很少有种系突变会影响肺癌风险。我们对来自39,146个欧洲血统的个体的罕见变体进行了分析，并研究了7,773个样品中的基因表达水平。我们发现与腺癌中的ATM L2307F（rs56009889）突变有很大的关联，以进行发现（调整后的赔率= 8.82，P = 1.18×10 -15）和复制（调整后的OR = 2.93，P = 2.22×10 -3）在女性中更为明显（调整后的OR = 6.81和3.19以及用于发现和复制）。我们观察到ATM肺肿瘤中杂合性的过度丧失L2307F等位基因携带者。在Ashkenazi犹太人口中，L2307F更为频繁（4％）。我们还观察到发现（调整后OR = 2.61，P = 7.98×10 −22）和复制数据集（调整后OR = 1.55，P = 0.06）与功能丧失突变Q4X（rs150665432）的关联基因，KIAA0930。我们的发现暗示ATM中的种系遗传变异与肺癌易感性有关，并建议KIAA0930作为肺癌风险的新候选基因。
肺癌是美国和世界范围内导致癌症死亡的主要原因，并且代表着重大的公共卫生问题1。遗传因素在肺癌发病机理中起着至关重要的作用2。第一波全基因组关联研究3确定了易感区域和常见的肺癌风险变异体，但仅限于分析等位基因频率为1％或更高的更常见变异体。很少有先前的研究能确定罕见的种系突变引起肺癌的病因，因为这种类型的研究需要大样本量和广泛的遗传分析。虽然<大多数人群的1％是种系突变的驱动器癌症，这样的突变可以赋予尽可能发展癌症的80％的终生风险的载体4 3和每年诊断出的癌症的10％至影响5。另外，癌症相关突变的鉴定为癌症治疗和药物开发提供了潜在的靶标。例如，罕见的EGFR遗传性T790M突变与不吸烟者患肺癌的风险大大增加有关6。具有这种突变的个体对第一代EGFR治疗7的反应不佳，因此需要针对具有这种突变的个体的靶向治疗方法8。同样，BRCA1和BRCA2中种系突变的鉴定导致PARP抑制疗法成功应用于乳腺癌和卵巢癌。定义为肺癌胚系突变也可协助早期发现和有针对性的预防，类似于益处筛选有害传达BRCA1和BRCA2胚系突变9，10。
这项研究的目的是确定可靠地影响肺癌风险的种系突变，并发现与肺癌的病因和发展有关的新基因。我们分析了两个独立的数据集，这些数据集包含39146个欧洲血统的个体，这些个体先前并未用于识别在人口中不到1％的低等位基因频率（MAF）变异，以发现和验证具有增加肺癌风险的重大影响的突变。我们通过重复发现和复制阶段的5,742名受试者的基因分型，并通过比较两个数据集中未受影响个体的MAF与公开数据集中的MAF，确认了两个数据集中所选种系突变的基因型保真度。此外，为了调查我们发现的突变的重要性和性质，我们分析了分层亚组和民族地理人群的数据，在欧洲血统的附加数据集中评估了双等位基因两次击中事件的可用变体，并进行了基于结构的突变研究评估其致病性。我们还利用RNA-seq数据和同工型表达数据探讨了发现的与突变相关的同工型是否在肺中表达，并通过研究基因表达数据阐明了新的突变相关基因在肺癌发病机理中的作用。总之，我们的研究确定并验证了两个显着影响肺癌病因的基因新突变，为理解肺癌机制提供了见识。
我们使用了两个数据集的可用性，在两个平台上对5742个个体进行了基因分型，以调查对肺癌风险具有重大影响的种系突变。我们从第一个病例对照数据集中删除了5742个重叠的个体，并将其用作发现数据集。该数据集包含在Illumina癌基因阵列上进行基因分型的28,878名欧洲血统个体。第二个数据集由10268例在Affymetrix Axiome基因分型阵列上进行基因分型的欧洲血统独立个体组成，该数据集用作复制队列。这些数据也未包括在先前的研究中。我们使用发现数据集来识别与肺癌易感性相关的潜在罕见变体。复制队列用于两个验证目标，首先，通过考虑平台之间的基因分型一致性来进行技术验证，其次，作为发现队列中确定的关联的独立验证队列。验证队列的结果除针对5q号染色体上hTERT附近的SNP进行了靶向分析外，尚未发布。11。研究设计在补充图 1中给出。
在发现系列中，为了探索能显着增加肺癌风险的种系突变，我们使用发现数据集（补充表1）对MAF <0.01的突变进行了关联分析 。当执行粗关联分析时，外显子组内的三个突变（包括rs56009889，rs150665432和rs61816761）与发现数据集中的P值<5.0×10 -8和OR值大于2.0（关联表 2）。然后，我们在由10,268个欧洲血统个体组成的独立的非重叠病例对照数据集中验证了这些发现。
因为此分析的发现和复制阶段的样本使用了不同的平台，所以我们能够通过研究5742个使用两种基因分型平台进行基因分型的个体来评估阵列的保真度。变体rs56009889和rs150665432的总体基因型一致性极佳，分别为99.95％和99.08％，稀有等位基因的一致性高达89.66％和92.31％，这两个数据集均证实了它们的基因分型逼真度。但是，rs61816761的基因分型显示出较差的一致性。此突变已从进一步分析中删除（补充表 3））。此外，在未受影响的个体中，两个数据集中的rs56009889和rs150665432的次要等位基因频率（MAF）与外显子聚集协会12中欧洲人群的MAF相当，并且与NHLBI GO外显子测序项目和跨组学精密医学计划（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=150665432，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects /SNP/snp_ref.cgi?rs=56009889）（补充表 4），这支持了两个数据集中rs56009889和rs150665432的基因分型数据的可靠性。
在独立复制系列中， 未经调整，rs56009889（P = 0.34）并未与总体肺癌风险显着相关（表 1）。但是，在rs56009889的肺腺癌（LUAD）（P = 9.8×10 -4）和女性（P = 0.01）的复制数据中，有很强的关联证据。结果肺癌整体是PC调整后更少显著，但仍然存在对一个高度显著结果ATM在LUAD -2307F关联（P = 1.18×10 -15用于发现和P = 2.22×10 -3用于复制（表 1个）。变体rs150665432 在小得多的复制数据集中显示了显着趋势（P = 0.06）。
rs56009889在ATM基因中定位（图 1a）。该突变在调节ATM活性13的FAT域中导致L2307F错义突变，这暗示了假定的功能作用。与这种突变在对ATM功能至关重要的高度保守区域中的位置一致，在计算机工具中，如SNPeffect 4.0 14 PolyPhen-2 15 Fathmm-XF（http://fathmm.biocompute.org.uk/）和SIFT提示功能作用。与非携带者（C / C）相比，L2307F携带者（T / C + T / T）在发现数据集中具有显着增加的肺癌风险（校正后的优势比（OR = 4.19，P = 3.56×10 -7）），尽管增加的风险在复制数据集中未达到显着水平（表 2）。在女性中，L2307F与肺癌风险显着相关， 发现数据集中的OR 值为7.76（P = 0.0002）， 复制数据集中的OR 值为3.22（P = 0.03）。在男性中，L2307F在发现数据集中与肺癌风险的关联较弱，而在复制数据集中则没有关联（图 2a和补充表 5）。组织学分层分析表明，在发现数据集中，L2307F携带者的肺腺癌（LAD）风险显着增加了5.23倍（P = 6.47×10 -9），并且复制数据集中的风险增加了2.48倍（P = 0.01），并且在这两个数据集中，几乎没有证据表明与肺鳞状细胞癌（LSQ）或小细胞肺癌（SCLC）的风险相关（补充表 5）。携带L2307F的雌性 在发现和复制数据集中分别表现出高LAD风险8.05倍（P = 0.0001）和4.69倍（P = 0.004）（图 2b和补充表 6）。值得注意的是， 在本研究中，所有L2307F纯合子（N = 5），无论年龄，性别和吸烟状况如何，均存在LAD（P = 0.004）（图2c）。 ）。此外，该关联在发现数据集中显示了突变的等位基因数量与LAD风险之间的剂量反应关系（P 趋势 = 5.44×10 -9）。L2307F在LAD发病机理中比LSQ或SCLC更重要的作用反映在两个数据集中LSQ和SCLC的突变等位基因频率低。这些结果表明，rs56009889与肺癌风险之间的关联仅限于LAD，在女性中尤为突出。
一个 有肺癌风险的ATM区域。rs56009889定位于11号染色体并在ATM内进行定位，与之前已确定的任何SNP没有连锁不平衡（LD）；b KIAA0930地区的肺癌风险。rs150665432定位于22号染色体，并在未表征的KIAA0930内定位，该KIAA0930不在LD中，之前已鉴定出任何SNP。对于每个图，根据其染色体位置显示了Slog的-log 10 P值（y轴）（x-轴）。每个分析中基因型最高的SNP均以其rs号标记。每个符号的颜色强度反映了发现数据中与肺癌相关的SNP最高的LD程度：蓝色（r 2 = 0）到红色（r 2 = 1.0）。物理位置基于人类基因组的NCBI构建37。还显示了基因的相对位置。源数据作为源数据文件（源数据1 ）提供。
通过逻辑回归分析确定P值，并根据年龄，性别，吸烟状况和主要成分进行调整。rs56009889与肺癌之间关联的分层分析。与非携带者相比，L2307F携带者患肺癌的风险增加，发现数据中的OR为4.19（P = 3.56×10 -7，n = 28872），而复制数据中的OR为1.31（P = 0.45，n = 10256））。在女性中，L2307F携带者有肺癌风险，发现数据中OR值为7.76（P = 0.0002，n = 10919），复制数据中OR为3.22（P = 0.03，n = 4698）。L2307F携带者在发现数据中患肺腺癌（LAD）的危险显着增加5.2倍（P = 6.47×10 -9，n = 19356），在复制数据中患病的风险增加2.5倍（P = 0.01，n = 7503）。 在发现数据中未发现L2307F与肺鳞状细胞癌（LSQ）（n = 16853）或小细胞肺癌（SCLC）（n = 14746）的风险相关。在复制数据的LSQ或SCLC中未观察到L2307F变体。颜色表示数据的人口统计学和组织学分层。brs56009889与LAD之间关联的分层分析。携带L2307F的雌性在发现数据集中的LAD风险高8倍以上（P = 0.0001，n = 8056），在复制数据中的LAD风险是4.7倍（P = 0.004，n = 3680）。携带L2307F的永不吸烟的女性在发现数据中发生LAD的风险高7倍（P = 0.01，n = 2817），在复制数据中发生LAD的风险高3.8倍（P = 0.15，n = 1212）。CL2307F纯合子的分布。发现数据中的L2307F的所有纯合子，无论年龄，性别和吸烟状况如何，都在发现数据中形成了LAD。在复制数据中未发现纯合子。d在以色列（n = 1173）中，发现rs56009889与肺癌风险，LAD整体和女性之间的关联性更高，而北美（n = 10858）更高。所有的协会都达到了重要的地位。以色列女性中LAD风险的最高95％CI（调整后OR = 17.15； 95％CI 2.24–131.32，n = 373）未显示，因为它太高了。颜色表示按组织学和性别分类的数据。误差线为OR±95％CI值。源数据作为源数据文件提供。
来自以色列的肺癌病例对照研究中发现ATM -L2307F占4.43％（MAF = 0.023），北美地区的ATM -L2307F略高（MAF = 0.002），在其他欧洲国家则接近单态（补充表 7）。与该观察结果一致，rs56009889在Ashkenazi犹太人口中更为普遍（https://gnomad.broadinstitute.org/variant/11-108196896-CT）。因此，我们调查了rs56009889与肺癌风险之间的关联是否受到原籍国的影响。在以色列人和北美人中，rs56009889与肺癌的风险，一般的LAD尤其是女性的肺癌风险显着相关。但是，在以色列的病例对照研究中，该关联性强于北美地区（图。 2d）以及缺少变异载体的情况意味着该分析在欧洲人中没有提供信息。如补充表7所示， 在北美，L2307F携带者的LAD风险OR为3.36（P = 0.004），在以色列的病例对照研究中为6.74（P = 3.38×10 -6）。L2307F的女性运输使LAD风险增加，在北美，OR为3.81（P = 0.04），在以色列为17.17 （P = 0.006）。复制数据不包括来自以色列的肺癌研究。
由于以色列的人口主要包括犹太人和阿拉伯人16，因此我们根据遗传信息调查了L2307F在两个族裔之间是否具有不同的流行率和关联性（补充表 8）。我们观察到L2307发生在来自以色列的阿什肯纳兹犹太人中（7.99％）（MAF = 0.042），在居住在其他国家的阿什肯纳兹犹太人中8.53％（MAF = 0.045），但在阿拉伯人口中发生率很低（补充表 9）。此外，尽管L2307F与居住在哪里的犹太人与肺癌和LAD的风险有显着相关性，但与其他国家的犹太人相比，以色列犹太人中这种相关性更为明显（补充表 8）。）。在L2307F航母中，以色列犹太人LAD风险的OR为7.86（P = 2.12×10 -6），居住在其他国家的犹太人的LA为3.40（P = 0.005）。携带L2307F的女性犹太人 在以色列的LAD风险为16.01倍（P = 0.008），在其他国家为4.23倍（P = 0.03）。
rs150665432位于KIAA0930（图 1b）内，位于22q13.31。rs150665432突变编码Q4X，导致全长蛋白质从409个氨基酸截断为3个氨基酸（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_056079.1?report=graph）。与非携带者（G / G）相比，Q4X携带者（A / G + A / A）在发现（调整后OR = 2.59；P = 1.15×10 -18）和复制数据集中患肺癌的风险均增加（调整后的OR = 1.69；P = 0.03）（图 3a和补充表 10）。此外，发现集中的所有Q4X纯合子（N = 29）都患有肺癌（P = 2.29×10 -8）（图 3b），并且发现数据集中突变的等位基因数量与肺癌风险呈剂量反应关系（P 趋势 = 1.51×10 -19）（表 2）。在复制数据集中未发现纯合子。分层分析表明，Q4X在所有阶层中均具有重大风险：女性，男性，吸烟者，不吸烟者（补充表 10）以及LAD，LSQ和SCLC（补充表 11））在发现数据集中。在复制中，没有一个层次达到显着水平，可能反映了在子集分析中少数具有这种罕见变异的个体。尽管对照组中rs150665432的发生频率在不同地理人群之间变化不显着，但北美国家（与校正后的OR相比，Q4X与肺癌风险之间的相关性OR值较高（校正后的OR = 4.19；P = 3.27×10 -16））高于欧洲国家（调整后的OR = 1.65；P = 0.0003，补充表 12）。
a以不同颜色显示对KIAA0930 Q4X与肺癌风险之间关联的分层分析。与非携带者相比，Q4X携带者的肺癌风险显着增加，发现中的OR为2.59（P = 1.15×10 -18，n = 27966），而在复制数据集中为1.69（P = 0.03，n = 10248） 。分层分析表明，Q4X携带者在女性，男性，吸烟者和非吸烟者中罹患肺癌的风险增加且一致，并且在组织学亚型上一致。误差线为OR±95％CI值。P通过年龄，性别，吸烟状况和主要成分调整的逻辑回归分析确定这些值。源数据作为源数据文件提供。b KIAA0930 Q4X纯合子的分布。在发现数据中，rs150665432中突变的等位基因的所有纯合子在发现数据中均发展为肺癌。源数据作为源数据文件提供（源数据1、2和3）。阴影表示组织学亚型。
在发现数据中，L2307F的携带者在整个肺癌发作以及所有子集中的肺癌发病总体上倾向于显着变老，除了小细胞和鳞状肺癌。对于女性肺AD，此效应在发现数据集中最为明显（69.37±10.71与62.78±11.06，P = 0.0007），并在复制数据集中显示了临界意义（68.74±10.49与63.69±10.31，P = 0.09，补充表 图13和图 4a）。随着自动取款机在17岁以上的人群中得到更高的表达变体效应在年龄较大时可能更明显，但需要更大的数据集来验证此观察结果。总体上或在亚组中，没有发现rs150665432基因型在年龄上的一致变化（补充表 14）。
一个 rs56009889影响发病年龄。误差线是平均值+平均值的标准误差（SEM）。在发现数据中，携带L2307F的肺癌病例的平均发病年龄显着高于非携带者的发病年龄。整体肺癌（n = 15830），女性（n = 5810），男性（n = 10019），吸烟者（n = 14006），LAD（n = 6329）和女性（n = 2954）的发病年龄较晚。与LAD。在复制数据中， 尽管样本量很小，但只有LAD（n = 906）女性和LAD 非吸烟者（n = 293）才观察到发病年龄的临界差异。P值由两侧t检验确定，无需调整。T等位基因的携带者在复制数据中未开发出LSQ和SCLC。b靶向ATM L2306F等位基因或ATM基因中同义变体的杂合性丧失率。源数据作为源数据文件提供。
为了了解ATM -L2307F与体细胞突变谱之间的相互作用，我们在另外的独立MSK-IMPACT数据集中利用了2127名欧洲血统肺癌患者的生殖系和匹配的肿瘤数据（补充表 15）。在这项研究中，在63（3％）例中观察到种系L2307F。LDs（P = 0.0009），女性vs男性患者（P = 0.03），轻烟（≤5包年）vs重度吸烟者（> 5包年，P = 0.003）和患有LDs的患者中L2307F的发生频率更高EGFR致癌突变与无EGFR致癌突变的病例（P = 0.001）。63例患者中有61例是L2307F杂合子，在这29.5％的患者中，野生型等位基因的杂合性（LOH）丧失与背景LOH的10％（P = 0.0026）（图 4b）。KIAA0930不是MSK-IMPACT研究靶向的468个癌症相关基因中的基因，因此无法在该数据集中探索该基因的种系体细胞相互作用。
两个ATM和KIAA0930具有在各种组织中，这可能会导致一个基因的外显子的某些选择性剪接被排除在外，因此无法转换为在相关的同种型的氨基酸序列。为了弄清楚rs56009889和rs150665432是否包含在正常在肺组织中表达的同工型中，从而可能在肺中发挥功能，我们研究了ATM和KIAA0930的同工型表达。ATM有八个同工型，可编码长度不同的蛋白质。L2307F导致两个同工型ENST00000278616和ENST00000452508的氨基酸（aa）发生变化，产生了包含3056 aa长的ATM蛋白的全长同工型，其中包括TAN，FAT，FATC和磷酸肌醇3激酶相关激酶（PIKK）域（图 5a）。基因型组织表达（GTEx）项目（补充表 16和图 5b–c）和德国的表达数据（补充表 17和图 5d）暗示ENST00000278616和ENST00000452508都在正常肺组织中表达。
一个 ATM具有八个同种型产生具有不同长度的蛋白质。ATM具有四个功能域，包括用于端粒长度维持和DNA损伤修复的TAN域，重要的调控域FAT和FATC域以及磷酸肌醇3-激酶相关激酶（PIKK），后者是具有内在的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。b ATM从GTEx数据中表达形式（n = 427）。c热图显示来自GTEx数据的ATM亚型表达。b 来自德国数据的ATM亚型表达（n = 6）。ËENST00000251993是KIAA0930的全长且规范的异构体。rs150665432可以将其蛋白质长度从409截短至3个氨基酸。f KIAA0930从GTEx数据中表达形式（n = 427）。g热图显示了来自GTEx数据的KIAA0930亚型表达。h KIAA0930来自德国数据的亚型表达（n = 6）。此图中的箱线图是表示使用百分位数函数计算的数据集的三个四分位数（25％，中位数：50％和75％）的可视化，以及不是异常值的数据集的最大值和最小值。使用四分位间距方法检测异常值。如果数据点位于该范围终点之上或之下的四分位数范围的1.5倍，则将其标记为离群值。
KIAA0930具有10种可产生不同长度蛋白质的同工型，其中ENST00000251993是全长且规范的同工型（https://gnomad.broadinstitute.org/gene/ENSG00000100364/transcript/ENST00000251993）。rs150665432将ENST00000251993的蛋白质长度从409个氨基酸截断为3个氨基酸（图 5e），并将另一种丰富的同工型ENST00000492273的蛋白质长度从85个氨基酸缩短至3个氨基酸。此外，rs150665432还包含在其他4个同工型中，包括ENST00000417906，ENST00000488038，ENST00000486640和ENST0000049622，它们是未翻译的转录本。ENST00000251993和ENST00000488038转录本（包括rs150665432）是GTEx数据在肺组织中表达的主要转录本（补充表 18图 5f–g），以及德国的数据（补充表 19和图 5h）。
我们探讨了未鉴定蛋白（角色http://www.uniprot.org/uniprot/Q6ICG6）KIAA0930可以通过研究其表达是否与肺癌的发生有关，其表达比较肺癌发病ATM，一个肿瘤抑制蛋白。KIAA0930在《癌症基因组图集》（TCGA）中的LAD（P = 0.004）和LSQ（P = 1.62×10 -12）中明显过表达（补充图 2A–D）。在来自哈佛18（P的独立数据集）中，KIAA0930与正常肺样本相比在肺癌中有明显的过表达（P = 0.0005），而ATM的可变性有限（补充图 3和补充表 20）。另外，我们观察到在从上皮细胞发展的大多数癌中，KIAA0930表达显着上调（补充表 21），表明KIAA0930是癌相关候选基因。
致癌作用是一个逐步的过程，其特征是积累了突变，包括种系和体细胞的变异19。癌症相关的驱动程序胚系突变的鉴定可以提供个性化的癌症筛查，预防目标9，10和治疗和药物开发20。分析稀有变体的挑战是拥有足够的样本以准确识别与遗传易感性相关的基因型。在这里，我们在两阶段研究中使用了大型基因分型资源。一个发现阶段，以确定潜在的变体，然后是复制阶段，以确认基因分型的保真度并评估病例与对照之间观察到的差异的稳健性。使用这种方法，我们报告了具有两个变体的大效应关联。rs56009889种系突变，我们在LAD中观察到可重现的关联，并暗示与rs150665432的关联。rs56009889的MSK-Impact研究中的仅案例分析加强了这种多态性与LAD之间的联系，尤其是女性。
rs56009889和rs150665432均为编码突变，ATM -L2307F中的错义变体和终止增益变体KIAA0930 -Q4X，并且都包含在基因的全长同工型中。ATM种系突变纯合子的个体可以发展共济失调毛细血管扩张症，其中包括在其疾病谱中对癌症的易感性，并且杂合子状态下的ATM突变也与癌症易感性有关21。ATM -L2307F 的功能影响仍然不明确；在计算机上的预测表明，这种变体可能会影响功能，但Clinvar将该变体报告为“可能是良性的”或“良性的”（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/127430/），并且与共济失调毛细血管扩张无关。在这里，我们观察到此变体与LAD尤其是女性之间有很强的联系。人们发现，Ashkenazi犹太人中ATM -L2307F的患病率很高，并且在以色列人群中与肺癌的关联更强。类似有害BRCA创始人突变也有在德系犹太人高患病率22和在临床实践中使用23之间的关联ATM -L2307F和LAD可能是这个人群的临床相关。
从机理上讲，通过计算机分析可以预测L2307F有害，已知有缺陷的ATM蛋白可以积累新的突变24。ATM是一种抑癌基因，可以识别和修复受损或断裂的DNA链，并有助于维持其他基因的稳定性（https://ghr.nlm.nih.gov/gene/ATM）。值得注意的是，所有L2307F纯合子均具有LAD，并且我们观察到等位基因携带者肿瘤中的LOH相对于非携带者而言过高，这表明双等位基因缺失可能在此过程中很重要。TCGA还报告说，LAD中最常见的致病种系变异是ATM中的杂合变异，在1.2％的病例中总计发生25。研究188例LAD病例的肿瘤测序项目也发现，ATM是在LAD中发生体细胞突变的最常见基因之一26。是否还有其他人群的变异也有助于肺癌易感性，或者与其他明显致病性ATM突变同时发生的L2307F是否会使肺癌的风险超过杂合子所致，尚待测试。
我们还发现了KIAA0930 -Q4X与肺癌风险增加的暗示性关联。KIAA0930是一种未表征的蛋白质（http://www.uniprot.org/uniprot/Q6ICG6），其功能尚未得到充分研究。rs150665432-Q4X突变似乎包含功能等位基因的丧失，该等位基因已包含在KIAA0930的全长同工型中。该基因在正常肺中表达，并且在肺癌和其他上皮细胞癌中，KIAA0930的表达显着上调，表明KIAA0930可能在这些癌的发生中起作用。此外，《人类蛋白质图谱》中的数据显示，KIAA0930肝癌，肾癌或子宫内膜癌等癌基因的表达显着影响癌症患者的生存（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000100364-KIAA0930/pathology），这也支持了KIAA0930作为癌症相关候选基因的作用。然而，必须进一步研究这种关联，以确保其鲁棒性，并且停止增益突变Q4X增加风险的机制仍不清楚。
总之，我们使用了大病例对照和仅病例收集的肺癌来发现和验证高风险，低流行的种系突变。我们研究设计的要素，例如在独立的数据集中复制结果，按地理种群和种族分析数据，确认基因分型保真度，将我们数据集中的突变的MAF与公共测序数据集中的MAF进行比较，计算机模拟分析并进行LOH探索有助于提高结果的可靠性。与这些变体相关的遗传风险升高，暗示了使用这些变体来鉴定将从筛查计划以及治疗靶标中受益最大的个体的潜在临床益处。
在发现阶段使用的OncoArray联盟是一个网络，旨在增进人们对常见癌症的遗传结构的了解。Oncoarray联盟的Dartmouth组件使用了57,776个样本的基因分型数据，这些数据来自于北美和欧洲以及亚洲27个地区的29个肺癌研究，以及来自头颈癌患者的其他样本，其中包括改善基因型的罕见变异。缺乏疾病状况（因为他们不是肺癌相关研究的一部分），近亲（二级亲属或近亲），重复的个体或其他受试者，或患有低水平的OncoArray联盟参与者本研究不包括基因型数据的呼叫率，未通过质量控制（QC）或非欧洲人。在复制阶段也进行了基因分型的OncoArray联盟有5742名参与者，因此在发现阶段将这些样品排除在分析之外。最后，来自26个研究的28878名欧洲人后裔参与者，包括15851例肺癌病例和13027例健康对照者，
当前发现数据集中的25项研究包括Alpha-生育酚β-胡萝卜素癌症预防研究（ATBC），加拿大筛查研究（CANADA），阿斯图里亚斯肺癌（CAPUA），哥本哈根肺癌研究（COPENHAGEN），环境与遗传学肺癌研究病因学（EAGLE），胡萝卜素和视黄醇功效试验（FHCRC），利物浦肺癌项目（FIELD），德国肺癌研究（GERMANY），哈佛大学肺癌研究（HSPH），IARC L2研究（IARC） ，以色列研究（ISRAEL），肯塔基州肺癌研究（KENTUCKY），医学博士安德森癌症中心研究（MDACC），马尔默饮食与癌症研究（MDCS），多种族队列研究（MEC），新英格兰肺癌研究（NELCS ） T奈梅亨肺癌研究（NIJMEGEN），挪威肺癌研究（NORWAY），瑞典北部健康与疾病研究（NSHDC），前列腺癌，肺癌，结直肠癌和卵巢癌筛查试验（PLCO），分辨率研究（RESOLUCENT），坦帕肺癌癌症研究（TAMPA），总肺癌：肺癌生存分子流行病学（TLC），西奈山医院-玛格丽特公主研究（TORONTO），范德比尔特肺癌研究（VANDERBILT），其详细信息显示在补充表 22中。在这26项研究中，包括ATBC，CAPUA，哥本哈根，EAGLE，FIELD，IARC，MDCS，奈梅亨，挪威，以色列，NSHDC，德国和RESOLUCENT在内的13项研究从欧洲获得了样本。来自北美的另外13项研究（包括CANADA，FHCRC，HSPH，肯塔基州，MDACC，MEC，NELCS，PLCO，TAMPA，TLC，多伦多和VANDERBILT）招募了受试者。
我们使用了Affymetrix Axiome阵列研究11在复制阶段，来自肺癌联合会癌症的跨学科研究。Affymetrix Axiome阵列研究是由10个独立的病例对照研究组成的大型样本，包括西奈山医院-玛格丽特公主（MSH-PMH），多种族队列，利物浦肺项目，护士健康研究和国家医师健康研究，欧洲癌症和营养（EPIC）肺部前瞻性调查，前列腺癌，肺癌和卵巢癌筛查试验，胡萝卜素和视黄醇功效试验，俄罗斯多癌病例对照研究，墨尔本合作队列研究和哈佛肺癌研究。在Affymetrix Axiome阵列研究中的12651名受试者中，缺乏疾病状态，非欧洲人或样本呼叫率较低（基因型呼叫缺失> 0.05）的参与者，被排除在外。最后，当前病例对照研究的复制数据集包括10268例欧洲人后裔，包括4916例肺癌病例和5352例健康对照。
所有研究均由相关机构的机构伦理审查委员会审查和批准。
进行描述性统计分析以在发现和复制数据集中表征肺癌病例和对照的研究人群。使用在诊断时的年龄，性别和吸烟状况分布病例和对照之间的差异进行评价χ 2测试。使用统计分析系统软件（版本9.3）进行统计分析。基于GWAS数据的EIGENSTRAT程序分别针对发现和复制数据集执行了主成分分析（PCA）（补充图 4A–B）。为了计算这些主要成分（PC），我们在排除了性染色体，MAF小于0.05的变异体以及取样彼此不相关的SNP之后分析了GWAS数据。
我们对具有较小等位基因频率（MAF）<0.01的突变进行了关联分析。使用1自由度Cochran-Mantel-Haenszel检验和PLINK 1.9版，进行基因型数据的病例对照关联测试，以发现对肺癌风险具有重大影响的种系突变。为了研究改变蛋白质序列的突变，我们仅将突变保留在外显子组内进行进一步分析。
为了从以色列的研究中推断犹太人和阿拉伯祖先，我们使用了程序AIPS 28（https://morgan1.dartmouth.edu/~f000q4v/html/aips.html），该程序使我们能够使用距离-基于分析的方法来解释地缘子种群结构。分析包括来自22个欧洲人口的已知起源的人口，其中包括阿什肯纳兹犹太人，被标记为阿拉伯人的巴勒斯坦，德鲁兹人和贝都因人。详细结果显示在补充表 9中。
我们通过在两个数据集的单变量和多元逻辑回归分析中计算OR值和95％置信区间（CI），估计了肺癌风险与所选种系突变之间的关联。在多元Logistic回归模型中，通过年龄，性别，吸烟状况（从不）和PC机对OR和95％CI进行了调整。为了控制可能的种群结构，我们对发现数据集中的三台PC进行了调整，因为对照组和病例之间的种群差异的方差分析的P值分别为第一台PC，第二台PC和第三台PC分别为2.18E-05、0.0001和0.018。我们对复制数据集中的两台PC进行了调整，因为它们的特征向量在病例和对照之间均没有显着差异（P第1台PC和第2台PC的对照组和案例间的种群差异的方差分析统计值分别为0.287和0.189。）
我们进一步按性别和吸烟状况对所选种系突变与肺癌风险的关联进行了分层。在单变量和多因素logistic回归分析中，我们还分别估计了所选SNP变异与LAD，肺鳞状细胞癌或小细胞肺癌风险之间的关联。补充表23提供了我们在组织学发现阶段发现的变体的完整列表 。小细胞肺癌有四个突变，包括rs17843743、3：9970073，rs150665432和rs61816761，其P值均小于5.0×10 -8发现数据集中的OR值大于2.0。但是，在未受影响的个体中，复制数据集中没有一个新突变的MAF与发现数据集中的那些相似。
在单变量和多变量logistic回归分析中，我们通过地理人口进一步对发现数据集中的关联进行了分层。根据rs56009889的MAF和研究数据在发现数据集中的位置，我们将所有研究分为三个亚组，包括以色列，其中rs56009889的MAF最高，在其他欧洲国家和北美人口中。然后，我们在单变量和多变量logistic回归分析中通过地理人口调查了发现数据集犹太人中的关联。由于对照组中rs150665432的频率在不同地理人群之间无显着差异，因此我们将所有研究分为两个亚组，包括欧洲国家和北美国家的人群，计算rs150665432与不同地理人群中肺癌风险的关联。在发现和复制阶段均使用SAS 9.3进行了统计分析；一个＜0.05的p值被认为是显着的。
荟萃分析是使用R包“ meta”（http://www.imbi.uni-freiburg.de/lehre/lehrbuecher/meta-analysis-with-r）进行的，该研究将测试统计数据和整个研究的标准误结合在一起。固定效应模型用于结合荟萃分析中的研究。
Illumina开发了一种有助于有效基因分型的新技术来对OncoArray样品进行基因分型27。质量控制步骤遵循先前针对OncoArray 29所述的方法。简而言之，基于标准质量控制，排除了具有低基因分型率和不良基因型分型分析（通过成功率或由Hardy Weinberg平衡偏离预期的基因型分布判断）的样本。SNP，表明在对照中偏离了Hardy-Weinberg平衡（P值<1×10 -6）或更低的通话率（基因型通话缺失> 0.05）或低于95％通话率的样本被排除。OncoArray样品的533,631个变体通过了质量控制程序，并被包括在内作为有效的标记，其中105,736个变体（其MAF <0.01）是罕见的变体。使用定制的Affymetrix公理阵列（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉，Affymetrix）对Affymetrix研究样本中的395,745个SNP进行基因分型，其中包含一整套全面的GWAS关键标记，稀有和低频变体以及插入缺失11。数据集是使用Genome Reference Consortium Human build 37构建的。
为了验证基因分型数据的可靠性，我们分别比较了发现和复制数据集的未受影响个体中所选种系突变的MAF与公开测序项目或数据集（包括Exome Aggregation Consortium（ExAC）12）中的MAF的比较， NHLBI GO外显子组测序项目（GO-ESP）和Trans-Omics for Precision Medicine（TOPMed）计划。ExAC是一个已发布的公共外显子组测序数据集，其中包含60,706个无关个体的变异。GO-ESP是一个外显子组测序项目，其中包括欧美和非裔美国人的参与者。TOPMed对来自不同种族背景的人的DNA进行了测序，其中50％是欧洲血统，而30％是非洲血统。
通过考虑两个平台之间这些基因型的一致性，我们分别在OncoArray平台和Affymetrix平台上确认了所选种系突变的基因分型保真度。在OncoArray联盟中，共有5742名受试者是Affymetrix数据中的重复个体。即使5742个受试者被排除在发现数据集中并包括在复制数据集中，我们仍对5742个个体的种系变异体的OncoArray财团与Affymetrix研究进行了基因分型的一致性，这些个体的基因分型结果可用于两个平台。
一致率是基于OncoArray基因分型和Affymetrix基因分型之间的一致性，我们认为稀有等位基因之间的一般一致性和一致性只有29个。补充表 24描述了OncoArray基因分型和Affymetrix基因分型之间在不同情况下的基因型频率。
使用基因型频率估算总体一致性率，这与OncoArray基因分型和Affymetrix基因分型相一致，并纳入了所有基因型频率（n）。
总体一致性=（a + e + i）/ n。
使用次要/次要和主要/次要的基因型频率来估计稀有等位基因的一致性，这与Oncoarray基因分型和Affymetrix基因分型一致，并整合了除主要/主要基因型频率以外的所有基因型频率。稀有等位基因的一致性=（i + e）/（n- a）。
学生t检验用于评估病例中所选种系突变的不同基因型之间肺癌发病年龄的差异。然后，我们根据性别，吸烟状况和肺癌的组织学来评估发病年龄的差异。
数据集由2014年1月至2016年5月在纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心招募的2686例晚期肺癌患者组成。在该数据集中，有2127例欧洲血统病例被选入当前分析。据报道，该人群中犹太人遗传的频率约为18％，但我们没有从目标测序小组获得足够的信息来推断祖先。使用确定性哈希算法以匿名方法进行种系分析，并为样品分配唯一的标识符，以链接种系和体细胞数据进行综合分析。来自患者的肿瘤和血液DNA通过可操作的癌症靶标的综合突变分析（MSK-IMPACT）进行测序。该测定法捕获了468个癌症相关基因的编码外显子并选择了内含子。使用FACETS版本0.5.6对肿瘤中的LOH进行了总，等位基因特异性以及肿瘤纯度和倍性的评估。使用同一基因中的同义变体估算背景LOH率。使用Fisher精确检验计算统计显着性。
我们使用来自六名患者的人肺浸润性黏液腺癌附近的人正常肺组织的RNA-seq数据进行了mRNA-seq分析。这些患者来自德国，因此本研究中的数据称为德国数据。通过高通量测序获得RNA测序读数，并从Gene Expression Omnibus（GEO）下载。我们使用Bowtie2将RNA测序读数与RSEM v1.2.22量化的同工型丰度进行比对。另外，要确认ATM和KIAA0930的同工型表达在肺中，我们还使用RSEM使用了GTEx v7数据集中的肺组织特异性同工型表达值。使用具有同工型表达值的所有427个肺样品。我们用R绘制原始同工型定量值。通过log2（1 + TPM）转换每百万同工型水平转录本（TPM）估计值之后，使用gplots版本的heatmap.2包对R中的相关矩阵进行分层聚类。 3.0.1.1。
通过使用SNPeffect 4.0 14，我们探索了TANGO，这是一种统计力学算法，可根据β-折叠形成的物理化学原理30预测蛋白质聚集。使用PolyPhen-2 15预测种系突变的功能效应。我们使用Fathmm-XF 18通过应用机器学习方法来准确预测突变的功能后果。
与19种癌症类型相关的TCGA 3级RNA-seq数据和临床患者数据，包括LAD包括515个肿瘤样品和59个正常样品，肺鳞状细胞癌（LUSC）包括503个肿瘤样品和52个正常样品，膀胱尿路上皮癌（BLCA），乳腺浸润癌（BRCA），子宫颈鳞状细胞癌（CESC），胆管癌（CHOL），结肠腺癌（COAD），食道癌（ESCA），多形胶质母细胞瘤（GBM），头颈鳞状细胞癌（HNSC） ），肾肾透明细胞癌（KIRC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP），肝肝细胞癌（LIHC），胰腺腺癌（PAAD），前列腺腺癌（PRAD），直肠腺癌（READ），肉瘤，胸腺瘤，甲状腺癌（THCA）用于研究是否表达ATM或KIAA0930与原发癌有关。总共分析了7570个样品，包括6930个肿瘤样品和640个正常样品。通过比较产生的每百万转录本（TPM）表达值，采用UALCAN进行t检验31，来评估肿瘤与正常样品之间基因表达水平差异的重要性。
哈佛大学的肺部表达数据18包括12600个基因的mRNA表达值，这些基因的表达已通过秩不变缩放方法从原始表达数据中进行了缩放和标准化，以消除批次差异。研究共包括127个LAD，21个肺鳞状细胞癌，20个肺类癌，6个小细胞肺癌和17个正常肺标本，共203个样本，并进行了微阵列分析。在这12600个基因中，包括ATM和KIAA0930。另外，分析了ATM的外显子2和5，而没有相应的完整基因表达变化。我们使用t检验来评估ATM基因表达水平的差异一般而言，在每种组织学类型中，肺癌和正常肺样本之间分别是第2和第5外显子以及KIAA0930。
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