单细胞基因组学对于绘制肿瘤生态系统至关重要。尽管单细胞RNA-Seq（scRNA-Seq）可以分析从新鲜肿瘤中分离的细胞中的RNA，但仍需要单核RNA-Seq（snRNA-Seq）来分析冷冻或难分离的肿瘤。每一种都需要针对不同的组织和肿瘤类型进行定制，这为采用提供了障碍。在这里，我们已经开发了系统的工具箱，分别使用scRNA-Seq和snRNA-Seq对新鲜和冷冻的临床肿瘤样品进行分析。我们分析了23个标本中40个样品的216,490个细胞和细胞核，这些标本涵盖了八种不同组织和样品特征的肿瘤类型。我们通过细胞和细胞核质量，恢复率和细胞组成评估了方案。匹配样品中的scRNA-Seq和snRNA-Seq可回收相同的细胞类型，但比例不同。
肿瘤包括恶性和非恶性细胞的复杂细胞生态系统，其多样性和相互作用会影响癌症的进展以及药物反应和耐药性。在单细胞基因组学最近的进展，特别是单细胞RNA测序（scRNA-SEQ），已经改变了我们来分析复杂的肿瘤的生态系统的肿瘤，揭示细胞类型，状态，遗传多样性和相互作用的能力1，2，3，4，5，6。肿瘤的单细胞分析正在迅速扩展，包括启动人类肿瘤图谱网络（HTAPP）作为Cancer Moonshot 7的一部分。
临床肿瘤标本的成功scRNA-Seq提出了许多挑战。首先，它需要针对肿瘤类型进行快速解离，并涉及酶消化，这可能导致敏感细胞丢失或基因表达改变。此外，获得新鲜组织是时间敏感的，并且需要组织采集和处理团队之间的紧密协调，这给临床环境带来了挑战。相反，单核RNA-Seq（snRNA-Seq）允许对从冷冻组织中分离出的单个核进行分析，从而将组织采集与即时样品处理脱钩。snRNA的-SEQ还能够处理不能成功地解离，即使当新鲜的样品，由于尺寸或细胞脆性8，9，以及对来自同一个人的纵向样品的多重分析10。但是，与细胞相比，细胞核的mRNA含量较低，要富集或消耗感兴趣的特定细胞类型更具挑战性。当应用于不同的肿瘤类型时，由于不同肿瘤中不同的细胞组成和细胞外基质（ECM），scRNA-Seq和snRNA-Seq都会带来实验挑战，因此每种测定都需要专门的定制11。
为了应对这些挑战，我们开发了一个系统工具箱，分别使用scRNA-Seq和snRNA-Seq处理新鲜和冷冻肿瘤（图1a）。该工具箱包含我们的实验工作流程和方法，计算管道和评估指标。为了概括肿瘤和样品类型，我们测试了具有不同组织特征的八种肿瘤类型（图1b），包括比较了来自同一肿瘤标本的新鲜和冷冻制剂。我们的工作提供了针对多种肿瘤类型的直接推荐方案，允许研究人员选择最适合他们研究目标的方案的决策树，以及有关如何针对新肿瘤和标本类型定制方案的指南。
a，sc / snRNA-Seq工作流程，实验和计算管道以及协议选择标准。b，研究中处理的肿瘤类型和样品。显示了新鲜（白色圆圈，细胞），冷冻（蓝色圆圈，细胞核）和冷冻保存（带下划线的圆圈，细胞（白色）和细胞核（蓝色））经过测试和选择的方案。O-PDX，患者原位异种移植；EZ，EZPrep；ST，盐和Tris；质量控制，质量控制；DE，差异表达；InferCNV，推断拷贝数变化，一种检测拷贝数偏差的方法。C4，胶原酶4和DNase I；PDEC，链酶，分散酶，弹性蛋白酶，胶原酶A和4和DNase I; LE，Liberase TM，弹性蛋白酶和DNase I；EZ，EZPrep；NST，含盐和Tris的Nonidet P40；CST，CHAPS（含盐和Tris）；TST，吐温加盐和Tris；LD，Liberase TM和DNase I；BTD，脑肿瘤分离；MHTD，Miltenyi Biotec人类肿瘤分离。
为了开发针对肿瘤sc / snRNA-Seq的定制方案工具箱，我们研究了八种具有不同组织特征的肿瘤类型（图1）。肿瘤类型具有以下特征：不同的起源细胞（例如上皮，神经元），实体和非实体细胞，患者的年龄和转变（例如原发性，转移性）。我们测试了各种组织和样品特征，包括切除，活检，腹水和原位患者来源的异种移植物（O-PDX）。我们收集了来自非小细胞肺癌（NSCLC），转移性乳腺癌（MBC），卵巢癌，神经母细胞瘤，胶质母细胞瘤（GBM），小儿高级别神经胶质瘤，慢性淋巴细胞性白血病（CLL），小儿肉瘤和黑色素瘤的样本（图。1B）。总共，我们分析了22位患者的216,490个细胞和细胞核，涉及22个患者，涉及40种样品制备方法。我们为在专用网站（https://tumor-toolbox.broadinstitute.org）中测试的每个样本提供了全面的分析摘要。
我们基于以下方面评估和比较了方案：（1）细胞/细胞核质量；（2）恢复的细胞数与预期的细胞/核数；（3）细胞组成（图1a）。对于“细胞/细胞核质量”，我们考虑了实验和计算指标。实验上，我们测量了细胞活力（针对scRNA-Seq），细胞/细胞核悬浮液中双链体或聚集体的程度以及整个转录组扩增后恢复的cDNA质量。通过计算，我们评估了映射到转录组，基因组和基因间区域的读段的百分比，超过最小基因和独特转录本（由独特的分子标识符，UMI反映）的细胞/核数，读段，转录本（ UMI）和每个细胞/细胞核中检测到的基因以及线粒体基因中UMI的百分比（请参见方法）。为了比较协议，当样本之间的测序饱和度或总读数之间存在显着差异时，我们还将样本之间的读数降采样为相同数量，然后重新估计并比较其QC指标。对于“回收的细胞数量与预期的细胞/细胞核数量”，我们评估了得分为可能为空的液滴的比例（即仅包含环境RNA而不是来自封装细胞的RNA 12）和双峰的比例13（请参见方法）。由于为细胞开发了空液滴的评分算法，因此我们没有使用它来评估snRNA-Seq。最后，对于“细胞组成”，我们考虑了捕获的细胞类型的多样性，从每个子集回收的细胞/核的比例以及在恶性细胞中回收的拷贝数畸变（CNA）模式类别（请参见方法）。如果协议可以恢复更大范围的细胞类型，我们认为这是一种优点，因为这有助于进行全面的研究。然而，捕获不同类型的细胞可能并不总是研究人员的预期目标，也不一定总是最准确地表示肿瘤的成分（请参见讨论）。）。我们基于CNA的存在（当可检测到时）和它们最相似的细胞类型标记来注释恶性细胞（请参见方法）。我们使用基于云的数据分析框架14 Cumulus进行了初始数据分析（请参见方法和图1a），并开发了专用的管道以进行额外的质量控制，肿瘤样本表征和方案比较。
我们定制样品采集和离解为scRNA-SEQ跨五种类型的新鲜肿瘤的（NSCLC，卵巢癌，MBC，神经母细胞瘤，GBM并冷冻保存CLL（图成功协议1B））。我们构建了工作流程，以最小化在临床环境中从患者体内取出样品与将其分离成细胞之间的时间间隔，以最大程度地提高细胞活力和RNA谱图的保存。我们确定每种肿瘤类型的解离条件，并构建特定步骤作为决策树，以调整临床样品之间的差异（例如，大小，红细胞（RBC）的存在；图2a和方法）。为了选择最有效的解离方法，在可能的情况下，我们将大的肿瘤标本分成较小的碎片（〜0.5–2 cm），并按照不同的方案进行分解。当样本大小受到限制时（例如，活检），优化将覆盖多个样本。我们对产生高度可行的单细胞悬液的样品进行了基于液滴的scRNA-Seq（请参阅“ 方法”），以便对大量细胞进行采样以计算QC指标。我们对协议进行了多次测试，以确认类似的性能趋势。
a，建议用于收集和处理新鲜肿瘤样品的流程图。b – f，比较应用于一个NSCLC样品的三种解离方案。b，协议性能因小区类型而异。顶部和中间：每个细胞的读取数目，每个细胞的UMI数目，每个细胞的基因数目和映射到线粒体基因（线粒体基因）的每个细胞的UMI分数的分布（中位数，第一和第三四分位数） ）（y轴）在整个数据集中的每个协议（x轴）中。下图：仅在上皮细胞（左）或B细胞（右）中每个细胞（y轴）的基因数量分布（中位数，第一和第三四分位数）。C，协议检测相似数量的双峰。每种协议的单个单元格轮廓（点）的统一流形近似和投影（UMAP）嵌入，通过分配为单个单元格（灰色）或双峰（红色）进行着色。水平条（底部）：单（灰色）和双峰（红色）单元的比例。d，协议的空液滴数有所不同。UMAP嵌入每种协议的单个单元格配置文件（点），通过分配为单元格（灰色）或空液滴（红色）进行着色。水平条（底部）：分配的单元格的比例（灰色）和空液滴（红色）。Ë，协议在捕获的细胞类型的多样性方面有所不同。UMAP嵌入来自所有三种协议的单个单元格配置文件（点），由分配的单元格子集签名（左）或协议（右）进行着色。底部：三种协议中每种协议的每个子集中的单元比例；k，通过QC的细胞数。f，推断的CNA配置文件。使用PDEC协议，可以推断单个细胞（行）中每个染色体位置（列）的染色体扩增（红色）和缺失（蓝色）。上图：该肿瘤中预期不包含CNA的参考细胞。底部：相对于参考单元格进行CNA测试的单元格。颜色栏：为每个单元格分配的单元格类型签名。g，成功耗尽CD45 +细胞。显示了NSCLC（顶部）和卵巢腹水（底部）样品中不含和带有CD45 +耗竭的每个子集中的细胞比例；k，通过QC的细胞数。 每个方案n = 1个样本。单元格数（k）在e和g中表示。来自NSCLC-C4，PDEC和LE的上皮细胞 数量分别为k = 1,284、641和260，而B细胞的数量分别为k = 100、121和78。ACK，氯化铵-钾。
对于解离，我们根据每种肿瘤类型的特定特征（例如细胞类型组成和ECM成分），文献综述以及来自处理类似人或小鼠组织的经验来选择酶混合物用于处理新鲜组织。例如，为了分解胶原纤维在乳腺癌15，16我们用的Liberase TM（见方法），而分解ECM在GBM 17我们使用了木瓜蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶）。我们还包括DNase I来消化从死细胞释放的DNA，以降低所有解离混合物的粘度。在下文中，我们建议那些能充分破坏ECM和细胞间粘附力的方法，同时最大程度地缩短处理时间，保持高活力并支持样品中细胞类型的多样性。
作为优化处理的一个例子，考虑一个切除NSCLC样品的深入分析（样品NSCLC14，图2B-F和扩展数据图1 - 3）。我们使用了三种处理方案：（1）胶原酶4（NSCLC-C4），（2）链酶，分散酶，弹性蛋白酶和胶原酶A和4（PDEC）的混合物，以及（3）Liberase TM和弹性蛋白酶（LE），分别在与DNase I组合使用（请参阅“ 方法”）。对于其他类型的肿瘤，我们显示了从所测试的方案中选择的方案的结果（图1b，2g和3a–e以及扩展数据图4a，b）。
a – d，质量控制指标。每个细胞的UMI的数目（一个），每个细胞的基因（数量b），每信元映射的UMI线粒体基因（的馏分C ^）和空滴（的馏分d）（X为每个样品轴）（Ý轴） 。中位数，第一和第三四分位数以a – c表示。e，细胞类型组成。分配给每个样品的每种细胞类型签名（颜色）的细胞比例。O-PDX，患者原位异种移植。指出了用于处理每种肿瘤类型的测试方案。F，推断出匹配的治疗前和治疗后神经母细胞瘤样品的CNA谱。从治疗前活检HTAPP-312-SMP-901（左）和治疗后切除术HTAPP-312-SMP推断出单个细胞（行）中每个细胞（行）的每个染色体位置（列）的染色体扩增（红色）和缺失（蓝色） -902（右）。上图：该肿瘤中预期不包含CNA的参考细胞。底部：相对于参考单元格进行CNA测试的单元格。颜色条：为每个单元格分配的单元格类型签名。 每个方案n = 1个样本。单元格数（k）在e中表示。Prot。，协议；NB，神经母细胞瘤；OPC，少突胶质祖细胞样细胞；NPC，神经祖细胞样细胞；NK，自然杀手；k。，套件。
协议通常在标准QC措施（例如，回收的细胞数量）上执行相似的操作，但是在回收的细胞多样性或预计仅包含环境RNA的液滴分数（“空液滴”）方面存在明显差异，这是我们优先考虑的两个评估标准。例如，在NSCLC14切除样本中，所有方法均产生了数量相似的具有高质量表达谱的细胞（图2b，e和扩展数据，图1a–c），双峰（图2c）和恶性的CNA模式。单元（图2f和扩展数据图1d）。但是，只有PDEC和LE方案可以恢复成纤维细胞和内皮细胞（图2e和图1c的扩展数据）），NSCLC-C4的液滴百分率更高，称为“空”（PDEC和LE中分别为7％对0.08％和0.04％；图2d和扩展数据图1a）。NSCLC-C4中指定为“空”的液滴聚集在最常见的细胞类型巨噬细胞内（图2d和扩展数据图1c），这表明这些细胞条形码的测序饱和度较低或样品本身具有较高的环境RNA内容。尽管我们估计在三种方案中环境RNA 18的水平相似（扩展数据，图1e），但NSCLC-C4确实具有较低的总体测序饱和度（扩展数据，图1a）。
由于细胞类型回收率和制备之间的测序深度不同，因此比较整个协议的QC指标可能具有挑战性，我们通过评估每种细胞类型内的QC指标并通过整个协议的总读数下采样来控制NSCLC14样品中的差异（图2b）和扩展数据（图2）。例如，当我们考虑NSCLC14样本中的所有细胞时，NSCLC-C4的检测基因数量明显更高（P = 1.3×10 -90相对于PDEC； 1.4×10 -62相对于LE，两侧曼恩·惠特尼U测试），但在B细胞中，PDEC的检测基因数量明显更高（相对于NSCLC-C4，P = 2×10 -15； 2×10-10对LE），而在上皮细胞中，LE的数目最高（对NSCLC-C4，P = 5×10 -6；对PDEC ，2×10 -4）（图2b）。因为检测到的基因数量（和其他度量标准）在细胞类型之间有所不同，并且细胞类型组成在协议之间也有所不同（图2e），所以在选择协议时评估特定于细胞类型的QC非常重要。此外，较低的测序饱和度不能直接反映出NSCLC-C4协议的性能，并且通过总读取数进行的下采样并不能从质量上改变我们的任何协议评估指标（扩展数据，图3）。）。考虑到所有这些功能，我们选择了PDEC协议来处理NSCLC肿瘤样本，因为它平衡了细胞类型的多样性和每种细胞类型的QC。
因为在某些肿瘤标本中恶性细胞的比例相对较低，免疫细胞的比例特别高，所以我们考虑了消耗CD45 +免疫细胞的策略，既可以富集没有特定标记的上皮细胞，又可以维持任何基质细胞。我们选择将MACS MicroBeads与抗CD45抗体一起使用，而不是通过流式细胞术（FACS）进行分选，因为在预订分选器的指定时间样品并不总是可用，并且FACS需要更长的样品处理时间，这可能会带来额外的细胞压力，就像我们发现的上皮细胞一样（数据未显示）。
我们通过测试不同的商业试剂盒并评估一轮和两轮消耗的影响，优化了CD45 +细胞的消耗策略（数据未显示）。例如，我们用scRNA-Seq对耗竭前后的NSCLC肿瘤样本（NSCLC17）进行了分析，发现上皮细胞从26％增至82％（图2g和Extended Data图4a），并且在免疫后几乎没有分析出免疫细胞消耗。同样，在卵巢腹水样品（HTAPP-727）中，我们通过耗竭后的scRNA-Seq回收了32％的上皮细胞（图2g和图4b的扩展数据），而CD45 −EpCAM +通常通过FACS在卵巢腹水中发现细胞（数据未显示）。一致地，FACS显示，CD45 +另一个腹水样品的细胞耗竭增加非免疫的（CD45整体比例- ）细胞从0.75％至29.4％和增加的EpCAM的比例+细胞从0.17％至4.9％（扩展数据图。4C）。
我们成功地将scRNA-Seq工具箱应用于来自不同解剖部位的更小的核心活检临床样品。例如，在MBC中，我们将LD（Liberase TM和DNase I）方案应用于两名患者淋巴结转移的切除术（HTAPP-254）和活检（HTAPP-735），产生了同样成功的QC（图3a） –d）。两名患者的切除和活检具有不同的细胞组成（图3e）：与切除相比，活检的上皮，内皮和成纤维细胞比例更高，T细胞比例更低。我们同样成功地通过相同的方案对MBC肝转移活检（HTAPP-285和HTAPP-963）进行了分析（图3a–d），除了在淋巴结活检中发现的相似细胞类型范围外，还可以恢复一些肝细胞（图3e）。因此，该方案可用于来自不同解剖转移部位的乳腺癌转移。
scRNA-Seq工具箱在处理后获得的样品上也表现良好，这可能因细胞死亡和处理后细胞类型组成的变化而带来挑战。例如，使用NB-C4协议对同一神经母细胞瘤患者进行的治疗前诊断活检（HTAPP-312-pre）和治疗后切除（HTAPP-312-post）均产生较高的QC（图3a– d）和恶性细胞中类似的CNA模式（图3f）。与治疗后切除（786个细胞：神经内分泌，T细胞，巨噬细胞以及内皮细胞）相比，治疗前活检（4,369个细胞：神经内分泌，T细胞和巨噬细胞）回收的细胞更多，但细胞类型更少。和成纤维细胞）（图3e），与观察到的治疗后纤维化一致。我们成神经细胞瘤O形PDX样品中测试的附加离解协议（木瓜蛋白酶）（O-PDX1）19，20，这是不预期包括非恶性人类细胞和确实导致了高品质的恶性细胞型材（图3a中–e）。木瓜蛋白酶方案的实验质量控制优于我们在其他NB-C4样品中观察到的质量控制，这一趋势在其他神经母细胞瘤样品中得到了证实（数据未显示）。因此，我们最终选择了针对神经母细胞瘤肿瘤的木瓜蛋白酶方案。
除了此类NSCLC，卵巢癌腹水，MBC和神经母细胞瘤样品外，我们还建立了针对GBM（GBM125），CLL（CLL1）和卵巢癌肿瘤（HTAPP-624）的有效scRNA-Seq方案（图3a–e）。特别地，在CLL中，我们成功地从含有活细胞的冷冻保存样品中恢复了预期的细胞类型。与其他类型的细胞相比，这也反映了免疫细胞对冷冻的抵抗力增强，这在其他环境中也可以观察到21，并且CLL scRNA-Seq中没有解离步骤（请参见方法）。然而，冷冻保存可以增加受损细胞22的比例，并且可能不能成功地恢复肿瘤中的所有恶性和其他非恶性细胞。
对于来自实体瘤的冰冻标本，我们优化了snRNA-Seq，评估了跨越以下7种肿瘤类型的细胞核分离方法（图4a和方法）：神经母细胞瘤，MBC，卵巢癌，小儿肉瘤，黑素瘤，小儿高度神经胶质瘤和CLL （图1b）。我们最初分配较大的样本或使用多次活检比较四种分离方法：EZPrep 8，含盐和Tris（NST）的Nonidet P40（从参考文献23修改），CHAPS，含盐和Tris（CST）11和含盐的吐温和Tris（TST）11。这些方法的主要区别在于机械力（例如，切碎或下垂），缓冲液（EZ与ST）和/或去污剂组成（请参见“ 方法”）。因为在早期测试中，EZPrep通常不如CST，NST和TST出色（数据未显示），所以我们在初始比较中仅将EZPrep包括在内（如下所示）。我们将来自所有测试方案的单核悬浮液用作基于液滴的snRNA-Seq的输入（请参见“ 方法”），从而对足够多的细胞进行采样以评估细胞多样性和QC。
a，收集和处理冷冻肿瘤样品的流程图。b – e，在一个神经母细胞瘤样品中比较四种核分离方案。b，变异协议性能：每核，每核和每个核映射的UMI线粒体基因（的部分的基因的数量的UMI的数目的分布（中位数和第一和第三四分位数）ý（在每个协议轴）X轴）跨数据集中的所有核。C，协议检测相似数量的双峰。UMAP嵌入每个协议的单个核分布图（点）通过分配为核（灰色）或双峰（红色）进行着色。单杠（底部）：单核（灰色）和双核（红色）的分数。d，协议在捕获的细胞类型的多样性方面有所不同。UMAP嵌入来自所有四个协议的单个核分布（点）的颜色由分配的细胞子集签名（左）或协议（右）进行着色。下：每个方案中每个子集的细胞比例。k，通过QC的核数。Ë，推断CNA配置文件。显示了从TST协议推断出的跨单个核（行）的每个染色体位置（列）中的染色体扩增（红色）和缺失（蓝色）。上图：此肿瘤中预期不包含CNA的参考核。下图：相对于参考原子核测试了CNA的原子核。颜色条：为每个核分配的细胞类型签名。 每个方案n = 1个样本。核数（k）在d中表示。OCT，最佳切削温度化合物。
为了评估方案，我们使用了上述事后计算标准（图1a），但我们排除了空滴的估计，因为它仅在单细胞RNA-Seq数据上开发和测试。我们进一步针对snRNA-Seq数据定制了Cumulus 14，将读码映射到外显子和内含子，并调整了转录本（UMI）和基因计数的QC阈值，以反映核中较低的预期mRNA含量（请参见方法）。在实验上，我们添加了过程中的光学显微镜QC，以确保完全隔离核并估计双峰，聚集体和碎片（图4a和方法）。与scRNA-Seq一样，我们多次测试了协议以确认类似的性能趋势。
总体而言，根据评估的核质量，三种核分离方法（TST，CST和NST）具有可比的性能（图4b–d和5和扩展数据图5和6），其中TST通常产生最大的细胞类型多样性和每个细胞类型的细胞核数目最多，线粒体基因的表达最高，而NST通常每个细胞核的基因最少，细胞类型的多样性最低。例如，在神经母细胞瘤中，在单个切除样本（HTAPP-244）上测试这四个方案中的每一个都产生了相似数量的高质量核（EZ，CST，NST和TST分别为7,896、6,157、7,531和7,415） （图4b–d和扩展数据图5a–c），细胞核双峰（图4c），细胞类型-恶性神经内分泌细胞最多见（图4d和扩展数据图5c），恶性细胞具有可检测到的CNA（图4e和扩展数据图5d；正如该儿科低风险样本所预期的那样，CNA不太突出。与三种ST方案相比，用EZ方案制备的核具有较少的UMI和检测到的基因（图4b）。与其他方案相比，TST回收了更多的内皮细胞，成纤维细胞，神经c细胞和T细胞（图4d）。TST还产生了更高的线粒体基因表达（图4b）），在这种和所有其他测试的肿瘤中（图5c），因为当使用这种方法时，核膜，内质网和核糖体仍附着在核上11。在特定于细胞类型的QC中保留了相同的趋势（扩展数据，图6），在下采样后，按测序读数的总数进行了保留（扩展数据，图7）。
a – c，QC指标：每个核的UMI数量（a），每个核的基因数量（b）以及每个核的UMI映射到线粒体基因的比例的分布（中位数，第一和第三和四分位数）（c）每个样本的（x轴）（y轴）。d，细胞类型组成，显示分配给每个样品的每个细胞类型特征（颜色）的核比例。 每个方案n = 1个样本。核数（k）在d中表示。
当与MBC，卵巢癌和小儿肉瘤样品进行测试时，CST，NST和TST核分离方法具有相似的性能特征，其中TST提供了细胞类型最多的多样性，尤其是在非恶性细胞中。在MBC中，我们比较了一个转移性脑切除术（HTAPP-394）中的CST和NST，以及另一个转移性脑切除术（HTAPP-589）和转移性肝活检（HTAPP-963）中的CST和TST（图5）。在所有情况下，方案之间的QC统计数据（图5a–c）和CNA模式（扩展数据图8a–f）相似，上皮细胞核最为普遍（图5d）。）。CST和NST捕获了非常相似的细胞类型分布，而TST捕获了更多的非恶性细胞，包括T细胞（图5d）和更高比例的线粒体读物（图5c）。在卵巢癌中，CST，NST和TST从同一样品中恢复了相似的CNA模式（HTAPP-316；扩展数据图8g–i），但TST捕获了最大的细胞类型多样性（图5d），而NST回收了更少的细胞核，每个核的基因和每个核的UMI（图5a–c），并且细胞类型多样性较低（图5d），尽管总体测序深度更大（73％的测序饱和度，而CST中为57％，TST为50％）。在横纹肌肉瘤样品（HTAPP-951）中，CST和TST以相似的比例捕获了相同的细胞类型（图5d），并显示出相似的CNA模式（扩展数据图8j，k）。
总体而言，对于大多数肿瘤类型，我们选择了TST方案，对于神经元组织（例如小儿高级神经胶质瘤）而言，我们选择了CST。使用我们选择的方案（图1b，右列），我们分析了其他神经母细胞瘤肿瘤（HTAPP-656，O-PDX1）以及尤因肉瘤（HTAPP-975），黑素瘤（MEL112，MEL128），小儿高等胶质瘤（HTAPP-443）和CLL（CLL1）肿瘤样本-活检，切除和治疗样本（图1b和5）。我们还通过两种不同的化学方法对儿科横纹肌肉瘤样品（HTAPP-951）进行了基于液滴的snRNA-Seq的测试（来自10x Genomics的V2与V3；请参阅方法），在检测到的细胞类型方面获得了总体上相似的结果，但是在V3中恢复的核数比预期的核数更高，每个核的复杂性更高（扩展数据图9）。
我们通过在神经母细胞瘤（HTAPP-656，图6a–g），MBC（HTAPP-963，图6h–n），CLL（CLL1，扩展）中测试来自同一标本的匹配样品，比较了scRNA-Seq和snRNA-Seq 数据图10a–g）和O-PDX（O-PDX1，扩展数据图10h–n）。两种方法通常恢复相似的细胞类型，但有时比例不同。在神经母细胞瘤和MBC中，免疫细胞在scRNA-Seq中更为普遍，而实质细胞（尤其是恶性）在snRNA-Seq中更为普遍（图6a–d，h–k）。在所有测试的肿瘤类型中，通过规范相关分析（CCA 24，请参见方法）进行批校正后，细胞和细胞核易于对齐），按单元格类型分组（图6e–g，l–n和扩展数据图10e–g，l–n）。
最后，我们利用匹配的数据来检查离解的新鲜组织细胞中的表达模式表明特定应力的程度，并将其与速冻组织的细胞核中的表达模式进行比较。为此，我们在最近发布的“解离签名” 25的匹配数据中对每个细胞或细胞核进行了评分（扩展数据图10o-r）。通常，在比细胞核更大比例的细胞中可检测到解离签名，尤其是在实体瘤（神经母细胞瘤和MBC）中，并且在细胞中的解离签名明显更高（P <1×10 -100，两面的Mann–Whitney U检验）。但是，当存在于细胞核中时，这些细胞核与高分细胞被嵌入表型空间的相同区域。值得注意的是，在细胞和细胞核中，签名在免疫细胞（例如T，NK和巨噬细胞）和基质细胞（例如成纤维细胞和内皮细胞）中更为突出。尽管这可能是一些实质细胞中解离破坏的标志，但也可能是免疫激活和更广泛的立即早期反应的标志。结果，在特殊情况下对“解离签名”的解释必须格外小心，要考虑到其细胞（而非核）数据源及其与立即早期基因表达的关系（原位自然反应为好）。
临床肿瘤的单细胞基因组学标本获得常规疾病管理或通过研究活检应有助于指导新的发现和治疗的更好的展开部26，27，作为最初的研究在神经胶质瘤的情况下表现出6，17，黑色素瘤3，28，头和颈部鳞状细胞癌4，29和其他恶性肿瘤30，31，32，33，34。但是，这需要适应实验室协议，这些协议最初是在研究环境中开发的，并且需要非常快速地处理新鲜组织，以适应临床样品采集和处理的需要。确实，这些最初的研究通常是从切除物中或少量容易分离的免疫细胞中采集到的少量样品。分析涉及多个站点的临床试验或纵向研究中需要的大量样品，要求简化和健壮的方案。此外，系统地表征实体瘤中的各种细胞需要细胞的强劲恢复，其中许多细胞，包括恶性上皮细胞，都是高度敏感的。肿瘤和转移所处的组织的多样性进一步加剧了这些挑战。
在这里，我们通过开发用于单细胞和单核RNA-Seq协议的系统工具箱来应对这些挑战，并提供从样品采集到文库制备的详细工作流程和协议，以处理八种肿瘤类型的新鲜和冷冻临床肿瘤样品，以及用于处理未来临床肿瘤样品的测试和选择方案的指南。我们在https://github.com/klarman-cell-observatory/HTAPP-Pipelines提供了用于广泛的QC的计算管道，并且所有实验室协议均在开放访问平台protocol.io中以详细的形式提供。
当选择新鲜组织离解的方案时，我们建议测试根据肿瘤类型和组织组成选择的两种至三种解离方法，并根据新鲜样品决策树进行处理（图2a）。通过评估实验和计算质量控制指标，我们选择了性能最佳的协议，并且，如果需要，增加了消耗步骤。当选择冷冻组织的方案时，我们建议测试NST，TST和CST方案，并根据我们的snRNA-Seq工作流程进行处理（图4a）。尽管TST由于能够捕获最多种细胞而通常是有利的，但在某些肿瘤中，我们建议使用CST或NST（例如，用于小儿高级别神经胶质瘤的CST；图1b）。CST还产生较少的线粒体读数，从而降低了测序成本。对于sc-和snRNA-Seq，重要的是要评估多个样品上的所选方案，以确保一致的性能（考虑到肿瘤固有的变异性）。
尽管我们指明了我们最终针对八种肿瘤类型选择的方案，但是由于样品的特性和研究问题，最佳方案对于其他研究可能有所不同。首先，每个患者和每个样本都是不同的，研究人员必须在统一的方案和对成功的现实期望之间取得平衡。其次，“理想”方案取决于研究目标。正如我们所展示的，大多数协议在细胞恢复方面各有不同，目前尚不清楚哪一种协议能够提供细胞组成的全部基本信息。而且，即使一个协议确实提供了忠实的细胞组成，研究人员也可能会选择另一种方法。例如，一些研究人员可能希望检测尽可能多的细胞类型（并且可能更喜欢富集稀有细胞的一种细胞），其他人可能对特定类别的细胞感兴趣，并选择最成功的细胞恢复方式，而另一些人则希望比较肿瘤中的细胞比例，并希望它们能最忠实地体现出来。我们的决策树将帮助研究人员做出最适合他们的样本和问题的明智选择。
当研究人员着手测试新协议时，一些原理可以帮助实验设计。首先，由于临床样本通常具有固有的局限性，因此通常无法对单个匹配样本进行基准测试和技术开发。对于新鲜样品的解离尤其如此，因为它需要较大的输入样本和非常快速的处理。在这种情况下，我们建议在多个样本中测试不同的协议。研究人员还可以选择我们提出的一种协议作为进一步优化的起点。对于新鲜组织，研究人员应首先通过过程QC评估组织解离，尤其是细胞活力和解离成单细胞悬液的程度，只有通过那些的样品才应进行scRNA-Seq（例如，在MBC中，我们先前已经排除了使用Accumax进行解离的情况（数据未显示）。在进行性能分析之前，还可以使用FACS作为附加的质量控制。由于它们需要组织的较小部分并且可以在方便的时间启动，因此更容易执行并行的核分离协议评估。但是，核的过程中实验性QC信息较少，通常需要snRNA-Seq来评估性能。
由于scRNA-Seq和snRNA-Seq的回收细胞组成不同，因此在可能的情况下分析新鲜和冷冻的肿瘤样品都是有利的。scRNA-Seq和snRNA-Seq之间的选择通常取决于样品的可用性，物流和生物学问题。scRNA-Seq可测量整个细胞的表达，完整的细胞膜可通过CITE-Seq 35选择特定的细胞群并进行蛋白分析。snRNA的-SEQ解耦处理样品采购，从难以离解的样品中恢复的核（例如，骨，脂肪和肝），并允许复用计随时间的样品36，37，包括来自银行。这可以帮助样品选择和实验设计，减少批次效应，并可以研究可能从许多地点收集的稀有或不寻常样品。
我们的工具箱将帮助研究人员系统地分析其他人类肿瘤，从而加深对肿瘤生物学的了解。该工具箱将支持绘制高分辨率肿瘤细胞图谱7，这将产生可为临床工作提供信息的见识，并应有助于提高诊断和治疗的准确性。
外部样本队列已添加到Broad Institute的《癌症分子分类》方案中（15–370B），并由Dana-Farber癌症研究所（DFCI）的机构审查委员会（IRB）进行了审查和批准。作为广泛协议的一部分，没有进行受试者招募或确定。添加到此协议中的样本还需要在最初收集样本的机构进行IRB审查和批准。具体而言，DFCI IRB批准了以下协议：NSCLC（IRB协议98-063），MBC（IRB协议05-246），神经母细胞瘤（IRB协议11-104和17-104），卵巢癌（IRB协议02-051），黑色素瘤（IRB协议11-104），肉瘤（IRB协议17-104），GBM（IRB协议10-417）和CLL（IRB协议99-224）和圣裘德儿童研究医院IRB批准了以下协议：
圣裘德儿童研究医院IRB审查并批准了用于创建神经母细胞瘤O-PDX样品的XPD 09-234 MAST（实体瘤的分子分析）方案。
对于神经母细胞瘤O-PDX样品，动物用途仅限于一只雌性裸胸腺小鼠用于O-PDX细胞的肾上腺旁注射。严格按照美国国立卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行这项研究。该方案已由圣裘德儿童研究医院的机构动物护理和使用委员会批准。尽一切努力使痛苦最小化。按照批准的IACUC方案饲养所有小鼠。以12-12小时的光照周期饲养动物（每天6:00和18:00熄灯），并随意提供食物和水。无胸腺裸雌鼠购自Charles River Laboratories（株号553）。
按照建立的协议以减少从身体中取出肿瘤组织，将标本放入培养基和处理scRNA-Seq。为此，我们在手术日之前在医院团队（外科医生/临床研究协调员/临床病理学家），协调团队（项目经理/病理技术人员）和处理团队（工作人员科学家/研究技术人员）之间建立了程序。这包括向医院团队提供带有适当介质的收集容器，并预先确定分配优先级，以确保病理技术人员快速处理收到的样品。在手术当天
在所有情况下，均由研究病理技术人员检查从医院团队收到的组织，并在采购标本以进行解剖病理学检查后，将质量最高的部分（或核心）分配给scRNA-Seq，并置于培养基中。按照适当的规程运输到Broad解离研究所（以下每种肿瘤类型的详细协议）。在收集时根据视觉检查和快速病理解释评估组织质量，并根据肿瘤含量，坏死，钙化，脂肪和出血确定组织质量。
对于卵巢癌腹水，通常在从体内取出后1小时内可从医院团队那里获得约300 ml，其中含有绝大多数非恶性（主要是免疫）细胞。因此，对所有腹水样品进行CD45 +细胞去除（下图）以富集恶性细胞。
对于CLL，从使用密度离心（Ficoll-Paque）分离的外周血单个核细胞中生成样品，并将其存储在液氮中的冷冻培养基（FBS + 10％DMSO）中直至处理。
对于神经母细胞瘤样品的O-PDX，通过超声引导的肾上腺旁肾上腺素注射法将Foxn1 - / -裸鼠（Charles River Laboratories）原位注射来自患者MYCN放大的神经母细胞瘤的细胞（可通过儿童期固体肿瘤网络获得的样品SJNBL046_X1） ）19，20。O-PDX肿瘤的一部分被快速冷冻以用于未来的snRNA-Seq，而其余部分则如下所述进行了解离。
对于我们前瞻性收集的snRNA-Seq样本（神经母细胞瘤HTAPP-244-SMP-451和HTAPP-656-SMP-3481），使用标准生物库技术将样本收集后尽快冷冻样品。记录样品冷冻的日期。（其他样品是从组织库中获得的，关于它们如何冷冻的记录有限，这是典型的情况。）将样品放在没有任何液体的冷冻管中。在放入冷冻管之前，通过轻轻擦拭容器侧面上的液体（不要拍打，否则会损坏组织）来完成从样品中完全除去液体的操作。然后将试管用干冰覆盖，并转移至-80°C进行长期保存。
其他来自snRNA-Seq的冷冻样品是从组织库中获得的，如下所示：卵巢最佳切割温度化合物（OCT）-冷冻档案样品是从DFCI妇科肿瘤组织库中获得的；肉瘤速冻样品取自波士顿儿童医院组织库；儿科速冻神经胶质瘤样本来自圣裘德儿童研究医院生物资源库；神经母细胞瘤速冻样品取自圣裘德儿童研究医院生物存储库和波士顿儿童医院Precision Link生物库以进行健康发现；MBC OCT冷冻样品获自癌症精密医学中心。快速冷冻的黑色素瘤样品是通过BWH的C. Yoon博士的实验室获得的。
使用相似的工作流程（图2a）对MBC，NSCLC（协议PDEC和LE），卵巢癌实体瘤和神经母细胞瘤进行新鲜组织离解，每种肿瘤类型均具有离解混合物的不同成分，如下一节所述。
从介入放射学（活组织检查）或手术室（切除）中的样品转移到DMEM（MBC），RPMI（NSCLC）或带有HEPES（卵巢癌和神经母细胞瘤）的RPMI中。到达实验室后，将样品在冷PBS中洗涤，并转移至装有解离混合物的2 ml Eppendorf管（用于活检）或含有3 ml离解混合物的5 ml Eppendorf管（用于切除）。接下来，使用弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号15514-12）在Eppendorf管中将样品切碎成〜0.4 mm以下的碎片，并在37°C下孵育，同时以〜14 rpm水平旋转10分钟。分钟 10分钟后，在室温下用1 ml移液器吸头将样品移液20次，然后再旋转孵育10分钟。g在4°C下持续4–7分钟。除去上清液，将沉淀重悬于200–500 µl ACK（氯化铵-钾）RBC裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，A1049201）中。ACK的添加量取决于沉淀的大小。虽然颗粒大小难以量化，但我们建议每100,000个细胞添加约100μlACK裂解缓冲液，最小体积为200μl。将样品在ACK RBC裂解缓冲液中在冰上孵育1分钟，然后以两倍于ACK体积的量加入冷PBS。通过短旋转设置，在4°C下短暂离心8 s，沉淀细胞，离心力逐渐增加，但不超过11,000 g。除去上清液。评估颗粒的颜色；如果保留了RBC（颗粒颜色为粉红色或红色），则将ACK步骤最多重复两次。为了去除MBC方案（或样品）中的细胞团，将沉淀重悬于100 µl TrypLE（Life Technologies，目录号12604013）中并孵育，同时用200 µl移液器吸头在室温下持续移液1分钟。加入200μl含10％FBS的冷RPMI 1640灭活TrypLE。如上所述，通过短时间离心沉淀细胞。将沉淀重悬于PBS中的50μl的0.4％BSA（Ambion，目录号AM2616）中。为了评估单细胞悬液，活力和细胞计数，将5 µl台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，产品目录号T10282）与5 µl样品混合，并上样至INCYTO C芯片一次性血细胞计数器，纽鲍尔改进型（VWR，目录号82030-468）。如果需要，可以将细胞浓度调整为200–2,000个细胞/μl。将总共8,000个细胞装入10x Genomics单细胞铬控制器的每个通道中。由于临床样品之间的差异，可能需要重复或调整某些步骤。有关准则的一般概述，请参见图。2a。
带有以下修改的协议NSCLC-C4使用了类似的工作流程。如上所述进行机械切割后，将样品在15 ml猎鹰管中解离15分钟，每5分钟轻轻涡旋一次，然后通过70 µm过滤器过滤，并用20 ml冰冷的PBS洗涤并在580离心g 5分钟。与上述工作流程类似，通过将沉淀重悬于1 ml ACK裂解缓冲液中并在冰上孵育1分钟来进行RBC裂解。加入20 ml体积的冰冷PBS以淬灭ACK裂解缓冲液，然后通过70 µm过滤器过滤，并在580 g下离心5分钟 根据制造商的说明，使用Viahance死细胞去除试剂盒（BioPAL，目录号CP-50VQ02）进一步清洗样品NSCLC14。然后将细胞重悬于M199中，并如上所述加载到10x Genomics单细胞铬控制器上。
所有步骤均在冰上完成。将每个样品在培养皿中彻底切碎，加入4 ml HBSS（Life Technologies，目录号14175095），然后将样品转移到15 ml试管中，并以1,000 rpm离心2分钟。离心后，除去上清液，加入预热的解离混合物，并将样品在37°C振荡的同时孵育15分钟。将样品上下吸移20次，在37°C下再温育15分钟，然后再次吸移。解离后，将样品通过100μm细胞过滤器（Fisher Scientific，目录号22–363–549）过滤到50 ml试管中。我们建议将所有组织碎片留在细胞过滤器中，因为如果初始细胞回收率较低，则可以使用相同的方案对其进行再处理。将滤液以1,000 rpm离心3分钟，并除去上清液。如果沉淀物是血性的，则在需要时使用Lympholyte H（Cedarlane，目录号CL5015）或RBC Lysis Solution（10x）（Miltenyi Biotec，目录号130-094-183）进行RBC去除。将沉淀用10ml冷PBS / 1％BSA洗涤，转移至15ml管中，并以1200rpm离心3分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于PBS中的0.4％BSA中。如上所述，将单细胞悬浮液可视化，计数并加载到10x Genomics单细胞铬控制器上。除去上清液，并将沉淀重悬于PBS中的0.4％BSA中。如上所述，将单细胞悬浮液可视化，计数并加载到10x Genomics单细胞铬控制器上。除去上清液，并将沉淀重悬于PBS中的0.4％BSA中。如上所述，将单细胞悬浮液可视化，计数并加载到10x Genomics单细胞铬控制器上。
解冻混合物的制备大约需要5-10分钟，然后从冷冻的等分样品中进行样品处理，如下所示。
RPMI 1640的950微升体积（。赛默飞世尔科技，目录号11875093）中的溶液与10μl的10毫克使用毫升-1 DNA酶I（Sigma Aldrich公司，目录号11284932001。）至100的最终浓度微克毫升- 1和40 µl 2.5 mg ml -1 Liberase TM（Sigma Aldrich，目录号5401127001）。
解离混合物基于Miltenyi人类肿瘤解离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号130-095-929）。在开始之前，根据制造商的说明将酶H，R和A重悬。在使用前，立即制备含有2.2 ml RPMI，100 µl酶H，50 µl酶R和12.5 µl酶A的解离混合物。
带有Hanks平衡盐缓冲液（Thermo Fisher Scientific）的培养基199与100 µg ml -1的DNAse I（Millipore Sigma，目录号11284932001）和100 µg ml -1胶原酶IV（Worthington，目录号LS004186）一起使用。 。
使用木瓜蛋白酶试剂盒，沃辛顿木瓜蛋白酶解离系统（目录号LK003150）。根据制造商的说明进行解离，解离持续时间的偏差缩短到15分钟。
我们使用2692微升HBSS（赛默飞世尔科技，产品目录号14170112），187.5微升20毫克毫升-1链霉蛋白酶（Sigma Aldrich公司，目录号10165921001），以1250微克ml的终浓度-1，27.6微升的1 mg ml -1弹性蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号NC9301601）至9.2 µg ml -1的终浓度，30μl10 mg ml -1 DNase I（Sigma Aldrich，目录号11284932001）至100微克毫升终浓度-1，30微升10毫克毫升-1分散酶（Sigma Aldrich公司，目录号4942078001）至100的最终浓度微克毫升-1，30微升的150毫克毫升-1最终浓度为1,500 µg ml -1的胶原酶A（Sigma Aldrich，目录号10103578001）和最终浓度为1,250的3 µl 100 µg ml -1胶原酶IV（Thermo Fisher Scientific，目录号NC9836075） µg ml -1。
我们使用4.7毫升RPMI 1640（赛默飞世尔科技，产品目录号11875093），200微升2.5毫克毫升-1的Liberase TM（Millipore公司西格玛，目录号5401119001）至100微克ml的终浓度-1，50 µl 10 mg ml -1 DNase I（Sigma Aldrich，目录号11284932001）至终浓度100 µg ml -1和46 µl 1 mg ml -1弹性蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号NC9301601）最终浓度为9.2 µg ml -1。
M199（5 ml）与DNase 1（最终浓度为10 µg ml）和胶原酶IV（最终浓度为100 µg ml -1）一起使用。
脑肿瘤解离试剂盒（P）（Miltenyi Biotech，目录号130-095-942）与4 ml缓冲液X，40 µl缓冲液Y，50 µl酶N和20 µl酶A一起使用。
将冷冻的（冷冻保存的）细胞在10ml RPMI中解冻，沉淀并用另外的10ml RPMI洗涤。使用MoFlo Astrios EQ细胞分选仪对活细胞进行分选，并将8,000个细胞上样到10x Genomics Single-Cell Chromium Controller的一个通道上。剩余的细胞通过短暂离心沉淀，弃去上清液，将沉淀在干冰上冷冻并保存在-80°C。
选择没有球的腹水样品，将其送入四个50 ml锥形管中，总共注入200 ml液体。将试管在4°C的预冷离心机中以580 g离心5分钟，然后吸出上清液。
将小丸重悬于5 ml冷ACK裂解缓冲液中，并在此步骤从所有试管中合并。在冰上进行ACK裂解3分钟，然后加入10 ml冷PBS淬灭，然后在4°C下以580 g离心5分钟。评估颗粒颜色；如果它是粉红色或红色，表明有大量的红细胞，则根据需要最多重复进行ACK处理步骤两次。ACK处理后，将沉淀物重悬于20 ml冷PBS中，通过70 µm细胞滤网过滤到50 ml锥形管中，并用另外的20 ml冷PBS洗涤滤纸以回收尽可能多的细胞。然后将样品在4°C下以580 g离心5分钟。为了减少样品中免疫细胞的比例，CD45 + 使用以下描述的MACS CD45耗竭方案进行细胞耗竭。
根据制造商的规程，使用CD45 MicroBeads（Miltenyi Biotec，目录号130-045-801）进行卵巢癌腹水样品和NSCLC样品中CD45 +细胞的消耗。简而言之，从腹水中滤除卵巢细胞或分离NSCLC组织样品后，对细胞进行计数。将单细胞悬液在4°C下以500 g离心4分钟。每10 6去除上清液并将沉淀重悬于80 µl MACS缓冲液（补充有0.5％BSA和2 mM EDTA的PBS）中细胞。将MACS CD45微珠添加到细胞悬液中（每1000万个细胞20微升）。将细胞在冰上孵育15分钟。在孵育过程中，通过将色谱柱连接到MidiMACS分离器并用3 ml MACS缓冲液冲洗色谱柱来制备色谱柱（用于NSCLC的MS和用于卵巢腹水的LS）。孵育后，每1000万个细胞用900 µl MACS缓冲液洗涤细胞和珠缀合物。将细胞在4°C下以500 g离心4分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于500μlMACS缓冲液中。将细胞悬浮液转移到柱和收集流出物（CD45 -分数）。该柱用3ml MACS缓冲液洗涤3次。将CD45 -分数在500离心g在4°C下放置4分钟。在腹水样品中，可以重复进行珠附着和柱分离，以增加相对于免疫细胞的肿瘤和基质细胞的数量。将沉淀重悬于PBS中的50μl的0.4％BSA（Ambion，目录号AM2616）中。通过将5 µl台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，目录号T10282）与5 µl样品混合并计数，并装入Neubauer改良的INCYTO C芯片一次性血细胞计数器（VWR，目录号82030-468）来计数细胞。 。如果需要，可以将细胞浓度调整为200–2,000个细胞/μl。将总共8,000个细胞装入10x Genomics单细胞铬控制器的每个通道中。
用于CD45 +的流式细胞仪分析在卵巢癌腹水样品中，将细胞重悬于补充有2％FBS的PBS中，并用FITC抗人CD45抗体（BioLegend，目录号304006CD45； 1：200稀释），PE抗人EpCAM抗体（Miltenyi）染色Biotech，目录号130-113-264； 1：50稀释），APC抗人CD14（BioLegend，目录号367118，克隆63D3； 1：20稀释）和PE-cy7抗人CD24（BioLegend ，目录号311120，克隆ML5； 1：20稀释度）20分钟，并用7-AAD（Invitrogen，目录号A1310； 1：200稀释度）5分钟。相同的细胞还用于单染色和未染色对照，以执行补偿和调整门控。使用BD FACSDiva软件版本8.0.1在BD LSRFortessa细胞分析仪上进行分析，并使用FlowJo版本10.5.3生成图。4c。抗体组中包括CD24和CD14抗体，用于FACS分析，以提供更多信息并更好地告知scRNA-Seq。具体而言，已显示肿瘤细胞上CD24的表达与卵巢癌的侵袭性有关，CD14的表达可识别单核细胞/巨噬细胞。
含292 mM NaCl（Thermo Fisher Scientific，产品目录号AM9759），20 mM Tris-HCl pH 7.5（Thermo Fisher Scientific，产品目录号15567027），2 mM的2x盐Tris溶液（ST缓冲液） CaCl 2（VWR International Ltd，目录号97062-820）和42 mM MgCl 2在超纯水中制备（Sigma Aldrich，目录号M1028），并用于制备三种缓冲液：对于CST，1 ml 2×ST缓冲液，980 µl 1％CHAPS（Millipore，目录号220201），10 2％牛血清白蛋白（新英格兰生物实验室，目录号B9000S）微升，无核酸酶的水10微升；用于TST，1 ml 2×ST缓冲液，60 µl 1％Tween-20（Sigma Aldrich，目录号P-7949），10 µl 2％BSA（New England Biolabs，目录号B9000S）和930微升无核酸酶的水；对于NST，使用1 ml 2×ST缓冲液，40 µl 10％Nonidet P40替代品（Fisher Scientific，目录号AAJ19628AP），10 µl 2％BSA（NEB）和950 µl无核酸酶的水。通过用超纯水（Thermo Fisher Scientific目录号10977023）以1：1的比例稀释2x ST来制备1x ST缓冲液。
在干冰上，将组织分裂并接受三种基于ST的核分离方案11和EZ核分离缓冲液8中的一种，如下所述。
在冰上，将一块冷冻的肿瘤组织放入带有1 ml CST，TST或NST缓冲液的6孔板（Stem Cell Technologies，目录号38015）的孔中。对于在OCT中冷冻的样品，在10厘米培养皿中执行另一个步骤，即除去周围的OCT并用PBS从样品中洗涤掉任何残留的OCT。然后在冰上使用Noyes Spring剪刀（Fine Science Tools，目录号15514-12）将组织切碎10分钟。对于细胞沉淀，例如CLL冷冻细胞，将样品吸移到冰上的缓冲液中，而不是切碎。然后将匀浆后的溶液通过40 µm Falcon细胞滤网（Thermo Fisher Scientific，目录号08-771-1）过滤。使用另外的1ml去污剂缓冲溶液洗涤孔并过滤。用3ml的1×ST缓冲液使体积达到5ml。g在旋转式桶式离心机中。将沉淀重悬于1×ST缓冲液中。重悬液的体积取决于沉淀物的大小，通常在100–200 µl的范围内。然后通过35 µm Falcon细胞过滤器（Corning，目录号352235）过滤细胞核溶液。使用C-chip一次性血细胞计数器（VWR，目录号：82030-468）对细胞核进行计数。将10,000或8,000个核（分别为V2或V3 10x Genomics核）的单个核悬浮液加载到用于Chromium Single Cell 3'Library（V2，PN-120233； V3，PN-1000075）的Chromium芯片上。制造商的建议（10倍基因组学）。
如先前所述进行核分离8。简要地，将组织样品切成＜0.5cm的碎片，并使用玻璃Dounce组织研磨机（Sigma，目录号D8938）进行均质化。在2 ml冰冷的核EZ裂解缓冲液中，将组织用杵A匀浆25次，并用杵B匀浆25次。然后将样品与另外的3 ml冷EZ裂解缓冲液在冰上孵育5分钟。核以500 g离心在4°C下放置5分钟，用5 ml冰冷的EZ裂解缓冲液洗涤，并在冰上孵育5分钟。离心后，将核沉淀物用5 ml核悬浮液（NSB；由1x PBS，0.01％BSA和0.1％RNase抑制剂组成）洗涤（Clontech，目录号2313A）。将分离出的细胞核重悬于2 ml NSB中，通过35μm细胞过滤器（Corning-Falcon，目录号352235）过滤并计数。最终浓度为每微升1,000个核，用于在10x通道上加载。
对于V2 10x技术，将8,000个单细胞或10,000个单核加载到Chromium单细胞3'芯片的每个通道中。对于V3 10x技术，已加载8,000个单细胞和8,000个单核。在Chromium控制器中，单细胞/细胞核被凝胶珠分配成液滴。形成乳剂后，发生条形码的RNA逆转录。然后按照制造商的建议进行cDNA扩增，片段化，衔接子和样品索引连接。将来自四个10x通道的文库集中在一起，并在Illumina HiSeq X的一个泳道上或NextSeq的一个流通池上进行测序，其配对末端读数如下：读数1，26 nt; 阅读2，55 nt; 指数1、8 nt；索引2，0 nt。
我们使用Cell Ranger mkfastq（v2.0和v3.0）（10倍基因组学）从原始测序读数生成解复用的FASTQ文件。我们将这些读数与人GRCh38基因组对齐，并使用Cell Ranger计数（v2.0和v3.0）（10x Genomics）以UMI量化了基因计数。对于snRNA-Seq读段，我们计算了映射到内含子和外显子的读段，因为这导致每个细胞核检测到更多的基因，更多的细胞核通过了质量控制，并且具有更好的细胞类型识别，如先前所述38。要在读取映射过程中计算内含子，我们采用了https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references中描述的方法。简而言之，我们使用Cell Ranger mkref（v3.0）（10x Genomics）和修改后的基因转移格式（GTF）文件构建了一个'mRNA前体'人类GRCh38参考，其中，对于每个转录本，特征类型均已从转录到外显子。起始GTF文件来自refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0.tar.gz或refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0.tar.gz，可从https://support.10xgenomics.com/下载。单细胞基因表达/软件/下载/3.0。
为了在比较协议时对测序读数或基因计数（UMI）进行下采样，我们分别使用了R包DropletUtils（v1.0.3或更高版本）12中的 downsampleReads和downsampleMatrix 。对读数进行降采样以使协议与总读数的最低数量相匹配。按总读取量进行降采样后，我们使用了DropletUtils中的write10xCounts和一个自定义Python脚本来生成HDF5文件，以输入到我们的分析管道中，如以下各节和“代码可用性”部分所述。
为了保持对所有基因和细胞质量控制过滤器的明确控制，在我们所有的下游分析中，我们使用了原始特征条形码矩阵，而不是由Cell Ranger生成的过滤后的特征条形码矩阵。通过要求每个细胞具有最少数量的UMI和检测到的基因，我们去除了低质量的细胞。我们根据实验方式（单细胞或单核）和10x试剂盒（V2或V3化学试剂）使用了不同的阈值。对于单核数据，我们保留通过V2化学检测到的至少200个基因和400个UMI以及通过V3化学检测到的至少500个基因和1,000个UMI的核。对于单细胞数据，我们保留了通过V2或V3化学检测到的具有至少500个基因和1,000个UMI的细胞。对于HTAPP-951-SMP-4652中的V2-V3比较（扩展数据，图9）），我们对两种化学方法使用相同的阈值：至少检测到200个基因和400个UMI。对于这两种数据类型，我们都过滤掉了那些> 20％的UMI来自线粒体基因的细胞或核。最后，我们将每个细胞或每个核的总UMI标准化为100,000（CP100K），并将这些值进行对数转换，以报告基因表达为E = log（CP100K +1）。
我们报告了以下QC指标：每个文库样品的总读取数，测序饱和度（由Cell Ranger计数报告的源自已观察到的UMI的读取分数），回收的总细胞或细胞核，每个细胞或细胞核的读取次数，每个细胞或细胞核的UMI数量，每个细胞或细胞核中检测到的基因数量，与线粒体基因对齐的细胞或细胞核中UMI的比例，估计仅包含环境RNA的液滴比例（“空滴”），细胞或核双峰，检测到的细胞类型数量和恶性细胞的CNA模式。对于样品的子集，我们还计算了每种检测到的细胞类型的细胞数或细胞核数，以及包含细胞的液滴中环境RNA的估计水平。
我们使用EmptyDrops（DropletUtils的一部分，v1.0.3或更高版本）预测了仅包含环境RNA而没有细胞的液滴，其保留参数由条形码等级图中曲线的拐点设置（细胞条形码按其总UMI排名）12。我们预测使用Scrublet（V0.2）与expected_doublet_rate = 0.06（参照电位双峰13）。我们使用SoupX（v0.3.1）18和一组细胞类型特异性标记基因估算了周围RNA的水平（补充表1）。）。重要的是，我们标记了双峰和空滴并将其保留在我们的分析中，而不是立即将它们过滤掉。似乎包含双峰或空滴的液滴可能是由许多不同的影响引起的，例如细胞分化或测序不足，并且通过对其进行分析，可以在完整数据集的上下文中更清楚地解释潜在的双峰或空滴。
对于每个肿瘤样品中，我们分析经过滤的表达矩阵，以确定细胞亚群，如先前所描述39，40。我们选择z得分截止值为0.5（参考文献41）的高度可变基因，将每个基因的表达居中并缩放以使其平均值为零，标准差为1，并使用主成分对可变基因进行降维分析。我们将前50个主要成分（PC）用作基于Louvain图的聚类的输入，其解析度参数设置为1.3。对于每个细胞簇，我们使用以下测试鉴定了特定于簇的差异表达基因：AUC分类器，Welch's t-测试和费舍尔的精确测试。对于返回P值的测试，我们使用Benjamini-Hochberg程序42将错误发现率控制在5％。我们通过将细胞或细胞核轮廓嵌入前50个PC 的统一流形近似和投影（UMAP）43中来可视化基因表达和聚类结果，其中min_dist = 0.5，spread = 1.0，邻居数= 15和欧氏距离度量。
对于通过聚类鉴定的每个细胞亚群，我们使用差异表达基因，已知基因特征（补充表1）和SingleR（v0.2.2）的组合为肿瘤微环境的恶性，实质，间质和免疫区室分配了细胞类型。44，一个自动注释包。运行SingleR时，仅考虑分配给30个或更多单元的单元类型。在对细胞表达已知基因特征进行评分时，我们使用了Seurat（v2.3.4）24中的AddModuleScore函数。。我们注意到，T细胞和NK细胞之间的重叠表达程序使这些细胞类型有时更难准确鉴定。我们没有区分巨噬细胞，单核细胞和树突状细胞，而是将所有这些注释为“巨噬细胞”签名的得分。
我们通过使用inferCNV（v1.1.0）从基因表达数据中推断染色体CNA来鉴定恶性细胞45。在逐样本的基础上，我们将免疫细胞和内皮细胞用作健康参考，以评估恶性细胞中的CNA。通过随机分配计数数据以最多采样2,000个细胞或细胞核，我们为inferCNV创建了计数矩阵文件和注释文件。我们从人类GRCh38程序集中创建了一个基因排序文件，其中包含每个基因的染色体起始和终止位置。要运行inferCNV，我们将参考细胞或细胞核中每个基因的最小平均平均读取数设为0.1，根据注释的细胞类型进行聚类，对输出进行去噪，然后运行隐马尔可夫模型（HMM）预测CNA水平，实现了inferCNV的i6 HMM模型，并要求八个线程进行并行步骤。
为了比较从同一样品收集的sc-和snRNA-Seq数据之间的概况，我们使用了批次校正方法。
我们使用了Seurat（v2.3.4）24中实现的CCA进行了批次校正。我们选择了1,500个在细胞和细胞核数据之间均可变的基因，使用这些基因作为RunCCA的输入来计算前20个规范成分，并将前12个规范成分与AlignSubspace对齐。对齐的规范成分代表细胞和细胞核数据的共嵌入，我们使用FindClusters在此降维空间中进行了聚类。
通过CCA进行批次校正后，我们对参考文献中的解离签名进行了评分。使用Seurat（v2.3.4）中的AddModuleScore函数在我们匹配的细胞/细胞核样品上添加25（来自其补充表5）24。
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