合成致死筛查有可能识别出由特定癌症突变引起的新的脆弱性，但由于研究之间缺乏共识而受到阻碍。在KRAS的情况下，我们确定已发表的合成致死性筛查命中在途径而非基因水平上显着重叠。对编码为蛋白质网络的途径的分析可以鉴定出比先前报道的可复制性更高的合成致死候选物。缺乏重叠的原因可能是生物学上的限制，而不是技术上的限制，因为大多数合成致死表型受细胞条件或遗传背景变化的强烈调节，后者使用成对遗传相互作用图谱确定，该图谱鉴定了抑制合成致死作用的多种相互作用。考虑途径，细胞和遗传背景提名了由包含BRCA1的网络介导的KRAS突变细胞中的DNA修复依赖性。我们提供了证据，说明为什么大多数报道的合成致死法是不可重现的，而使用多方面的测试框架可以解决这一问题。
合成杀伤力是一种遗传相互作用，当两个非必需基因的同时扰动导致细胞死亡时就会发生。这样的方法已被用于在肿瘤细胞中携带特定突变，如BRCA1-或BRCA2-突变细胞，其是PARP抑制敏感的情况下，以限定新的漏洞1，2。为了寻找这种脆弱性，功能基因组筛选已启用等位基因或具有特定目的突变的细胞系集合来快速绘制潜在的合成致死关系。广泛建议使用RNAi技术的历史筛选会受到文库质量和脱靶效应的影响，这些效应限制了已发表的合成致死候选物的再现性3[ 4]，并且有人建议，CRISPR汇集筛选可以克服这些问题。另一种可能性是主要的障碍识别再现的合成致死是相互作用的外显率，或弹性针对调制由附加的基因改变的癌症中发现的5，6。旨在解决和克服合成致死性鉴定中的概念性挑战的计算和实验策略在很大程度上尚未得到开发。
KRAS是癌症中最常见的致癌基因。它目前是不可吸收的，可以激活多种信号传导途径，并且是鉴定合成致死物方面挑战的例证。虽然研究的大量已力图确定KRAS合成致死靶基因7，8，9，10，11，12，它们已经显着的事实，从这些研究中几乎不重叠，这已被归因于使用不同的命中细胞系和筛选文库，可能会遭受脱靶效应和部分敲低3。此外，故障重现公布KRAS合成致死目标已报告13，14。虽然公开的合成致死的荟萃分析可以找出更强劲的候选人的有效途径，有系统的整合和重新测试至今尚未执行3，15。
我们对遗传相互作用的组织知识的大部分来自通过单基因敲除研究和组合基因敲除研究[ 16]的模型生物。这样的相互作用，其中包括合成致死的大规模映射，已经发现链路功能相关的蛋白和用于描绘路径结构17，18。遗传相互作用已经显示是高度上下文特定与环境的变化和应变大大改变了通路使用和在酵母中合成致死关系19，20。单细胞生物中存在的遗传相互作用的可塑性可能预示了在异质性疾病（例如癌症）中临床相关的合成致死相互作用的鉴定挑战。
我们假设，在确定合成致死相互作用挑战一个事实，即癌细胞中基因的差异依赖于平行于模式生物的基因观察到的必要性的广泛差异暴露于环境的变化或海港遗传差异茎16，20。综合研究结果，我们发现先前发表的KRAS合成致死性筛选包含有关KRAS突变细胞所需途径的重要信息，其途径超出了经常报道的单个基因。与这些途径有关的基因在确认性研究中更有可能被概括，表明它们与背景无关。合成致死基因的进一步测试表明，大多数细胞受到细胞条件变化和遗传修饰剂的影响，这可能解释了为什么已公布的合成致死作用有限。考虑到背景情况，突出显示了DNA修复途径是KRAS突变癌症的一种依赖性，在多项研究中可重复观察到这种现象，但并不总是首屈一指的，因此并不立即可见。
合成致死性的概念是一个强大的工具，在癌症，以确定新的依赖和基因目标，但尽管有潜在的效用已经在稳定性和重现性挑战的限制3，6，21，22。我们假设整合多个独立研究可能会揭示更致命的合成致命相互作用。为了确定在何种程度上是这种情况，我们分析了三种开创性的研究，其试图通过功能丧失的屏幕定义KRAS合成致死基因，以下简称罗，炉卷和芭比研究10，12，23。Luo和Steckel研究使用了独特的同基因细胞对，而Barbie研究使用了一组KRAS突变和野生型细胞系。作为比较的基础，我们选择了每项研究中报道的前250个KRAS合成致死基因作为命中（KSL基因，补充数据 1），并发现在基于总几何数的超几何检验基础上，每对研究之间存在边际重叠在每个研究中测试的基因，与先前的报道一致（图的 图1A）3，15。接下来，我们探讨了每种筛选是否都可以鉴定出不同但相关的基因，从而表明了在途径而非基因水平上具有共同的重要性。例如，通过不同的研究3鉴定出26S蛋白酶体的不同亚基（PSMB6，PSMD14），这表明在途径水平上研究之间的趋同（图 1a）。我们综合这些基因列表以包括从HumanNet从CORUM和高置信度的物理和功能上的相互作用已知的蛋白复合物的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络24，25。总共，我们从三项研究中的任何一项中确定了6,830种涉及KSL基因蛋白产物的相互作用（图 1b）。），并发现了260种不同研究中连接KSL基因的相互作用。为了评估这是否是一个重要的数字，我们将研究对之间的相互作用数与随机选择的基因集之间预期的相互作用数进行了比较，以控制样本量和测试空间（请参见方法）。在所有情况下，我们观察到两项独立研究得出的KSL基因之间的联系比随机预期的要多得多（图 1c）。例如，我们在Luo和Steckel列表中的前250个基因之间观察到162个PPI，比250个随机基因之间的预期值高约8倍，表示p <0.0001。相反，这两项研究之间的基因水平重叠并不显着（p = 0.17）（图1a）。 ）。我们使用纯实验性蛋白质-蛋白质相互作用网络26（补充图 1）观察到了相似的发现。
a在Luo等人和Steckel等人，Barbie等人的三个已发表的KRAS合成致死研究中报告的前250个命中基因之间存在基因重叠。10，12，23。p值基于成对比较之间计算的两尾超几何检验，其中考虑了每个研究的所有测试基因。b数据整合策略，用于将每项研究报告的前250种KRAS合成致死物映射到一个蛋白质-蛋白质相互作用网络上，该网络由HumanNet和CORUM蛋白复合物的相互作用组成。每个研究中测试的基因数量，n。C比较两项指示性研究中报道的命中之间的蛋白-蛋白质相互作用（PPI）网络中观察到的相互作用数与随机基因之间观察到的相似相互作用的数。直方图表示从10,000个模拟中随机选择的250个基因进行的结果，这些基因在每个研究中均进行了测试，p值表示模拟中与实际观察到的相互作用数相同或更多的部分。dPPI网络仅限于相互作用，在相互作用中至少有一种蛋白质是在先前的研究中鉴定出来的，然后使用MCODE进行网络聚类以鉴定紧密连接的组分。将单个子网过滤为包含来自多个研究的基因的子网，并根据基因功能将其分为7个簇。使用两尾超几何检验，评估在每个子网中识别出的一组基因与CORUM或KEGG复合物或所列途径的重叠。
由于来自不同研究的KSL基因被丰富起来可以在功能上和物理上相互作用，因此我们接下来询问它们是否会融合到代表已知途径和蛋白质复合物的分子子网络中。我们在此网络上应用了称为MCODE的网络聚类算法，以识别密集的基因子网络或模块，这些子网络或模块富含跨多个研究的KSL基因27。根据我们对子网络必须包含在两项或多项研究中发现的基因的要求，我们确定了七个功能独特的KRAS合成致死网络，所有这些都可以追溯到特定的蛋白质复合物或途径（图 1d，补充数据 2）。 ， 3）。例如，网络之一对应于蛋白酶体和后期促进复合物（CORUM ID：181和96），其中包括由Luo，Barbie和Steckel研究中鉴定的基因编码的亚基（图 1d）。我们在这项研究中确定的其他复合物和途径是与Nop56p相关的pre-rRNA复合物（包含Steckel和Luo基因），BRCA1-RNA聚合酶II复合物（Steckel和Barbie），细胞周期S期的RC复合物（所有这三项研究），与LCR相关的重塑复合物（也称为LARC）（所有三项研究），含有伴侣蛋白的TCP1复合物（也称为CCT（Luo和Steckel））和胰岛素信号传导途径（Steckel和Barbie）。在所有情况下，这些复合物和途径均显着丰富了KSL基因（图 1d）。总之，我们预测105个KRAS合成致死基因网络（网络SL基因），其中65％（105分之68）未覆盖在我们最初的KSL列表（图 1D，补充数据 2，4）。这种方法的效用不仅限于KRAS，因为使用已发表的MYC合成致死研究的相似方法突显了许多共享的蛋白质复合物，这些复合物也是我们在KRAS特异性分析中发现的独特蛋白质（补充图 2）。因此，尽管已发表的研究中有限的基因水平重叠，网络整合显示独立的合成致死研究在共同的蛋白质复合物和途径上趋于一致。
由于我们的网络分析强调了研究之间共享的途径和复合物，因此我们假设Network SL基因可能代表了更强大的合成致死因素，因此在后续研究中更有可能重现。为了解决这个问题，我们询问了与文献（Literature SL）精选的26种先前发表的KRAS合成致死基因相比，是否更可能在一系列不用于网络鉴定的最新RNAi筛选中回收它们（补充数据） 2）7，8，9。金等人。8和Kim等。9项研究使用KRAS突变体与野生型肺癌细胞系进行比较，而Costa-Cabral研究7使用了大肠癌系的等基因组。为便于比较，我们将这三项研究中鉴定出的基因独立地排列到百分位数中，最低百分位数中的基因显示出KRAS合成杀伤力的最强证据（请参见方法）。与以前发表的文献SL基因相比，网络SL基因更可能是命中率最高的百分数之一。例如，在Kim等人中。在9项研究中，测试的Network SL基因中有15％的命中位居前1个百分点，而文献SL基因的3％则是命中率最高的5个百分点（图 2）。同样，Kim等[ 8]中9％的Network SL基因位于命中率最高的1％。研究中，使用文学SL基因的比例为0％。Network SL基因还预测了Costa-Cabral研究CDK1的最高候选者。综合六项研究的荟萃分析，这些数据为S期（CDK1，RPA1，RPA2）和BRCA1-RNA聚合酶II复合物（POLR2B，POLR2D，POLR2G，BRCA1）参与RC复合物的蛋白质提供了额外的支持。 ）作为KRAS合成致死候选物，已在多项研究中重复使用。因此，基于网络途径鉴定合成致死基因的网络方法以优于标准单项研究单基因方法的方式鉴定了可重现的合成致死性。 5，6）。
接下来，我们寻求获得独立的实验证据，证明途径环境的纳入可以确定可靠的KRAS合成杀伤力。我们使用表达KRAS G12D或eGFP的MCF10A细胞作为对照建立了同基因模型，并使用阵列基因敲除文库平行筛选了它们，这些基因敲除文库分别靶向KRAS途径中的28个文献SL基因，40个网络SL基因和128个基因（图 3a，补充图。 3，补充数据 4）。MCF10A细胞是未转化的，并已被广泛用于模型RAS信令28，29和突变体KRAS经常在人类癌症中扩增，这表明我们的方法的相关性30，31。KRAS G12D细胞的增殖不超过对照表达eGFP的细胞，并且KRAS细胞是生长因子独立的且在不存在生长因子的情况下具有持续的MAPK活性，这是致癌性转化的标志和KRAS生物学的关键特征（图 3b，c）。作为阳性对照，我们观察到在没有所有培养基补充剂和生长因子（最小培养基）的情况下，敲除KRAS仅能减少表达KRAS的细胞的增殖，这证明了该模型对KRAS的依赖性（图 3d）。）。比较在完全培养基中生长的对照eGFP细胞与在最小培养基中生长的KRAS突变细胞中基因敲低的增殖影响，以定义与四次重复效应的重要性相关的相互作用评分，负评分代表推定的合成致命命中率（参见方法）。在完全培养基中的eGFP细胞与在最小培养基中的KRAS细胞之间的生长速率之间仅存在边际差异（补充图 4）。使用5％的错误发现率（FDR），我们确定了包括KRAS在内的28个匹配项（图 3e）。在预测的前10个基因中，网络SL基因为BRCA1（S = -6.3）和RPA3（S = -4.2），以及先前描述的文献SL基因GATA2（小号 = -4.9），YAP1（小号 = -2.9）和RHOA（小号 = -5.4）（图 3F）。筛选中所有最热门的基因在通过RT-PCR测量的转录水平上的敲除效率均> 60％（补充图 5）。在途径水平上，KRAS细胞特别依赖于RAS中的基因，核糖体蛋白S6激酶（S6K），细胞周期和YAP途径（图 3g）。受体酪氨酸激酶（RTK）信号的抑制作用对KRAS细胞的影响最小，以GRB2的敲低为代表，其蛋白质产物将RTK和RAS信号联系起来，对eGFP的毒性比对KRAS细胞的毒性更大（S = 5.9）（图 3f，g）。大多数命中与特定的KRAS等位基因无关，因为G12V和G12D表达细胞之间的筛选结果高度相关（r = 0.81，补充图 6，补充数据 7）。对于先前发表的文献SL基因，我们发现FDR <10％时可回收6/27（22％），但平均而言，它们没有与合成病或致死性一致的负面相互作用评分（ 根据学生的t检验p = 0.48 ）（图 3i）。相比之下，作为一组的39个预测的Network SL基因总体上具有很强的阴性评分（ 根据Student's t检验，p = 4.6e-5 ），总体上比文献SL基因更阴性（p = 0.046），其中33％是合成的致命命中率（FDR为10％时为13/39）（图 3i）。综合我们的回顾性分析和实验数据，我们的发现表明，网络荟萃分析方法是鉴定健壮和可复制的合成致死基因的有效策略。
将稳定表达eGFP或突变KRAS构建体的 MCF10A细胞用靶向特定基因的esiRNA进行转染。72小时后，比较了eGFP和KRAS突变细胞之间的相对增殖，以评分遗传相互作用。b在存在或不存在20 ng / ml EGF的情况下，表达eGFP，KRAS G12V或G12D的均匀铺板的MCF10A细胞在72 ng / ml的生长下增殖。n = 4个生物学独立的样本。c在存在或不存在20 ng / ml EGF的情况下生长24小时的同基因细胞的免疫印迹。重复实验两次，结果相似。d在非靶向（NT）或KRAS敲除72小时后，在指定的培养基条件下生长的eGFP或KRAS G12D细胞的增殖，标准化为NT对照。n = 4个生物学独立的样本。e火山图反映了在完全培养基中生长的KRAS G12D细胞与在完全培养基中生长的表达eGFP的对照相比，基因敲除后基因敲除后增殖变化的幅度，以及在重复实验中计算出的这种效应的重要性。虚线表示指示的错误发现率（FDR）临界值。KRAS表示为对照（红色）。f与非靶向对照相比，eGFP或KRAS G12D细胞中基因敲低的相对增殖。基于与<1％FDR的遗传相互作用选择的基因。n = 4个生物学独立的样本。G在更广泛的RAS途径中，按功能类别将基因的已签名遗传相互作用评分进行分类。列出了每个类别中得分最高的得分基因。h重新测试的文献的签名的遗传相互作用评分确定了KRAS合成致死基因及其来源。Luo等人的基因子集。为了清楚起见，示出了40。i比较涉及RAS或MAPK途径（RAS / MAPK），RTK信号，来自文献的KRAS合成致死基因（绿色）或预测的合成致死网络基因（紫色）的基因的遗传相互作用评分。p值基于两尾学生t与中位数互动得分为零（底部）和组之间（上方）的比较得出测试。方框代表中位数，铰链跨度在25％至75％之间，晶须跨度在10％至90％之间。数据表示为平均值±标准偏差
已经提出了基因敲低技术的局限性导致缺乏KRAS合成致死力的可重复性，并有可能使用基于CRISPR的方法加以解决3。另一个解释可能是合成的致死作用不完全渗透，在具有不同遗传背景的细胞中不能平等地表现出来6。为了确定遗传背景影响合成致死性鉴定的程度并阐明可抵抗这种效应的靶标，我们系统地筛选了可改变合成致死表型的次级扰动。我们通过使用RNA干扰对单基因和成对基因扰动的适应性进行系统测量和比较分析，生成了定量上位图（E-MAP）32。在该系统中，正向得分相互作用构成缓冲或上位性相互作用，并且在组合敲低的效果小于预期的情况下发生，因为在极端情况下分别考虑了两个基因的敲低，从而完全抑制了一种扰动的表型。另一个 33，34。负向相互作用表明，基因对可以独立运行，并且共同耗尽时会产生比预期 33更强的表型。通过敲除我们在单基因研究中确定的31个顶级合成致死基因（查询基因）与188个主要参与更广泛RAS信号通路的基因组合，我们在基本培养基中生长的MCF10A KRAS G12D细胞中生成了E-MAP （图 4a，补充数据 8）。在一起，我们测量了5828个基因对之间的相互作用，并在2分（Z > | 2 |）的分界线处确定了170个正相互作用和105个负相互作用，这对应于平均值的两个标准差（图 5b）。在这个分数截止值上，我们发现4.6％的基因对之间发生强相互作用，这与酵母35中观察到的遗传相互作用速率一致。
一个的方法概述，以产生使用组合的RNAi来测量在基本培养基中生长MCF10A KRAS G12D细胞5828成对遗传相互作用的上位迷你阵列配置文件（E-MAP）。靶向一组基因的esiRNA以成对方式（一式四份）排列在组织培养板中。然后进行反向转染，并使用高内涵成像观察所产生的适应性缺陷。原始数据经过标准化和评分（请参见方法）。b 30个KRAS合成致死基因和候选修饰物的遗传相互作用图谱概述。显示的互动得分为> 2（红色）或<-2（蓝色）。C这项研究中确定或证实的三种KRAS合成致死因子（CCND1，CDK6和STK33）的相对增殖在单独的eGFP或KRAS G12D MCF10A细胞中以及与它们的主要阳性相互作用伴侣结合时均得到证实。扩散归一化为模拟。基于双面t检验的p值，数据表示为平均值±sd n = 4个生物学独立的样品。d 基于两尾学生t检验，显示与合成致死查询基因（p <0.01）具有显着强遗传相互作用的基因组的分类注释。边缘宽度与重要性成正比。Ë涉及本研究中确定的两个KRAS合成致死基因RGL1和DNMT3A的遗传相互作用伙伴，以及丰富的遗传相互作用相关通道。边缘厚度与交互作用分数成正比。
一个在MCF10A的eGFP或KRAS G12D细胞在72小时所指示的媒体条件KRAS或非靶向（NT）的敲低。相对于NT测量的增殖。n = 4个生物学独立的样本。上方显示了媒体复杂度和KRAS依赖关系之间的逆关系示意图。b与eGFP细胞相比，在完全，中等或最小培养基条件下生长的KRAS G12D细胞的遗传相互作用评分的热图。突出显示的基因组在不同条件下显示出一致或特定条件下的合成致死率。红色箭头突出显示BRCA1是一致的KRAS合成杀伤力。c以前发表的KRAS合成致死物在不同生长条件下的遗传相互作用评分的热图。d在指定条件下生长的细胞增殖具有对NT转染对照标准化的指定基因的敲除。n = 4个生物学独立的样本。完全=完整介质，整数=中间介质，最小值=最小介质。数据表示为平均值±标准偏差
我们测试了31个查询基因，确定了170种遗传相互作用，可抑制KRAS突变细胞的合成致死表型（Z > 2，每个基因平均5.5）。我们验证了小规模研究中几个最重要的命中。例如，虽然CCND1敲低对KRAS细胞有选择性毒性，但RASSF5的共敲低使KRAS突变细胞恢复正常增殖（Z = 3.9）（图 4c）。击倒的影响CDK6也显著通过敲低救出RASSF5（Ž = 3.8）和ERBB2（ž = 3.3）。基因修饰剂还可以调节对已发表的KRAS合成致死靶标的依赖性。例如，虽然敲除STK33在KRAS G12D中有选择性毒性，但对eGFP细胞没有毒性，但同时敲除SHP2（Z = 5.1）或ARID1B（Z = 3.0）可以抑制STK33（图 4c）。基于通路的分析确定了查询基因和细胞通路之间的32个连接，其中相互作用可以组织为明显阳性或阴性的捆绑（p = 0.05，图 4d，请参见方法）。例如，我们确定了RALGDS类似1（RGL1）与应激相关的MAPK，RHO和RAC途径的基因表现出正向相互作用（图 4d，e），并且发现DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）与剪接体，后期和蛋白酶体复合体之间存在很大的负向相互作用（图 4e））。这些结果表明，KRAS合成致死基因的抑制作用可能被二级基因和途径的丧失所抑制，在某些情况下，这些基因可以完全拯救致死表型。
例如在血清和媒体可用的可以改变细胞生物学的生长因子和营养成分变化环境差异36，37和已经假定在癌症验证候选治疗的目标，以有助于挑战38。我们推测细胞背景下的这种变化可能是所报告的合成致死基因在体外缺乏持久性的潜在来源。如果正确的话，这可能会严重不利于在体内和人类中发展合成致死靶标，而在复杂的肿瘤微环境中确实存在这种变异性。为了对这种变化进行建模，我们将补充剂迭代添加回了我们最初筛选所用的最小培养基中，用于MCF10A KRAS G12D细胞。在最低限度的培养基中，我们添加了胰岛素，霍乱毒素和氢化可的松（称为中间培养基），发现它部分拯救了细胞对KRAS的依赖性，进一步添加EGF（完全培养基）完全消除了KRAS依赖性（图 5a））。击倒效率不受培养基条件变化的影响（补充图 7）。我们使用这三种不同条件进行了平行单基因敲除筛选，发现我们观察到的合成致死相互作用有显着差异（图 5b，补充数据 7）。令人惊讶的是，在基本培养基或中间培养基中进行的实验之间的遗传相互作用评分之间的相关性很弱，并且不显着（r = 0.11）（图 5b，补充数据 7）。
接下来，我们探讨了培养基条件调节对已发表的KRAS合成致死基因的依赖性的程度。我们观察到，合成致死与蛋白酶体（例如PSMA2，PSMA5）的成员10，12在更复杂的培养基（和KRAS独立的）中生长的细胞是只明显表明此途径可以仅针对KRAS突变体细胞时是必要同时存在KRAS和生长因子信号传导（条件特定SL，图 5c，d）。同样，两家媒体KRAS合成致死基因，STK33和YAP1，只有在基本培养基条件的依赖，而不是在别人提供的，为什么STK33已经很难再现的可能依据（图 5D）11，39，40。在我们分析的26种合成致死基因文献中，绝大多数（92％）仅在特定的培养基条件下表现出了合成致死性，而在我们测试的条件下则完全没有表现出致死性。尽管大多数合成致死关系特定于某些条件，但有些与条件无关，并且是一致的合成致死相互作用，其中最强且最一致的是 BRCA1和 RGL1（图 5b，d）。结合我们的组合遗传相互作用图谱，这些结果证明了大多数报道的合成致死基因对细胞和遗传背景的依赖性。
我们的研究表明，考虑途径，细胞和遗传背景可能有助于描述强大的合成致死作用。我们首先开发了基于复合SL的候选SL基因基于细胞和遗传背景筛选的弹性（图 6a，请参见方法）。从我们最初的等基因筛选中对31个单一的合成致死基因进行排名，我们发现Network SL基因趋向于与文献SL基因相比在上下文方面更加独立（ 通过秩和检验，p = 0.05）。这项分析确定了网络SL基因BRCA1是最佳候选基因。为支持这一发现，我们的网络荟萃分析确定了涉及DNA修复和复制的两种复合物，其中包括所有三个原始RNAi研究（包括BRCA1和POLR2G，POLR2D，POLR2B，RPA1，RPA2，RPA3（图 1d）。在另外三项研究中，在该网络的七个基因中，有六个在命中率最高的5％中被发现（图 2）。BRCA1在我们的单基因合成致死性筛查中名列前茅，在各种培养基条件下都是一致的合成致死性（图 5b），并且遗传抑制物的数量低于平均水平（补充图 8）。）。基于BRCA1的功能，我们假设KRAS突变细胞对DNA修复具有独特的依赖性。我们使用独立的siRNA试剂证实了对MCF10A-KRAS细胞中BRCA1的依赖性，并证实了蛋白的敲除作用（补充图 9）。接下来，我们通过鉴定相关的化学可解决的漏洞，寻求DNA修复缺陷的进一步确证证据。对91种抗癌化合物的独立筛选突出显示了几种靶向DNA修复途径的药物，它们是在包括WEE1，CHK1 / 2和PARP抑制剂在内的基本培养基中生长的MCF10A KRAS G12D细胞中的最佳命中物（图 6b，补充数据 9）。我们使用三种不同的PARP抑制剂验证了PARP抑制剂的敏感性，他唑帕尼在亲代和KRAS突变细胞之间的IC 50表现出约1000倍的差异，而rucaparib和olaparib则显示了2-5倍的敏化作用（图 6c，d）。这些PARP抑制剂同样抑制PARP的酶活性，但他拉唑帕尼最强地将其捕获到DNA上，引起DNA双链断裂，该断裂优先通过BRCA1 41的同源重组修复。因此，这些KRAS细胞对BRCA1具有依赖性，而BRCA1对PARP抑制具有脆弱性，并且对将PARP捕获到染色质上的试剂优先敏感。
基于遗传和细胞扰动筛选的整合，对候选KRAS合成致死基因进行排名。基于在基本培养基中生长的MCF10A KRAS细胞中的合成致死性证据，选择基因进行分析。列出了每个基因的概念来源。b根据在完全培养基中生长的eGFP细胞与在最小培养基中生长的KRAS G12D细胞之间曲线下药物面积（AUC）的差异，对91种临床相关化合物的敏感性进行了药物筛选。二甲基亚砜（DMSO）和表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂分别指示为无效果对照和KRAS诱导的耐药性。n =来自3种药物浓度的4种生物学独立的样品。C对照eGFP，KRAS G12D或G12V表达MCF10A系在用PARP抑制剂他唑帕尼，rucaparib或olaparib处理72小时后的相对增殖。显示IC 50值。n = 4个生物学独立的样本。d用DMSO或他拉唑帕利处理了两周的MCF10A KRAS G12D和eGFP细胞的长期克隆生长。重复实验两次，结果相似。È在的eGFP或G12D表达细胞γH2AX免疫荧光，红。基于DAPI染色的核轮廓以虚线表示。比例尺= 10um。重复实验两次，结果相似。f在指定的细胞系中用DMSO或500 nM talazoparib处理18 h的γH2AX病灶定量。ñ 通过3个独立实验分析了> 90个生物学独立的细胞。g用500 nM他唑帕尼处理所示细胞18小时，然后洗净。冲洗前，冲洗后8和24 h对γH2AX病灶进行定量。 从3个独立实验中分析了n > 104个生物学独立的细胞。p值使用两尾学生t检验。数据以平均值±sd 表示，但sem的f和g除外，不显着，ns
我们假设KRAS突变细胞在DNA修复中存在缺陷，导致依赖于该途径来维持基因组保真度。在基线时，与对照细胞相比，KRAS突变细胞系具有更多的γH2AX病灶（DNA双链断裂的标志物），表明突变KRAS诱导了DNA损伤（图 6e，f）。这些结果与增殖无关，因为对照和突变细胞以相同的速率生长（图 3d）。用他拉唑帕利治疗18 h导致总DNA损伤程度相当，这表明PARP抑制剂并不能简单地增加KRAS突变细胞中的诱导双链断裂（图 6g）。）。相比之下，在洗掉PARP抑制剂后，KRAS细胞的双链断裂解析延迟了至少24小时，这表明KRAS导致了由PARP抑制引起的双链断裂修复缺陷（图。 6克）。
我们试图确定对PARP抑制剂的敏感性是否能抵抗细胞和遗传背景的变化，正是这些关键特征使我们专注于BRCA1。KRAS细胞对PARP抑制的敏感性与培养基条件无关（补充图 10）。敲除talazoparib治疗的191个基因确定了一种抑制子，远低于我们研究中与大多数基因敲除相关的抑制子的数量（补充图 8）。）。因此，PARP抑制证明了KRAS合成杀伤力，该杀伤力对该系统中遗传和细胞环境的变化均很稳定。为了确定这些发现是否扩展到其他的RAS突变癌模型，我们分析了使用二甲基苯并[a]蒽（DMBA）引发和12-O-十四烷酰佛波醇13-乙酸盐（TPA）在小鼠中引发的皮肤肿瘤细胞促进的导致肿瘤特征性怀有致癌HRAS突变两阶段皮肤癌变协议42，43。与C5N角质形成细胞对照相比，HRAS突变的CCH85癌细胞对所有三种PARP抑制剂都敏感，他拉唑帕尼的IC50变化为10-25倍（补充图 11a）），在长期菌落形成试验中也得到了证实（补充图 11b）。接下来，我们分析了来自肿瘤类型的细胞系面板中的PARP抑制剂敏感性，其中RAS突变足够普遍，可以用于药物敏感性（GDSC）数据集的基因组学中的统计比较，其中包括大肠，肺癌和卵巢癌细胞系44。在这些肿瘤类型中，我们确定了KRAS突变与olaparib敏感性之间的许多显着关联（ 大肠和卵巢的p <0.002， 总体p = 3e-6，（补充图 11c）。）。与基因组中存在的其他突变或拷贝数关联相比，KRAS突变通常是与olaparib敏感性相关的最重要的基因组特征之一（补充图 11d）。我们得出的结论是，考虑到途径，细胞和遗传背景，可以确定对DNA修复的依赖性，而该修复可以使用PARP抑制剂靶向，因此有必要在其他RAS突变型癌症中进行进一步研究。
合成杀伤力的概念是一种针对具有特定，不可消耗的癌症突变的癌细胞的激动人心的方法。我们提供了证据，证明合成致死研究的大多数结果为何难以复制，并提供了识别更强大的合成致死候选物的框架。最近改进的遗传扰动技术，例如使用CRISPR / Cas9的那些技术，引起了人们对合成致死筛选的新兴趣45。我们认为，由于癌症模型之间存在的细胞和遗传背景差异，仅凭这些技术无法固有地克服局限性。我们提供了关键的实验证据和解决遗传背景差异的策略，这些差异被认为是导致合成致命鉴定失败的原因5，6。
在这里，我们表明大多数合成杀伤剂高度依赖于细胞和遗传背景。例如，STK33和GATA2仅在单一培养基条件下对KRAS表现出合成杀伤力，并且具有最多数量的遗传抑制剂。有关这两个蛋白质KRAS特定关系一直有争议39，40。我们提出了计算和实验方法来识别更鲁棒的合成致死相互作用。首先，我们提供了一个计算方法，使合成致死，通过使用通路信息来集成功能基因组学的数据，而不是基因列表是多个上下文独立的鉴定如先前执行3，15。其次，我们提出了一个实验框架，使用一组细胞条件的变化来严格测试合成致死作用，以及针对一组次级扰动进行筛选，以确定潜在的遗传适应力，可能使用E-MAP方法。除了培养基条件的变化外，还可以通过调节环境（例如缺氧），生长密度和所用细胞系的批次来实现变化46。
将我们的荟萃分析方法应用于三个早期的KRAS筛选中，我们确定了一组代表蛋白质途径和复合物的网络，这些网络在已发表的研究中经常被鉴定。我们以网络为中心的方法的局限性是当前蛋白质-蛋白质和功能相互作用数据集的完整性和准确性，如果来自筛选的命中基因未在这些网络中编码，则将无法使用此方法进行恢复。在三项坚持的研究和我们的同基因模型中，发现这些网络中的许多基因都可以重新验证。在这些研究中，我们研究了涉及DNA复制和修复的网络，包括BRCA1，无论细胞条件如何，BRCA1都是很强的合成杀伤力，并且在我们的研究小组中具有最低的遗传抑制剂数量。CCT复合体（CCT2，CCT4，CCT8），47，我们的荟萃分析方法也突显了这一复杂性，并且在总共4项独立研究中突显了该复合物的成分，值得进一步研究。该网络框架通过在合成致死筛选中考虑途径背景来增强目标发现，从而确定遗传定义的癌症的有力且潜在的新目标。
我们的数据突出了PARP抑制剂在KRAS突变型癌症中的潜在作用，值得进一步研究。PARP抑制剂可通过酶促抑制作用以及将PARP捕获到DNA上并在S期抑制复制41。我们观察到最强的PARP捕集剂talazoparib对野生型与KRAS突变细胞的抑制差异最大，这表明KRAS细胞依赖于通过S期的无阻碍进展，这与我们确定的DNA复制网络的作用一致。这种相互作用在化学诱导的鼠类肿瘤模型以及大肠，肺癌和卵巢癌细胞系中的小分子谱数据中也很明显。而RAS诱导复制应力被连接在初级细胞衰老48，49DNA修复过程的增强50和抑制（Gilad等51； Kalimutho等52； Kotsantis等53）都与突变体KRAS有关。尽管平均而言，KRAS突变细胞往往对PARP抑制剂更敏感，但显然没有一个亚群具有敏感性。因此，本研究中未研究的其他遗传背景可能会影响这种合成致死关系，并且确定哪些KRAS突变体背景预测对特定DNA修复途径的依赖性将需要未来的工作。特别是，此类工作可以根据与KRAS突变（例如TP53）同时发生的继发突变来定义遗传环境变化的影响和LKB1对PARP抑制剂的敏感性。
我们从Luo，Steckel和Barbie研究的补充信息中获得了筛选数据，并根据每份手稿的补充材料中报告的评分标准对所有基因进行了排名。由于芭比娃娃的研究仅报告了250次命中，因此该临界值用于进一步分析，所有其他研究均报告了250次以上的命中。通过计算每项研究的前250个基因之间的重叠度的高测p值，并设置背景测试的基因，可以确定基因组之间重叠的显着性。超几何是在R（www.r-project.org）中使用1-phyper（x，m，n，k）与x实现的由于研究1和研究2之间的匹配重叠，m是研究1中测试的全部基因数量，n是研究2中发现的也在研究1中测试的匹配数量，k是排名前250 位的匹配基因研究1。
对于人类蛋白质相互作用（PPI）数据集，我们下载了所有CORUM蛋白质复合物和HumanNet PPI（得分> 2）以得出高可信度PPI列表。为了识别高度连接的子网，我们在Cytoscape中将具有默认参数的MCODE聚类算法应用于此网络，并考虑了在多个KRAS SL研究中报告的基因簇，以进行下游分析27。使用gProfiler网络工具54针对CORUM或KEGG信号通路分析了聚类，以对聚类进行功能分类富集值已针对多次测试进行了校正。为了确定两个KRAS研究之间基于网络的重叠的重要性，我们从每个研究中测试的基因列表中随机选择了250个基因，并确定了两个研究中跨越基因的相互作用数以建立零分布。将该无效分布与两次研究之间观察到的实际重叠进行比较，以确定p值，定义为10,000个保留度的随机网络的一部分，该网络具有比实际数据中观察到的更多的相互作用。
为了在其他研究中比较基因集，我们使用百分位数方法，因为主观性是评估p值的临界值以从不同类型的筛选数据（即等基因与细胞系面板）中选择命中。在举行了KRAS SL屏幕数据集进行评估，我们获得的基因水平筛选从三个KRAS公布研究数据，7，8，9。命中率按Costa-Cabral研究中的排名进行。对于Kim研究，根据KRAS野生型和突变型细胞系之间的基本得分的平均差异，将基因排名为百分位。对于依赖关系图，分析数据可从depmap.org下载并进行类似处理，但仅限于被认为是独立研究的肺和结肠直肠细胞系。
根据RAS 2.0途径注释（https://www.cancer.gov/research/key-initiatives/ras/ras-central/blog/2015/ras-pathway-v2）的组合，将基因分配给指定的途径手动策展。使用双面t检验评估基因与特定途径之间的遗传相互作用的显着性，以从中位数零确定显着性。
MCF10A细胞从ATCC获得，C5N和CCH85细胞由Balmain实验室产生。在我们的实验中，MCF10A等基因细胞在三种条件下生长。完全培养基定义为：DMEM / F12、5％马血清，20 ng / ml EGF，0.5 mg / ml氢化可的松，100 ng / ml霍乱毒素和10ug / ml胰岛素；中间介质是DMEM / F12、5％马血清，0.5 mg / ml氢化可的松，100 ng / ml霍乱毒素和10μg/ ml胰岛素；最少的培养基是DMEM / F12和5％马血清。使小鼠细胞系在DMEM中以10％FBS加1X GlutaMAX（ThermoFisher）生长。
补充图12中提供了未裁剪的印迹 。在冰上用RIPA缓冲液（25 mM Tri-HCl，ph 7.5，150 nM NaCl，0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠，10％Triton-X，5 mM EDTA，pH 8.0）裂解细胞30分钟。沉淀并收集上清液，并用BCA蛋白定量获得蛋白浓度，在该研究中使用以下一级抗体（除非另有说明，以1：1000稀释）：BRCA1（C-20）（Santa-Cruz，sc-672）， 1：500的总KRAS抗体（Sigma，3B10-252），ERK1 / 2（p44 / 42）抗体（CST，＃9102），磷酸-ERK1 / 2（phosphor-p44 / p42）（CST，＃9101）， β-肌动蛋白（CST，＃3700），于1：2500。对于RT-PCT，将5,000个细胞铺在384孔板中，并分别用esiRNA转染48小时，然后使用Cells-to-CT试剂盒（Thermofisher ）。使用QuantStudio 5实时PCR系统，使用Power SYBR Green PCR预混液进行RT-PCR。将所有基因的Ct值标准化为参考基因ACTB，并表示为与esiEGFP对照相比的相对mRNA表达。使用的引物是以下的（正向，反向）（5′–3′）：MAP2K7（GTCCTCACCAAAGTCCTACAG，CTTTGGTCTCTTCCTGTGATCT）；GRB2（GGCTTCATTCCCAAGAACTACA，CTGTGATAATCCACCAGCTCAT）; YAP1（ACGACCAATAGCTCAGATCCT，CACCTGTATCCATCTCATCCAC）; GATA2（CAGAACCGACCACTCATCAAG，TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）; RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。将所有基因的Ct值标准化为参考基因ACTB，并表示为与esiEGFP对照相比的相对mRNA表达。使用的引物是以下的（正向，反向）（5′–3′）：MAP2K7（GTCCTCACCAAAGTCCTACAG，CTTTGGTCTCTTCCTGTGATCT）；GRB2（GGCTTCATTCCCAAGAACTACA，CTGTGATAATCCACCAGCTCAT）; YAP1（ACGACCAATAGCTCAGATCCT，CACCTGTATCCATCTCATCCAC）; GATA2（CAGAACCGACCACTCATCAAG，TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）; RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。将所有基因的Ct值标准化为参考基因ACTB，并表示为与esiEGFP对照相比的相对mRNA表达。使用的引物是以下的（正向，反向）（5′-3′）：MAP2K7（GTCCTCACCAAAGTCCTACAG，CTTTGGTCTCTTCCTGTGATCT）；GRB2（GGCTTCATTCCCAAGAACTACA，CTGTGATAATCCACCAGCTCAT）; YAP1（ACGACCAATAGCTCAGATCCT，CACCTGTATCCATCTCATCCAC）; GATA2（CAGAACCGACCACTCATCAAG，TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）; RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。使用的引物是以下的（正向，反向）（5′–3′）：MAP2K7（GTCCTCACCAAAGTCCTACAG，CTTTGGTCTCTTCCTGTGATCT）；GRB2（GGCTTCATTCCCAAGAACTACA，CTGTGATAATCCACCAGCTCAT）; YAP1（ACGACCAATAGCTCAGATCCT，CACCTGTATCCATCTCATCCAC）; GATA2（CAGAACCGACCACTCATCAAG，TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）; RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。使用的引物是以下的（正向，反向）（5′-3′）：MAP2K7（GTCCTCACCAAAGTCCTACAG，CTTTGGTCTCTTCCTGTGATCT）；GRB2（GGCTTCATTCCCAAGAACTACA，CTGTGATAATCCACCAGCTCAT）; YAP1（ACGACCAATAGCTCAGATCCT，CACCTGTATCCATCTCATCCAC）; GATA2（CAGAACCGACCACTCATCAAG，TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）; RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）；RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。TTGTGCAGCTTGTAGTAGAGG）；RALB（TCCACAAGGTGAATCATGGTTG，CAGCTTTGGTAGGTTCATAGTCT）; RHOA（GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT，GGCTGTCGATGGAAAAACACAT）; BRCA1（AATGGAAGGAGAGTGCTTGG，ATACCTGCCTCAGAATTTCCTC）; CCND1（GTGTCCTACTTCAAATGTGTGC，AGCGGTCCAGGTAGTTCA）; PAK2（CTATTGAGATGGTAGAAGGAGAGC，TTCTCTGGATTCTGAAGTTCTGG）；ACTB（ACAGAGCCTCGCCTTTG，CCTGGCACATGCCGGAG）。
总共1000个细胞/孔用0.05il /孔的RNAiMax和5 ng /孔的每个esiRNA进行一式四份的转染，转染后72小时，将板用3％多聚甲醛（PFA）固定，并用0.5％Triton- X。加入Hoechst 33342溶液（Themo＃62249），终浓度为4 µg / mL，并在37°C下孵育30分钟。使用Thermo CellInsight显微镜对细胞核进行计数。将细胞计数相对于每个平板中包含的阴性对照非靶向性靶向esiRNA 进行标准化，并通过比较KRAS与eGFP细胞中每种esiRNA的标准化计数，使用Student's t检验确定显着性p值。遗传相互作用评分基于Log 10（p价值）并签名以反映综合疾病（阴性）和病情增强（阳性）。p值用于使用本杰明·霍奇伯格方法55估计错误发现率（FDR）。对于esiRNA研究，非靶向esiRNA靶向eGFP（Sigma，＃EHUEGFP）。对于siRNA研究，siBRCA1是ON-TARGET SMARTpool（Dharmacon，＃L-003461-00-0005），siNT是ON-TARGET NT4（Dharmacon＃D001810-04-05）。
对于组合式E-MAP筛选，将96份esiRNA（“阵列”）中的每5 ng一式四份接种到384孔板中，并使用Mantis Liquid Handler向其中添加第二个恒定的“查询” esiRNA（5 ng）孔中加入10 µl RNAiMax以制备反向转染混合物，将细胞铺板并生长72小时。在终点，如上处理板以进行细胞计数。将计数归一化为每个板的中位数，并以Z评分。平均四个重复，以获得每个esiRNA组合的平均Z分数。
每个基因的细胞背景评分定义为三种条件下KRAS遗传相互作用评分的方差。遗传背景评分是基于 为每个基因确定的重要遗传抑制因子的数量（E-MAP相互作用评分Z > 2）。这两个指标的乘积用于定义排名，然后Z归一化以进行可视化。
第二天，在384孔板中接种总共1000个细胞/孔，并暴露于药物库中。通过将储备药物稀释成四个重复的4点稀释系列（500、250、50、5 ng / mL）来制备药物板。使用Caliper Zephyr液体处理器将每个剂量一式四份添加。在核计数之前，使细胞生长72小时。将细胞计数相对于DMSO对照孔进行标准化，并将剂量反应曲线（AUC）下的面积计算为所有4种浓度下增殖值的总和。
将细胞接种到含有盖玻片的6孔板中，并使其在生长前用talazoparib生长过夜。为了洗脱，将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并使其在没有他唑帕尼的新鲜培养基中生长。在室温下使用4％PFA固定细胞10分钟，在DPBS中使用0.3％Triton-X透化细胞，并在PBS中使用3％BSA封闭。将细胞与一抗在4°C（抗组蛋白γ-H2AX，＃07-627克隆PC130，Millipore Sigma 1：1000）和二抗（山羊抗小鼠Alexa Fluor 647多克隆，Thermo Fisher）中孵育过夜在室温下放置1小时。用PBS和水洗涤后，使用含DAPI的Prolong Antifade固定盖玻片（P36931）。使用ImageJ插件Foci Counter（康斯坦茨大学生物成像中心）对病灶进行定量。
对于IC 50的测定，将500个细胞接种到384孔板中过夜，然后将其暴露于药物中并增殖96小时。使用核计数对细胞进行定量，并与使用DMSO处理的细胞计数进行比较。拟合曲线并使用Graphad Prism非线性回归分析确定IC 50。对于集落形成测定，在添加药物之前将500个细胞在12孔板上铺板过夜。每72小时更换一次培养基和药物。固定细胞，并用20％甲醇中的1％结晶紫染色。用水洗涤板，干燥并使用Epson V600扫描仪成像。
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