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基于氧化还原的电生CRISPR系统连接并控制生物信息网络

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发表时间：2020-05-18 16:06作者：武汉新启迪Xinqidibio来源：www.qidibio.com

基于氧化还原的电生CRISPR系统连接并控制生物信息网络

摘要

电子信息可以通过电极激活的氧化还原介体直接从微电子学传递到细胞。这些传输由氧化还原响应性启动子解码，该启动子使用户能够指定对生物学功能的控制。在这里，我们通过建立信息交换的电子eCRISPR管道来建立这种氧化还原通信方式。该系统充当生物信号处理器，放大信号接收并过滤生物噪声。我们通过激活LasI（autoinducer-1合酶）来电子扩增细菌群体感应（QS）信号。同样，我们通过抑制天然SoxRS介导的氧化应激反应调节剂来滤除意外噪声。然后，我们在大肠杆菌和肠沙门氏菌中构建基于eCRISPR的氧化还原导管。最后，我们展示基于eCRISPR的信息处理，该信息处理允许时空氧化还原命令的传输，然后由明胶封装的大肠杆菌对其进行解码。我们预计氧化还原通信渠道将使生物混合微电子设备成为可能，这些设备可以将我们的能力转变为电子解释和控制生物功能。

介绍

交流的目标是信息的有效传输。不仅在电子领域，而且在生物学中，电磁传输被离子和分子流代替的情况也是如此。电磁和生物分子通信通道都必须克服数据结构和噪声限制。嵌入生物分子结构中的信息内容类似于我们通常在电子产品中使用的数据压缩工具。生物纠错（包括演化），冗余和并行处理与在嘈杂环境中维持数据传输的技术保持一致。注意到生物学中的氧化还原方式包括电子运动，分子结构和反应性，我们建议氧化还原还可以在生物和电子系统之间直接传递信息（以电子形式）。而且，这种方式与信息传递的理论基础非常吻合1，2因为可编程电输入端直接介导，反过来，被接收并通过生物分子和细胞化学解释的传输。

建立在生物系统中起作用的简便的电子分子通信渠道将具有变革性。数十年来，电脉冲已被应用于调节生物学功能。电磁神经和肌肉刺激3，疼痛减轻4，伤口愈合5是已经有益于人类健康的生物电子学的一些例子。但是，在这些情况下，施加的电脉冲会调制基于离子的电流6导致系统级更改。近来，一种替代的策略已经提出其中电极施加的信息被本地发射，在通过涵盖分子通信的结构特征的基于电子的氧化还原态细胞水平7，8。氧化还原是最普遍的天然存在的生物在通信模式与肠道微生物影响一个7，9，炎症和自身免疫10，11，老化12，和细菌群体感应13，14。一系列小分子氧化还原介体（例如抗坏血酸，NAD（P）H，过氧化氢，超氧化物，羟基自由基）可实现氧化还原，更重要的是，这些氧化还原介体可通过接受或给予电子来激活。通过这种美德，这些分子可从发射电极以生物学反之亦然电子信息15，16，17，18。此外，性质已演变广阔组的氧化还原应答调控元件，诸如SoxS的19，OxyS 20，NFκB 21，Nrf2的/ Keap1的22，而这些可以被重新用于响应用户施加的氧化还原输入。我们已经展示了两个此类调节器SoxS 23的重新布线和OxyS 24，25，26，27，以使用于致动和控制本机细菌功能，如运动性和细胞-细胞信号传导用户施加的氧化还原输入。

在这项工作中，我们使用CRISPR介导的工具集将丰富的CRISPR功能带入氧化还原通信通道。我们组装了一个由两部分组成的遗传系统，该系统包括（i）由基于氧化还原的分子信号激活的基于SoxS的电启动子；（ii）基于CRISPR-Cas9的合成转录因子，用于多重激活和抑制。我们将其称为电遗传CRISPR系统（eCRISPR，图 1），在该系统中，电子设备的便捷性和鲁棒性可访问生物学中的多种功能。首先，由铜绿假单胞菌产生的吩嗪类抗生素氧化的氰化花青素（PYO）用于激活SoxS启动子。通常，在有氧条件下，PYO氧化了SoxR阻遏从SoxS启动子导致表达13，23和缩小PYO，反过来，是通过细胞内的电子转移容易重新氧化。在厌氧条件下，PYO再循环是由氧化还原活性电子受体如铁氰化物（Fcn（O））介导的，其氧化还原状态由外部电极23控制，从而导致在具有减弱的氧化应激反应的允许宿主中控制基因表达。第二部分由CRISPR-Cas9的衍生的转录因子，使基因组精确定位和编辑28，29和那些含有死Cas9（dCas9）能够进行精确的基因沉默（简称CRISPRi）30，31。当dCas9与转录激活因子（如VP16 32，细菌RNA聚合酶33的ω亚基和SoxS 34）融合时，CRISPR已被证明可以激活转录（称为CRISPRa）。

我们假设，通过用electrogenetic耦合基于CRISPR合成转录调节23，35个启动子系统一个将使在宿主基因组中的转录直接的电气控制。而且，由于电子控制是通过简单地偏置靠近含细胞的介质的电极来进行的，因此电子信号和控制的全部功能都可以访问。可调性可以通过控制尺寸，位置，和电极材料来实现36，37，38，39，可以创建可编程化学梯度（例如，电泳，凝胶化）40，41复杂的信号输入可以被应用于在生物电路17上采用先进的信号处理方法。为此，我们研究了Bikard等人先前描述的细菌CRISPRa系统。等涉及使用dCas9-ω作为转录激活因子33并构建了一个电可调和可控制的CRISPRa系统（eCRISPR）。我们调整了控制CRISPR组分化学计量的各种因素，然后将它们与电基因SoxS启动子整合在一起。电感应后，我们观察到荧光蛋白的转录激活增加了约15倍。为证明受控的生物学功能，我们使用eCRISPR来放大细菌之间的细胞间通讯。通过这些演示，我们展示了细菌细胞之间电子编程的生物通讯。

除了建立一个大肠杆菌特异性electrogenetic控制器中，我们试图证明在其他非兼容的主机功能23，42。也就是说，通过显示eCRISPR可以与为不同宿主选择的gRNA协同工作，我们展示了一个信息通道，该通道可通过同一电子输入将不同消息传递给多个参与者。我们以前的工作23利用了应力响应减弱的DJ901 大肠杆菌。这使得更集中地扩增SoxS介导的基因转录。在效果上，本机应激反应的抑制作为一个过滤器，降低噪音43，44和简化传输。我们和其他人先前已经证明通过下调伴随多效响应，可以集中代谢活性朝向期望遗传改造的功能，包括靶向基因表达45，46，47，48，49，50。在这项研究中使用的SoxS启动子是SoxRS regulon的一部分，后者是大肠杆菌中氧化应激防御反应的全球调节剂。暴露于氧化应激源后，SoxS 51的几倍上调导致〜15 个基因上调，包括超氧化物歧化酶（sodA和sodB），富马酸盐水合酶（fumC）等赋予细胞以减轻氧化应激的广泛而有效的手段。在这里，我们使用CRISPR-Cas9系统选择性地和暂时地沉默基因组SoxS和随之产生的氧化防御反应。这种多效性噪声的减少使大肠杆菌中靶向电生SoxS启动子活性提高了4倍。同样，通过在肠沙门氏菌中进行类似的实验显示了电生成系统的可移植性，在该实验中我们发现基于大肠杆菌的soxS启动子的表达增加了类似的4倍，但具有针对沙门氏菌设计的抑制靶标。

最后，我们将eCRISPR展示为信号放大器和滤波器，可在复杂环境中实现电输入与细胞输出之间更好的一致性。为此，我们组装了一个生物电子界面并演示（i）生化梯度的电化学形成，以及（ii）这些梯度如何在空间上指导固定在水凝胶中的细胞内eCRISPR介导的功能。相对于没有eCRISPR控制的细胞，含CRISPR的细胞群显示出增强的信号强度。通过这种方式，我们证明了电子控制细胞功能的灵活性以及eCRISPR基因调节所带来的好处。

结果

细菌中的可调CRISPRa系统

我们首先旨在创建可诱导的和可调CRISPR-Cas9介导的转录活化（CRISPRa）系统，该系统使能集成基于细菌群体感应（QS）信号转导系统的大肠杆菌 W3110 52，53，54，55，56，57，58。要做到这一点，我们创建NB101菌株（大肠杆菌 W3110Δ rpoZ，lacZ启动，补充表 1）用于调整先前报道的细菌CRISPRa系统，其中所述RNA聚合酶亚基ω（rpoZ）遗传融合至化脓性链球菌起源失活的Cas9（dCas9）导致绿色荧光蛋白（GFP）33的 23倍转录激活。重要的是，在NB101中，我们发现了相当水平的CRISPRa（补充图 1），并将该菌株用于进一步的实验。

接下来，我们着重于提高转录激活水平。Bikard et.al。已使用化脓性链球菌启动子表达CRISPR组件，并使用tracrRNA：crRNA杂种为GFP 33的 CRISPRa提供间隔子。代替tracrRNA：crRNA杂种，我们引入了间隔子（W108 spacer 33）以单个短gRNA（表示为108 gRNA）的形式从p108gRNA中的强组成型启动子（J23119）表达。此外，我们将dCas9-ω融合物置于pdCas9-ω中的可诱导Tet启动子下，并使用dCas9-ω的泄漏表达来实现pWJ89的GFP激活。这种结合导致GFP活化提高了约5倍，这表明dCas9-ω和gRNA的相对水平在控制转录中起着重要作用（补充图 2）。为了进一步增强CRISPRa，在真核CRISPRa系统中使用的常见策略是增加每个dCas9分子32的转录激活子结构域，但是增加ω的数量并未导致CRISPRa的增强（补充图 3）。59。为了实现可调节的细菌CRISPRa系统，我们首先在gRNA的前几个碱基对中使用错配，该错配首先退火至与原间隔子相邻基序（PAM）相邻的DNA区，也称为间隔区 60的种子区。我们没有发现错配在CRISPRa可调性中的作用（补充图 4）。

然后，我们专注于使用诱导型启动子来调节dCas9和gRNA的表达。首先，我们通过添加脱水四环素（aTc）从Tet启动子诱导dCas9-ω的表达（补充图 5）。尽管dCas9-ω随着aTc增加，但CRISPRa和GFP荧光却没有。通过调节来自Tet启动子61的 dCas9-ω来减少渗漏表达的其他尝试均未成功（补充图 6）；此后，我们依靠dCas9-ω的漏表达。接下来，我们将注意力从构成性J23119启动子转移到诱导型启动子（pTrc-108gRNA中的pTrc和pSoxS-108gRNA中的pSoxS），将gRNA集中起来，同时随着诱导物浓度的增加，gRNA的表达增加（补充图 7b）。），CRISPRa没有变化（补充图 7c，d）。这些结果表明两个启动子都表达了足够的gRNA，最终结果是饱和的CRISPRa反应。

接下来，我们用低拷贝的pSC101 *起源替换了表达gS的gS的pSoxS质粒中的高拷贝pBR322起源，以创建质粒pSC-S108gRNA。相反，我们将目标GFP质粒pWJ89的pSC101 *来源替换为pBR322来源，以创建pMC-GFP（图 2a）。通过这种重排，我们诱导了SoxS启动子的gRNA表达。我们观察到6小时后gRNA表达随PYO增加而增加（图 2b），以及GFP荧光增加约21倍（图 2c），表明CRISPRa的可调性。

已经证明我们可以通过控制gRNA的水平和基因靶标的数量来调节CRISPRa，接下来我们寻求看看CRISPRa系统是否可以用于激活基于QS的细胞间通讯。（图 2a，d）。我们使用大肠杆菌 CRISPRa系统激活了LasI的转录，LasI是一种来自铜绿假单胞菌的QS自诱导物1合酶。为此，我们用lasI替换了pMC-GFP中的gfpmut2（pMC-LasI），并将其与pSC-S108gRNA和pdCas9-ω一起转化为NB101。我们将这些种群称为AI-1生产细胞。在有氧条件下重新接种到LB培养基中时，我们添加了不同水平的PYO，并激活了LasI的CRISPRa。4小时后，我们收集了条件培养基（CM），并与AI-1报告细胞一起孵育（请参见“方法”）。结果（图 2d）表明，PYO增加了AI-1活性，这是QS活性的量度。值得注意的是，较高的PYO水平最大程度地提高了QS活性。

因此，在图 2中，我们显示了通过替换天然化脓性链球菌启动子的dCas9-ω表达，以允许Tet启动子的漏表达，以及通过使用合成启动子从tracrRNA：crRNA杂交系统切换到短gRNA系统，我们进行了改进CRISPRa反应提高约5倍。然后通过不仅改变gRNA的化学计量比而且改变系统中靶标的数量来实现该CRISPR系统的可调性，从而导致荧光报告基因的转录增加约21倍。我们通过激活AI-1合成进一步证明了CRISPRa介导的QS在两个不同种群之间的交流。我们发现AI-1响应人群中的生物发光增加了约7倍。

电可调CRISPRa — eCRISPR

在展示了基于小分子的可调CRISPRa系统的诱导后，我们接下来试图使用SoxS电动启动子23电诱导CRISPRa ，从而创建eCRISPR系统（图 3a）。我们首先使用氧化还原介体PYO和Fcn进行了厌氧性测试。我们从取代了报告基因gfpmut2在PMC-GFP与phiLOV（PMC-phiLOV），其能够需氧和厌氧条件下发荧光的62，并用它作为用于CRISPRa（图靶 3A）。如上图（图 2），在有氧条件下，单独的PYO足以氧化SoxR阻遏物并激活SoxS的基因表达。但是，在厌氧条件下，SoxR的PYO回收需要使用氧化还原活性电子受体，例如Fcn（O）。因此，展望未来，在厌氧条件下，PYO和Fcn均被加入以介导SoxS启动子的活化。在有氧条件下，我们将LB101细胞与可调节CRISPRa质粒（pSC-S108gRNA，pdCas9-ω）和新的报告质粒pMC-phiLOV一起在LB培养基中于37°C下培养。OD 6000.6，我们洗涤细胞并将其重悬于基本M9培养基中，并在厌氧条件下进行进一步的实验。为了表征SoxS启动子和所得CRISPRa的gRNA表达，我们首先优化了氧化还原介质Fcn（O）和PYO的浓度。phiLOV荧光随着Fcn（O）和PYO浓度的增加而增加（补充图 8a，b）。我们发现最高的PYO和Fcn（O）浓度（分别为10 µM和50 mM）产生约18倍的CRISPRa（补充图 8c）。但是，为了保持荧光测量的线性，我们随后使用了5 µM PYO和50 mM Fcn进行进一步的实验。

接下来，我们试图证明电极介导的CRISPRa控制。我们没有向细胞中添加氧化的Fcn（O），而是添加了5 µM的PYO和50 mM的Fcn（R），并使用电化学设置（“方法”）施加了+0.5 V的氧化电位，以将Fcn（R）氧化为Fcn（O）。我们向细胞群体施加了不同量的电荷，并将其转移到37°C的培养箱中2 h。然后，我们测量了来自SoxS启动子的gRNA和来自CRISPRa的phiLOV的相对表达水平（图 3b）。随着施加电荷的增加，我们发现gRNA和phiLOV的水平均升高，直到-0.5 Coulomb都降低了，这可能是由于表达介导的毒性所致。图 3c表示在电感应后6小时内以不同水平的施加电荷获得的荧光。如预期的，荧光在最初的4小时内随着电荷的增加而增加，直至-0.4 C，最大〜13倍转录激活。

作为电子与生物信号传递方式之间信息传递的演示，我们尝试使用AI-1生产细胞将电子信号转换为生物信号来电子提高QS通信。我们使用了CRISPRa系统来激活LasI的转录（见图 3a）。在OD 600为0.6时，我们将AI-1生产者群体转移到最小M9介质中，并在厌氧条件下施加了不同量的电荷。在37°C下孵育2小时后，我们收集了条件培养基（CM），并将此CM与AI-1报告细胞在有氧条件下孵育4小时，并通过生物发光测量了相对QS活性（图 3d）。结果表明，施加的电荷大于-0.06 C时，QS活性增加了约1.5倍。也就是说，已经通过基于AI-1的通信进行通信的细胞（由于以下原因，AI-1的背景水平为零）：当电荷超过-0.06 C时，来自电刺激的生产细胞的贡献大大增强了信号的泄漏性表达和低电荷情况。因此，这些结果清楚地证明了eCRISPR的电子驱动作用，以介导交流细菌种群之间的天然信号传导。我们进一步注意到，在我们以前的工作中，我们使用了转基因宿主，其中，SoxS调节的应激反应调节因子被减弱。

多路复用以降低噪声并展示便携性

为了增加由基于SoxS的氧化还原启动子介导的生物电子通信中的信号强度，我们试图利用CRISPR抑制由代谢抑制性氧化应激反应（否则由电信号触发）引起的噪声，从而导致所需信号的放大。另外，为了介导广泛的适用性并概括电子向生物信息的转移，我们检查了大肠杆菌和沙门氏菌的电启动子系统的便携性，而遗传电路的重新布线很少（图 4a）。

首先，我们专注于eCRISPR作为可靠的信号放大器。SoxS启动子的诱导剂-花青素（PYO）也是一种氧化应激源23。大肠杆菌主要通过两个全局转录调节因子SoxS和OxyS 63减轻氧化应激。在这里，我们试图确定CRISPR介导的大肠杆菌基因组中SoxS的抑制是否可以导致质粒编码转基因的SoxS启动子活性的提高，并以此作为电信号放大器。我们预期基因组中SoxS的抑制将不会对各种CRISPRa构建体中存在的pSoxS启动子产生影响，因为SoxR驱动了对SoxS启动子的控制，而在我们的实验中SoxR并未受到影响。

我们通过靶向细菌基因组中的soxS，将转录激活因子dCas9-ω重新用于抑制SoxS介导的氧化应激反应。理想的dCas9抑制目标位点是-35至-10启动子区域33，但是，由于我们在可调gRNA质粒pSC-S108中使用了大肠杆菌soxS启动子进行电激活，因此我们选择了靶向PAM位点基因组中最接近soxS转录起始位点（TSS）的下游位点。我们针对soxS的非编码链中的两个PAM站点基因在+4 bp和+5 bp处设计，并设计了两个相应的gRNA S-1和S-2（“补充方法”）。我们在强组成型启动子J23119的非特异性控制下表达了这些gRNA，并如上所述通过Tet启动子的漏表达提供了dCas9-ω。作为CRISPRi的阳性对照，我们使用了不含ω亚基的dCas9，即使用pdCas9的已知转录阻遏物33。我们将各自的gRNA和dCas9质粒转化为在LB培养基中于37°C生长的NB101细胞。在OD 600 0.6时，我们在有氧条件下用5 µM PYO 诱导基因组中的soxS，并在3 h后收集RNA并进行qPCR。我们比较了soxS的相对水平在S1，S2和对照gRNA与dCas9和dCas9-ω结合存在下进行S-RNA表达（图 4b）。使用对照gRNA，与无PYO条件相比，soxS表达增加了约12至17倍。重要的是，对于S1和S2 gRNA，添加PYO 后soxS并没有增加，证明了有效的CRISPRi。由于S1 gRNA对soxS的抑制作用略好于S2，因此我们在所有其他实验中都使用了S1。另外，由于dCas9和dCas9-ω之间的抑制水平没有差异，因此我们继续进行dCas9-ω进行进一步的实验。

我们的目标是通过CRISPR 抑制基因组中的soxS，从而避免各种SoxS调节的防御反应基因的上调，这是细胞在未来电遗传应用中的潜在代谢负担。使用qPCR，我们测量了被SoxS高度上调的两个基因的表达水平：sodA（超氧化物歧化酶A）和fumC（富马酸盐水合酶）。在与图4b相似的条件下，S1和dCas9-ω阻止了sodA和fumC的上调（补充图 9）。为了证实这一点，我们添加了0.5 mM百草枯，这是一种强力且特性良好的氧化剂19。我们发现〜75倍的激活soxS与对照gRNAs（补充图 10一个），但是在存在soxS特定S1 gRNA和dCas9-ω，soxS被压抑至背景水平。类似地，由于不存在升高的SoxS ，sodA（补充图 10b）和fumC（补充图 10c）没有上调。

接下来，我们研究了如果镇压soxS在大肠杆菌基因组中导致质粒编码SoxS启动子活性的改进。我们使用了先前描述的电遗传报告质粒pTT01 23起点，该起点在带有pBR322起点的SoxS启动子下包含phiLOV（表示为pSoxS-phiLOV），并插入了一个要在J23119组成型启动子下表达的S1 gRNA序列的盒（创建pSoxS-phiLOV： pS1gRNA）。在无氧条件下，我们用5 mM Fcn（O）和5 µM PYO诱导了带有pSoxS-phiLOV：pS1gRNA的NB101细胞，并通过流式细胞仪测量了phiLOV荧光水平。作为对照，我们也仅将pSoxS-phiLOV转化为DJ901细胞（ΔsoxRS）。在图 4c中，phiLOV荧光测量表明，添加的S1 gRNA和dCas9-ω以及pSoxS-phiLOV报告质粒导致NB101细胞增加3至4倍（WT为soxS）。这与基因修饰的DJ901（ΔsoxRS）细胞相当（图 4c）。我们还设计了在质粒pSCSoxS-S1gRNA中具有pSC101 *起源的SoxS启动子下S1 gRNA的表达。在这里，我们也观察到phiLOV荧光增加了约3倍。这些结果表明，伴随基因组SoxS的下调确实增强了质粒编码的SoxS启动子的上调。

接下来，我们重点介绍了通过将这些成分转移到沙门氏菌中来使用CRISPR来构建便携式电信号系统的方法。我们设计了特定的gRNA，以抑制肠炎沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌LT2中的soxS，并证明从大肠杆菌 SoxS启动子输出增强的电启动子输出。首先，我们在soxS基因的非编码链中，在+29 bp处的TSS下游鉴定了一个PAM位点，称为S3 gRNA（“补充方法”中的序列）。我们替换了质粒pSoxS-phiLOV：pS1gRNA中的gRNA序列，以创建pSoxS-phiLOV：pS3gRNA，并将其与pdCas9-ω一起转化到沙门氏菌 LT2中。我们将细胞生长到OD 600在有氧条件下为0.6，并用5 µM PYO 诱导基因组中的soxS。3小时后，我们收集了RNA样品并进行了qPCR。作为对照，我们也有不含S3 gRNA和dCas9-ω的沙门氏菌。加入PYO后，对照中的soxS基因表达增加了约14倍。然而，随着S3 gRNA和dCas9-ω，有在无显著增加soxS指示成功的基于CRISPR阻遏soxS在沙门氏菌基因组（补充图 11）。接下来，我们验证了基因组中soxS的抑制是否会导致大肠杆菌 SoxS启动子活性的增加，含有pSoxS-phiLOV：pS3gRNA和pdCas9-ω的沙门氏菌 LT2细胞在有氧条件下于LB培养基中的OD 600 0.6，随后将其重悬于基本M9培养基中，并移至无氧条件下。然后，我们添加了10 µM PYO和5 mMFcn®，并施加了+0.5 V的氧化电位。在-0.5 C放电后，我们将细胞移至厌氧室内的37°C，并在随后的6小时内测量phiLOV荧光。作为对照，我们在没有gRNA的情况下进行了类似的实验。结果（图 4d）显示不带电荷的总体表达量最低，而在施加-0.5 C的电荷后荧光达到300-800（au）。值得注意的是，pSoxS-phiLOV结果显示基因最多增加了4倍表达而不压抑soxS。在具有dCas9-ω和soxS指导RNA 的情况下，soxS驱动的基因表达又增加了2-4倍，尤其是在6 h样品中。这些结果表明，soxS在抑制沙门氏菌基因组导致增加从electrogenetic输出大肠杆菌soxS在启动子沙门氏菌 为好。更重要的是，这些结果表明我们的遗传方法可移植到非底盘菌株（如沙门氏菌）中，并且CRISPRi可用于靶向其他基因组中的选择基因，从而导致系统设计更加多样化。

已经证明我们可以通过简单地靶向转录起始位点下游的dCas9-gRNA复合物来重新利用dCas9-ω转录激活因子来抑制基因，我们试图研究CRISPRi和CRISPRa是否可以在同一位点同时在不同位点进行大肠杆菌中的激活剂。我们将108 gRNA和S1 gRNA表示为来自同一SoxS启动子的单个杂种gRNA转录本。为了介导gRNA加工，我们引入了自切割核酶（参见补充图 12a）。我们观察到phiLOV激活108 gRNA起作用，导致phiLOV荧光（补充图 12b），而抑制soxS的 gRNA起作用（补充图 12c）。）导致来自SoxS启动子的phiLOV荧光增加（补充图 12d）。这些结果表明（i）成功的核酶介导的RNA加工导致了具有不同功能的gRNA，以及（ii）dCas9-ω可以同时在不同位点进行转录抑制和激活。但是，使用多重RNA时，虽然来自SoxS启动子的phiLOV荧光增加，但CRISPRa介导的phiLOV荧光没有增加（补充图 12b），表明该方法的局限性。需要更多的研究来确定控制SoxS介导的SoxS启动子活性增强和CRISPRa线性的因素。

重要的是，结果图中 4表明转录激活dCas9-ω可以重新用于氧化应激的防御反应基因导致的伴随3-4倍于在质粒编码SoxS启动子活性总增强抑制大肠杆菌以及作为沙门氏菌。从信息处理的角度来看，氧化应激反应类似于噪声，并且这种噪声的衰减导致针对phiLOV表达的集中代谢活性。类似于信息的放大。这些系统可以以最少的基因组布线跨各种物种轻松运输，表明其可移植性。

eCRISPR的时空电子控制

为了证明eCRISPR在时空环境中作为信号放大器和滤波器的重要性，我们构建了一个生物设备接口，其中电输入被转换为瞬时生化梯度。然后，细胞内部的生物信号网络根据其位置响应这些外部梯度（图 5a）。我们预期，CRISPR电路的存在将导致整体生物信号放大，同时仍保留存在于电子和生物信号网络接口处的信息信号的梯度性质。

首先，我们创建了Fcn的电化学梯度。我们在Owl Easycast B1A（Thermo Scientific）凝胶电泳系统中填充了含有50 mM亚铁氰化钾和5 µM PYO的基本M9培养基。将设备放置在厌氧室内，并在设备上施加连续的+0.3 V电位8小时。通过测量在420nm处的吸光度显示了Fcn（R）到Fcn（O）的转化（图 5b）。随着时间的推移，发现了明显的铁氰化物梯度，其中最高水平的Fcn（O）直接与工作电极相邻。如预期的那样，这些水平在8小时内随时间增加。

接下来，为了研究铁氰化物梯度对电生成细胞的影响，我们将细胞固定在明胶水凝胶中，将这些凝胶浸入培养基中，施加指定时间的电荷，并评估其反应。细胞在MOPS-M9培养基中生长至OD 600 0.5，封装在明胶水凝胶中，并浇铸到显微镜载玻片上（方法）。我们将载有水凝胶的载玻片（一次3个，平行通道）放置在凝胶设备的中间腔室中（图 5a），并施加+0.3 V的电势8小时。然后取出显微镜载玻片并通过共聚焦显微镜分析phiLOV荧光（补充图 13））。我们测试了各种细胞群，包括带有phiLOV报告质粒（pSoxS-phiLOV）的W3110细胞，带有pdCas9-ω和phiLOV报告基因的NB101细胞，以及带有pdCas9-ω和pSoxS-phiLOV：pS1gRNA质粒的NB101细胞。结果表明，在所有细胞群体中，电感应8 h后，细胞荧光随着距工作电极距离的增加而降低，这与铁氰化物梯度相对应。最值得注意的是，在各种细胞类型中，带有pdCas9-ω和pSoxS-phiLOV：pS1gRNA质粒的NB101细胞在所有距离上的荧光强度几乎都增加了2倍，而pdCas9-ω和pSoxS-phiLOV：pS1gRNA质粒携带着SoxS特异性gRNA。而且，包含CRISPRi机制的细胞的荧光变化随距离而降低（图 5c）。在图 5d中，我们测试了去除PYO或Fcn（O）或电荷的几种条件。如所预期的，在所有这些情况下8小时后细胞荧光均没有增强。在某些条件下，分别添加25 mM Fcn（O）和Fcn（R）的混合物，以避免高浓度Fcn（O）引起的潜在毒性，同时仍将其他Fcn（O）的总Fcn浓度保持在50 mM。只有在将25 mM Fcn（O），25 mM Fcn（R）和5μMPYO以及+0.3 V电场施加到设备上时，才会出现明显的荧光。这些数据表明，注入2％明胶的细胞不会对加标的25 mM Fcn（O）产生反应，除非在8小时内施加外部电荷（图 5d）。）。在这些测试中，通过电场的存在，既可以将Fcn（R）转换为Fcn（O），也可以将Fcn（O）更新。这反映在图5d中该对照的前缘处的荧光增加。

总之，这些数据支持以下结论：eCRISPR对铁氰化物的电化学产生的空间梯度提供了增强的响应，并且这些梯度可以控制大范围内和固定细胞内的细胞功能。结果，eCRISPR可用于在非工程细胞难以解码的传输梯度内产生全等时空响应。

讨论区

在这项工作中，我们首先改变了几种CRISPRa组件的化学计量，从而开发了可调谐和可诱导的CRISPRa系统。接下来，我们通过将驱动转换为SoxRS regulon来演示了电动控制。发现〜15倍的电基因转录激活。第三，我们将基于dCas9的转录激活因子重新定位为抑制宿主的氧化应激防御反应，从而导致大肠杆菌和沙门氏菌中SoxS启动子的产量增加3-4倍。最后，我们证明了使用凝胶电泳系统可以通过简单的电子设备来时空控制基因表达。

同样，尽管通过操纵gRNA表达发现了可调节的CRISPRa系统，但通过操纵dCas9来控制表达的努力仍未成功。另外，来自Tet启动子的dCas9固有的泄漏表达对于转录激活而言是绰绰有余的，并且dCas9的进一步增加降低了靶基因表达。最近，通过利用各种翻译后方法克服了转录控制的问题，在这些方法中，dCas9和转录激活因子经过二聚化结构域改造，并表达为两个独立的亚基，然后在光学64或小分子65上二聚化。输入。虽然我们有一个CRISPRa系统进入了我们的成功整合SoxS介导electrogenetic电路由phiLOV的〜15倍的激活指示，从SoxS促进phiLOV的直接转录激活是〜类似的质粒拷贝数条件下的40倍23。在这些情况下，激活效率的差异可能归因于在这两种情况下启动转录的方式不同。在CRISPRa系统的情况下，转录激活因子ω亚基在所需启动子上游的位点募集并稳定RNA聚合酶，在SoxS启动子的情况下，RNA聚合酶很容易组装在启动子上，并且在SoxR氧化后具有构象。 SoxS启动子的-35区发生改变，导致转录激活66。有趣的是，SoxS最近被证明是CRISPRa系统中的激活亚基，其转录激活优于ω亚基 34。总体而言，基于CRISPR的合成转录调节因子的整合作为电启动子和目标基因之间的中间层，提供了同时电靶向，激活和抑制多个基因的灵活性。

总之，我们提出了一种电生成方法，其中电子信号和细菌细胞之间的直接连接可以介导靶基因的表达。eCRISPR的出现提供了以电子方式靶向生物体基因组中特定基因的能力，重要的是，CRISPR与电子技术的整合提供了同时电开启和关闭多个基因的能力。以这种方式，使用氧化还原介质作为通信通道，将电子编程的信息传输到生物学并在生物学内传输。作为概念的证明，我们已经证明了宿主防御反应和伴随的转基因激活的程序沉默。这建立在CRISPR的多重能力之上。我们认为，这些能力的进一步发展将以电子方式靶向宿主基因组中的选定基因可能是生物电子学研究中的重要工具，迄今为止，传统上，重点一直是改变离子流并靶向细胞和组织，而不是特定的分子和基因。在细胞内。因此，这项工作增强了我们电子控制生物学功能的能力。通过以编程方式改变电压，人们可以激活修饰细胞中的基因，从而可以介导天然生物信号传导过程。特别是由于氧化还原介体提供了将电子信息从电极转移到生物系统中的手段，因此我们已经利用了氧化还原通信。尽管这里没有详细讨论，但是这种调制的应用很丰富。例如，67，68和其影响疾病的能力是公认的。将电启动子与细菌中的群体感应网络整合可能可以实现肠道微生物组的直接电调节，特别是如果将这些系统整合到诸如可摄入电子胶囊 69的设备中。这项工作还将拓宽合成生物学的应用，其中经常报道与底盘兼容性有关的问题。同时的激活和抑制机制对于调节或支持宿主行为以及成功适应多种生物的合成生物学工具集非常重要。

方法

菌株和质粒

本研究中使用的菌株和质粒列于补充表 1中。使用本文参考文献中所述的引物从背景菌株大肠杆菌 ZK126 70产生了用于CRISPR实验的大肠杆菌 NB101 菌株（ΔrpoZ，lacZ）。33和λ红色重组酶71。用于构建质粒的所有引物均列于补充表 2中，我们使用标准分子生物学方案（例如限制性克隆，Gibson组装和定点诱变）构建质粒。

媒体和成长条件

我们在有氧条件下进行的所有实验中均使用了溶源性肉汤（LB）。我们在LB培养基中于37°C下培养过夜培养物，第二天在新鲜LB培养基中以1：100比例重新接种培养物，并按照每个特定实验中的说明进行使用。对于在厌氧条件下进行的实验，我们首先在有氧条件下将细胞在LB培养基中培养至OD 600 0.6，然后洗涤，然后重悬于基本M9培养基（1x M9盐，0.4％葡萄糖，0.2％酪蛋白氨基酸，2 mM MgSO 4， 0.1 mM氯化钙2和100 mM MOPS）并用于进一步的实验。我们使用包含90％氮气，5％二氧化碳和5％氢气的混合气体在厌氧室（密歇根州科伊）中创建了厌氧条件。根据需要添加氨苄西林（50 µg / ml），卡那霉素和氯霉素（每种25 µg / ml）。

荧光测量

我们使用Spectramax M2读板仪（Molecular Devices，CA）测量激发/发射波长为488/520 nm的GFP荧光。为了通过流式细胞仪（BD，NJ）测量phiLOV荧光，我们使用了恒定的前向和侧向散射设置以及带有530/30绿色滤光片的488 nm激光（补充图 14）。每个样品至少使用50,000个细胞，并使用FACSDiva（BD）和MS-Excel进行数据分析。

AI-1报告基因检测

我们在含有卡那霉素和四环素的LB培养基中于37°C过夜培养AI-1报告细胞（含有质粒pAL105 72的大肠杆菌），第二天在新鲜的LB培养基中将报告细胞稀释2500x。我们还将来自AI-1生产者细胞的条件培养基（CM）稀释到LB培养基中的1000x或100x。我们在FACS管（BD，NJ）中将10 µL的每个稀释的CM样品与90 µL的稀释的报告细胞相加，并在30°C的振荡器中孵育3小时。孵育后，我们使用GloMAX发光计（Promega，WI）测量了发光度。AI-1活性被报告为相对于添加新鲜LB培养基代替CM的对照标准化的发光值。

用于电激活的电化学装置

为了电激活细胞，我们在厌氧室内设计了一种电化学样品装置，该装置由两个玻璃小瓶组成，其中一个小瓶包含1 ml的细胞，在M9培养基中添加Fcn（R）和PYO，另外一个小瓶包含1 ml毫升的Fcn（O）。我们使用浸入每个小瓶中的两条金线（直径0.5 mm，长约50 cm）作为工作电极和对电极，并以Ag / AgCl电极（CH Instruments，TX）作为参比电极。小瓶通过两个盐桥相连。我们将所有电极连接到CHI Instruments 600系列恒电位仪以控制电压。为了将Fcn（R）转换为Fcn（O），我们通过工作电极以Ag / AgCl作为参考施加了恒定的氧化电压。由于电压保持恒定，施加所需电荷所需的时间从几秒钟到3-4分钟不等。在厌氧室中施加所需的电荷后，我们从小瓶中取出细胞，将其转移到培养管中，然后在37°C的培养箱中在厌氧室内进行不同时间的培养而不摇动。对于时程实验，我们在每个时间点取出100 µL细胞，并用2％多聚甲醛固定至少15分钟，然后用于流式细胞仪。

时空氧化还原信号装置

我们在厌氧室内使用了Owl Easycast B1A（Thermo Scientific）凝胶电泳系统来创建电化学梯度。我们通过在厌氧条件下不断搅拌对基本M9介质进行脱气，然后将200 ml脱气介质添加到电泳凝胶系统中。后来，我们在培养基中添加了50 mM亚铁氰化钾和5 µM PYO。为了产生梯度，我们的电化学设置包括一个连接到设备左腔的工作电极，一个连接到设备右腔的反电极以及一个放置在左腔工作电极附近的Ag / AgCl参比电极设备的通过低通玻璃料从培养基中分离出参照物。所有电极都连接到CHI 620E稳压器，并施加了所需的电荷。

明胶细菌细胞的封装和成像

我们将基本M9培养基中的细胞群体培养至OD 600 0.5，并将2x浓度的OD 600 0.5细胞与保持在37°C的2％明胶溶液在基本M9培养基中混合。我们将这种混合物均匀地倒在载玻片上，将其划为0.25平方英寸的片段，并将混合物在4°C下冷却10分钟（补充图 13）。）。然后将三种细胞类型的显微镜载玻片转移到厌氧室中，并小心地并排放置在上述凝胶设备的中间室中，该室在厌氧室中的30°C恒温箱内。在施加电势之前，将载玻片小心地放置在培养基中，使其残留量最小。施加电势8小时后，将显微镜载玻片从凝胶设备中取出，并通过激光扫描共聚焦显微镜分析载玻片上标定位置的phiLOV荧光（488 nm激光和530/30绿色滤光片）。使用ImageJ分析图像，以确定至少10,000个细胞的每细胞荧光。