患有实体瘤的儿童，青少年和年轻人的全面种系基因组概况 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

与成人癌相比，针对儿童，青少年和年轻人的实体瘤的靶向治疗很少（C-AYA）。种系基因组特征的影响对遗传性有影响，但是其对靶向疗法的影响尚未得到充分认识。对1,507名患有实体瘤的C-AYA患者的种系DNA进行变体优先分析，我们显示这些患者中有12％在已知的癌症易感基因（KCPG）中携带种系的致病性和/或可能的致病性变体（P / LP）。另有61％的人在非KCPG基因中具有种系致病变异，包括PRKN，SMARCAL1，SMAD7，我们称为候选基因。尽管在广泛的基因谱系中存在种系变异，但途径分析仍导致围绕p53的顶级网络。我们的药物靶点分析显示，种系P / LP变异的患者中有1/3至少具有一种可药物改变，而其中一半以上来自我们的候选基因组，否则在常规临床治疗中将无法确定。

介绍

实体瘤占儿童，青少年和年轻的成年人（C-AYA），用体细胞变体的低负担恶性肿瘤的一半，被假定为有生殖系改变的频率较高，相较于实体瘤成人1，2。尽管在理解癌症中的体细胞变异方面已取得实质性进展，但我们对具有实体瘤的C-AYA中种系变异的频谱，频率和影响的了解有限。最近的全癌研究表明，被诊断为＜20岁的这些恶性肿瘤中，有7–8％的患者在已知的易癌基因中具有致病性或可能的致病性（P / LP）种系变异，其中肾上腺皮质癌（50％）且高在所有实体瘤中，变种百分比最高的重度神经胶质瘤（25％）。但是，这些百分比可能由于以下原因而存在偏差：在那些研究中，患有这些特定肿瘤类型的患者比例很高，而缺少一些其他亚型的儿科癌症患者。相反，张等人研究的对照组为1.1％。1个，2，3，4，由从1000基因组计划的健康成年个体，携带这样的变体。

易患癌症的基因主要编码肿瘤抑制因子，与DNA损伤有关，以确保DNA修复过程或致癌基因促进生长。一般来说，致病失功能在癌基因可能破坏正常细胞过程，以及易患癌症发展变体5 ; 此外，多个基因可以具有具有不同功能和表型作用的两种类型的变体。众所周知，种系癌症易感基因和体细胞肿瘤驱动基因之间存在重叠：有许多例子表明相同的基因分别在体细胞癌变和癌症易感性中起作用6。

在儿科和AYA诊所，家族史基本上是识别可能患有遗传性癌症患者的主要手段7。尽管有以前的研究表明，由于多重局限性，只有约40％的P / LP突变患者可以获得家族史的癌症2。现在也已经证实，在癌症易感基因中携带种系P / LP突变的C-AYA癌症幸存者中，继发原发性肿瘤的风险显着增加，而未携带这些子的患者8。。除了对遗传力和第二原发肿瘤的影响外，种系（在人体的每个细胞中）变体也可以提供新的治疗靶标。与肿瘤的异质体细胞模式相比，种系变异体的克隆性使其成为潜在的合适生物标志物和治疗靶标，与成年恶性肿瘤相比，这两者均缺乏C-AYA恶性肿瘤9。在这里，我们通过研究1507名29岁以下实体瘤患者的种系基因组特征来解决这一差距。

结果

克利夫兰诊所患者系列中的生殖细胞改变

我们评估了克利夫兰诊所（CCF）的50名前瞻性登记的C-AYA患者，这些患者被诊断为29岁以下的广泛实体瘤。该系列的中位年龄为12±7.1岁（范围0.5-29），包括31名儿童（女性52％，中位年龄8±4.2岁），12名青少年（男性66.7％，中位年龄18±1.2岁））和7个年轻人（均为男性，中位年龄为22±3.6岁）。这些患者总共有14种不同的肿瘤类型，其中骨和软组织肉瘤是主要的癌症类型（补充表 1；补充数据 1）。

首先，我们分析了204个已知的癌症易感基因（KCPG），除最近出版物中新提出的基因外，还使用先前建立的癌症易感基因进行了策划（补充数据 2；补充图 1）。我们在两名骨肉瘤患者中发现了三种致病种系变异体（方法），TP53中的一个无意义突变以及BRCA2和GJB2基因中的两个移码插入缺失，并通过Sanger测序进一步证实（表 1；图 1a，b；补充数据）。 3 ;补充图 2）。CCF P / LP KCPG变体的平均平均深度为258×（范围45×–444×）。使用外显子组覆盖率数据评估种系拷贝数变异（CNV），我们发现了5个具有种系重复的基因，包括DDX10和SUZ12（补充图 3；补充数据 4）。在基因组变体（DGV）数据库中的已识别区域中没有已知的CNV。在罕见的情况下，发现一名27岁的男性患有多个原发性肉瘤，其具有两种致病性KCPG变体，一种在BRCA2中（由父母遗传），另一种在TP53中（由父母遗传），后者证实了李弗劳梅尼综合征诊断（表 1）。父母双方都五十多岁，没有癌症史。我们的第二例代表病例是一名女性骨肉瘤患者，诊断为10岁，除DDX10生殖系重复外还携带GJB2的致病变异，后者是一种与体肉瘤预后不良相关的已知标志物（表 1 ;图1。 1c；补充图 3a）。总体而言，在50例患有实体瘤的C-AYA CCF患者中，有2个携带种系致病性KCPG变体，而其他3名C-AYA CCF患者则具有种系CNV。

表1已知癌症易感基因种系发生变化的CCF患者。

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对获得家史的家谱进行的评估表明，在其余42位患者中，约有40％（84％）存在阳性的家族癌症史。这表明KCPG突变阴性患者中尚存在尚未确定的易感基因。因此，我们扩展了分析范围，以探索非KCPG的其他P / LP变体，我们将其称为候选基因。我们基于ACMG指南的变体分类在89个候选基因中鉴定出59个预测的致病变异和37个预测的可能致病变异（图 1a，b；补充数据 3）。所有CCF P / LP候选变体的平均平均深度为163x（范围为20x-454x）。总体而言，其余45例患者中有34例（75.5％）的候选基因中至少有一种变异（图 1d）。与没有种系改变的组相比，具有种系改变的C-AYA患者趋向于不良结局，我们在操作上将其定义为任何复发，转移，第二原发恶性肿瘤（SMN）或死亡（图 1e）（P = 0.31，比值比（OR）= 2.14，95％置信区间（CI）= 0.6–8.0）。

为了用更大的独立系列验证我们的发现，然后我们分析了来自St. Jude（StJ）数据集的1457名患有实体瘤的C-AYA患者的种系外显子组数据。因为我们在StJ数据集中大致看到了与我们的CCF系列相似的突变模式，所以我们将CCF和StJ系列结合起来进行进一步的分析。合并的数据集包括1507名患者，中位年龄为6.41±5.8岁，其中包括1182名儿童（女性为50.7％，中位为5.2±4.5岁），164名青少年（男性为59.1％，中位年龄为16.8±1.3岁），20岁以下的年轻人成人（75％的男性，中位年龄为21±2.4岁），以及141位未知年龄组，被诊断患有29岁以下的实体瘤。最常见的肿瘤类型包括323例患者（21.4％）的CNS肿瘤，其次是207例患者的Wilms肿瘤（13.7％），190例患者的神经母细胞瘤（12.6％），和横纹肌肉瘤134例（8.9％）。与监测，流行病学和最终结果（SEER）计划中实体瘤的预测频率相比（http://seer.cancer.gov/iccc），我们的研究代表了威尔姆斯肿瘤，视网膜母细胞瘤和骨肉瘤的病例数过高（1.8-2.1倍），而生殖细胞瘤和肾上腺皮质癌的病例数却不足（两个倍）（表 2）。

表2患者的人口统计学和临床特征。

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已知癌症易感基因中的种系变异

在分析204 KCPG（方法；补充数据 2）时，我们在182例患者中发现了158个病原体和40个可能的病原体变体（占12％）。所有P / LP KCPG变体的平均平均深度为120倍（范围21倍-410倍）。P / LP KCPG变异体的平均变异等位基因分数为47％（±9.2）。致病变异包括53个移码插入缺失（37个缺失，16个插入），53个无意义，25个剪接位点，23个错义，3个起始缺失突变和1个框内缺失（补充数据 5 – 6；补充图 4）。。大多数可能的致病变异（37，92.5％）是错义突变（补充数据 5）。RB1（32例患者，其中53％具有无意义突变），NF1（22位患者，有41％的人无义突变），CHEK2（19位患者，有58％的移码缺失）和TP53（10位患者，有50％的错义突变）是54个突变中P / LP突变频率最高的基因基因组中的基因（图 2a，b）。所有这198个P / LP变体均属于具有常染色体显性（AD），常染色体隐性/常染色体显性（AR / AD）或X连锁显性（XLD）遗传模式的KCPG基因。由于我们仅鉴定出杂合性改变，因此我们排除了所有常染色体隐性KCPG变异体（补充数据 7）。在182位具有P / LP KCPG突变的患者中，有168位（92.3％）个体每个都只有一个P / LP KCPG变异。12名患者携带了两种P / LP KCPG变体，其中6名被诊断为视网膜母细胞瘤。我们有一名2岁的患有肾上腺皮质癌的男性患者，他在NTRK1，EP300和HMBS基因中具有三个P / LP KCPG变异体。我们的第二个病例具有三个P / LP KCPG变异体，是一名女性，在6岁时被诊断出患有CNS肿瘤，并携带NF1，LZTR1和RECQL基因变异体。经过20年的临床随访，她是没有SMN的癌症幸存者（补充数据 8）8。

图2：患有实体瘤的儿童，青少年和年轻人（C-AYA）的种系致病/可能致病（P / LP）突变分布。

候选基因中的种系变异

除了KCPG变体，我们在1173个候选基因中鉴定出1825个致病变体和896个可能的致病变体（图 2a，b；补充数据 9；补充图 5）。这包括另外925个（61％）具有预测病原体变异的患者和193个（13％）具有潜在病原体变异的患者。所有P / LP候选变体的平均平均深度为99x（范围为20x-1040x）。通过IVA分析，有111个（40％）的预计致病性变体和380（42％）的预计可能的致病性变体具有损失推断活性（补充数据 9）。候选P / LP变异体中的平均变异等位基因分数为47％（±9.4）。候选P / LP变体包括696个无义，418个剪接位点，377个移码插入/缺失（197个缺失，180个插入），1179个错义和51个框内插入/缺失（44个缺失，7个插入）（补充数据 9）。在我们数据集中的1173个突变的候选基因中，PRKN（23个患者），PAH和TYR（每个在17个患者中发现）以及EYS和TMPRSS3（每个在16个患者中发现）具有最高的P / LP变异体数量（图 2a）。，b ;补充数据 10 - 11）。作为对照，对来自Exome Aggregation Consortium数据集（ExAC）的53,105个人的数据进行了相同的变体分析，不包括属于癌基因组图谱（TCGA）的个人，即非TCGA ExAC数据集。总体而言，在我们的研究中，具有四个或更多个P / LP变异体的候选基因中，具有统计上显着的P / LP变异等位基因频率（OR = 4.3–247和无穷大，经Bonferroni校正的P值= 0.049至2.44×10 -17） C-AYA数据集相比，在非TCGA EXAC数据集（补充数据 12 - 13）。有趣的是，此百分比等于针对具有四个及更多P / LP变体的KCPG组与非TCGA ExAC数据集所计算的百分比（28％，优势比= 7.4–40.7，Bonferroni校正的P值= 0.039至3.16×10 −31）。

实体瘤类型的种系基因组特征

为了找到每种肿瘤类型的种系基因组特征，我们针对12种特定类型的实体瘤按肿瘤类型对种系数据进行了分类（每种肿瘤类型的样本范围为22至323例）。患有肾上腺皮质癌和高级别神经胶质瘤的个体每个样本的种系P / LP变体（组合的KCPG和候选基因）数量最多，分别为3.6和2.8，而每个样本的总P / LP变体为1.9。每个患者中有一半的ACT患者和45％的视网膜母细胞瘤患者至少携带一种KCPG P / LP变体。虽然每种类型的C-AYA实体瘤的有它自己的公知的相关种系KCPGs，我们报道了许多肿瘤类型（图意想不到KCPGs。 2 c和图3a ;补充数据 14 - 15）。例如，虽然TP53，PMS2和RET已被报道为尤因肉瘤个体生殖系发生改变的基因，但我们在ATM（1位患者），BRCA1（1），CHEK2（3），GJB2（ 1），尤因肉瘤病例中的LZTR1（1）和POLE（1）基因（补充图 6）。其他示例包括MEN1（1），BRCA2（1），PALB2（1），KIT（1），MPL（1），CDC73（1）和Wilm肿瘤患者中的COL7A1（4）。尽管RB1在我们的视网膜母细胞瘤病例中约三分之一发生了突变，但RB1突变阴性的视网膜母细胞瘤患者在其他已知的癌症易感基因如BRCA1（2），EGFR（1）和MSH6（1）中具有种系P / LP变异（图。 3A，3B）。

除了P / LP KCPG变体之外，我们还在候选基因组中证明了种系P / LP变体的有趣特征（图 3c，d）。例如，我们在患有CNS肿瘤（5），成视网膜细胞瘤（3）和软组织肉瘤（3）的患者中发现了丝氨酸蛋白酶家族成员TMPRSS3中的种系P / LP变体（图 3c，d）。另一个例子是在MCPH1中检测出种系P / LP变体，该变体在我们的三名Ewing肉瘤患者中编码DNA损伤反应蛋白。在三名骨肉瘤患者中检测到SMARCAL1中的胚芽 P / LP变体，这是与DNA损伤途径相关的另一种基因。SMAD7中的Germline P / LP变体在我们的六名高级神经胶质瘤患者中发现了与大肠癌和乳腺癌相关的基因。在我们的Wilms（6），CNS（5），神经母细胞瘤（4）和骨肉瘤（3）肿瘤患者中经常发现PRKN基因的种系功能丧失（图 3c，d）。表3列出了我们根据癌症与癌症的已知联系选择的最佳候选基因，以及它们的预测功能机制。

表3候选基因及其与癌症的关联的十个例子。

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最后，为了研究患有实体瘤的C-AYA患者在与其他常见非癌性先天性综合症相关的基因中是否存在任何种系改变富集，我们将我们的数据与185个先天性心脏缺陷（CHD）相关基因进行交叉匹配，发现在我们的患者中，有67名（4.4％）在一种常染色体显性遗传的冠心病相关基因（7个KCPG和19个候选基因）中携带至少一种P / LP变异体。另外72名（4.8％）患者携带常染色体隐性CHD相关基因（2 KCPG和31个候选基因）的杂合变异，由于其遗传方式，我们未将其包括在我们的分析中。患有CNS（32个变体），神经母细胞瘤（21个），横纹肌肉瘤（15个）和Wilms（15个）肿瘤的C-AYA患者的CHD相关基因变体数量最多， 7；补充数据 16）。

所有实体瘤的途径分析

由于我们注意到参与C-AYA实体瘤的KCPG和候选基因的谱非常广泛，因此我们接下来试图确定它们是否在任何常见途径上趋同。p53途径受影响的部分为0.5（6个基因中的3个）受到的影响最大，其次是受体酪氨酸激酶和Ras（RTK-RAS）途径受影响的部分为0.14（85个基因中的12个），Hippo途径受影响的部分影响为0.13（38个基因中的5个）（图 4a；补充数据 17）。候选基因明显参与了受影响的途径。例如，在RTK–RAS途径中，12个突变基因中有3个来自候选基因组，包括SHC1，ERBB3和FLT3（图 4b）。）。河马途径有四个受影响的候选基因，CRB1，CRB2，HMCN1和LATS1。在Wnt途径中，我们最近发现了一个KCPG，LZTR1，其他六个受影响的基因来自候选基因组：AXIN1，WNT10A，CHD8，FZD6，LRP5，RSPO1。尽管只有两个基因属于细胞周期通路，但RB1是这两个基因之一，在我们的数据集中具有32个病例（24个变体）中具有最高变异频率的基因（补充图 8）。

图4：患有实体瘤的儿童，青少年和年轻人（C-AYA）带有种系致病/可能致病（P / LP）变异的基因发生改变的途径分析。

除了对每个途径的直接影响外，我们还通过创造力途径分析（IPA）研究了突变基因之间的相互作用（补充数据 18）。仅使用数据集中至少具有四个变体的基因来生成我们的网络。IPA知识数据库中目标基因与分子之间的联系构成了该网络构建的基础。我们的IPA预测的顶层网络包含以p53为中心的26个基因（10个KCPG和16个候选基因）（右尾费舍尔精确检验P = 1×10 -42；图 4c））。预计受此网络影响的主要疾病和功能是代谢疾病，机体伤害和异常以及癌症。我们的分析表明，受目标基因影响最大的经典途径是通过同源重组修复DNA双链断裂（重叠28.6％，Benjamini-Hochberg（B-H）校正为P = 2.08×10 -3），BRCA1在DNA损伤反应（11.2％重叠，B–H校正的P = 5.82×10 -5），以及CHK蛋白在细胞周期检查点控制中的作用（8.8％重叠，B–H校正的P = 2.48×10 -2）。使用我们的网络分析，我们可以预测到真核翻译起始因子4 Gamma 1（EIF4G1，B–H已校正P = 1.39×10 -3）和I kappa b激酶（IκB激酶，经B–H校正的P = 1.39×10 -3）可以充当突变基因的上游上游调节剂，并可能控制那些突变基因的表达（图。 4D）。

C-AYA实体瘤的药物-靶标网络分析

为了确定什么在我们的数据集中检测到的P / LP的比例变体潜在地可成药基因内的窝藏，我们交叉匹配我们的基因列表与由我们的组产生的药物目标网络数据库10，11。该数据库包含13567个药物-靶点对，它们连接2248个靶点和1703个美国FDA批准的药物。在1507名患者中，有511名（34％）的基因具有至少一种P / LP变体，该变体可能具有药物作用。127名（8.4％）患者患有KCPG P / LP变异，另外384名（25.5％）患者在可药物治疗的候选基因中具有P / LP变异。这些患者中约有三分之一（161人），具有KCPG P / LP变异体的72个人和具有候选基因P / LP变异体的89个人具有现有的FDA批准的抗肿瘤和免疫调节相关化合物。这些患者的P / LP基因改变位于73个基因，19个KCPG和54个候选基因上。我们有八个人有两个可药物治疗的基因。肾上腺皮质癌的C-AYA患者中具有可药物治疗基因的患者数量最多（45.5％），其次是肉瘤患者，包括软组织肉瘤（14％），尤因肉瘤（12.6％）和骨肉瘤（11.6％）。接下来是CNS肿瘤，视网膜母细胞瘤，Wilms肿瘤和神经母细胞瘤的患者，每例患者中有10％携带可药物治疗的改变。患有低度神经胶质瘤的患者为4.2％，发生药物事件的人数最少（图。 5；补充数据 19 – 20）。

讨论区

尽管目前针对成人实体瘤的一线靶向治疗取得了进步，但对靶向治疗的探索和开发并没有太多关注，特别是考虑了C-AYA患者实体瘤的种系基因组特征。Grobner等。最近发表了关于C-AYA癌症领域的综合研究，主要关注体细胞突变特征。在他们的种系变异评估中，他们检查了914位C-AYA恶性肿瘤患者中的162个癌症易感基因，包括798例实体瘤1。我们将该评估范围扩大为几乎有实体瘤的个体数量（1507 C-AYA）翻了一番，并评估了204种已知的癌症易感基因。值得注意的是，我们还使用不可知论方法扩展了评估范围，以评估新的（以前未知易患癌症的）候选基因，以及影响到增加C-AYA实体瘤种系特征的途径。据我们所知，这项研究对患有实体瘤的C-AYA患者的种系突变提供了最大的评估。在这里，我们对1507名患有实体瘤的C-AYA患者的生殖系外显子组数据进行了变体优先分析，同时不仅关注KCPG中众所周知的生殖系突变，而且还关注了以前未知的基因中任何P / LP生殖系改变易患癌症。

从我们前瞻性招募的CCF系列开始，我们发现10％的病例具有P / LP种系改变，即KCPG中的截短突变和/或癌症相关基因中较大的CNV，与先前的研究一致1，2，3，12。我们的一例 CCF骨肉瘤患者出现了GJB2的生殖截断突变和DDX10重复。编码上皮间隙连接蛋白的GJB2最常与综合征性听力丧失相关，例如角膜炎-鱼鳞病-耳聋（KID）。据报道，这些KID患者具有种系GJB2突变增加了发展上皮恶性肿瘤的风险，例如，与正常人群相比，皮肤和口腔粘膜鳞状细胞癌的发生率为19％13。总的来说，结合StJ病例，我们在患有CNS肿瘤（3例），骨肉瘤（2例），尤因肉瘤（1例）和横纹肌肉瘤（1例）的C-AYA患者中检测到7个GJB2种系P / LP变体。在这种情况下，第二个改变的基因DDX10是已知的与癌症相关的基因，最近有报道称其体细胞过表达与骨肉瘤患者较低的生存率相关14。Shi和Hao 14显示了DDX10的沉默通过抑制MAPK途径，可能具有治疗作用，并抑制肿瘤细胞的增殖，侵袭和迁移。

使用更大的数据集验证了我们的发现，重点放在单核苷酸变异（SNV）和小的indels上，我们确认12％的实体瘤C-AYA患者在KCPG中至少具有一个种系P / LP变体，另外一个我们的病例中有61％在其他候选基因中携带病原体。如预期的那样，与实体瘤数据集相比，我们的实体瘤C-AYA患者中约有三分之一的这些KCPG和候选基因均具有四个和更多的P / LP变异，并且具有统计学上显着更高的P / LP变异等位基因频率。非TCGA ExAC数据集中的对照组。与对照数据集相比，我们的数据集中这些基因的种系P / LP变体的过度表达证实了这些发现的偶然性。最近，Wang等。15，采用相同的方法，建议杂种BRCA2杂合突变易患儿科或青少年非霍奇金淋巴瘤，因为与没有癌症的对照人群相比，目标人群中的BRCA2突变表现出过高的代表（优势比，3.3； 95）。％CI，1.7–5.8）15。

另一方面，有许多证据表明这些生物信息学预测的候选基因的一部分与癌症有关（表 3）。例如，体细胞过表达TMPRSS3，跨膜丝氨酸蛋白酶，大多已知其与非综合征的听力损失相关联，先前报道与乳腺癌，卵巢癌和胰腺癌相关联16，17，18。TMPRSS3可以利用其蛋白水解活性，通过调节ERK1 / 2和PI3K / AKT途径，帮助恶性细胞增殖，迁移和存活，从而介导癌症的进展19。在另一个示例中，PRKN的体细胞耗竭的一个多蛋白E3泛素连接酶复合物的成分，与帕金森氏症相关联的已知基因，另据报道在卵巢癌和肺癌20，21，22，23。PRKN可以充当肿瘤抑制基因，其功能丧失可以通过PTEN 24失活来激活PI3K / AKT途径。在这里，我们报道了Wilms（6），CNS（5），神经母细胞瘤（4）和骨肉瘤（3）肿瘤患者中PRKN预期功能丧失的多个实例（图 3c，d）。我们还报道了COL7A1种系功能丧失在四名患有Wilms肿瘤的C-AYA患者中。有趣的是，RNA表达数据，从基因表达谱交互式分析（GEPIA）比较肿瘤和正常组织25，确认的较低表达COL7A1在成人肾相关的肿瘤以及（补充图 9）。

有几项流行病学研究与儿童先天性畸形伴有癌症风险。在瑞典患者登记簿的最新研究中，例如，Mandalenakis等。26显示，与没有CHD的瑞典总人口登记册中的对照相比，患有任何CHD的C-AYA患者罹患癌症的风险增加（危险比= 2.24、95％CI，2.01-2.48）。（2％比0.9％）。在这里，我们还表明，在我们的实体瘤C-AYA患者中，有67名（4.4％）在CHD相关基因（7个KCPG和19个候选基因）中携带至少一种种系P / LP变体（补充图 7），证实了评估KCPG和候选基因的重要性。例如，种系NF1和PTPN11在我们的24例患有实体瘤的C-AYA患者中发现了P / LP变体（补充数据 5）：这两种KCPG易患CNS相关肿瘤，并且通过RAS通路的上调也与CHDs密切相关27，28，29，30。在我们的两个案例中（补充数据16），NOTCH1种系P / LP变异体是通过各种机制与冠心病和癌症相关的候选基因的另一个例子，包括下调影响上皮间质转化的TGF-β信号通路（ EMT）31，32，33。总之，迄今为止的数据再次强调了将所有C-AYA癌症患者转诊进行遗传咨询和进一步临床评估的需要。

C-AYA实体瘤患者具有体细胞突变的下负担，同时携带更高数量的种系改变的，与它们的对应物的成年1，2，34。因此，我们在这里的研究揭示了种系作为治疗的考虑。我们的途径分析表明，不仅点突变和TP53的缺失本身对C-AYA患者的癌症易感性很重要，但是其他看似完全不同的基因的P / LP种系突变也指向p53途径的最终共同破坏。因此，p53信号通路似乎是C-AYA癌症易感性中至关重要的最终通用途径。相关地，我们还表明，DNA损伤反应（DDR）和检查点控制途径是该组中最常见的常规途径。虽然通常在实体瘤中靶向体细胞突变，但这些观察结果表明，对于恶性肿瘤患者，种系突变也可以有效靶向。主要的例子是在DDR基因的种系突变的背景下，使用聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂治疗患有晚期乳腺癌，卵巢癌和前列腺癌的成年人。BRCA1，BRCA2，ATM，或PALB2 35，36，37。尽管由于对非癌组织的可能毒性，在种系环境中靶向突变基因具有挑战性，但我们推测适当的药物剂量阈值可以带来较高的治疗指数。此外，由于癌细胞通常具有复杂的基因和途径破坏网络（包括正常细胞不存在的体细胞畸变），因此我们预期恶性细胞与正常细胞对治疗靶向的敏感性不同。我们的药物-靶标网络分析为当前被认为是不可药物治疗的肿瘤靶标的潜在药物基因和可能可重复使用的药物打开了一个新窗口。因此，在翻译成常规临床武器库之前，有必要进行进一步的临床前和临床研究。获取并合并体细胞和种系改变的数据，及其随后受影响的途径，对于选择具有最高治疗指数的治疗策略可能至关重要且基本，甚至可以减轻C-AYA人群的后期影响。为此，美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）建立儿童癌症数据计划（CCDI）的最新努力，以及正在进行的临床试验，例如儿科实体瘤的全面组学分析（NCT01109394）应该共同为C-AYA实体瘤提供相关的基础设施，由于非药物靶标，目前认为这些实体瘤难以治疗。

我们的研究有很多局限性，包括许多病例缺乏匹配的肿瘤或RNAseq数据。我们的研究不是基于人群的队列研究。圣裘德系列只包括5年幸存者。因此，此处的癌症风险优先变种可能会受到幸存者偏倚的挑战。未来的研究（包括来自圣裘德一侧的研究）应能弥补这些差距。

方法

患者入组/样本选择

该项目的患者数据来自两个来源：

1。
克利夫兰临床基金会（CCF）：根据Cleveland Clinic批准的IRB规程8458，前瞻性地招募了50名最初诊断为29岁以下并患有肿瘤的实体病的儿童，该病出现于小儿血液肿瘤学或癌症遗传学诊所。获得每个参与者的同意。通过审查电子病历（EMR）确认最终诊断和肿瘤类型，包括初级保健医师笔记，手术笔记和病理报告。家族史数据和血统书由CCF遗传咨询师获得。在一级和/或二级亲属中发生的任何相关癌症都算作阳性家族史。对患者进行了任何复发，转移，第二原发恶性肿瘤（SMN）或死亡的评估，
2。
圣裘德（StJ）云：患者的其余种系/临床数据是从圣裘德儿童研究医院和华盛顿大学医学院麦道分校基因组研究所生成的圣裘德云中的两个数据集中获得的。法律协议4147653：
1. （一个）
  小儿癌症基因组计划（PCGP）的193名患者38
2. （b）
  来自圣裘德终身（SJLIFE）的1269名患者8

样品制备和测序

通过Cleveland诊所的标准方法，从外周血白细胞（ReliaPrep大容量HT gDNA系统/ Promega，麦迪逊，威斯康星州）或颊粘膜（DNeasy血液和组织试剂盒/ Qiagen，德国城，马里兰州）中提取CCF患者的基因组DNA。基因组医学生物资源库（俄亥俄州克利夫兰）。对于来自CCF的DNA样品的全外显子组测序，我们使用了Nextera Rapid Capture外显子组文库制备试剂盒（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚）。使用具有dsDNA广谱分析试剂盒和E-gel电泳系统（Invitrogen）的Qubit荧光计（Invitrogen，Carlsbad，CA）对样品进行定量和QC处理。DNA总输入量为50 ng，然后进行酶切。连接Illumina衔接子和独特的条形码后，使用Qubit dsDNA广谱分析试剂盒验证文库，并使用500 ng每个标记的文库平均合并。使用Illumina捕获探针的杂交已在最终库中完成，并通过PCR进行了扩增。使用Qubit荧光计得出浓度（ng /μl），用Bioanalyzer进行文库质量和平均bp大小的最终分析，并通过qPCR（KAPA Biosystems，Illumina文库定量试剂盒）进行最终定量，最终富集文库的验证完成。根据HiSeq 2500系统的标准Illumina规程，稀释，变性和加载最终的富集液。样品在两个快速运行的流通池中运行，运行流通池为2×100 bp（成对末端）。并通过qPCR（KAPA Biosystems，Illumina文库定量试剂盒）进行最终定量。根据HiSeq 2500系统的标准Illumina规程，稀释，变性和加载最终的富集液。样品在两个快速运行的流通池中运行，运行流通池为2×100 bp（成对末端）。并通过qPCR（KAPA Biosystems，Illumina文库定量试剂盒）进行最终定量。根据HiSeq 2500系统的标准Illumina规程，稀释，变性和加载最终的富集液。样品在两个快速运行的流通池中运行，运行流通池为2×100 bp（成对末端）。

对齐方式和变体调用

以二进制比对图（BAM）格式接收CCF病例的测序数据。我们重新生成了Fast-Q文件，并使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA v.0.6.1）39将原始读数映射到人类参考单倍体基因组序列GRCH37 / hg19 。Genome Analysis Toolkit（GATK 3.5）40，Sequence Alignment / Map（SAMtools）41和Picard（http://broadinstitute.github.io/picard/）用于indel 重组，PCR重复序列的去除以及碱基和碱基质量得分重新校准。GATK单倍型调用子用于SNV和短（<50 bp）插入缺失的变异调用。

变体分类

对于两个数据集的变体注释和解释分析，通过采用独创性的产生®变量分析™（IVA）软件（www.qiagenbioinformatics.com从独创性系统）（版本5.4.20190121）。在健康的公共基因组（1000个基因组）中，我们保留了变种，其变种质量至少为20.0，读取深度至少为20.0，基因型质量至少为30.0，并且在外显子可变性最强的100个碱基窗口之外的5.0％之外。如果MaxEntScan 42预测变体会破坏剪接，则它们最多可保留20个碱基到内含子区域。如果在以下任何人群数据库中等位基因频率大于或等于1.0％，则排除变体：1000个基因组计划（3v5b期），NHLBI ESP外显子组（ESP6500SI-V2），ExAC频率（0.3.1）和gnomAD最大频率（2.0.1）。用PHRED缩放CADD（V1.3）得分变体<10（http://cadd.gs.washington.edu/info）43或没有耐受的SIFT预测（2016-02-23）也被排除，除非存在确定的致病性常见变异。随后，仅保留根据美国医学遗传学和基因组学（ACMG）指南通过IVA的自动分类被分类为致病性和可能致病性（P / LP）的变体，以进行进一步评估。此外，IVA使用以下数据库中的数据进行自动分类：等位基因频率社区（2018-09-06），RefSeq基因模型（2018-07-10），PolyPhen-2（v2.2.2），PhyloP（2009 -11），DbSNP（151），TargetScan（6.2），GENCODE（版本28），CentoMD（5.0），Ingenuity知识库（Stepford 190106.000），OMIM（2017年5月26日），BSIFT（2016-02-23）， TCGA（2013-09-05），ClinVar（2018-08-01），DGV（2016-05-15），COSMIC（v86），HGMD（2018.3）。如果ClinVar（https://preview.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）称它们为良性或可能是良性的。通过Integrative Genomics Viewer（IGV）检查了StJ数据集中所有优先的CCF变体和大部分indel，以排除工件44（补充图 1）。

癌症易感基因选择

我们使用编辑出版的文献和数据库204已知的癌易感基因（KCPG）的列表1，2，5，6，7，45，46（癌症基因人口普查种系2019 https://cancer.sanger.ac.uk/ census＃cl_search）（补充数据 2）。基于该列表，我们将所有优先变体分配给了两个组，即KCPG组或候选基因组。如果杂合子变体KCPG具有显性遗传模式，我们只会对其进行计数。我们的KCPG常染色体隐性（AR）基因均没有纯合或复合杂合变异体。

对照人群的变异分析

病例对照分析以CCF的13名非癌患者和StJ数据集的340个非癌样本作为对照，进行了分析，以排除我们的IVA分析中的管线对准误差。

此外，我们提取了研究中发现的所有KCPG和候选基因的种系外显子组数据，并分别从非TCGA ExAC数据库中对53105个个体进行了相同参数的另一个IVA分析，以比较P / LP等位基因的频率具有实体瘤的C-AYA患者与该非癌症对照人群之间的变异。

CNV分析

我们使用VarSeq™v2.1.0（Golden Helix，Inc.，Bozeman，MT，www.goldenhelix.com）来检测CCF数据集中的CNV，并按照制造商的说明使用覆盖深度（https://link.springer.com /protocol/10.1007%2F978-1-4939-8666-8_9）。使用主成分分析（PCA）和参考样本归一化对数据进行归一化。我们使用了两个指标来检测CNV事件：（1）Z得分，即相对于参考样本平均值的标准偏差数；（2）比率，然后将目标样本的归一化读取深度除以归一化参考样品的平均深度。这两个指标都是根据标准化覆盖率计算得出的。我们使用比率≤0.75和Z-score≤-2.5用于筛选杂合缺失，比率≥1.25，Z-score≥2.5用于重复检测。使用1000个基因组，ExAC，ClinVar和基因组变异数据库（DGV）进行数据注释。该ž -scores被用来计算P值为每个称为事件。eXome隐藏马尔可夫模型（XHMM）算法47与默认参数一起使用，以确认我们的CNV发现。检测到的CNV的平均每目标覆盖深度为149。

途径分析

我们使用了maftools 48的OncogenicPathways功能来检查数据集中已知致癌信号通路的富集。为了计算受影响的比例，我们将每个途径中受影响的基因数除以该途径中的基因总数。接下来，我们使用Qiagen IPA 49为目标基因生成网络。优化后，我们在数据集中仅将具有四个或更多P / LP变体的基因包括在KCPG和候选基因中。每个基因ID都被映射到Ingenuity知识库中的相应对象。这些基因是产生我们网络的种子。然后根据我们感兴趣的基因与Ingenuity知识库中存在的其他分子的连通性，通过算法生成网络。

毒品目标网络的重建

我们从七个常用数据源中收集了FDA批准药物的物理药物-靶点相互作用。具体而言，药物-靶标相互作用是从DrugBank 50，治疗靶标数据库51，PharmGKB 52和DrugCentral 53获得的。药物-靶标对的生物活性数据是从三个常用数据库中收集的：ChEMBL 54，BindingDB 55和IUPHAR / BPS药理学指南56。在这里，我们使用报告的结合亲和力/抑制数据定义了药物与靶标的物理相互作用：抑制常数/效价（K i），解离常数（K d），中位有效浓度（EC 50）或中位抑制浓度（IC 50），每个≤10 µM。从制备的生物活性数据库中提取与药物有关的生物活性数据后，仅保留满足以下四个标准的那些项目：（i）结合亲和力，包括K i，K d，IC 50或EC 50，≤10μM；（ii）以唯一UniProt登录号表示的蛋白质；（iii）UniProt数据库中标记为“已审阅”的蛋白质57，以及（iv）人类来源的蛋白质。总共，我们收集了13567个药物-靶标对，连接了2248个靶标和1703个美国FDA批准的药物（2018年12月）。我们根据从DrugBank 50和DrugCentral 53下载的解剖治疗化学（ATC）分类代码定义了治疗药物家族。例如，我们根据第一级ATC代码将抗肿瘤药和免疫调节剂定义为L。要选择可药物化的基因，我们将优先化的基因清单与重构的药物靶向网络交叉匹配，并使用了Sankey图（R包-networkD3）进行可视化。

统计分析

在路径分析中，网络分数是根据超几何分布创建的，并使用右尾费舍尔精确检验进行计算。B–H P值校正用于降低FDR。在病例对照比较分析中，我们使用R统计软件中实施的双面Fisher精确检验计算了P值，OR和95％CI。P当我们比较实体瘤C-AYA和非TCGA ExAC对照人群中P / LP变异的频率时，考虑使用593项检测进行Bonferroni校正的多重检测，我们对值进行了调整。FDR阈值0.05被认为是重大事件。我们使用了圣裘德儿童研究医院的独立数据集来重现我们对克利夫兰诊所系列进行的初步研究的数据。这项研究的所有分析都进行了多次，以确保结果的可重复性。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《自然研究报告摘要》。

资料可用性

来自克利夫兰诊所的患有实体瘤的C-AYA病例的全外显子数据已以登录号PRJNA559601保存在NCBI序列读取档案（SRA）数据库中。可从https://www.stjude.cloud/网站获取来自圣裘德儿童研究医院的C-AYA实体瘤的全外显子数据。研究期间引用的非TCGA数据可从Broad Institute网站的公共资源库中获得，网址为ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/ExAC_release/release0.3.1/subsets/。支持本研究结果的所有其他数据均可在本文及其补充信息文件中找到，并在合理的要求下可以从通讯作者处获得。本文的报告摘要可作为补充信息文件。