必须对噬菌体的宿主因子要求和突变性噬菌体不敏感机制进行表征，以合理设计噬菌体混合物。为了表征两种新型大肠杆菌噬菌体（T1样噬菌体LL5和V5样肌噬菌体LL12）的宿主依赖性，针对Keio收集物进行了正向遗传筛选，该收集物是大肠杆菌 str 中单个非必需基因缺失的文库。BW25113。这些筛选和随后的实验鉴定了噬菌体LL5和LL12所需的基因。大肠杆菌缺乏核心糖脂多糖（LPS）的庚糖II和庚糖I的磷酰基取代基的突变体，以及缺乏外膜蛋白TolC的突变体，均无法繁殖噬菌体LL5。缺少LPS外核心葡萄糖I的突变体无法传播LL12。发现两个额外的编码细胞质伴侣的基因PpiB和SecB是噬菌体LL5而非LL12有效繁殖所必需的。这种筛选方法对于鉴定噬菌体的宿主因子依赖性可能是有用的，这将为它们作为治疗剂和噬菌体工程的潜在用途提供有价值的信息。

大肠杆菌是革兰氏阴性兼性厌氧细菌，通常在哺乳动物1中作为共肠肠道菌群的成员被发现。虽然普通的大肠杆菌菌株通常不会在人类中引起疾病，但多种大肠杆菌菌株已获得毒力因子，并可能导致症状从轻度不适到威胁生命的菌血症的疾病。这些菌株已分类为几种致病型，包括肠致病性大肠杆菌（EPEC），肠出血性大肠杆菌（EHEC），产肠毒素性大肠杆菌（ETEC），肠聚合性大肠杆菌（EAEC），肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）和弥散性大肠杆菌（DAEC）2。

肠毒素大肠杆菌菌株可以通过存在热不稳定肠毒素（LT）和/或热稳定肠毒素（HT）2与其他大肠杆菌致病型区分开。这些肠毒素会引起旅行者的腹泻（TD），其特征是轻度至重度水样腹泻2，并伴有恶心，呕吐，腹痛，发烧或大便带血3。TD是发达国家人在国际旅行中感染的最常见疾病之一，ETEC是TD在拉丁美洲，非洲，南亚和中东地区的主要病原体4。TD通常可以自行解决，或者可以成功用抗生素治疗，但是随着全球对抗生素耐药性的增加，有必要对替代治疗方法进行评估4。

噬菌体（噬菌体）是细菌的天然病毒捕食者。由于多重耐药性细菌和新抗生素的发展有限的持续出现，出现了在使用噬菌体作为抗微生物剂的一个新的兴趣5，6，7，8，9。但是，对许多经过充分研究的模型生物之外的噬菌体的基本生物学知识的了解是有限的。噬菌体是高度多样的，并且它们不断地与它们的细菌宿主共同进化10，11。在使用噬菌体作为治疗剂时，需要分离和部署许多新型噬菌体12; 为了使噬菌体治疗成功，需要更广泛地了解噬菌体与宿主之间的相互作用5。

由于噬菌体必须与其宿主密切互动才能繁殖，细菌甚至可以通过单个基因的突变丢失而对噬菌体产生抗性。噬菌体混合物的合理配方包括选择具有遗传上不同的突变抗性机制的噬菌体，这可以延迟细菌对整个噬菌体混合物的耐药性的出现。随着现代遗传资源的可用性，可以更有效地大规模研究宿主-噬菌体的相互作用。大量的基因组宽的屏幕的已进行了在生物体如HIV病毒复制所需的研究宿主因子13，流感病毒14，噬菌体λ 15，T7 16，P22 17和HK97 18。这些筛选也可以专门优化，以鉴定可用作噬菌体受体的细胞表面宿主因子。我们针对Keio收集了大肠杆菌噬菌体LL5和LL12 进行前向遗传学筛选，这是一个大肠杆菌 K-12菌株BW25113 19中所有非必需基因的单基因缺失文库，以鉴定主要宿主这两种潜在的治疗性噬菌体繁殖所需的功能。鉴定宿主依赖性可以合理设计噬菌体混合物，并为噬菌体工程克服宿主依赖性开辟了道路。根据噬菌体LL5和LL12的感染和繁殖所需的宿主因子讨论了该筛选的结果。

噬菌体LL5和LL12的表征

分离噬菌体LL5 20和LL12 21，并如前所述对它们的基因组进行测序。噬菌体LL5是一种T1样噬菌体，在DNA水平上与噬菌体TLS具有> 90％的同一性，噬菌体LL12是一种V5样噬菌体，与噬菌体rV5关系最密切，但也与噬菌体phi92关系更远。透射电子显微镜显示噬菌体LL12是一个噬菌体，头直径为〜85 nm，尾巴的长度为〜110 nm，具有明显的基板，而LL5是噬菌体，其头部直径为〜60 nm，并且尾巴具有柔性〜长度为150 nm（图   1）。

噬菌体LL5（A）和LL12（B）的透射电子显微照片。噬菌体LL5的衣壳直径为61 nm（±2 nm），长度为156 nm（±10 nm），是柔软的，不收缩的尾巴。噬菌体LL12的衣壳直径为86 nm（±2 nm），非收缩尾巴的长度为112 nm（±4 nm）。尺寸是十次测量的平均值，误差代表标准偏差。比例尺表示100 nm。

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STEC菌株感染可导致水样或血性腹泻，溶血性尿毒症综合征，微血管性溶血性贫血和血小板减少症22。属于几种病理型的大肠杆菌菌株倾向于克隆，并基于O抗原（脂多糖）和H抗原（鞭毛）2分为血清型。噬菌体LL12熊相似噬菌体RV5和ΦAPCEc02，两者传染STEC血清型O157：H7 23，24，我们试图确定是否噬菌体LL5和LL12也能够感染STEC的代表。

噬菌体LL5和LL12被发现在STEC菌株的软琼脂表面上，与Keio亲本菌株BW25113相比，它们的平板接种效率（EOP）。噬菌体LL5无法在任何经测试的STEC菌株上形成噬菌斑，并且噬菌体LL12在血清型O157：H7，O145：NM，O121：H19，O146和O121：H19的STEC菌株中表现出接近1的EOP。 STEC血清型之间的寄主范围广（表   1）。

筛选试验的开发和优化

感染复数（MOI）是培养物中噬菌体与宿主细胞的数量之比。筛选的目的是鉴定噬菌体成功感染细胞并产生后代所需的宿主基因，这是通过噬菌体在液体培养物中抑制细菌生长的能力来衡量的。为了确定这一点，必须为每个噬菌体优化MOI，因为即使噬菌体能够感染细胞但仍不产生后代，过高的MOI也会导致细菌生长受到抑制，而过低的MOI则可能导致假阳性结果25。最初，在37°C孵育8小时后，确定了控制亲本BW25113在液体培养物中生长所需的最低输入噬菌体浓度。在该筛选中应用了十倍高的噬菌体浓度，以最大程度地减少假阳性。通过可行的计数确定由96针复制子接种的细菌细胞数。根据接种的细胞和所用噬菌体的PFU，此筛选中使用的LL5和LL12的初始MOI分别为1.0和0.001。经过该筛选后，仅保留了与突变菌株的草坪上显着的平板缺陷相关的突变体（与BW25113亲本相比，EOP降低了约20倍或更多），用于进一步研究（表   S1和S2）。

噬菌体LL5繁殖所需的基因

如材料和方法以及补充文本中所述，针对Keio集合的3,985个单基因敲除筛选了噬菌体LL5。表S3中报道了在不存在和存在LL5的情况下筛选期间观察到的菌株的OD值   。在筛选，通过平板接种确认缺陷以及在每个突变的反式互补中，确定了噬菌体LL5的有效繁殖所需的八个基因（表   2）。删除了基因gmhA，waaE，waaC，waaP，waaF和tolC基因的菌株显示出严重的平板缺陷，噬菌体LL5的EOP小于〜10-7。在P1转导的waaP突变体中也观察到了这种电镀缺陷。当相应的基因被反式提供时，噬菌体LL5的铺板效率可以恢复（表   2）。另外两个Keio突变体secB和ppiB在支持噬菌体LL5生长方面表现出较弱的缺陷，相对于亲本大肠杆菌 BW25113 ，EOP降低了约10到100倍。这些突变体可以通过P1转导到亲本背景中，也可以反式互补（表   2）。

基因gmhA，waaE，waaC，waaP和waaF是核心LPS生物合成途径的一部分，并且与该途径中多个基因相关的严重平板缺陷表明噬菌体LL5需要完整的核心LPS进行感染。WaaP向内核LPS的Hep I添加磷酸酯或2-氨基乙基二磷酸酯（PPEtN）26（图   2B），并且waaP或更早的步骤中的缺陷会导致“深粗”表型，与明显的外膜缺陷相关，包括增加的去污剂灵敏度，LPS异常分布和OMP掺入大大减少27。WaaF加入Hep II是LPS途径的最后一步，观察到的LL5有很强的平板缺陷，这表明噬菌体LL5感染也需要核心LPS的Hep II残基。在电镀效率WAAY突变体是正常的，只观察到在轻微缺陷waaQ突变体（表   S1），这表明这些基因不需要用于LL5感染。

噬菌体LL5和LL12复制所需的大肠杆菌核心脂多糖（LPS）的基因和生物合成途径。通路中的蛋白质以粗体表示，并标记了生物合成的每个步骤。噬菌体LL5和LL12在通路的每个步骤缺陷的突变体上形成噬菌斑的能力由绿色复选标记（形成噬菌斑）或红色“ X”（不形成噬菌斑）表示，如每个蛋白质名称上方所示。图A：核苷酸糖前体ADP L-甘油-β-D-甘露糖庚糖用作将庚糖（图B中绿色）转移至大肠杆菌核心LPS 的底物。ADP L-甘油-β-D-甘露糖庚糖是通过七聚庚糖-7-P通过gmhA，waaE和waaD组成的途径合成的。都gmhA和waaE对于噬菌体LL5和LL12的生长是必需的。B组：LPS由四个不同的域组成：脂质A，内核，内核和O抗原。标出了负责添加与该研究有关的糖残基和磷酰基成分的酶。WaaC，WaF，WaQ，WaG，WaI和WaaB在LPS上添加六元或庚糖残基，WaP和WaaY在七元糖残基I和II上分别添加磷酰基取代基。噬菌体LL5形成噬菌斑需要WaaC，WaP和WaaF。LL12需要WaaC，WaF和WaaG，而缺少WaaP（复选标记和“ X”）会导致噬菌体LL12的电镀效率降低约50倍。面板A改编自54，面板B 改编自55。

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LL5预测的中央尾部蛋白质gp51与T1样噬菌体TLS（TLS gp51，YP_001285540）的TspJ尾部蛋白质98％相同。LL5 gp57位于gp51下游约3 kb处，仅在其N末端结构域与其他假定的T1样尾巴纤维相似，而C末端结构域与在T5样噬菌体（如DT57C）中发现的假定的尾巴纤维蛋白更紧密相关和DT571 / 2 28。LL5 gp57的273-605位残基与C跨区（跨越1,076个DT57C LtfA蛋白（YP_009149889）的515至830位残基）在57％相同，位于该蛋白的宿主特异性区内29。噬菌体TLS利用外膜蛋白TolC和LPS核心识别并感染其大肠杆菌宿主30。由于噬菌体LL5的内核LPS需求与噬菌体TLS 30的需求相似，因此还测试了LL5对TolC的感染依赖性。在tolC缺失突变体中噬菌体LL5的铺板效率小于5×10 -7，并且该表型可以反式互补（表   2）。尽管此处提供的数据表明噬菌体LL5需要完整的LPS内核和TolC OMP才能进行感染，但应注意，正常的外膜组装也需要TolC，而且这些突变体还显示出“深粗”表型31，因此难以确定tolC中缺失的影响和与噬菌体LL5感染中LPS内核合成有关的基因。而且，先前已经报道了tolC突变体也对LPS特异性噬菌体32具有抗性，因此尚不清楚噬菌体LL5是否与TolC直接相互作用以成功感染，或者由于TolC的丧失而导致的LPS结构的改变赋予LL5不敏感。还不清楚LL5的两个假定尾纤维中的哪一个，即中央纤维gp51和L形侧纤维gp57，能识别出哪个表面特征。

除了编码表面特征的基因以外，还发现噬菌体LL5的铺板效率在其他两个基因secB和ppiB缺失的菌株中也降低了（表   2），这两个伴侣是有助于蛋白质转运和脯氨酸肽键异构化的伴侣分别33，34。SecB是一种四聚体细胞质伴侣，是一般分泌（Sec）系统的一个组成部分，可将细胞质中合成的蛋白质翻译后转运到细胞质外区室。翻译后转运主要优选用于周质和外膜蛋白35，36。十八种大肠杆菌蛋白已报道为依赖的SecB介导的转位33，36。我们不知道这些SecB依赖蛋白是否在噬菌体LL5的感染周期中起作用，或者secB突变体中胞质蛋白聚集体的积累是否会阻碍噬菌体的复制。在没有SecB的情况下，据报道其他细胞质分子伴侣被上调以稳定分泌蛋白，使其延迟转运和/或拯救蛋白聚集体37。其他伴侣分子的这种补偿机制可能是secB突变体中噬菌体LL5的EOP缺陷相对较轻（EOP = 0.06）的原因。

PpiB，属于蛋白质的肽基-脯氨酰顺/反异构酶（PPIase）超家族，催化脯氨酸残基之前的肽键处的蛋白质折叠34。尽管PPIase在几种生物学过程中都发挥着作用，但没有证据表明仅依赖于任何PPIase 34的任何生物学过程。大肠杆菌 K-12 的基因组编码八个PPIase，属于三个家族：FKPBs，亲环蛋白和小白蛋白34。亲环蛋白家族由PpiA和PpiB组成，分别是周质和细胞质蛋白34。据我们所知，还有另外两个报道的噬菌体感染需要PPIase的实例。的SlyD，属于家庭FKBP的PPIases，已经显示由单链DNA噬菌体ΦX174需要为斑形成38通过稳定噬菌体裂解蛋白E 39。FkpA，一种周质性PPIase，被噬菌体HK97和一些相关的大肠菌感染是必需的，并且似乎是支持噬菌体DNA进入细胞18所必需的。由于尚未鉴定噬菌体LL5的感染周期，因此难以解释噬菌体复制的哪个方面受到PpiB缺失的影响。

噬菌体LL12繁殖所需的基因

按照“材料和方法”及补充文本中所述，针对Keio集合的3,985个单基因敲除筛选了噬菌体LL12。表S3中报道了在不存在和存在LL12的情况下筛选期间观察到的菌株的OD值   。在证实了平板缺陷和遗传互补之后，确定了六个基因对于噬菌体LL12的有效繁殖是必需的（表   2）。对于LPS生物合成途径中的基因，删除了噬菌体LL12显示出平板缺陷的所有突变体。噬菌体LL12 在gmhA，waaE，waaC和waaF中显示出严重的镀层缺陷（EOP <10 -8）缺失，和〜10的EOP -6在WAAG删除。删除waaP会导致较轻的镀层缺陷（EOP〜0.02）。当以反式提供各自的基因时，这些缺陷可以被修复（表   2）。

在上文噬菌体LL5的背景下，已经解释了基因gmhA，waaE，waaC，waaP和waaF在LPS生物合成中的功能。WAAG链接葡萄糖（GLC）我到的的Hep II LPS内芯（图   2B）40，41，和标记的外核心结构域的起始大肠杆菌 LPS。糖残基Glc II和半乳糖（Gal）分别通过WaaI和WaaB与Glc I连接27。噬菌体LL12在waaI和waaB中的铺板效率突变体接近野生型（〜0.5），表明Glc II和Gal侧链在噬菌体LL12感染中不发挥重要作用（表   S2）。waaG缺失时噬菌体LL12的EOP大大降低，这表明外核Glc I在噬菌体LL12的宿主识别机制中起着至关重要的作用。在waaP突变体（表2）中观察到了较轻的镀层缺陷，该突变体   缺乏对Hep I的磷酸酯/ PPEtN修饰，WaaY对Hep II的磷酸酯修饰以及WaaQ 26对Hep III的添加。但是，waaQ删除未出现在初始屏幕中，并且删除了waaY 结果表明，电镀效率仅略有降低（EOP〜0.1），这表明LL12可能还需要对Hep I进行磷酸盐/ PPEtN修饰才能成功感染。

Hep II-Glc I连锁在K-12中保守，而R1-R4 LPS核心类型在大肠杆菌42中保守。如表1所示   ，噬菌体LL12能够以K-12，R1和R3LPS 核心类型感染大肠杆菌菌株，这与以下发现相一致：在K-12核心中，Gal侧链残基与Glc I连接。有效噬菌体感染不需要Glc I下游的残基。据我们所知，LL12是第一个表征宿主因子需求的V5样噬菌体。

像相关的噬菌体rV5，phi92和ΦAPCEc02一样，噬菌体LL12编码了一组广泛的预测尾纤维：gp27，gp29，gp32，gp33，gp36，gp41和gp42 42。所有这些LL12推定的尾纤维中的所有七种均与rV5和ΦAPCEc02中发现的推定的尾纤维相似，蛋白质同一性（按Dice系数计）范围为4–100％（表   S4）。在距离更远的噬菌体phi92中也可以检测到这七个蛋白中的六个，其中三个gp29，gp33和gp42分别与几乎全长phi92蛋白147、142和141产生比对（表   S4）。phi92的CryoEM重建表明，该噬菌体具有多组尾纤维，这些尾纤维以向下，侧向和向上的方向安装到基板上43。这些多条尾巴纤维可能有助于扩大噬菌体及其亲属的宿主范围 43。的向下面对的尾纤的电子密度被分配到gp143，其未在LL12保守 42，43。LL12 gp27与phi92 gp150的N端显示出较弱的相似性，预计它会在cryoEM重建物中形成向下的尾尖峰 43。LL12 gp41与rV5 gp41也具有相似性（表 S4），但是LL12 gp41缺少rV5 gp41跨越残基1151–1200的唾液酸内切酶结构域（pfam13884）的C端伴侣。根据尾纤维的序列相似性（表 S4），其他密切相关的V5样噬菌体，例如rV5，ΦAPCEc02和O157：H7型噬菌体4、5和14，可能具有与噬菌体LL12类似的启动感染的要求。

遗传分析已确定噬菌体LL12需要完整的大肠杆菌 LPS外部核心才能在K-12背景中成功繁殖，而缺少完整的O抗原。但是，LL12也能够用各种全长O抗原感染多种不同血清型的大肠杆菌（表   1）。在识别LPS外核44的噬菌体P1的情况下，宿主如大肠杆菌 O157：H7和鼠伤寒沙门氏菌表达的广泛的O-抗原能够掩盖LPS核。O-抗原的损失在细菌灵敏度这些菌株的结果到噬菌体P1 45，46。该观察结果表明噬菌体LL12已经发展出一种机制，以处理可能掩盖其在LPS核心中的受体的O-抗原的存在。已知有几种噬菌体已经进化出机制，可以穿透细菌的O抗原，从而到达细胞表面的主要受体。的尾部刺突蛋白（TSP）沙门氏菌噬菌体P22识别O-抗原作为其受体，并且还具有endorhamnosidase活性和切割其糖苷键产生的缩短的O-抗原47，48。Coliphage G7C还可表达具有针对噬菌体吸附中涉及的O抗原的酶活性的尾尖峰49。在噬菌体LL12的推定尾蛋白中不存在任何这样的酶促结构域，表明LL12可能具有克服细菌O-抗原屏障的其他机制。

最初针对致病性大肠杆菌宿主分离了噬菌体LL5和LL12，并且噬菌体LL12显示出感染了几种突出的STEC血清型的代表。噬菌体LL5与噬菌体TLS密切相关，并编码两种推定的受体结合蛋白：中央尾刺（gp51）和尾纤维（gp57），后者与大肠杆菌噬菌体T5的L形纤维紧密相关。LL12是大的（〜136 kb）噬菌体，是V5样噬菌体的成员，已知会感染致病性大肠杆菌菌株。发现总共八个和六个大肠杆菌基因分别严重影响噬菌体LL5和LL12的繁殖（表   2）。噬菌体LL5在细胞中表现出严重的镀层缺陷（<10 -7）。大肠杆菌tolC和其他突变体在LPS内核的生物合成中存在缺陷，这表明LL5需要外膜蛋白TolC以及LPS内核的Hep I的Hep II和磷酸化修饰才能感染其宿主。噬菌体LL5 在ppiB和secB缺陷的大肠杆菌突变体中也表现出轻度的平板缺陷，它们是胞质伴侣，可能参与噬菌体成分或适当受体表达所需蛋白质的产生。噬菌体LL12在大肠杆菌突变体中显示出严重的平板缺陷，该缺陷对于LPS内部和外部核心合成是有缺陷的，表明LL12需要LPS外部核心Glc I来感染。

通过本研究中使用的基于液体培养的方法检测到的噬菌体繁殖所需的宿主基因数量与通过类似筛选发现的宿主基因数量相似。Qimron 等人在这种最早的屏幕中之一。16用复制平板方法对整个Keio收集品针对强毒的噬菌体T7进行了筛选，并鉴定了11种T7感染所需的基因；这些编码的LPS中有九种具有生物合成功能，而LPS是T7受体。通过评估软琼脂覆盖物上的噬斑形成，Cumby 等人。18筛选了针对Lambdoid噬菌体HK97的815个Keio集合子集，并鉴定了噬菌体感染所需的三个基因，其中之一是噬菌体受体LamB。鲍姆等。17用一种高度敏感的方法针对饱和的转座子插入文库筛选沙门氏菌噬菌体P22，并鉴定了312个对噬菌体感染有一定影响的基因，通过培养中噬菌体DNA的持久性来测量。然而，许多这些突变体仍然能够支持噬菌斑形成，并且倾向于在具有LPS生产缺陷的突变体中观察到最强的表型，该LPS也用作P22受体。

这项研究是从针对Keio文库的噬菌体LL5和LL12的筛选开始的，以研究健壮噬菌体繁殖所需的宿主因子。初步筛选确定了噬菌体LL5和LL12繁殖所必需的37个大肠杆菌基因（表   S1，S2和补充文本），但在进一步分析中，仅发现其中5个与显着的平板缺陷相关，另外鉴定了4个基因通过对特定基因敲除的有针对性的重新测试。这些观察结果突显了高通量筛选的一般噪音性质，以及筛选后需要进行其他验证性实验的要求。

细菌菌株和质粒

Keio系列是从Thermo Scientific 19购买的。删除tolC和waaC的 Keio菌株直接从耶鲁大学的Coli遗传储备中心获得。删除waaF的Keio菌株购自Dharmacon，Inc。用于补充的ASKA文库菌株购自National BioResource Project（日本NIG）50。为了补充与tolC，waaC和waaF相关的表型，来自大肠杆菌 str。MG1655被克隆到pBAD24载体中，并按反义表达，如前所述51。亲本大肠杆菌菌株BW25113获自Ry Young（德克萨斯州A＆M大学，大学城，德克萨斯州）。大肠杆菌从庆应义塾收集和他们的转导株在LB（伦诺克斯）肉汤[10克L-中培养-1 Bacto胰蛋白胨（BD），5克L- -1细菌用酵母提取物（BD），5克L- -1的NaCl（ Avantor）]或LB琼脂[在15 ° L下用15 g L -1杆菌琼脂（BD）修饰的LB肉汤]在30μgmL -1卡那霉素（LB kan）下修饰，并将含有ASKA文库质粒的菌株保持在LB上用10μgmL -1修正氯霉素（LB cm）。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）提取来自ASKA库菌株的质粒DNA。在ASKA质粒的互补实验中，在LB平板或顶部琼脂上添加了0.05–0.1 mM IPTG以诱导蛋白质表达50。将含有基于pBAD24的质粒的菌株保持在LB上，并用100μgmL -1氨苄西林（LB amp）修正。在基于pBAD24的质粒的互补实验中，向LB板补充了0.1 mM L-阿拉伯糖。在tolC互补过程中省略了L-阿拉伯糖由于TolC过度表达的毒性。来自未诱导的互补质粒的TolC的泄漏表达足以恢复噬菌体LL5的铺板效率。本研究中使用的所有引物均应要求提供。

噬菌体分离与培养

如前所述，针对从John Deaton（Deerland Enzymes，Kennesaw，GA）获得的产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的临床分离株，分离出噬菌体LL5 20和LL12 42。随后使用大肠杆菌菌株DH5α作为宿主培养两种噬菌体。通过融合板裂解法52使用LB（Miller）底板制备噬菌体裂解物（10 g L -1 Bacto胰蛋白,、 5 g L -1 Bacto酵母提取物，10 g L -1 NaCl，15 g L -1 Bacto琼脂）和由10 g L -1胰蛋白,、 10 g L -1 NaCl，5 g L -1组成的顶部琼脂细菌琼脂。噬菌体收获并且如拉姆达稀释剂过滤灭菌（0.22微米）的裂解物（25mM的Tris-盐酸pH为7.5，100mM NaCl的，8mM的硫酸镁存储4，0.01％w / v的明胶）在4℃下。

使用斑点滴定法和全板滴定法进行噬斑测定52。对于滴定度测定，将10 µL连续稀释的噬菌体点在4 ml顶部琼脂的凝固草坪上，该草坪接种了100μL如上所述制备的新鲜过夜宿主培养物。对于全板滴定度，将100μL连续稀释的噬菌体与100μL宿主培养物在4 ml熔融顶琼脂中混合，并如上所述倒在LB板上。在37°C下孵育16–18 h后，计数噬菌斑。镀覆效率（EOP）被计算为在测试菌株的草坪上出现的噬菌斑数目与参考菌株上的噬菌斑数目之比。

噬菌体不敏感突变体的筛选和确认

该筛选的目的是鉴定其缺失在噬菌体复制能力上产生重大缺陷的基因。这是由噬菌体以与完全敏感的亲代宿主相同的程度抑制每种突变菌株的液体培养物中的生长的能力来确定的。为了优化输入的噬菌体浓度和孵育时间，将噬菌体LL5和LL12的储备液在新鲜LB中连续稀释，然后将每种稀释液160 µL均分到96孔无菌透明聚苯乙烯平底平板中（Greiner Bio-one）。然后使用96-pin复制器（Phenix）用Keio亲本菌株BW25115接种平板，并在37℃下孵育6、8、10和18小时。在每个时间间隔在Tecan M200读板器中测量550 nm处的光密度（OD），并分析平均OD以确定抑制细菌生长的最低噬菌体浓度。确定抑制亲本BW25113菌株生长的噬菌体LL5或LL12的最低浓度后，在高通量筛选中使用高十倍的噬菌体浓度以最大程度减少假阳性。

Keio集合由90个96孔板组成，在大肠杆菌 BW25113背景19中包含两个独立生成的3985个单基因敲除集。使用无菌塑料96针复制器（Phenix）将Keio菌株复制到含有LB kan + 8％甘油的96孔无菌聚丙烯U型底微孔板（Greiner Bio-one）中。将板在37℃下孵育过夜，并在-80℃下冷冻保存。这些板用作以下筛分的工作原料。奇数和偶数板具有通过独立实验创建的相同的基因缺失突变体19，只有奇数编号的45个板用于初始筛选。初始筛选在96孔无菌透明聚苯乙烯平底平板（Greiner Bio-one）中进行。将噬菌体LL5和LL12稀释在新鲜的LB中以获得LL5的10 6 PFU mL -1和LL12的10 3 PFU mL -1的工作储备液。将160 µL噬菌体工作储备液等分到所有孔中，用96针复制子将Keio菌株接种到96孔工作储备液的噬菌体裂解物中，并将板在37°C下孵育8小时。测量OD 550，并用OD 550孔 高于预定的临界值（噬菌体LL5的0.2和噬菌体LL12的0.11）被评为生长阳性。

通过用相同菌株及其来自偶数编号的Keio收集板的相应突变菌株重复测定来验证从第一个筛选获得的阳性突变体，每个测定并排重复八次。如上所述，通过在软琼脂草坪52上进行斑点测定，通过测量平板的噬菌体效率（EOP），保留了使平均OD 550高于偶数或奇数组中指定的临界值的突变体，以进行进一步表征。EOP的计算方法是：在突变菌株上观察到的噬菌斑数量除以在亲本大肠杆菌上观察到的噬菌斑数量菌株BW25113。EOP小于〜0.05的突变体通过在全板上计数噬菌斑来确认。在可能的情况下，使用卡那霉素抗性盒作为选择标记53，通过P1转导将突变等位基因移至亲本BW25113背景中。通过使用预测插入物侧翼的引物通过PCR确认所有基因破坏，随后对PCR产物进行测序以确认基因破坏。通过用表达相应基因的质粒转化原始的Keio突变体或其P1转导子，对所有突变体进行补充。