摘要
由新型人类冠状病毒SARS-CoV-2引起的2019年冠状病毒疾病（COVID-19）目前是全球公共卫生的主要威胁。病毒刺突蛋白经由受体结合域（RBD）结合宿主受体血管紧张素转化酶2（ACE2），因此被认为是阻断病毒进入的主要靶标。SARS-CoV-2和SARS-CoV都共享此机制。在这里，我们在功能上分析了位于RBD受体结合基序内的关键氨基酸残基，这些残基可能与人ACE2和可用的中和抗体相互作用。体内实验表明，用SARS-CoV RBD或SARS-CoV-2 RBD免疫能够在小鼠中诱导强进化枝特异性中和抗体。但是，交叉中和活性却弱得多，这表明在两种病毒的RBD中存在明显的抗原特征。可用抗SARS-CoV或SARS-CoV-2的中和单克隆抗体证实了这一发现。值得注意的是，新开发的SARS-CoV-2人类抗体HA001能够中和SARS-CoV-2，但无法识别SARS-CoV。此外，在SARS-CoV-2 RBD中，HA001的潜在表位残基被鉴定为A475和F486，代表了中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。可用抗SARS-CoV或SARS-CoV-2的中和单克隆抗体证实了这一发现。值得注意的是，新开发的SARS-CoV-2人类抗体HA001能够中和SARS-CoV-2，但无法识别SARS-CoV。此外，在SARS-CoV-2 RBD中，HA001的潜在表位残基被鉴定为A475和F486，代表了中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。可用抗SARS-CoV或SARS-CoV-2的中和单克隆抗体证实了这一发现。值得注意的是，新开发的SARS-CoV-2人类抗体HA001能够中和SARS-CoV-2，但无法识别SARS-CoV。此外，在SARS-CoV-2 RBD中，HA001的潜在表位残基被鉴定为A475和F486，代表了中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。值得注意的是，新开发的SARS-CoV-2人类抗体HA001能够中和SARS-CoV-2，但无法识别SARS-CoV。此外，在SARS-CoV-2 RBD中，HA001的潜在表位残基被鉴定为A475和F486，代表了中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。值得注意的是，新开发的SARS-CoV-2人类抗体HA001能够中和SARS-CoV-2，但无法识别SARS-CoV。此外，在SARS-CoV-2 RBD中，HA001的潜在表位残基被鉴定为A475和F486，代表了中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。代表用于中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。代表用于中和抗体的新结合位点。总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。
2019年冠状病毒病（COVID-19）是由新出现的冠状病毒SARS-CoV-2引起的呼吸道感染，该病毒于2019年12月首次被发现。全球范围，截至2020年4月25日美国中部标准时间2:00，向世界卫生组织（https://covid19.who.int/）报告了2,724,809例确诊的COVID-19病例，包括187,847例死亡。该病毒的基因测序表明，SARS-CoV-2是与SARS-CoV紧密相关的β冠状病毒。1，2上SARS冠状病毒的研究提供了可以在针对SARS-CoV的-2战斗直接使用有用的信息，但新的冠状病毒也具有在某些方面不同的特性，这需要更深入的研究。
许多研究小组表明，SARS-CoV-2利用同源三聚体突突糖蛋白（S）糖蛋白结合功能受体人类ACE2（hACE2）。SARS-CoV也使用这种病毒进入机制。3，4的RBD在S蛋白介导的病毒的宿主细胞，这对于病毒进入靶细胞中的关键步骤的结合。根据高分辨率晶体结构迄今获得的信息，5，6，7受体结合基序（RBM）是在RBD的主要功能性基序，并且由两个区域（区域1和区域2），其形成界面的在S蛋白和hACE2之间。8RBM以外的区域在维持RBD的结构稳定性方面也起着重要作用。9
根据氨基酸比对研究，SARS-CoV和SARS-CoV-2共享的RBD的序列同一性为73.5％。10然而，RBD可变性最大的区域RBM的身份仅为47.8％。尽管RBM区域中氨基酸的身份较低，但是两种病毒的结合机制相似。5，6，7，11，12，13的氨基酸序列的保守性表明这两种病毒的可靠性框图可引发可具有用于交叉保护潜在交叉反应性抗体。目前尚不清楚两种病毒的可变RBM是否可以诱导交叉反应抗体。
在这项研究中，我们比较了SARS-CoV-2和SARS-CoV RBD对hACE2的亲和力，并探讨了针对这些RBD的抗体进行交叉保护的可能性。通过在SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBM序列中创建单个氨基酸取代突变，我们证明SARS-CoV-2具有两种氨基酸残基来维持其与hACE2的结合活性：通过引入增强受体结合P499，Q493，F486，A475和L455的氨基酸变化，并且通过替换残基N501，Q498，E484，T470，K452和R439减少了受体结合。一项动物免疫研究表明，SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD是潜在的抗原，可在小鼠中诱导强大的进化枝特异性中和抗体，而交叉中和作用则弱得多。该发现归因于两种病毒中RBD的抗原性差异，这已通过可用的针对SARS-CoV和/或SARS-CoV-2的中和单克隆抗体（mAbs）进行了仔细验证。最后，发现一种新开发的阻断SARS-CoV-2受体的人抗体HA001的潜在表位在SARS-CoV-2 RBD中涉及氨基酸A475和F486，它们是新发现的中和抗体的结合位点。
总的来说，我们的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同的关键表位，这表明有必要开发新的预防性疫苗和抗体药物来特异性控制COVID-19大流行，尽管可从SARS-CoV研究不可忽视。
将HEK293T细胞（ATCC CRL-3216）在5％CO 2中于37°C 在补充有每毫升100 U青霉素，每毫升100μg链霉素和10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Invitrogen）中培养。将ExpiCHO-S哺乳动物细胞（Invitrogen）在补充有1％青霉素-链霉素和8％CO 2的 ExpiCHO™表达培养基（invitrogen）中培养。合成了80R，m396，S230，CR3022和N-176-15 VH和VL序列（GenScript），并将其克隆到人IgG1支架中。由噬菌体展示产生的靶向SARS-CoV-2 RBD的HA001由上海三友生物制药提供。编码SARS-CoV S蛋白，SARS-CoV-2 S蛋白和人ACE2全长的表达质粒购自Sino Biological。通过整合免疫球蛋白（Ig）重链（H）信号，将包含SARS-CoV S蛋白残基306-527，SARS-CoV-2 S蛋白残基318-541的RBD结构域克隆到pcDNA3.1哺乳动物表达载体中N末端的多肽和C末端的人IgG1 Fc标签。
将编码SARS-CoV或SARS-CoV-2的RBD的DNA序列与N端人IgE信号肽和C端6 His标签框内融合，并克隆到pBudCE4.1载体（Invitrogen）中。选择用于诱变的残基基于氨基酸序列比对和RBD-ACE2结合界面的结构信息。用商业化的KOD-Plus诱变试剂盒（TOYOBO）诱导单氨基酸取代诱变。通过DNA序列分析（Biosune）验证所有突变。为了表达野生型和突变型RBD，将ExpiCHO-S细胞铺在六孔板中，并用这些质粒瞬时转染。转染96小时后收集上清液。
mAb和RBD-hFc是通过ExpiCHO-S细胞（Invitrogen）的瞬时转染产生的。4天后收集来自RBD-hFc转染的细胞的上清液，7天后收集mAb转染的细胞的上清液。上清液通过蛋白G色谱（GE Healthcare）进行亲和纯化，并在4°C下用PBS透析过夜。
使用Octet Red96仪器（ForteBio，Inc.）进行生物层干涉测量。将浓度为5μg/ ml的SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD-hFc固定在涂有抗人IgG-Fc（AHC）的生物传感器表面上300 s。通过在动力学缓冲液（KB：1x PBS和0.02％Tween-20）中进行60 s的测量获得基线干扰相，然后，将传感器在包含以KB稀释的重组hACE2的孔中进行400 s的缔合相浸没。 。然后，在分离步骤中将传感器浸入KB中长达400 s。根据所有结合曲线与1：1 Langmuir结合模型（具有R2值）的整体拟合，从所有结合曲线计算出ACE2的SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD结合亲和力的平均Kon，Koff和表观K D值≥0.95。
如前所述产生SARS-CoV和SARS-CoV-2假型病毒。14简而言之，将编码全长S蛋白和pNL4-3.luc.RE的质粒共转染到10 cm皿中的293T细胞中。转染后48 h收获上清液，并在完全DMEM中稀释（与等体积（50μl）的稀释血清或抗体混合或不混合），然后在37°C下孵育1 h。将混合物转移到稳定表达人ACE2的HEK 293 T细胞中。将细胞在37°C下孵育48小时，用被动裂解缓冲液裂解，并测试萤光素酶活性（Promega USA）。通过将抗体或血清组的荧光素酶值与仅病毒对照组的荧光素酶值进行比较来计算中和百分比。
简而言之，将Lipofectamine 2000用编码SARS-CoV和SARS-CoV-2 S蛋白的密码子优化全长形式的质粒转染（当六孔板中约60-70％融合时）HEK293T细胞。对照质粒。平行地，另一组HEK293T细胞用编码hACE2的质粒转染。转染后二十四小时，将两组细胞用胰蛋白酶消化并以1：1的比例混合，然后铺在24孔板上。共培养48小时后，观察到多核巨细胞。收集图像并用Olympus IX53共聚焦显微镜分析。15
在存在佐剂QuickAntibody（BioDragon）的情况下，以25μg重组SARS-CoV-RBD hFc，SARS-CoV-2 RBD hFc或hIgG作为对照，肌内免疫五只年龄和体重匹配的雄性C57BL / 6小鼠组）。随后在所有情况下均以3周为间隔进行一次加强免疫。第二次免疫后14天处死动物，并收集血清。就中和测定而言，将血清样品在56℃下热灭活30分钟。
为了确认抗体是否识别SARS-CoV RBD或SARS-CoV-2 RBD，将96孔微孔板（Nunc）涂在0.1 M中的50 ng /孔重组SARS-CoV RBD hFc和SARS-CoV-2 RBD hFc碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 9.6）于4°C孵育过夜。用羊血清白蛋白（2％）的PBS溶液在37°C封闭2 h后，洗涤ELISA板，并添加稀释的抗体进行2 h孵育。使用HRP共轭的山羊抗人Fc抗体或HRP共轭的山羊抗小鼠Fc抗体（Sigma）检测结合的抗体。
确定有助于SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD与ACE2或中和抗体结合的残基。通过夹心酶联免疫吸附测定法测量培养上清液中RBD突变体的浓度。具体地，将与SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD两者交叉反应的CR3022和R007（Sino Biological）用于涂布板，然后添加稀释50倍或500倍的细胞上清液并进行处理。两个mAb。将连续稀释的纯化的SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD（初始200 ng / ml的2倍稀释液）用作标准液。随后，结合的抗原通过结合了HRP的小鼠抗His mAb进行检测。根据标准曲线确定RBD突变体的浓度。然后，进行了另一次ELISA分析这些RBD突变体对ACE2和mAb的相对结合活性。将RBD突变体（100和200 ng / ml）在预先涂有500 ng mAb或ACE2的板上孵育。在37°C下孵育2小时后，通过HRP偶联的小鼠抗His mAb检测到RBD突变体对mAb或ACE2的结合亲和力。将突变体与mAb的结合信号与野生型病毒蛋白的结合信号进行比较。
为了研究免疫小鼠的单克隆抗体和血清阻断SARS-CoV-2穗状蛋白与ACE2结合的能力，依次稀释了单克隆抗体（最初30μg/ ml的3倍稀释度）和血清（最初1μg/ ml的3倍稀释度） ：10）加入预先涂有100 ng /孔重组SARS-CoV RBD-his，SARS-CoV-2 RBD-his（Sino Biological）的平板中，并于37°C孵育1小时。然后，将由293 T细胞表达的生物素标记的重组hACE2-his（Novoprotein）150 ng / ml加入平板中。在37°C下孵育2小时后，将孔洗涤并用HRP偶联的抗生蛋白链菌素（R＆D Systems）检测。将板孵育1小时，然后添加TMB底物。通过与与不存在血清的情况下获得的百分比相比确定的S与ACE2的结合减少的百分比来确定受体被阻断的百分比。抑制浓度为百分之五十[IC50（微克/毫升）用作抑制值。
在将Q498突变为Y后，Prime进行了局部最小化，以模拟Q498周围氨基酸（PDB ID：6LZG）的构象变化在5Å之内。最小化表明Y498的芳香环可以与hACE2中的Y41形成π-π堆积相互作用，从而增强RBS与hACE2的结合。结构图是使用PyMOL（PyMOL分子图形系统，版本2.0Schrödinger，LLC）生成的。
所有统计分析均使用Graph Pad Prism 6软件进行。图和图例中显示的P值是使用不成对的两尾学生t检验确定的（* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001；不显着（NS））。
为了确认SARS-CoV和SARS-CoV-2的感染性取决于hACE2，我们通过共转染编码表达Env缺陷型荧光素酶的HIV的质粒，构建了伪型SARS-CoV和SARS-CoV-2 -1（pNL4-3.luc.RE）和一个表达SARS-CoV或SARS-CoV-2全长S蛋白的质粒进入HEK293T细胞。用假型含病毒的上清液处理表达或不表达hACE2的HEK293T细胞。伪型SARS-CoV和SARS CoV-2在表达hACE2的HEK293T细胞中的感染性比在不表达hACE2的HEK293T细胞中高得多，而在伪造的SAV-CV和HEK293T细胞中，伪型VSVG感染性无显着差异。有或没有hACE2（图 1a）。结果表明，hACE2是SARS-CoV和SARS-CoV-2进入细胞所使用的受体。因为在感染SARS-CoV的培养的Vero E6细胞中已经观察到合胞体形成，所以16我们也试图确定表达SARS-CoV-2 S蛋白的HEK293T细胞是否可以与表达hACE2的HEK293T细胞融合。如所预期的，用hACE2转染的HEK293T细胞与表达SARS-CoV S蛋白的细胞形成许多合胞体。相反，对于表达hACE2的293T细胞，单独的SARS-CoV或SARS-CoV-2的S蛋白没有形成合胞体。表达SARS-CoV-2 S蛋白的HEK293T细胞也能与hACE2转染的细胞有效形成合胞体（图 1b））。由于RBD是SARS-CoV S-hACE2识别的关键区域，我们通过生物层干涉法（BLI）和酶联免疫吸附测定（ELISA）研究了hACE2和S蛋白的结合亲和力。通过链霉亲和素将生物素偶联的hACE2蛋白捕获，该蛋白固定在芯片上，并测试与梯度浓度的SARS-CoV和SARS-CoV-2可溶性RBD的结合。SARS-CoV-2-RBD与hACE2结合的平衡解离常数（KD）计算为5.09 nM，与SARS-RBD的平衡解离常数（1.46 nM 6）相当（图 1d）。通过ELISA获得了相似的数据（图 1c）。两者合计，这些结果证实SARS-CoV和SARS-CoV-2都利用RBD结合hACE2进行病毒进入。
SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD均与hACE2结合。SARS-CoV-2和SARS-CoV假型病毒的受体依赖性感染进入hACE2 + 293 T细胞。用SARS-CoV-2或SARS-CoV假型病毒感染稳定表达hACE2的293T细胞，并收获细胞以检测荧光素酶活性。通过与未感染细胞中的水平比较来计算倍数变化。VSV伪型病毒被包括作为对照。b在表达S蛋白和hACE2的细胞之间形成合胞体。将用hACE2质粒转染的293T细胞与用编码来自SARS-CoV-2（左下）或SARS-CoV（右下）的S蛋白的质粒转染的293T细胞以1：1的比例混合。作为对照，将空质粒转染的293T细胞与以hACE2质粒转染的293T细胞（上排），SARS-CoV-2的S蛋白（左中）或SARS-CoV（中排）以1：1的比例混合。对）。图像以20倍的放大倍率拍摄。显示了代表性图像。c通过ELISA确定SARS-CoV-2 RBD与可溶性hACE2的剂量依赖性结合。测试了SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD与hACE2上的Fc标签的结合。包括人Fc作为对照。数据以OD450±sem的平均值表示（n = 2）。d SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD与可溶性hACE2受体的结合图谱，通过在Octet RED96仪器中进行生物层干涉测量法测得。通过链霉亲和素将生物素偶联的hACE2蛋白捕获，该蛋白固定在芯片上，并测试了与SARS CoV和SARS CoV-2的S蛋白的可溶性RBD的梯度浓度的结合。通过ForteBio Data Analysis 9.0软件使用1：1 Langmuir结合模型评估结合动力学
由于序列比对表明SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD具有76％的共享同一性的高度保守性，因此我们试图确定RBD是否诱导交叉反应性免疫反应，从而保护两种病毒。为了解决这个问题，我们进行了体内免疫实验，以确定由SARS-CoV RBD和SARS-CoV-2 RBD诱导的抗体的交叉反应性（图 2a）。首先，我们进行了ELISA，以检测重组SARS-CoV-2 RBD或SARS-CoV RBD免疫小鼠的血清的交叉反应性。结果表明，SARS-CoV RBD抗血清与SARS-CoV RBD的反应强烈，平均抗体滴度为1.701×10 4，而SARS-CoV-2 RBD暴露时的滴度较低（平均抗体滴度：3.1×10 2）。同样，SARS-CoV-2 RBD抗血清与SARS-CoV-2 RBD的反应强烈，抗体滴度高（7.53×10 4），而SARS-CoV RBD暴露时效价较低（2.19×10 3）（图 2b）。相应地，我们研究了hACE2和S蛋白RBD之间相互作用的抗血清交叉阻断效率。结果显示，SARS-CoV RBD抗血清强烈阻断hACE2与SARS-CoV RBD之间的相互作用，平均抗血清滴度为50％（BT 50：1.68×10 3），而暴露于SARS-时的BT 50非常低。CoV-2 RBD（BT 50：73.6）。同样，SARS-CoV-2 RBD抗血清对SARS-CoV-2 RBD和hACE2的相互作用具有较高的50％阻断抗血清滴度（BT 50：3.12×10 3），但对SARS-CoV的交叉阻断效率低得多RBD和hACE2的相互作用（BT 50：1.65×10 2）（图 2c）。为了证实该观察结果，进行了伪型病毒中和测定以评估SARS-CoV RBD或SARS-CoV-2 RBD免疫的小鼠抗血清的交叉中和功效。与阻断试验的结果一致，小鼠抗血清的中和活性接近完全进化枝特异性，具有非常低的交叉中和水平。50％中和抗血清效价（NT 50）的SARS-CoV-2抗血清对SARS-CoV-2伪型病毒的计算值为1.49×10 4，SARS-CoV抗血清对SARS-CoV-2假型病毒的抗血清值为8.15×10 3（图 2d）。因此，这些结果表明，SARS-CoV RBD和SARS-CoV-2 RBD具有独特的免疫原性，解释了两种病毒产生的交叉保护抗体的数量有限。
SARS-CoV和SARS-CoV-2的重组RBD诱导的小鼠抗体反应。一个疫苗方案的示意图。每组五只C57BL / 6小鼠用25 µg SARS CoV-2 RBD-hFc或SARS CoV RBD-hFc蛋白与快速佐剂联合肌肉注射两次（间隔2-3周）两次。将没有RBD蛋白但有hIgG免疫的小鼠作为对照。在免疫后第35天处死小鼠，并收集抗血清用于随后的测试。b通过ELISA测定，SARS-CoV-2-RBD或SARS-CoV-RBD特异性小鼠血清与SARS-CoV RBD或SARS-CoV-2 RBD的交叉反应性。将小鼠抗血清连续稀释三倍，并测试与SARS-CoV RBD或SARS-CoV-2 RBD的结合。在终点稀释时计算SARS-CoV-2抗血清（红色），SARS-CoV抗血清（蓝色）和对照抗血清（黑色）的IgG抗体（Ab）滴度，对于SARS-CoV-2 RBD或SARS冠状病毒RBD。数据表示为平均值A450±sem（n = 5）。c通过ELISA测定，SARS-CoV-2-RBD或SARS-CoV-RBD特异性小鼠血清和hACE2与SARS-CoV RBD或SARS-CoV-2 RBD的交叉竞争。数据以平均阻滞（％）±sem（n = 5）。计算了针对SARS-CoV假型病毒或SARS-CoV假型病毒的百分之五十的阻断抗体滴度（BT 50）。d通过伪型病毒中和测定法测量的SARS-CoV-2-RBD或SARS-CoV-RBD特异性小鼠血清对SARS-CoV-2或SARS-CoV伪型病毒进入的交叉中和作用。数据表示为平均中和度（％）±sem（n = 5）。计算了针对SARS-CoV-2或SARS-CoV假型病毒的中和抗体效价的50％（NT 50）
众所周知，S-RBD和ACE2之间的界面相互作用在其结合活性中起着至关重要的作用，RBM区被认为特别重要。5但是，RBM的氨基酸差异很大，共有的同一性仅为47.8％。尚不清楚RBM中的哪些突变残基会改变其对hACE2的亲和力；因此，需要进行功能分析。基于序列比对（图 3a），选择19个残基，并添加单个氨基酸取代以突变SARS-CoV-2和SARS-CoV RBM区域。结果表明，在某些突变体中，SARS-CoV-2 RBD与hACE2的结合亲和力降低，但对于另一些突变体，则增加或不受影响（图 3b）。）。根据高分辨率晶体结构迄今获得的信息，5，6，7，11，12的受体结合基序（RBM）是由两个区域（区域1和区域2），其形成所述S蛋白的接口的使用hACE2，我们将重点放在区域1或区域2中的残基上（图 3c）。17有趣的是，在SARS-CoV-2中将9个氨基酸残基突变为SARS-CoV之后（L455 / Y442，F456 / L443，S459 / G46，Q474 / S461，A475 / P462，F486 / L472，F490 / W476， Q493 / N479和P499 / T485），与WT病毒相比，它们与hACE2的结合亲和力被取消（图 3b，c），表明这些残基对于SARS-CoV-2与hAEC2的结合非常重要。值得注意的是，根据结构分析，先前已报道9个残基中的6个残基（L455，F456，A475，F486，F490和Q493）是SARS-CoV-2 RBD-hACE2相互作用残基。5，6，7根据结构分析，L455和Q493的SARS-CoV的-2 RBD的具有hACE2 K31和E35有利的相互作用; 结合后，两个hACE2残基之间的盐桥断裂，并且每个残基与SARS-CoV-2 RBM中的Q493形成氢键，从而增强了与hACE2 6的结合（图 3c），这一发现是一致的我们的诱变结果（图 3b））。F486在SARS-CoV-2 RBD中的引入通过在hACE2 6中产生一个涉及M82和Y83的疏水口袋，增强了hACE2的结合亲和力（图 3c）。此外，我们首次在这里报告不直接接触hACE2的其他三个SARS-CoV-2替代突变体S459 / G443，Q474 / S461和P499 / T485也降低了结合亲和力。这三个SARS-CoV-2残基可增强结构并稳定hACE2-SARS-CoV-2结合界面。
SARS-CoV-2-RBD和SARS-CoV-RBD的单氨基酸取代诱变。SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD中的序列差异。RBM为红色。以前，已识别的关键ACE2结合残基用绿色阴影表示。保守的残基用星号（*）标记，组间性质相似的残基用冒号（:)标记，性质略有相似的残基用句号（。）标记。b ACE2与SARS-CoV-2 RBD中的相互氨基酸替换结合。计算每个值作为相对于WT的结合数（％）。显示了两个独立实验的重复孔的平均值±SEM。两条红色虚线分别代表WT数据的75％和125％。c，d SARS-CoV-2-RBD和SARS-CoV-RBD与ACE2结合的结构比对。SARS-CoV-RBD复合物（PDB ID：2AJF）叠加在SARS-CoV-2 RBD（PDB ID：6lzj。灰色：ACE2，小麦：SARS-CoV-2）上，弱化SARS-CoV-2的突变体。 RBD与ACE2结合的突出显示在青色（C ^）。从SARS-CoV的相应的残基在绿色指示，并详细（被示出ç左）。增强ACE2结合在品红（突出显示突变体d）。ËACE2与SARS-CoV RBD中的相互氨基酸取代结合。计算每个值作为相对于WT的结合数（％）。在两个独立的实验中显示了重复孔的平均值±SEM。两条红色虚线分别代表WT数据的75％和125％。f携带Q498Y突变体的SARS-CoV 2 RBD与hACE2的分子对接。Q498Y与hACE2中的Y41形成π-π堆积：对，Q498
相反，我们还发现了SARS-CoV-2 RBD，N439 / R426，L452 / K439，T470 / N457，E484 / P470，Q498 / Y484和N501 / T487中的6个取代突变体，它们增强了结合亲和力，从而提供了监测病毒传播过程中天然RBD突变感染性增加的线索（图 3b，d）。我们推测这些残基可能对SARS冠状病毒RBD绑定到hACE2至关重要。不出所料，对于SARS-CoV，当用SARS-CoV-2 RBD中的相应残基替换R426，K439，N457，P470，Y484和T487时，与之相比，SARS-CoV RBD的结合活性大大降低了。 WT病毒中RBD的表达（图 3e）。先前的结构研究确定R426，Y484和T487是SARS-CoV RBD与hACE2结合的关键残基，4，18这是基于上面提供的数据证实（图 3D）。根据结构分析，通过在SARS-CoV-2 RBD中的R426与hACE2中的E329之间引入强盐桥，用R426替代SARS-CoV-2 RBD N439可提高hACE2的结合亲和力（图 3d）。分子对接表明，SARS-CoV-2 RBD Q498被Y484取代与hACE2上的Y41形成了π-π堆积相互作用，尽管还涉及氢键，这解释了hACE2结合增强（图 3f）。）。此外，根据结构数据，SARS-CoV-2 RBD N501和SARS-CoV RBD T487在hACE2中与Y41和K353具有相似的相互作用，但用T487替代SARS-CoV-2 RBD N501则显着增强了其与HACE2的结合。 ACE2。SARS-CoV-2 RBD突变体N501 / T487增强的结合活性可能是由于此残基提供的增加的支持以稳定RBD的整体结构或增强亲水相互作用的网络（图 3d）。这些结果表明，对于SARS-CoV RBD-ACE2识别至关重要的一些残基，即R426，K439，N457，P470，Y484和T487在SARS-CoV-2的相应位置不同。相反，SARS-CoV-2识别的关键残基L455，A475，F486和Q493在SARS-CoV-2的相应位置也不同。
总之，SARS-CoV-2和SAR-CoV RBD的整体受体结合模式非常相似，但是详细的相互作用模式却大不相同，这可能解释了SARS-CoV-2和SAR-CoV RBD，可诱导进化枝特异性中和抗体的产生。
然后，我们使用一组针对SARS-CoV RBD的中和单克隆抗体，包括针对80R，S230，m396，CR3022和N-176-15的中和单克隆抗体，研究了SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD的免疫原性特征。 。14，19，20，21，22，我们还测试了人mAb HA001对抗SARS-CoV的-2 RBD（图 4A）。除CR3022外，所有抗体均仅显示进化枝特异性结合活性（图 4b，c）。选择的所有中和抗体仅破坏进化枝特异性RBD-hACE2相互作用（图 4b，c）。进一步的伪型病毒测定证实，所有SARS-CoV-RBD mAb均无法中和SARS-CoV-2，而HA001未中和SARS-CoV。不出所料，SARS-CoV-RBD mAb中和SARS-CoV的IC 50值为0.016至2.0 µg / ml，HA001中和SARS-CoV-2的IC 50值为0.016 µg / ml（图 4d）。 。这些数据表明，针对SARS-CoV-2 RBD的已测试mAb无法交叉保护SARS-CoV，反之亦然，这可能是由于两种病毒中RBD的序列不同所致。该结果强调了开发针对SARS-CoV-2 S的特异性疫苗和抗体的必要性。
靶向RBD的中和mAb对SARS-CoV和SARS-CoV-2的交叉反应性。a针对SARS CoV-2 RBD和SARS CoV RBD的中和单克隆抗体的特征。b，c通过ELISA确定SARS-CoV和SARS-CoV-2 mAb与SARS-CoV RBD（b）或SARS-CoV-2 RBD（c）的剂量依赖性结合。包括同种型抗体作为对照。数据表示为平均OD450±sem（n = 2）。d，e SARS-CoV-2或SARS-CoV mAb和hACE2与SARS-CoV RBD（d）或SARS-CoV-2 RBD（e的剂量依赖性竞争））（通过ELISA测定）。数据表示为平均OD450±sem（n = 2）。˚F IC 50为单克隆抗体中和SARS-CoV的-2或SARS-CoV的伪类型的病毒的一个面板被确定的值。显示代表性数据
为了评估鉴定的用于抗体识别的关键残基，选择了一组针对SARS-CoV RBD的中和mAb和一个针对SARS-CoV-2 RBD（HA001）的中和mAb（图 4a）。每种抗体仅显示进化枝特异性结合活性（图 4b）。为了研究RBD的关键残基在进化枝特异性中和抗体的识别方面，基于报告的抗体表位位置和RBM中的序列变化进行了单氨基酸取代诱变扫描（图 5a，b）。
mAb对SARS-CoV或SARS-CoV-2 RBD的单个氨基酸替代突变体的识别模式。以表面表示形式在SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD中进行序列保守。红色，不同；灰色，相同。b站点诱变扫描。SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD突变组包括已报告的抗体表位位置和RBM中的序列变化。与野生型的相对结合：0–25％黑色。25–50％，以深灰色显示；50-75％为浅灰色；> 75％，呈白色。显示的结果代表至少两个独立实验中与突变体结合的mAb相对于野生型RBD的结合信号的平均百分比。CYRS和D480在SARS-CoV RBD中与80 R的相互作用（PDB ID：2ghw）。极性相互作用用黄色虚线表示。d SARS-CoV RBD中Y484和T487与m396的相互作用（PDB ID：2dd8）。黄色：重链，青色：轻链。m396的结合表面由静电表面表示表示。e对HA001绑定很重要的残基位于ACE2和RBD的界面上（PDB ID：6VW1）
在我们的诱变测定中，四个SARS-CoV-2 RBD突变体A475 / P462，V483 / P469，F486 / L472和S494 / D480无法结合HA001（图 5b）。在这四个氨基酸中，A475和F486对于RBD与HA001和hACE2的相互作用具有至关重要的作用（图 5e）。这些观察结果表明HA001通过竞争RBD的β5环中的相同关键残基而中和SARS-CoV-2，从而阻断受体结合。5
我们采用了类似的策略来测试SARS-CoV mAb对SARS-CoV RBD突变体的结合亲和力。数据显示，当SARS-CoV RBD残基D480和Y484突变为SA494-CoV-2 RBD中的相应氨基酸S494和Q498时，80R的结合被显着抑制，而其他序列变化则没有影响（图5）。 5b）。基于SARS-CoV RBD-80R配合物的晶体结构，显示出19 D480和Y484在80R与SARS-CoV-RBD之间的相互作用中起着战略作用（图 5c）。用Q取代Y484可消除80R的CDRH3区域中Y102的强π-π堆积相互作用，从而削弱SARS-CoV-RBD与80R之间的相互作用。
类似地，对于m396，与其他突变体相比，用SARS-CoV-2 RBD中的Q498和N501残基取代SARS-CoV RBD Y484和T487残基会显着降低其与SARS-CoV RBD的结合（图。 5B）。根据SARS-CoV RBD-m396复合物的晶体结构分析，m396 CDRH1区与SARS-CoV RBD的疏水残基Y484，T486和T487接触。用亲水性Q取代SARS-CoV RBD Y484破坏了与m396的疏水性相互作用。SARS-CoV RBD T487插入涉及m396的疏水性囊袋中，用SARS-CoV-2 RBD N501取代该残基可能导致疏水性囊袋的构象结构发生变化，从而削弱了SARS-CoV RBD-hACE2结合和SARS-CoV RBD-m396结合（图。 5d）。
简而言之，我们将SARS-CoV-2 RBD中的A475和F486以及SARS-CoV RBD中的Y484和T487识别为识别其共同功能受体hACE2和中和抗体的关键残基。由于两种病毒中RBM的免疫原性不同，因此中和抗体无法显示交叉反应性。
此外，SARS-CoV RBD的一些突变（主要位于高变区A430-D463中）适度降低了其与S230和N-176-15的结合活性。通过诱导结合表面的构象变化，所有突变可能协同作用导致不良的交叉反应性。我们观察到，K439对于S230和N176-15与SARS-CoV RBD的结合均很重要，它也是SARS-CoV RBD与hACE2结合的关键残基。
总之，RBM的变化，尤其是与ACE2识别有关的残基，对于靶向RBD的抗体的交叉中和失败可能至关重要。
世界卫生组织于2020年3月11日正式宣布SARS-CoV-2为大流行病。该流行病在全球范围内变得越来越严重。随着对SARS-CoV-2和COVID-19的研究的深入，以前对这种病毒的长期斗争的期望逐渐取代了以前的乐观猜测。为了控制流行病，迫切需要预防性疫苗和有效药物。
根据已发表的文章，SARS-CoV-2和SARS-CoV都利用相同的人类受体ACE2，我们的研究也证实了这一点。因此，负责hACE2结合的S蛋白，尤其是其RBD，是SARS-CoV疫苗和基于抗体的药物开发的最有希望的目标。23根据新近公开的结构信息和我们的功能分析，我们讨论了SARS-CoV-2和SARS-CoV的受体识别和抗原特性。
SARS-CoV-2-和SARS-CoV-hACE2复合物的晶体结构和cro-EM结构均显示，尽管RBM中的氨基酸存在很大差异，但总体结合方式非常相似。但是，尚未很好地说明SARS-CoV-2和SARS-CoV中RBM的可变部分如何影响受体识别。在这项研究中，我们证明了SARS-CoV-2 RBD中的六个单氨基酸取代导致与hACE2的有利相互作用的丧失，即N501，Q498，E484，T470，K452和R439。我们还证明，SARS-CoV-2 RBD中的5个单个氨基酸取代增强了SARS-CoV-2 RBD-hACE2的结合活性，即P499，Q493，F486，A475和L455。这些发现以及其他取代突变的结果证实了其他已发表结构文章的假说。24，25
值得注意的是，我们的数据表明SARS-CoV-2 RBD，N439 / R426，L452 / K439，T470 / N457，E484 / P470，Q498 / Y484和N501 / T487中的六个取代突变导致获得增强的结合亲和力hACE2的研究，为监测病毒传播过程中天然S蛋白突变的增加的感染性提供了线索。RBM氨基酸序列的差异提出了一个新问题：SARS-CoV之间RBD中的保护性抗原位点是否不同？我们发现RBD的抗原性抗原位点在两种病毒中是不同的。我们测试了一组针对SARS-CoV RBD的中和mAb，这些抗体中只有一种名为CR3022，能够识别SARS-CoV-2 RBD，但没有中和活性。值得注意的是，IC 50用于中和SARS-CoV假型病毒的CR3022的抗体远远高于其他四种测试抗体。孟媛等人的最新报告。图13揭示了与CR3022复合的SARS-CoV-2RBD的晶体结构，并显示了以S蛋白为中心的保守表位不与hACE2结合RBM界面重叠。我们还测试了一种抗SARS-CoV-2的人中和抗体，名为HA001，购自上海三友生物制药，对SARS-CoV-2具有高结合亲和力并具有抗SARS-CoV-2的中和活性，但与SARS-CoV无交叉反应。
我们鉴定出SARS-CoV S蛋白的Y484是SARS-CoV特异性mAb m396和80R识别的关键氨基酸。该氨基酸对于SARS-CoV S-hACE2结合也很重要。考虑到SARS-CoV S蛋白中的Y484被对应于SARS-CoV-2 S的Q498取代，该残基可能是导致抗原变异的关键氨基酸之一。HA001的推测表位被确定为SARS-CoV-2 RBM区域中两个与hACE2接触的氨基酸A475和F486，这可能是中和抗体结合的新位点。使用ELISA，我们还证明了用哺乳动物细胞免疫的小鼠的抗血清表达SARS-CoV和SARS CoV-2的重组RBD表现出对各自同源病毒的高结合亲和力和中和活性，而交叉结合和中和活性弱得多。这些结果表明，RBD结构域是诱导进化枝特异性中和抗体破坏病毒-受体结合的良好免疫原。关于通过用SARS-CoV RBD免疫小鼠来诱导交叉中和抗体的可能性，多项研究表明，SARS-CoV或SARS-CoV-2的自然感染以及SARS-CoV RBD对动物的免疫诱导的交叉非常有限。中和S蛋白靶向抗体反应，26，27这与我们的观察相一致。
总体而言，这项研究为制定针对SARS-CoV-2的干预策略提供了线索。首先，尽管诱导交叉保护性抗体并不容易，但SARS-CoV-2中的RBD是一种潜在的抗原，可以诱导针对SARS-CoV-2的大量中和抗体，从而有可能成为开发亚单位疫苗的良好候选者。其次，我们证明了SARS-CoV-2 RBM特异性中和mAb通过阻断hACE2相互作用来预防SARS-CoV-2感染，因此在缺乏有效的预防性疫苗的情况下是有希望的基于被动抗体的药物。此外，SARS-CoV-2和SARS-CoV残基对ACE2和中和抗体识别的重要性的鉴定为SARS-CoV-2的致病性和免疫逃逸机制提供了启示。
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