摘要
最近的全基因组关联研究（GWAS）对59种脑脊液（CSF）蛋白与阿尔茨海默氏病（AD）的关系表明趋化因子配体2（CCL2）水平升高与非典型趋化因子受体趋化因子结合蛋白2之间存在关联变体V41A（ACKR2-V41A; rs2228467）。高水平的CCL2与AD发展以及其他炎性疾病的风险增加有关。在这项研究中，我们通过测量其配体结合亲和力，CCL2清除效率和细胞活化敏感性来表征ACKR2-V41A受体与野生型等位基因相比的生物学功能。我们用携带野生型ACKR2（ACKR2-WT）或突变的ACKR2-V41A受体的质粒转染了中国仓鼠卵巢细胞。结合亲和力测定表明，ACKR2-V41A对CCL2和CCL4的结合亲和力比ACKR2-WT低。CCL2清除结果与结合亲和力测定一致，其中ACKR2-V41A细胞清除CCL2的效率低于ACKR2-WT。细胞激活试验还显示，与ACKR2-WT细胞相比，经刺激后ACKR2-V41A细胞的受体上调（β-阿瑞斯汀依赖性信号通路）显着降低。这些发现为ACKR2-V41A的GWAS与CSF和可能的其他趋化因子配体中CCL2水平升高之间的GWAS关联提供了分子和生物学机制的见解。CCL2水平升高与认知能力下降和AD风险增加有关。
炎症与罹患癌症，自身免疫性疾病和神经退行性疾病（例如阿尔茨海默氏病（AD）1）的风险增加相关。急性炎症在组织损伤正常的反应中起重要作用2，3。这种炎症反应提升者先天免疫细胞的细胞激活信号（例如巨噬细胞，肥大细胞和内皮细胞）的级联，从而导致促炎细胞因子和趋化因子的增加的4，5，6。这些细胞因子和趋化因子对于先天性和适应性免疫系统中其他细胞的募集和激活至关重要。对炎症的不适当反应或这些趋化因子产生的改变可导致疾病发展。
AD是最常见的神经退行性疾病，是老年人口痴呆的主要原因7。在了解AD的遗传结构方面已取得重大进展。迄今为止，32个位点已被确定与该影响AD的风险常见和稀有等位基因8，9，10。AD的病理特征是淀粉样蛋白β（Aβ）肽的积累形成灰质不溶性聚集的斑块和被认为导致神经变性和记忆功能的丧失5，6，11。然而，通过这些稀有变体和用于疾病Aβ调制风险的积累已被证明的生物机制的表征是非常困难的，只用这些中的几种变体被试验其特征在于8，12，13，14，15，16，17，18，19。
最近对脑脊液（CSF）中AD内表型的分析已经确定了趋化因子受体变异体，可以改变AD 20的风险和进展速度。这项针对59种与AD相关的CSF分析物的全基因组关联研究（GWAS）使用了两个独立的数据集：骑士阿尔茨海默氏病研究中心（ADRC）和阿尔茨海默氏病神经影像学计划（ADNI）20。这项研究表明趋化因子配体2（CCL2）水平升高与非典型趋化因子受体趋化因子结合蛋白2（ACKR2）变异V41A之间存在关联。
CCL2也称为单核细胞趋化蛋白1（MCP-1），由位于染色体17q11.2-q12上的CCL2基因编码。CCL2是一种促炎性趋化因子，涉及通过趋化因子梯度将免疫细胞从血液募集到炎症部位。CCL2有助于控制血脑屏障单核细胞和树突状细胞的迁移，并有助于巨噬细胞的分化和迁移21。在大脑中，CCL2主要由星形胶质细胞，小胶质细胞分泌，并由内皮细胞22少量分泌。在对感染，损伤或炎症产生免疫反应后，中枢神经系统（CNS）会产生CCL2 23。CCL2与趋化因子受体CCR2相互作用，后者通过G对蛋白级联反应发出信号。在CCR2和CCL2配体相互作用后，会发生一系列细胞激活事件[即，激活蛋白激酶C（PKC），钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII），PI3K，Akt和ERK。此激活级联信号细胞迁移，细胞存活，转录调节和促感受伤害释放分子24，25。一旦CCL2结合受体时，其诱导的海马神经元强烈趋化反应和细胞内钙离子和突触网络活动的动员26，27。高水平的CCL2是多种神经炎症和神经退行性脑疾病（例如多发性硬化症，脑缺血，脑外伤和AD 28）的危险因素。在AD小鼠模型中，CCL2是诱导慢性炎症和免疫细胞活化以及其他趋化因子分泌的关键29。CCL2的过表达保留了发炎部位30附近的活化的小胶质细胞。这导致增加的与AD的主要功能活化的小胶质的相互作用：淀粉样蛋白斑，鼠疫聚集，和认知衰退31，32，33。AD小鼠模型中CCL2的抑制或清除显示淀粉样蛋白病理形成加快34。这些研究表明，CCL2的适当功能和调节对于保持大脑固有的免疫反应稳态和认知功能至关重要。
非典型趋化因子受体2（ACKR2 35）由位于染色体3p21.3上的ACKR2基因编码。ACKR2是七跨膜G蛋白偶联受体，包含三个细胞内环和三个细胞外环36。ACKR2与CC家族的14种炎症趋化因子结合，包括CCL2和CCL4，但不与CCL19 37结合。ACKR2是一种非典型趋化因子，因为它在第二个细胞外环中缺少典型的DRYLAIV基序。这种基序的缺乏抑制了受体发出其他细胞因子信号的能力36。而是，ACKR2识别炎症趋化因子，清除它们，并上调更多ACKR2受体的产生38。ACKR2通过内化炎症趋化因子在调节炎症反应中起重要作用，当细胞内体与酸性溶酶体融合时，ACKR2有助于破坏它们。然后，不含趋化因子的ACKR2受体被循环回到细胞表面，并可以清除其他炎症趋化因子39。ACKR2主要在白细胞上表达，包括树突状细胞，单核细胞，巨噬细胞和先天性B细胞40。在中枢神经系统（CNS）ACKR2主要表达在小胶质细胞和星形胶质细胞的细胞41，42，43。映射到ACKR2的非同义突变基因已与乳腺癌的风险增加，睾丸白血病，CD45缺乏症，葡萄糖耐受不良和抑制白细胞类型的分化和单核细胞计数相关联的44，45，46，47，48，49。
ACKR2-V41A等位基因（rs2228467）与CSF和血流中趋化因子水平的改变有关。2017年，对8,293名Finn参与者进行的研究发现，与rs2228467相关的趋化因子趋化因子（一种有效的嗜酸性粒细胞引诱剂）水平升高，患克罗恩病，多发性硬化症和溃疡性结肠炎的风险增加50。在涉及从电子医疗记录和基因组学网（出现）超过11000科目不同的研究中，rs2228467与增加冠脉心脏疾病和血液中较高的单核细胞计数相关联44，51。在分析了700多对母婴妊娠中期血清和新生儿血斑之后，Rs2228467也被确定为发育障碍的高风险因素52。2017年另一项使用国家人类基因组研究机构（NHGRI）数据集的研究发现rs2228467与AD风险增加相关53。这些研究在一起为ACKR2-V41A的生物学表征提供了令人信服的案例。在这里，我们提供了ACKR2-V41A的分子和生物学特性，并显示了其对CCL2的结合亲和力，清除效率和受体上调（β-阿瑞斯汀依赖性信号通路）均降低。这些结果为以前报道的ACKR2-V41A与AD风险，认知能力下降和血清炎症标志物之间的关联提供了见识，而这可能会导致新颖的AD治疗方案。
ACKR2-V41A与野生型的区别在于位于ACKR2趋化因子结合位点的单个氨基酸。V41A特别位于三个细胞外环的第一个。生成了预测的蛋白质折叠模型，并叠加了ACKR2-WT和ACKR2-V41A，以检查折叠和亲水性的差异。在预测的蛋白质结构折叠中没有观察到差异（图 1A，B）。
ACKR2-V41A模型不能预测蛋白质折叠的变化，而可以预测亲水性的轻微降低。ACKR2-WT和ACKR2-V41A之间预测的蛋白质折叠和亲水性均没有显着差异。（A）ACKR2-WT（蓝色和绿色）和ACKR2-V41A（金色和红色）蛋白质模型的并排色带视图。（B）ACKR2-WT和ACKR2-V41A色带模型的叠加，突出显示了在氨基酸位置41处的折叠（WT为绿色，V41A为红色）。（C）ACKR2-WT和ACKR2-V41A（WT为绿色，V41A为红色）氨基酸39-43位的并排带状结构（D）关于ACKR2-WT（左）和ACKR2-V41A（右）趋化因子结合位点第39–43位氨基酸的疏水（红色）和亲水（蓝色）氨基酸的视图。氨基酸41显示在两个模型的右中间。
预测第41位的单个氨基酸变化将使ACKR2-WT和ACKR2-V41A之间的亲水性略有降低（图 1C，D）。尽管缺乏预测的折叠和较小的亲水性差异，但仍预测该变体具有生物学作用。使用RegulomeDB进行的注释分析使该非同义突变得分为5/6。PolyPhen-2预测此变异可能具有0.958的分数（敏感性：0.78；特异性：0.95）。这些预测工具-Chimera，RegulomeDB和PolyPhen-2都预测ACKR2-V41A变体会导致生物学变化并产生功能性后果。
将CHO-k1细胞用ACKR2-WT或ACKR2-V41A转染，并在选择培养基中生长一周，然后使用磁珠和磁柱富集阳性细胞。富集的CHO-k1 ACKR2-WT或ACKR2-V41A细胞群体具有相似的受体阳性细胞百分比（图 2A）和受体表达水平（图 2B）。T检验分析（n = 5）无法检测到在细胞表面表达ACKR2 WT或ACKR2-V41A的细胞百分比之间的显着差异。指示细胞群体ACKR2-WT和ACKR2-V41A之间的转染效率没有不同。
非典型趋化因子受体ACKR2-V41A和ACKR2-WT在细胞表面具有相似的受体表达水平。（A）在细胞表面，非典型趋化因子受体ACKR2-V41A和ACKR2-WT的阳性细胞百分比没有显着差异（n = 5； ns =不显着）。（B）ACKR2-V41A和ACKR2-WT具有相似的细胞表达水平（n ＝ 3）。
在直接结合和竞争测定中都测量了ACKR2-WT和ACKR2-V41A对CCL2的结合亲和力。在直接结合测定中，通过测量AF647缀合的CCL2的水平除以ACKR2受体的水平来确定CCL2与ACKR2-WT和ACKR2-V41A结合的百分比。5次独立运行的分析表明，ACKR2-V41A的结合亲和力明显低于ACKR2-WT（图 3A）; 两尾T检验，p值0.0071）。在具有ACKR2-V41A的细胞中，与受体结合的CCL2百分比与趋化因子受体表达的百分比之间的比率（μ= 64.16）比表达ACKR2-WT的细胞（μ= 79.12）低。这些亲和力差异在3个独立运行中一致，使用AF647偶联趋化因子配体CCL2的滴定始于50 nM，ACKR2-WT和V41A变体达到饱和时为1200 nM（图 3B）。非线性分析表明ACKR2-V41A的平衡解离常数（Kd = 103.4 nM）比ACKR2-WT（Kd = 67.68 nM）高1.5倍（图 3B））。遵循相似的方法观察缀合AF647的CCL19是否能够与ACKR2-WT或ACKR2-V41A相互作用。但是，没有可检测到的相互作用（补充图 1）。
与配体结合测定中的ACKR2-WT相比，CCL2与ACKR2-V41A的亲和力较低。（A）将ACKR2-WT和ACKR2-V41A转染的细胞与抗ACKR2抗体一起孵育，并且将单独的ACKR2-WT和ACKR2-V41A转染的细胞试管与AF647缀合的CCL2一起孵育。将CCL2 +细胞相对于ACKR2 +细胞的百分比标准化后，ACKR2-V41A之间的结合亲和力明显低于ACKR2-WT对CCL2的结合亲和力（两尾T检验； p值0.0071）（n = 5； ** p < 0.01）。（B）使用不同浓度的AF647缀合的CCL2配体（范围从50nM至1200nM）重复相同的实验。当使用650 nM的CCL2配体（n = 3）时，ACKR2-WT饱和，Kd值（67.68 nM）比ACKR2-V41A（103.4 nM）低1.5。
还进行竞争测定以测试未缀合的趋化因子配体CCL2是否能够干扰抗ACKR2抗体的结合。5次独立运行的分析表明，趋化因子受体ACKR2-WT和ACKR2-V41A之间存在显着差异（两尾T检验，p值为0.0153）。表达ACKR2-V41A的细胞与较低水平的CCL2结合，从而允许ACKR2抗体以比ACKR2-WT（μ= 66.18）更高的百分比（μ= 88.5）结合。量化阻断抗ACKR2抗体的未缀合CCL2的水平的水平显示，与ACKR2-WT（33.82％）相比，ACKR2-V41A（11.5％）与CCL2的结合亲和力明显更低（补充图 2）。
在竞争分析中使用未偶联的CCL4配体来阻断ACKR2抗体，从而测量ACKR2-WT和ACKR2-V41A对CCL4的结合亲和力。该竞争分析与CCL2结合结果一致，其中ACKR2-V41A（9.74％）比ACKR2-WT（26.0％）以统计学上较低的百分比阻断了CCL4（图 4A；双尾T检验，p值0.0310）。这些结合亲和力结果在3个独立的运行中一致，使用未偶联的CCL4滴定始于100 nM，ACKR2-WT达到饱和时为1000 nM（图 4B）。在这种情况下，ACKR2-V41A没有达到完全饱和。非线性分析表明，ACKR2-V41A的Kd值（2033 nM）比ACKR2-WT（600.2 nM）高3.4倍。
与配体结合测定中的ACKR2-WT相比，CCL4与ACKR2-V41A的亲和力较低。（A）将细胞与未缀合的CCL4在37℃下孵育45分钟；然后，加入抗ACKR2以确定CCL4抑制受体结合的水平。ACKR2以较低的亲和力与CCL4结合，导致与ACKR2-WT相比，ACKR2受体与抗ACKR2抗体的结合更高。减去100减去ACKR2 +细胞的百分比以确定CCL4阻断的百分比。CCL4阻止ACKR2-V41A（9.74％）的比例明显低于ACKR2-WT（26.0％）（n = 5; * p <0.05）。（B）使用不同浓度的CCL4配体（范围从100 nM至1200 nM）重复相同的实验。ACKR2-WT在1000 nM的CCL4配体（n = 3）下饱和，其Kd值（600.2 nM）比ACKR2-V41A（2033 nM）低3.4倍。
非典型趋化因子受体ACKR2的主要作用之一是清除CCL2。为了确定清除效率，我们将表达ACKR2-WT和ACKR2-V41A的细胞与CCL2孵育，并在72小时的过程中测量了上清液中CCL2的水平。ACKR2-V41A细胞清除CCL2的效率明显低于表达ACKR2-WT的细胞（图 5A；两个尾部T检验，p值0.0097）。从18小时的时间点开始直到72小时的最后一次测量之间，ACKR2-WT和ACKR2-V41A的清除效率存在显着差异（图 5B，C；两次拖尾T检验，p值<0.0001，18岁， 24、48和72小时）。ACKR2-WT的IC 50的18.19小时，表明WT受体比ACKR2-V41A更有效地清除CCL2，ACKR2-V41A的IC 50为36.83小时（图 5B；非线性回归分析）。CHO空孔和培养基孔中CCL2水平的增加可能是由于80小时内的蒸发所致。
ACKR2-V41A对CCL2的清除效率明显较低。（A）CCL2清除效率测量。将表达ACKR2-WT和ACKR2-V41A的CHO-k1细胞与初始浓度为100 pg / mL的CCL2孵育。在72小时的过程中测量了CCL2水平。与ACKR2-WT相比，具有非典型趋化因子ACKR2-V41A的细胞清除的CCL2水平显着降低（两尾T检验，p值0.0097）（n = 5； **** p <0.0001）。（B）ACKR2-V41A的IC 50值（36.83小时）是ACKR2-WT（18.19小时）的两倍高。（C）按时间点进行清除分析。在6小时时，ACKR2-WT和ACKR2-V41A以相同的速率清除。18小时后，具有ACKR2-V41A受体的细胞以明显较低的速率清除CCL2配体，并持续长达72小时（n = 5； **** p <0.0001）。
存在能够激活受体55的趋化因子配体会刺激受体再循环和细胞表面ACKR2受体表达水平的增加。在将CCL2趋化因子添加至上清液之后，监测72小时的ACKR2-WT和ACKR2-V41A细胞表面受体水平。在该试验中，表达ACKR-WT或ACKR2-V41A的细胞以相似的表达水平开始，并在6小时内保持相似的水平，但从18小时到72小时的时间点，ACKR2-V41A的受体表达水平明显降低（图7）。 6A ;两个尾部T检验，p值0.0045和图 6B ;两个尾部T检验，p值<0.01）
ACKR2-V41A在CCL2刺激后具有明显较低的受体表达。（A）72小时内的ACKR2-V41A和WT受体表达。将表达ACKR2-WT和ACKR2-V41A的CHO-k1细胞与初始浓度为100 pg / mL的CCL2孵育。在72小时的过程中测量受体表达。与ACKR2-WT相比，具有非典型趋化因子ACKR2-V41A的细胞对CCL2的刺激反应明显更低（两尾T检验，p值0.0045）（n = 3； ** p <0.01）。（B）按时间点分析受体水平。在6小时标记处，ACKR2-WT和ACKR2-V41A在细胞表面表达相似量的受体。18小时后，带有ACKR2-V41A受体的细胞表达明显降低，并且持续长达72小时（n = 3； ** p <0.01，*** p <0.001）。
为了确认ACKR2受体上调的差异取决于β-Arrestin依赖性信号传导途径，我们测量了cofilin磷酸化。Cofilin是β-Arrestin依赖性信号传导途径的一部分，对调节趋化因子的激活，再循环和ACKR2受体的产生至关重要。通过蛋白质印迹检查表达ACKR2-WT或ACKR2-V41A受体的CHO-k1细胞，以确定CCL2诱导的磷酸化cofilin（p-cofilin）的水平。在用趋化因子配体CCL2激活受体后，表达ACKR2-V41A受体的细胞的p-cofilin水平明显低于表达ACKR2-WT的细胞（图 7和补充图 4；两个尾部T检验，p值0.0137）。
用CCL2配体激活后，ACKR2-V41A的磷酸化cofilin含量较低。通过在任一受体中存在p-cofilin来测量具有非典型趋化因子ACKR2-WT和ACKR2-V41A受体的CHO-k1细胞的G蛋白依赖性应答。用CCL2激活30分钟后，测量P-cofilin水平。代表性的蛋白质印迹显示在左侧，三个运行的数据分析显示在右侧。使用cofilin将数据标准化。表达ACKR2-V41A的细胞的p-cofilin明显低于表达ACKR2-WT的细胞（n = 3，两个尾部T检验，p值0.0137）。
还使用活细胞钙（Ca 2+）成像检查了表达ACKR2-WT或ACKR2-V41A趋化因子受体激活特征的CHO-k1细胞。用趋化因子CCL2激活受体后，与CCBP-WT相比，表达ACKR2-V41A受体的细胞在CCL2激活后4分钟开始的钙信号水平显着降低（补充图 3A；两个尾部T检验，p值0.0052）。 。从第1分钟（添加CCL2）到第5分钟（结束时间点）的曲线下面积的分析表明，与ACKR2-WT相比，ACKR2-V41A细胞在CCL2激活后的钙信号传导水平显着降低（补充图3B；参见图 3B）。两尾T检验，p值0.008）。
我们已经确定了ACKR2-V41A变体（rs2228467）的直接生物学效应以及CSF中CCL2水平升高的可能机制。ACKR2-V41A具有较低的CCL2结合亲和力，CCL2清除效率和CCL2诱导的ACKR2受体上调。如原始GWAS分析20中所建议的，CSF CCL2水平升高可能是由于ACKR2-V41A对CCL2的结合亲和力降低。我们还发现ACKR2-V41A变体也改变了与趋化因子CCL4的结合，在未来的研究中要解决的一个重要领域将是如何改变其与所有12种已知配体的结合。
Chimera预测蛋白软件，PolyPhen-2和Regulomedb预测，从疏水性缬氨酸到疏水性较低的丙氨酸的氨基酸变化足以改变生物学功能。在这项研究中，我们证明了位于第一个细胞外环和结合位点的变体V41A降低了ACKR2受体与CCL2和CCL4配体的结合亲和力。我们怀疑如果用已知与之相互作用的其余12种趋化因子配体测试该变异体的结合亲和力，则会观察到相同的行为。另外，ACKR2-WT和ACKR2-V41A没有显着改善对趋化因子配体CCL19的结合。该配体是CC家族中不与ACKR2受体相互作用的趋化因子之一。从而，
ACKR2结合CCL2的能力的这种改变导致CCL2清除活性降低和细胞表面受体水平降低。ACKR2-V41A随着时间的流逝（在将系统用100 pg / ml的CCL2浸透18小时后）失去了清除效率，并且随着时间的推移（从刺激细胞后的18小时开始），其在细胞表面的ACKR2受体水平也降低了与野生型相比，含100 pg / ml的CCL2）。我们发现，ACKR2-V41A清除CCL2的效率降低了两倍，导致这种炎症趋化因子信号的维持时间比野生型更长。这些结果表明结合亲和力和受体水平是调节促炎性趋化因子例如CCL2水平的关键。
ACKR2是一种非典型的趋化因子受体，并且缺乏启动其他趋化因子产生和细胞迁移的信号传导基序。ACKR2刺激由CCL2激活β抑制蛋白依赖的信号传导途径丝切蛋白途径[Rac1的-P21活化激酶1（PACK1）-LIM激酶1（LIMK1）级联]和ACKR2可以发送细胞内信号来上调表面受体水平38，54，55。在这里我们报告说，在CCL2激活后，与野生型相比，具有ACKR2-V41A受体的细胞中p-cofilin表达水平降低了。此结果与在72小时内CCL2刺激后检查ACKR2受体水平的分析相符。ACKR2-V41A细胞中低水平的p-cofilin可以解释在细胞表面定量的低水平ACKR2和降低的CCL2清除活性。此外，有表明ACKR2能够钙的引人注目的研究2+动员在用刺激CCL2在HEK 293个细胞56和神经元23，57。这些研究与我们的结果相吻合，并加强了我们提出的机制。在这里，我们显示了非典型趋化因子ACKR2-V41A结合，清除和被CCL2激活的生物能力的降低。ACKR2-V41A等位基因的其他影响也应针对其他12种趋化因子进行研究，已知ACKR2与37种结合。因此，由ACKR2-V41A引起的趋化因子水平改变对趋化因子梯度稳态，炎症和发展为AD的风险增加具有强大的影响。
在Aβ聚集的存在下，包括CCL2在内的促炎相关分子的表达和产生增加。在这种情况下，已知高水平的CCL2表达和产生触发小胶质细胞增生，增加APP / CCL2比，并增加Aβ斑块聚集。CCL2可通过载脂蛋白E，一个主要生物标记物AD发病机制和Aβ沉积的具有间隙的干扰以及提高表达增加Aβ沉积速率30，58，59。因此，调节CCL2水平对脑稳态和长寿具有多种影响。在这项研究中，我们观察到ACKR2-V41A结合和清除CCL2的能力存在显着差异，可能导致损伤部位CCL2的水平更高，并维持促炎信号和单核细胞募集，这可能导致Aβ斑块增加聚集和AD风险。
GWAS研究人员发现了成千上万的遗传变异，这些变异有助于人类复杂疾病的发展。在DNA级别上提供有关单核苷酸多态性（SNP）如何导致生物学和分子级别功能改变的见解。事实证明，GWAS中发现的稀有变异体可用来调节疾病风险的生物学机制非常困难。SNP表征需要更深入地了解DNA变化如何通过转录，RNA剪接，配体-受体结合，蛋白质功能等影响基因表达60。因此，GWAS鉴定的遗传变异必须具有重要的生理意义，才能最终确定其生物学效应为蛋白质。在这项研究中，我们提供了使用GWAS鉴定的ACKR2-V41A的生物学特性。我们提供了有关ACKR2-V41A和CCL2改变趋化因子梯度稳态，增加炎症和改变AD风险的机制的见解。未来的工作应集中于了解ACKR2-V41A是否以及如何影响AD相关细胞系中Aβ的产生和聚集以及AD的其他生物标记。
ACKR2-WT和ACKR2-V41A趋化因子受体氨基酸序列以FASTA格式发送到密歇根大学的Zhang Lab LOMETS服务器。通过从11本地安装的线程程序（CEthreader，FFAS3D，HHpred，HHsearch，鼓起，纳夫-鼓起，PPAS，PRC，PROSPECT2，SP3和SparksX）收集高得分的结构模版产生3D模型61，62。将这11个模型与相似的趋化因子受体进行比较，以确保准确性。使用UCSF Chimera软件，将3D模型定位在空间63中。我们叠加了ACKR2-WT和ACKR2-V41A，以检查折叠性和亲水性的差异。使用UCSF Chimera软件生成3D图像，以突出预测的趋化因子受体结构和氨基酸位置41 63的疏水相互作用。
使用RegulomeDB和Polymorphims Phennotyping v2（PolyPhen-2）确定ACKR2-V41A变体的生物学功能的注释和预测。RegulomeDB是一个数据库，用于注释人类基因组中具有已知和预测调控元件的变体，例如eQTL，转录因子结合和转录因子基序64。该预测器算法的得分介于1到6之间，而分类为1-5的任何变体都将在人类基因组中具有破坏性的生物学功能。PolyPhen-2是一种算法，可以预测人类基因组65中氨基酸取代的可能的生物学影响。该算法将变体的生物影响从破坏性变为可容忍变体。
质粒构建体在Genscript处订购。将ACKR2-WT和ACKR2-V41A的DNA序列插入载体pCMV6-AN-myc-DDK（ORIGENE，目录号PS100016）。按照制造商的建议遵循转化方案。简言之，将质粒转化到DH5 一个使用ZymoPURE II质粒Maxiprep试剂盒（Cat＃D4203）扩增和纯化细胞。使用脂转染胺（ThermoFisher，Cat＃15338100）将质粒转染到中国仓鼠卵巢（CHO-k1ATCC®CCL-61）细胞中，并遵循制造建议。使用抗生素G418硫酸盐（ThermoFisher，Cat＃10131035）选择正确转染的细胞。转染的细胞在含10％FBS（HYCLone Cat＃SH30071.01）的F12培养基（10μg/ ml青霉素，10μg/ ml链霉素； Gibco Cat＃21127-022）中生长。每隔48到72小时更换一次细胞培养基，具体取决于细胞融合水平。
我们使用CHO-k1细胞测试了非典型趋化因子受体ACKR2-V41A的功能，因为它们缺乏野生型ACKR2受体以及其他竞争性人类趋化因子受体的表达。重要的是要注意，人脑中不存在这种细胞类型，因此我们的结果不应被过度解释。用携带ACKR2-WT或ACKR2-V41A的质粒转染CHO-k1细胞后，将细胞孵育直至达到80％融合度，并准备进行细胞分选。将细胞在37°C下用抗人ACKR2多克隆IgG抗体（ABNOVA Cat＃H00001238-B02）染色30分钟。两次洗涤后，将细胞在4°C下用与PE（Biolegend Cat＃405307）缀合的抗人IgG染色30分钟。然后按照制造建议，使用来自MACS Miltenyi Biotech（Cat＃130-048-801）的抗PE MicroBeads洗涤并分离细胞。分离后，将细胞在F12培养基中孵育直至达到80％融合。
当75 cm 2烧瓶达到80％细胞汇合时，收获用ACKR2-WT或ACKR2-V41A转染的CHO-k1细胞。将250,000个细胞重悬于300μLPBS-1％BSA中，并置于FACs管中。为了评估ACKR2受体的表达，将细胞在冰上用抗CD16 / 32（Fc阻滞）染色20分钟（eBioscience，目录号14-0161-85）。两次洗涤后，将细胞在37°C下用抗人ACKR2多克隆IgG抗体染色30分钟，洗涤两次，然后在4°C下用与PE偶联的抗人IgG染色30分钟。两次洗涤后，在BD Accuri上分析受体表达。另外，在将CCL2添加至生长培养基后，监测受体在细胞表面的表达72小时。按照上述步骤获得表达水平。
为了确定ACKR2-WT和ACKR2-V41A的CCL2结合水平，将细胞与缀合的CCL2-AF647（ALMAC，目录号CAF-02-D-2）在37°C，100至750范围内的不同浓度下孵育45分钟nM。两次洗涤后，在BD Accuri上分析受体表达。为了确定ACKR2-WT和ACKR2-V41A受体表达的水平，将细胞在冰上用抗CD16 / 32（Fc阻断）染色20分钟。两次洗涤后，将细胞在37°C下用抗人ACKR2多克隆IgG抗体染色30分钟，洗涤两次，然后在4°C下用与PE偶联的抗人IgG染色30分钟。在ACKR2-WT和ACKR2-V41A的CCL2竞争结合测定水平中，将细胞与未结合的CCL2（PEPROTECH，目录号300-04100UG）在37°C下孵育45分钟。经过两次洗涤和上述Fc阻断后，将细胞在37℃下用抗人ACKR2多克隆IgG抗体染色30分钟，洗涤两次，然后在4℃下用与PE缀合的抗人IgG染色30分钟。洗涤两次后，在BD Accuri中分析ACKR2抗体的结合水平。
按照上述步骤进行CCL4（PEPROTECH，目录号300-.9）竞争结合测定。使用与CCL2结合测定相同的方法完成结合的CCL19-AF647（ALMAC，目录号CAF-06-A-01）结合分析。
将ACKR2-WT和ACKR2-V41A细胞接种到6孔细胞培养板中，该培养板装有新鲜的F12培养基，每个孔中加入10％FBS和100 pg / mL的CCL2。在不同的时间点，使用CCL2 TMP夹心ELISA试剂盒（PeproTech，Cat＃900-T31）从每个孔中提取150μL培养基上清液，以测量CCL2的剩余浓度。将96孔ELISA微孔板在室温下用对人CCL2特异的单克隆抗体（PBS中的0.25μg/ mL）包被过夜。将板用在PBS中稀释的0.05％吐温洗涤3次，然后在室温下用封闭缓冲液（PBS / 1％BSA）温育孔2小时。洗涤三遍后，将样品和对照加入孔中，并在室温下孵育2小时。在三次洗涤后，将板与在封闭缓冲液中稀释的生物素化抗人CCL2抗体（0.25μg/ mL）在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将板与100μL的链霉亲和素-HRP缀合物（0.05μg/ mL）在室温下孵育30分钟。将板洗涤3次，并在黑暗中于室温下添加100μL的TMB底物溶液（氢过氧化物和色原四甲基联苯胺）20分钟。用100μL1 M盐酸终止反应。使用设置在450 nm的微板读取器（波长校正为620 nm）确定光密度。将板洗涤3次，并在黑暗中于室温下添加100μL的TMB底物溶液（氢过氧化物和色原四甲基联苯胺）20分钟。用100μL1 M盐酸终止反应。使用设置在450 nm的微板读取器（波长校正为620 nm）确定光密度。将板洗涤3次，并在黑暗中于室温下添加100μL的TMB底物溶液（氢过氧化物和色原四甲基联苯胺）20分钟。用100μL1 M盐酸终止反应。使用设置在450 nm的微板读取器（波长校正为620 nm）确定光密度。
磷酸化的cofilin的水平是根据先前描述的研究方法[ 55]获得的。简而言之，将表达ACKR2-WT或ACKR2-V41A的300,000个CHO-k1细胞接种在孔中，并血清饥饿18小时。然后，用100 nM CCL2（PEPROTECH，Cat＃300-04100UG）刺激细胞，并在5％CO 2中于37°C孵育30分钟。收集细胞，按照制造建议使用RIPA裂解缓冲液（ThermoFisher，目录号89900）裂解。制备裂解产物用于蛋白质印迹分析。使用相同的裂解产物样品平行运行两种凝胶。一种凝胶用针对p-cofilin的抗体染色（Cells信号传导，目录号3313），以检测磷酸化的cofilin。使用ImageJ（ImageJ软件，NIH）分析对应于p-cofilin的条带强度。第二种凝胶用cofilin染色（细胞信号转导，目录号5175），并在ImageJ分析后用于对p-cofilin的标准化。进行了独立的T检验，以确定表达ACKR2-WT和ACKR2-V41A的细胞之间p-cofilin水平是否不同。
将细胞接种在8室玻片上（Nunc，Cat＃155411），并在37°C和5％CO 2中的含10％FBS的F12培养基中孵育过夜。第二天，细胞加载在林格氏溶液（150mM NaCl的4μM的Fura-2AM的（Invitrogen，目录＃F1221），10mM葡萄糖，5mM的HEPES，5mM的KCl，1毫摩尔MgCl 2，2mM的氯化钙2，pH 7.4）在5％CO 2中于37°C放置30分钟。然后将细胞用林格斯溶液洗涤一次，并在林格斯溶液中于37℃再温育30分钟。使用配备有氙弧灯的Olympus IX51倒置显微镜在室温下进行钙成像。使用340 nm和380 nm激发滤光片激发表达受体ACKR2-WT和ACKR2-V41A的Fura-2AM加载的CHO-k1细胞，并使用荧光显微镜相机（Q Imaging）捕获340 nm，380 nm的图像并透射光Exi Blue），以1.6秒的间隔拍摄20倍的物镜（NA 0.75）。在每个成像方案的一分钟时间点，添加250 nM重组人CCL2以刺激Ca 2+通量23。在五分钟的时间点加入碘霉素（终浓度为1μM）作为阳性对照。在每帧中选择十到二十个代表性细胞作为目标区域，并使用Olympus的CellSens软件计算和分析F340：F380的比率。每个单独的小区的荧光根据等式（F-FO）/ FO，其中F是在特定时间点上的荧光，fo是在时间0的荧光值归一化到其第一记录值66，67。
使用Prism 8软件（GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉荷亚）进行统计分析。使用未配对的T检验分析了ACKR2-V41A和ACKR2-WT之间的结合亲和力，CCL2清除效率和细胞活化敏感性的差异。使用非线性分析最佳拟合测试计算Kd，EC 50和IC 50。每个独立的运行每个样品至少包含三个重复，并且这些重复的平均值被认为是一个分析点。在这项研究中，每个实验都进行了三到五次独立运行（每个样品9到15个重复）。给出的结果代表了观察到的表型，P值小于0.05的分析被认为是有效的。
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