触发自噬。一致地，当我们比较未感染的dram1的自噬活性的基础水平时，我们没有发现任何差异4 dpf突变幼虫与其野生型同胞的幼虫。该发现与对小鼠DRAM1 44的功能的体外研究一致，该研究表明，在原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中不存在DRAM1的情况下，基础自噬没有改变。缺乏DRAM1不会改变饥饿或阻断mTOR 45时自噬的诱导。但是，缺乏DRAM1会影响线粒体抑制剂3-硝基丙酸（3-NP）46诱导细胞应激后人类细胞（HeLa和A549）中自噬的激活。此外感染，DNA损伤，并干扰能量代谢6，11，14仍然有待进一步研究哪些压力因素可以在体内和体外激活DRAM1 / Dram1。
BafA1阻止dram1突变体幼虫中的自噬通量表明GFP-Lc3点和Lc3-II蛋白水平增加。所述DRAM1突变体也毫米感染的条件下，积累高于对照LC3-II蛋白水平。在BafA1治疗或感染期间对斑马鱼幼虫施加的长期胁迫条件可能会导致dram1突变体产生代偿性反应，从而产生更多的自噬体。重要的是，尽管受感染的dram1突变体中Lc3-II水平增加，但在GFP-Lc3转基因鱼中的成像显示，自噬囊泡靶向分枝杆菌的频率降低了dram1中近三倍突变体与野生型斑马鱼幼虫相比。Mm的这种自噬靶向性降低不是由于斑马鱼巨噬细胞具有不同的吞噬能力。但是，我们确实发现Dram1缺乏症降低了含Mm囊泡的酸化作用，这与被感染的巨噬细胞过早死亡有关。导致斑马鱼感染的分枝杆菌负担增加，与细胞外生长的Mm 47的扩增增加相一致。尽管我们发现在缺乏Dram1的情况下，受Mm感染的巨噬细胞死亡的速度更快，但人类DRAM1已被证明可以触发溶酶体膜通透性和HIV感染的CD4 +细胞死亡T细胞，从而降低病毒复制（14）。总之，这些研究表明DRAM1 / Dram1表达水平可能对感染过程中的细胞死亡过程产生重大影响，根据细胞类型和感染因子的不同，其结果也不同。
先前显示DRAM1通过阻断促凋亡蛋白Bax 12的降解来介导凋亡，但在我们的感染研究中未观察到Dram1缺乏对凋亡的影响。令人惊讶的是，我们发现Dram1缺乏导致感染过程中炎性caspase活性增加和加德明依赖的焦细胞凋亡。以前的研究显示，pyroptosis可以通过不同的病原体和形式来诱导的关键机制，以限制微生物感染48，49。本着这一精神，也有证据通过不同机制感染的巨噬的是分枝杆菌抑制pyroptosis 50。然而，最近的研究发现，溶解细胞死亡（pyroptosis和坏死的）帮助分枝杆菌逃避宿主免疫和传播感染25，51。确实，在本研究中，我们发现，在Dram1缺陷型斑马鱼宿主中，焦细胞凋亡会促进分枝杆菌的扩增。另外，胱天蛋白酶和Gasdermin的Eb的遗传抑制可以抢救加剧了细菌生长DRAM1突变，证实高热表型是造成细胞凋亡而不是坏死性坏死的原因。两者合计，被感染的巨噬细胞的死亡与结核病的发病机理有千丝万缕的联系，并可能导致斑马鱼宿主中感染的传播增加或受到限制。上面讨论的有关不同细胞死亡方式的有益或有害作用的相互矛盾的证据表明，不同细胞死亡方式之间的平衡在确定感染的结果以及仔细鉴定特定类型的细胞死亡中起着至关重要的作用。进行研究对于更好地了解结核病发病机制至关重要。
总之，在感染初期限制感染的巨噬细胞中的分枝杆菌需要功能性Dram1。在这项工作中，我们已经表明Dram1参与了几个重要的过程，这些过程对于防御细胞内病原体很重要，可能在自噬调节，溶酶体功能和调节的细胞死亡之间提供了一个交集。需要进一步的研究来精确阐明溶酶体蛋白Dram1 / DRAM1在该网络中的作用。使用针对结核病早期阶段的体内模型，我们已经证明了Dram1对于消除细胞内分枝杆菌和感染巨噬细胞的细胞命运的重要性。
本研究中的斑马鱼品系（表S2）是根据莱顿大学动物福利机构（许可证号：10612）监督的当地动物福利法规进行处理的，并根据标准协议进行维护（zfin.org）。dram1的生成莱顿大学动物实验委员会（UDEC）根据协议14198批准了该突变体。所有实验均在受精后最多5天的胚胎或幼虫上进行，但尚未达到自由喂养阶段。将胚胎/幼虫保存在20.00°C的含0.003％1-苯基-2-硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）的蛋水中（60 µg / ml速溶海盐），并用0.02％3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（ Tricaine（Sigma-Aldrich）用于细菌注射，成像和固定之前的麻醉。
使用chop-chop网站52设计靶向斑马鱼dram1的第一个编码外显子的短链RNA（sgRNA），并通过PCR互补和扩增全长ssDNA寡核苷酸（Sigma-Aldrich，表S3）来生成19。对于sgRNAs的体外转录，0.2微克模板DNA用于产生sgRNAs使用MEGA短脚本® T7试剂盒（AM1354，赛默飞世）和通过的RNeasy Mini洗脱清理试剂盒（74204，Qiagen）纯化。该Cas9的mRNA使用mMESSAGE mMACHINE转录®从Cas9质粒（39312，Addgene）获得SP6转录试剂盒（AM1340，ThermoFisher），并用RNeasy Mini Elute Clean up试剂盒（74204，Qiagen）纯化。将sgRNA和Cas9 mRNA的混合物注入单细胞阶段AB / TL胚胎（sgRNA 150 pg /胚胎和Cas9 mRNA 300 pg /胚胎）。通过PCR和Sanger测序证实了CRISPR注射的效果。使用以下引物，通过PCR扩增目的基因组区域来进行基因分型：正向：5'-AGTGAACGTCCGTGTCTTTCTT-3'，反向：5'-ACATCTTGTCGATACAAAGCGA-3'；随后进行Sanger测序以鉴定突变（Base Clear，荷兰）19。
使用Qiazol试剂（79306，QIAGEN）根据制造商的说明从三个独立的杂交中从5 dpf感染和未感染的速冻幼虫（20幼虫/样品）中提取总RNA，并用RNeasy Mini试剂盒（74104，QIAGEN）提取。使用2100生物分析仪（美国安捷伦）对RNA进行定量。在Hiseq2500中使用Illumina单次读取50 nt电泳对每个样品进行至少1000万次读取测序。测序，映射所述读取抵靠D.鱼GRCz10.80参照基因组和读取计数由ZF-屏幕（莱顿，荷兰）进行。在运行R 3.4.3 54的 RStudio 1.1.383 53中对计数库进行了分析使用内部脚本（可从github.com/gabrifc获得）。使用edgeR软件包v3.20.7 55中提供的工具对样品进行了初始质量检查。通过使用DESeq2 v1.18.1 56的成对比较评估差异基因表达。经FDR调整的p值（adjpval）<0.05的基因被认为具有统计学意义。Venn图是使用R包VennDiagram v1.6.18 57创建的。使用已发布的函数“ -log 10（adjpval）* log 2（倍数变化）”对基因列表进行排名，与使用GSEA v3.0 58从分子特征数据库（MSigDB）收集的C2“计算的基因集”进行比较。使用goseq v1.3.0分析基因本体富集59。Zv10程序集的更新的基因长度和基因本体论数据分别从ensembldb v2.2.1 60和biomaRt v2.34.2 61包从Ensembl检索。必要时，还可以使用biomaRt v2.34.2在不同数据库基因标识符之间进行映射。使用limma v3.34.5 62中提供的kegga功能执行KEGG通路分析。重要路径的基因调控数据已通过pathview v1.18.0 63可视化。原始数据以登录号GSE129035存入Gene Expression Omnibus。
如先前所述进行蛋白质印迹分析19。使用的抗体如下：多克隆兔抗DRAM1（N末端）（1：1000，ARP47432-P050，Aviva系统生物学），多克隆兔抗Optineurin（C末端）（1：200，批次＃100000；开曼化工），多克隆兔抗p62（C端）（1：1000，PM045，批次＃019，MBL），多克隆兔抗Lc3（1：1000，NB100-2331，批次＃AB-3，Novus Biologicals） ，单克隆Caspase 3抗体（1：1000，＃9662，Lot＃12，细胞信号转导），抗单和多泛素化缀合物小鼠单克隆抗体（1：200; BML-PW8810-0100，批号01031445，Enzo life Sciences） ，多克隆肌动蛋白抗体（1：1000，4968S，lot＃3，细胞信号），抗兔IgG，HRP链接的抗体（1：1000，7074 S，Lot＃0026，细胞信号），抗小鼠IgG，HRP连接抗体（1：3000，7076S，Lot＃029，Cell Signaling）。
毫米应变M或毫米应变20 mWasabi或mCherry的，分别荧光标记64，65，在28 HPF如前所述显微注射入血液岛胚胎66。除吞噬作用分析（500 CFU）以及感染的野生型（300 CFU）和dram1突变体（150和300 CFU）的RNA测序外，所有实验的注射剂量均为200 CFU 。注射前用镊子将胚胎手工去绒毛。使用配备DFC420C彩色相机的Leica MZ16FA立体荧光显微镜对受感染的胚胎成像，并使用先前描述的软件67从单个胚胎立体荧光图像中获得每只被感染鱼的细菌像素数。。
将固定的或活的胚胎用1.5％低熔点琼脂糖（140727，SERVA）固定，并使用Leica TCS SPE共聚焦显微镜成像。为了量化GFP-Lc3阳性囊泡的数量，通过共聚焦显微镜用×63水浸物镜（NA 1.2）在预定的尾鳍区域对固定的4 dpf幼虫成像，以检测GFP-LC3阳性的数量。阳性囊泡（图3a，b）。GFP-Lc3囊泡的数量通过Fiji / ImageJ软件测量（图3a，b）68。为了量化针对Mm团簇的自噬反应（图3f，g），通过共聚焦显微镜用40倍水浸物镜（NA 0.8）在整个尾部造血组织（CHT）区域对固定的2 dpi幼虫成像。使用相同的方法来量化CHT区域中Mm的酸化（图5b，c）。为了研究细菌的巨噬细胞内或细胞外定位，如上所述，再次在CHT上对固定的幼虫进行成像，然后对Mm簇的总数和巨噬细胞内部的簇数进行计数。为了测定细胞死亡，如上所述获得来自固定的2 dpi幼虫的图像，并且手动计数CHT区域中TUNEL染色阳性的细胞数目。
使用QIAzol裂解试剂（79306，QIAGEN）从野生型或dram1 ∆19n / ∆19n胚胎中分离dram1或dram1 ∆19N（阴性对照）RNA ，并使用RNeasy MinElute纯化试剂盒（74204，QIAGEN）进行纯化。使用iScript cDNA合成试剂盒（1708891，BIO-RAD）进行cDNA合成。全长DRAM1 cDNA和DRAM1 Δ19N通过使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶（M0530S，New England Biolabs公司）进行PCR扩增获得的cDNA。使用了以下引物：正向：5'-CTGCGGCGAGATGTGTTTTGGTT-3'；反向：5'-CAAAAACAGTGGGACATACAGTGAA-3'。dram1或dram1 ∆19N将PCR产物连接到ZERO BLUNT TOPO载体（450245，ThermoFisher）中，并通过Sanger测序（Base Clear，荷兰）确认插入物。DRAM1和DRAM1 Δ19N的mRNA是使用SP6 mMessage mMachine试剂盒（AM1340，赛默飞世）和聚（A）加尾试剂盒（AM1350，赛默飞世）生成的; 使用RNeasy Mini Elute Cleanup试剂盒（74204，QIAGEN）纯化，并将50 pg mRNA显微注射到单细胞阶段的胚胎中。
通过末端脱氧核苷酸TUNEL染色，用原位细胞死亡检测试剂盒TMR红色（1256792910，SIGMA-ALDRICH）在2dpi固定的胚胎中检查细胞死亡。该测定方法如下：将胚胎在4°C的PBS溶液O / N中的4％PFA中固定，脱水，然后在甲醇（MeOH）（25％，50％，75％， 100％，75％，50％，25％），并在含0.1％Triton-X100的PBS中洗涤。然后，将胚胎在37°C的10μg/ ml蛋白酶K中渗透40分钟，然后在含0.1％Triton X100的PBS中快速漂洗。根据试剂盒说明O / N在黑暗中37°C进行TUNEL染色。洗涤样品并保存在PBST中，直到如上所述通过共聚焦显微镜成像。
将感染的胚胎与10μMLysoTracker Red DND-99（L7528，ThermoFisher）一起浸入鸡蛋水中1小时。成像前，将卵用蛋水洗涤3次。用白细胞检测试剂盒（390A，SIGMA-ALDRICH）进行Mpx活性测定，以检测嗜中性粒细胞，如先前所述69。
胚胎用浓度为100 nM的鸡蛋水稀释的Bafilomycin A1（BafA1）（BafA1）（B1793-10UG，SIGMA-ALDRICH）浴处理12小时。
如前所述，用荧光底物Z-YVAD 7-酰胺基-4-三氟甲基香豆素（Z-YVAD-AFC，Caspase-1底物IV，比色法，sc-311283，圣克鲁斯）测定炎症性胱天蛋白酶活性。70。将35个胚胎/组超声处理并在低渗细胞裂解缓冲液（25 mM 4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙烷磺酸，5 mM乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，将N'-四乙酸，5 mM二硫苏糖醇，pH 7.5）在冰上放置15分钟。对于每个反应，将10μg蛋白质与50μL反应缓冲液（0.2％3-[（3-苯甲酰氨基丙基）二甲基氨] -1-丙磺酸盐（CHAPS），0.2％的50μMYVAD-AFC）在28°C孵育90分钟。 M 4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙烷磺酸，20％蔗糖，29 mM二硫苏糖醇，pH 7.5）。温育后，在Tecan M1000酶标仪中测量荧光，激发波长为400，发射波长为505 nm。
先前验证的caspa和gsdmeb吗啉代（MO）71购自Gene Tools（美国Gene Tools）。MO寡核苷酸序列：CASPA 5'-GCCATGTTTAGCTCAGGGCGCTGAC-3'，gsdmeb MO 5'-TCATGCTCATGCTAGTCAGGGAGG-3' 71。如前所述（39），将MOs用0.05％酚红在Milli-Q水中稀释，并将1 nL 0.6 mM（caspa MO）或0.7 mM（gsdmeb）MO显微注射到单细胞期卵黄中（39）。
进行功率计算以确保实验中包括足够的动物，以能够检测出至少20％的效应大小。对于感染实验，将注射不当的动物排除在实验之外。最初选择后，没有动物被排除在分析之外。将野生型和突变型动物随机分布在不同的实验条件下，并在可能的情况下在数据采集和分析过程中应用盲法。使用GraphPad Prism软件（版本5.01； GraphPad）进行统计分析。所有实验数据（平均值±SEM）使用不配对的两尾曼恩-惠特尼U两组之间进行比较的检验，以及使用Dunn的多重比较方法进行的Kruskal-Wallis单向方差分析，作为两组以上进行比较的事后检验。（ns，无显着差异； * p <0.05； ** p <0.01； *** p <0.001）。对于F1或F3杂合子代的分离，使用卡方检验分析数据（ns，无显着差异）。连续测量以条形图表示。在非连续测量中，每个组的数据集以散点图（左）和箱形图（右）显示。在散点图中，每个数据点代表一个单独的胚胎/幼虫，其平均值由一条水平线表示。箱线图包含50％的数据点，垂直线表示95％置信区间，水平线表示中位数。
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