摘要
在唯一的酶鞘糖脂（GSL）代谢途径，其产生葡糖（神经酰胺）从头是UDP-葡萄糖神经酰胺葡糖基转移酶（UGCG）。UGCG与多种癌症类型的多药耐药性发展和增殖增加等癌前过程有关。以前，我们显示了UGCG依赖的谷氨酰胺代谢适应乳腺癌细胞缺乏营养的环境。这种适应性包括增强的氧化应激反应，以及通过增加谷氨酰胺氧化为三羧酸（TCA）循环提供燃料。在当前的研究中，我们调查了UGCG 过表达后的糖酵解和氧化代谢表型（OE）。通过增加糖酵解和氧化性葡萄糖代谢，过表达UGCG的MCF-7细胞经历了从静止/有氧代谢到能量代谢的代谢转变。能量代谢表型与线粒体质量增加无关，但是，线粒体更新的标志物增加了。UGCG OE改变了内质网（ER）/线粒体部分的鞘脂成分，这可能有助于增加线粒体更新和细胞代谢。我们的数据表明，GSL与细胞能量代谢密切相关，这一发现可能有助于开发新的癌症治疗策略。
肿瘤性疾病的一个重要标志是持续且不受控制的细胞增殖。根据细胞能量代谢的调节，除其他外，提供足够的大分子水平和三磷酸腺苷（ATP）形式的能量来促进细胞的生长和分裂。了解这些代谢变化的潜在分子机制是开发针对癌症疾病的新治疗策略的第一步。鞘糖脂（GSL）不仅是重要的膜的组件，但也可以作为信令生理和病理过程，如增殖和凋亡的分子（综述1，2）。大量研究表明，各种GLS在特定癌症中的特异性表达（在2中进行了综述），例如神经节苷脂GD2在乳腺癌中的表达3。糖基化鞘脂在质膜中簇集，导致形成富含GLS的微区（GEM）。鞘脂，胆固醇和蛋白质的这些动态聚集是功能簇，并为膜蛋白提供信号传递平台，膜蛋白受GEM脂质组成的调节（参见4）。脂质微结构域也存在于调节细胞质途径如细胞凋亡的亚细胞器的膜中（在图5中综述）。先前的研究表明UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶（UGCG）过度表达（OE）导致乳腺癌细胞中GEM组成的改变，导致信号通路激活并随后改变了基因表达6。UGCG是一种驻留在高尔基体中的酶，可将UDP-葡萄糖分子转移到神经酰胺中，生成葡萄糖基神经酰胺（GlcCer），它是所有复杂GSL的前体。UGCG OE在多种癌症中均有报道7，与乳腺癌患者的不良预后8相关（在9中进行了综述）。奥托沃伯格是第一，相比于非肿瘤细胞谁描述癌细胞能量代谢的异常特性10，11。尽管有足够的氧气供应，但仍在肿瘤组织中观察到葡萄糖代谢特别重编程为糖酵解增加，以及随后的葡萄糖消耗增加（综述于12）。在过去的几年中，也引起了对线粒体的关注。线粒体呼吸障碍被认为是增加了有氧呼吸癌细胞和癌症发展的原因，但是一些研究表明并非所有类型的癌症都如此（在13中进行了综述）。此外，现在已经确定，线粒体呼吸缺陷通常不是增强的需氧糖酵解的原因。相反，大多数是糖酵解性的特定肿瘤保留了高的线粒体呼吸能力（综述于13）。线粒体不仅是生物合成中心，例如通过以ATP的形式产生能量，而且是关键的信号枢纽。细胞器利用来自细胞质的各种底物来驱动例如三羧酸（TCA）循环，线粒体膜电位，脂肪酸氧化以及从头脂质合成（在13中进行了综述）。活性氧（ROS）主要是电子传输链的副产物而产生的，具有促肿瘤作用，并且升高的水平与癌症有关（在14中进行了综述）。但是ROS也可以作为信号分子，例如通过缺氧诱导因子-1（HIF-1）激活来影响细胞增殖15。此外，线粒体通过 B细胞淋巴瘤蛋白（Bcl-2）家族和相关蛋白 16是重要的细胞凋亡调节剂，并保持钙稳态 17。虽然大多数线粒体蛋白是由核基因编码的，但线粒体具有一个小的DNA基因组（mtDNA），该基因组编码呼吸，转移RNA和核糖体RNA所必需的蛋白质。线粒体形态受多种细胞途径的调控，如促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），磷酸肌醇-3-激酶 -Akt（PI 3 K-Akt）和骨髓瘤（MYC）（在 18中进行了综述））。它们形成相互连接的长小管网络，并不断发生裂变和融合。线粒体通过融合来共享营养，mtDNA和电子传输链成分，它们分裂后在有丝分裂期间分配给子代细胞，或者能够迁移到能量需求更高的区域（参见18）。裂变还促进了线粒体吞噬（在18中进行了综述）。线粒体与内质网（ER）的膜结构紧密相关。结果表明，这些接触位点在功能上与各种生理过程相关，例如ATP的产生，凋亡和线粒体动力学（在5中进行了综述）。）。几项研究证明，线粒体生物发生，动力学和降解的改变与包括癌症进展在内的多种病理因素有关。新型的诊断和治疗方法已经针对线粒体氧化还原稳态，TCA周期，氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白或线粒体动力学（在13中进行了综述）。一个例子是动力相关蛋白1（DRP1），其抑制作用目前正在研究中。DRP1对于线粒体裂变至关重要，它的阻断导致胶质母细胞瘤癌干细胞的生长减少19 体外和体内肺腺癌细胞的生长20。此外，DRP1阻滞抑制乳腺癌和黑色素瘤细胞21的肿瘤球形成。由于我们发现UGCG是GSL代谢的关键酶OE，导致乳腺癌细胞6的细胞增殖增加，因此我们对将GSL与细胞能量代谢联系起来的分子机制感兴趣。在以前的研究中，我们能够证明谷氨酰胺用于通过谷胱甘肽生产来增强氧化应激反应，并为TCA循环提供燃料，以维持UGCG过表达乳腺癌细胞的增殖优势22。
在当前的研究中，我们表明UGCG OE增加了乳腺癌细胞中的底物氧化和OXPHOS。UGCG的OE将细胞从静止/有氧状态转变为高能状态，这不归因于线粒体质量的增加。内质网/线粒体部分的鞘脂成分的改变似乎会影响OXPHOS蛋白的活性，导致OXPHOS的增加，并伴随着线粒体更新的加速。我们的数据表明GSL与细胞能量代谢密切相关，据我们所知，这是一个新颖的发现。这一发现可能有助于开发新的癌症治疗策略。
人MCF-7乳腺癌细胞系获自健康保护局（欧洲细胞培养物保藏中心EACC，英国索尔兹伯里）。如先前所述培养细胞22，并通过补充200 µg / ml G418（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国）选择稳定转染的细胞。
使用Lipofectamine 2000将UGCG表达质粒（pCMV6-ENTRY载体，OriGene Technologies Inc.，美国罗克维尔）（MCF-7 / UGCG OE）和空对照质粒（MCF-7 / empty）稳定转染到MCF-7细胞中（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，USA），使用G418如先前所述选择转染的细胞五周6。
示踪剂测量如23中所述进行。简短地说，将1.5×10 4个细胞/ 24孔接种到细胞培养基中（测定前一天），然后在含有D- [3- 3 H]葡萄糖或D-的Krebs Ringer Phosphate（KRP）营养缓冲液中孵育。[ 14 C（U）]葡萄糖。测量底物氧化，捕获释放出的14 CO 2。对于糖酵解测量，通过扩散从。化的[ 3 H] 2 O中分离出D- [3- 3 H]葡萄糖。为了量化示踪剂的氧化，将介质酸化并添加14 CO 2在液体闪烁光谱法之前通过与0.1 ml KOH的反应捕获。为了定量将示踪剂掺入细胞脂质中，进行了氯仿-甲醇（2：1体积/体积）提取，并通过闪烁光谱法测定了级分。
使用Seahorse XFe分析仪（美国圣克拉拉安捷伦科技公司）实时测量氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。如24中所述接种细胞并进行处理。代替的羰基氰氯苯腙（CCCP），将细胞用10μM的处理Ñ 5 ，N 6 -双（2-氟苯基） - [1,2,5]恶二唑并[3,4-b]吡嗪 -5,6- -二胺（BAM15）（美国安阿伯市的开曼化学公司）。
播种0.5×10 4个细胞/ 96孔（黑色），并在37°C下孵育24小时。随后，将细胞与5μM红色线粒体超氧化物指示剂一起在37°C下孵育30分钟，以进行活细胞成像（MitoSOX）（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）。用PBS清洗三遍后，在Fluostar读板仪上检测到荧光，激发波长为510 nm，发射波长为590 nm。这些值经过背景校正（仅中等）。
将细胞接种在6cm培养皿中，并在第二天用100nM NAO处理。温育15分钟后，通过胰蛋白酶收集细胞并沉淀。在PBS中进行一个洗涤步骤后，使用BD FACS Canto II流式细胞仪和BD FACSDiva软件（BD Biosciences，Franklin Lakes，美国）通过FITC通道分析每个样品的100,000个细胞的线粒体染色。使用FlowJo软件（FlowJo LLC，美国阿什兰，美国）评估数据，并与MCF-7 /空对照细胞相关。
Western Blot分析用于研究五种线粒体OXPHOS复合物的相对水平以及MCF-7 /空和UGCG过表达细胞的线粒体裂变和融合酶。收获细胞，并将沉淀重悬于PhosphoSafe缓冲液（EMD Chemicals Inc. Billerica，美国），2 mM DTT（AppliChem GmbH，德国达姆施塔特），1 x Roche Complete（Roche Complete，德国曼海姆，德国），pH 7.4补充1 ％100 X暂停蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特）。超声处理后，将裂解液离心（14,000 xg，10分钟，4°C）。通过Bradford方法测定上清液中的蛋白质浓度。用12％或15％SDS-PAGE分离40–75 µg总蛋白提取物（由于Complex IV单元的热敏感性，仅在50°C下加热5分钟），然后电印迹到硝酸纤维素膜上（Amersham Protran， GE Healthcare Life Sciences，德国弗莱堡）。进行丽春红染色（0.5％的1％乙酸溶液）以验证蛋白质转移。在5％乳粉中孵育90分钟后含0.1％吐温的PBS使用Odyssey红外扫描仪（德国巴特洪堡的LI-COR Biosciences）和Image Studio Lite软件（德国巴特洪堡的LI-COR Biosciences）进行荧光发射和光密度分析。蛋白质浓度与丽春红染色强度或热休克蛋白90（HSP90）作为管家蛋白（1：1000;孵育30分钟（BD Biosciences，Franklin Lakes，新泽西州，美国），二抗IRDye 800偶联（LI-COR Biosciences，Bad Homburg，德国），60分钟孵化）。对于磷酸DRP1（Ser616）蛋白检测，使用抗兔IgG，HRP联结的二抗（＃7074 Cell Signaling Technology，英国剑桥）和抗小鼠IgG（全分子）-过氧化物酶抗体（在兔体内生产，应用＃A9044（美国圣路易斯的Sigma-Aldrich）进行HSP90检测。使用Pierce ECL Western Blotting底物（＃32106，Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA），通过增强化学发光法检测蛋白质浓度。
使用NovaQUANT人线粒体与核DNA比率试剂盒（Merck KGaA，德国达姆施塔特）和SYBR select Master Mix（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）来比较核与线粒体DNA比率。基于qRT-PCR的试剂盒包含针对两个线粒体（ND1和ND6）和两个核基因（BECN1和NEB）的引物对。通过计算BECN1 / ND1和NEB / ND6的Ct值的比率，确定每个细胞的mtDNA拷贝数。使用KAPA Express Extract Kit（美国威尔明顿，Kapa Biosystems）分离DNA，每个反应孔加入2 ng DNA。
如先前所述22进行定量实时PCR（qRT-PCR）。简而言之，使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，希尔登，德国）分离总RNA。使用Verso cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆），将300 ng RNA应用于合成cDNA。在QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）上，使用5 X QPCR Mix EvaGreen（ROX）（Bio＆SELL，Feucht，德国）对基因特异性PCR产物进行定量。根据Δct方法计算相对mRNA表达。将相对值标准化为60 S核糖体蛋白L37a（RPL37A）表达水平的管家基因。表1中列出的所有引物 均购自Eurofins（卢森堡，卢森堡）。
为了确定MCF-7 / UGCG OE和MCF-7 /空细胞的线粒体膜去极化，使用了在线粒体中表现出电位依赖性累积的阳离子染料JC-1。将细胞接种在6 cm培养皿中，第二天，以80％汇合度，用2 µg / ml JC-1刺激细胞20分钟。随后，将细胞用PBS洗涤，通过胰蛋白酶收集并沉淀。将沉淀物重悬于250 µl PBS中，使用BD FACS Canto II流式细胞仪（单体形式：514/529 nm； J聚集形式：585/590 nm）和BD FACSDiva软件（BD Biosciences）测量每个样品100,000个细胞（美国富兰克林湖）。使用FlowJo软件（FlowJo LLC，美国阿什兰）评估数据。
为了分析ER /线粒体级分的脂质组成，使用Qproteome线粒体分离试剂盒（目录号37612，QIAGEN，Hilden，德国）从1.5×10 7个新鲜收获的细胞中分离出线粒体。所有步骤均根据制造商的规程进行，不包括高纯制剂。馏分纯度通过蛋白质印迹分析确认。通过液相色谱串联质谱法（LC-MS / MS）确定分离的ER /线粒体部分的鞘脂浓度，如先前所述6。水平与胞浆级分的蛋白质浓度有关，并针对MCF-7 /空对照细胞进行标准化。
使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。数据表示为平均值±平均值的标准误（SEM）。两组之间均值的显着差异通过不配对t检验和Welch校正进行评估，并通过双向方差分析与Bonferroni多重比较后检验评估两组以上。
本文不包含任何作者对人类参与者或动物进行的任何研究。
在先前的研究中，我们发现在MCF-7细胞中UGCG 过表达（OE）后，谷氨酰胺摄取增加，谷氨酰胺氧化增强[ 22]。在这项研究中，我们用[U- 14 C]标记的葡萄糖进行了底物竞争测定，以追踪MCF-7 / UGCG OE和对照细胞中葡萄糖衍生的碳的代谢。UGCG OE导致捕获的14 CO 2的水平增加，这表明UGCG OE增加了葡萄糖的氧化（图 1A）。与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中以耗氧率（OCR）表示的基底线粒体呼吸显着增加（图 1B，C）。同样地，ATP生产（基础呼吸-呼吸后寡注射）中的溶液显著增加，最大呼吸速率（呼吸后Ñ 5，N 6 -双（2-氟苯基） - [1,2,5]恶二唑并[3,4与对照组相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中的b]吡嗪-5,6-二胺（BAM15）注射-抗霉素a /鱼藤酮注射后的呼吸作用显着增加（图 1C）。最大呼吸指示细胞呼吸对能量需求增加作出反应的能力。此外，与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞的备用容量（注射BAM15后的呼吸-基础呼吸）显着增加（图 1C））。向培养基中添加3- 3 H-D-葡萄糖，随后测量3 H 2 O的释放量，表明UGCG OE后糖酵解增加（图 1D）。与这些数据一致，UGCG过表达的细胞的基础细胞外酸化率（ECAR）（由葡萄糖的乳酸生产过程中质子的净产生和质子向培养基中的挤出确定）显着增加（图 1E，F）。此外，与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞的糖酵解能力（从寡霉素处理后的ECAR降低-基础ECAR）显着增加（图 1F）。
UGCG过表达增强糖酵解和细胞呼吸。（A）通过U - 14 C-葡萄糖示踪实验测量底物氧化。确定释放出的14 CO 2。数据以n = 3±平均值的标准误差（SEM）的平均值表示。（B）由Seahorse XFe分析仪测定的耗氧率（OCR ）的代表图。（C）ATP产生（基础呼吸-寡霉素注射后的呼吸），最大呼吸速率（N5，N6-双（2-氟苯基）-[1,2,5]恶二唑并[3,4-b]吡嗪-5的呼吸，6-二胺（BAM15）注射-抗霉素a /鱼藤酮注射后的呼吸），储备能力（BAM15注射后的呼吸-基础呼吸）。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（D）通过使用3- 3 H-D-葡萄糖并测量释放的标记的H 2 O 来测定厌氧糖酵解。数据表示为n ＝ 3±SEM的平均值。（E）通过Seahorse XFe分析仪定量的细胞外酸化率（ECAR ）的代表性图。（F）糖酵解能力（从寡霉素治疗后的ECAR-基础ECAR推算得出）。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（G）MCF-7 / UGCG OE和对照细胞的能量图。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001，**** p≤0.0001。
总之，在UGCG OE之后，MCF-7细胞从有氧/静止状态转变为高能代谢状态（代谢潜能转移），这表现为糖酵解和氧化磷酸化增加（图 1G）。
UGCG OE导致线粒体超氧化物水平升高，可检测为MitoSOX红色染料的荧光增强（图 2A）。另外，通过流式细胞术检测线粒体膜电位传感器5,5,6,6'-四氯-1,1'，3,3'四乙基苯并咪唑基-碳菁碘（JC-1）。我们测量到JC-1聚集体与单体的比率显着下降，这意味着线粒体去极化增加（图 2B）。线粒体JC-1染色的代表性图像如图2C所示。 。为了排除代谢效应是线粒体质量依赖性的可能性，我们通过MCF-7 / UGCG OE和对照细胞中的几个参数分析了线粒体质量。由于MitoTracker绿色与ROS反应，我们使用荧光线粒体染料壬基a啶橙（NAO）进行线粒体质量分析25。我们用NAO标记细胞，并通过流式细胞仪分析重要的线粒体。UGCG过表达和对照细胞之间没有显着差异被检测到（图 2D）。线粒体外膜受体转位酶的蛋白质水平20（TOM20）是TOM复合物的一部分，能够通过线粒体外膜导入蛋白质，在UGCG OE上未改变（图 2E和补充数据 1）。与对照细胞相比，UGCG过表达细胞的OXPHOS蛋白含量没有显着变化（图 2F，G和补充数据 2）。结果通过UGCG敲低（Kd）实验得到证实。MCF-7 / UGCG Kd细胞未显示出明显的总OXPHOS蛋白含量变化，而可以检测到复合V蛋白（ATP合酶）浓度显着降低（补充数据 3）。相反，与对照细胞相比，我们在MCF-7 / UGCG OE细胞中检测到显着增加的mtDNA拷贝数（图 2H）。
UGCG过表达对线粒体ROS和质量的影响。（A）使用荧光试剂MitoSOX对线粒体活性氧（ROS）水平进行定量。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（B）利用5,5,6,6'-四氯-1,1'，3,3'四乙基苯并咪唑基-碳菁碘（JC-1）通过流式细胞术分析线粒体膜电位。数据以n = 3±SEM的平均值表示。（C）通过免疫细胞化学对JC-1染色的n ＝ 3的代表性图像。从每个生物样品至少产生5张图像。（D）使用壬基a啶橙通过流式细胞术测定的线粒体质量（NAO）。数据以n = 4±SEM的平均值表示。（E）通过Western印迹分析分析线粒体外膜20（TOM20）蛋白的转位酶。蛋白表达与管家Hsp90和对照细胞有关。数据以n = 6±SEM的平均值表示。（F）通过蛋白质印迹分析对氧化磷酸化（OXPHOS）复合物IV蛋白浓度的光密度分析。蛋白表达与丽春红染料有关。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（G）OXPHOS蛋白Western Blot分析（上部）和Ponceau染色（下部）的代表性图像。（H）线粒体DNA（mtDNA）拷贝数使用NovaQUANT人线粒体与核DNA比率试剂盒确定。数据与MCF-7 /空相关，以n = 7±SEM的平均值表示。* p≤0.05，** p≤0.01。
因此，我们在UGCG OE后的作用并非归因于线粒体质量增加，而可能是由于OXPHOS蛋白活性增加所致。
接下来，我们通过qRT-PCR和Western Blot分析了参与线粒体融合和裂变过程的酶的表达。我们在MCF-7 / UGCG OE细胞中检测到了丝裂霉素1（MFN1）mRNA水平的显着增加，而丝裂霉素2（MFN2）mRNA表达却没有变化（图 3A）。相反，UGCG OE后MFN1蛋白水平未改变（图 3B和补充数据 4），而MFN2蛋白含量显着降低（图 3B和补充数据 5）。1型视神经萎缩的蛋白质浓度与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中的（OPA1）显着增加（图 3B和补充数据 6），并且在mRNA水平上证实了该结果（补充数据 7）。亲裂变的mRNA水平酶PTEN诱导的激酶1（PINK1），其积聚在功能失调线粒体和线粒体裂变蛋白1（FIS1）中显著增加以下UGCG OE（图 3C），而在没有显著差异帕金可以检测到2（PARK2）mRNA水平（补充数据 7）。此外，我们确定了总的动力蛋白相关蛋白1（DRP1）和总的蛋白质印迹分析显示线粒体分裂因子（MFF）和磷酸化DRP1（Ser616）蛋白水平。在UGCG OE后，总DRP1（补充数据8）和pho-DRP1（Ser616）（补充数据 9）蛋白水平没有差异 （图 3D）。UGCG OE后，总MFF蛋白水平显着降低（图 3D和补充数据 10）。无法检测到Phospho-MFF（Ser146）（数据未显示）。在MCF-7细胞中UGCG Kd之后，与对照细胞相比，可检测到MFN1，PINK1，FIS1和OPA1 mRNA表达水平无显着差异（补充数据 11），这证实了与线粒体融合和裂变过程有关的几种蛋白质的UGCG依赖性mRNA表达增加。在以前的研究中，UGCG OE导致TCA周期中谷氨酰胺代谢增加22。为了验证此数据，我们确定了参与丙酮酸加工和TCA循环的几种线粒体酶的mRNA水平。与MCF-7 /空对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中线粒体氧化还原传感器α-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）的表达显着增加（图 3E）。OGDH催化α-酮戊二酸转化为琥珀酰CoA，这是从谷氨酰胺开始的TCA循环的第一步。所述脱氢酶E1组分α亚基丙酮酸（PDHA1）和-β（PDHB）是丙酮酸脱氢酶复合物的单元，可将线粒体基质中的丙酮酸转化为乙酰辅酶A。与MCF-7 /空对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中两个亚基的mRNA水平均显着增加（图 3E）。谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT2）的线粒体同工型2在UGCG OE后也显着增加（图3E），与谷氨酸的天冬氨酸代谢增加相匹配，这通过13 C 5-谷氨酰胺标记测定22可见 。胞质GOT亚型1明显减少与MCF-7 /空细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中的（GOT1）mRNA水平（图 3F）。此外，测量到UGCG OE后胞质乳酸脱氢酶亚基A（LDHA）mRNA水平显着增加（图 3F）。LDHA催化丙酮酸转化为乳酸。这种增加与MCF-7 / UGCG OE细胞中ECAR的升高一致（图 1E，F）。
UGCG的过表达对线粒体动力学以及线粒体和细胞质酶的影响。（A）通过qRT-PCR分析测定促分裂酶丝裂霉素1（MFN1）和丝裂霉素2（MFN2 ）的mRNA表达。该表达与管家基因（RPL37A）有关。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（B）通过蛋白质印迹分析确定的MFN1，MFN2和1型视神经萎缩（OPA1 ）的蛋白质浓度。数据与管家蛋白HSP90相关，并以n = 6±SEM的平均值相对于MCF-7 /空对照细胞显示。（C）裂变酶PTEN诱导的激酶1（PINK1）和与RPL37A相关的线粒体裂变蛋白1（FIS1）。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（D）通过蛋白质印迹分析测定总动力蛋白相关蛋白1（DRP1），总线粒体裂变因子（MFF）和磷酸化DRP1（Ser616）的蛋白浓度。数据与管家蛋白HSP90相关，相对于MCF-7 /空对照细胞，其平均值为n = 6±SEM。（E）α-酮戊二酸脱氢酶（OGDH），丙酮酸脱氢酶E1组分亚基α（PDHA1），β（PDHB）和谷氨酸草酰乙酸转氨酶2的 mRNA表达分析（GOT2）通过qRT-PCR。该表达与RPL37A有关。数据表示为n = 3±SEM的平均值。（F）通过qRT-PCR 分析谷氨酸草酰乙酸转氨酶1（GOT1）和乳酸脱氢酶亚基A（LDHA）的mRNA表达。该表达与RPL37A有关。数据表示为n = 3±SEM的平均值。* p≤0.05，** p≤0.01，*** p≤0.001。
为了解释观察到的MCF-7 / UGCG OE细胞线粒体的变化，我们比较了MCF-7 / UGCG OE 内质网（ER）/线粒体级分和对照细胞中的鞘脂成分。由于ER是从头神经酰胺合成的场所，并且ER和线粒体通过特定的ER-线粒体接触位点相连，因此我们没有分离单个ER和线粒体级分。相反，我们分离了ER /线粒体级分，并通过蛋白质印迹分析来分析级分的纯度。蛋白质印迹分析结果表明，通过蛋白质二硫酸盐异构酶（PDI）（ER标记）和OXPHOS蛋白检测（补充数据 12）具有很高的纯度。使用液相色谱串联质谱仪（LC-MS / MS），对ER /线粒体级分的鞘脂水平进行定量。可以检测到与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中的总GlcCer（1.44倍）和总的乳糖基神经酰胺（LacCer）水平显着增加（1.35倍）（图 4A）。在UGCG OE后，总的二氢（dh）-神经酰胺和总的神经酰胺水平没有变化（图 4A）。详细地，C 18：0 -dh-Cer，C 18：0 -Cer，C 16：0-，C 18：0-，C 18：1 -GlcCer和C 24：0 -LacCer水平在与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞（图 4B））。的C 18：0 -LacCer电平在MCF-7 / UGCG OE细胞增加趋势（P = 0.0512）相比，对照细胞（图 4B）。C 24：1- Cer是唯一的鞘脂，与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE中C 24：1- Cer降低（0.76倍）。在UGCG上调后，所有其他分析过的鞘脂浓度没有明显变化（补充数据 13）。MCF-7 / UGCG Kd细胞的数据证实了我们的结果，与对照细胞相比，MCD-7 / UGCG Kd细胞的总GlcCer，LacCer和神经酰胺水平显着降低，而总的dh-神经酰胺水平升高（补充数据 14）。此外，我们确定了癌基因G olgi磷蛋白3的mRNA表达（GOLPH3），位于高尔基体中，并参与囊泡出口以运输到质膜。与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞中GOLPH3的mRNA水平降低（图 4C）。
UGCG影响ER /线粒体级分的脂质组成。（A）通过LC-MS / MS测定的分离的ER /线粒体级分的总葡糖基神经酰胺，乳糖基神经酰胺，二氢-（dh-）神经酰胺和神经酰胺水平。数据表示为n = 6±SEM的平均值。（B）UGCG OE后特定鞘脂种类的水平。数据表示为n = 6±SEM的平均值。（C）通过qRT-PCR确定的与RPL37A有关的高尔基磷蛋白3（GOLPH3）mRNA水平。数据以n = 5±SEM的平均值表示。* p≤0.05，*** p≤0.001。
通过这项研究，我们能够证明UGCG 过表达（OE）介导了从糖酵解和OXPHOS升高所指示的从静止/有氧到高能乳腺癌细胞类型的代谢转化。尽管线粒体质量不变，但伴随着ER /线粒体部分中鞘脂含量的变化和线粒体周转率的增加（图 5）。
观察到的UGCG过表达对乳腺癌细胞代谢的影响的示意图。UGCG OE导致增加的糖酵解，增加TCA循环，增加OXPHOS。这导致线粒体ROS水平升高，并伴随着线粒体周转增加。这种作用并非归因于线粒体质量的增加，而是改变了ER /线粒体级分的鞘脂成分，其中可能包含ER-线粒体接触位点。TCA = 三羧酸，ROS = 活性氧，OXPHOS = 氧化磷酸化，GlcCer = 葡萄糖基神经酰胺，LacCer = 乳糖基神经酰胺，mtDNA = 线粒体DNA，绿色箭头=与对照细胞相比，MCF-7 / UGCG OE细胞增加。
UGCG OE介导乳腺癌细胞中糖酵解的增加。糖酵解不仅提供能量，还提供大分子以产生生物质来维持细胞增殖。糖酵解通量的增加并不自动意味着OXPHOS受损（在26中进行了综述）。确实，我们测量了UGCG OE后超氧化物的增加（可能是由OXPHOS的增加引起的）和线粒体膜电位的降低，但是我们可以清楚地表明，在过表达UGCG的细胞中，氧化代谢并没有受到损害，反而增加了（图 5）。这表明增加的糖酵解不需要恢复线粒体功能障碍，并且这有助于增加MCF-7 / UGCG OE细胞的增殖6。花王等。还观察到在耐药性HL-60细胞中基础呼吸和最大呼吸能力增加，同时伴随UGCG表达增加27。通过使用鞘脂酶抑制剂，作者发现了鞘脂水平改变介导的线粒体功能改变27。我们证实了我们先前的结果，该结果表明，通过增加OGDH（催化TCA循环中的限速步骤）和GOT2 mRNA水平并降低GOT1 mRNA水平，UGCG OE 22之后通过TCA循环的通量增加。OGDH是一种线粒体氧化还原传感器，随着H 2 O 2含量的增加，它可以经历S-谷胱甘肽化28。另外，丙酮酸脱氢酶mRNA在UGCG OE后表达更多，这支持了TCA循环。但是，从统一标记的[U 14 C]标记的葡萄糖中提高的14 CO 2水平也可能至少部分是由于通过戊糖磷酸途径的通量增加所致。我们已经可以显示NADPH浓度在MCF-7细胞之后UGCG OE同比增长22。
由于UGCG OE后OXPHOS和TOM20蛋白的浓度以及NAO阳性细胞数没有变化，因此我们认为对糖酵解和氧化代谢的影响并非归因于线粒体质量的增加。有趣的是，MCF-7细胞中的UGCG Kd导致ATP合酶蛋白浓度降低，这表明导致MCF-7 / UGCG OE细胞中ATP合成增加的效应是UGCG依赖性的。但是，MCF-7 / UGCG OE细胞显示出比MCF-7 /空对照细胞高得多的mtDNA拷贝数。与基因组DNA相比，mtDNA表现出较高的突变率，这可能是由于呼吸导致的致突变性ROS持续暴露（在29中进行了综述）。由于MCF-7 / UGCG OE细胞表现出增加的线粒体ROS，这很可能是导致mtDNA量增加的原因。ori等。表明融合过程中电子传输链的重新分布导致ROS水平增加，从而导致mtDNA拷贝数增加30。mtDNA含量的增加为融合和裂变过程的持续运行提供了足够的mtDNA拷贝，并防止了没有mtDNA的线粒体的产生（综述于31）。mtDNA含量改变的现象存在于各种人类恶性肿瘤中（综述于32）。在各种癌症类型中，例如大肠癌，前列腺癌和卵巢癌中，mtDNA拷贝数均有所增加，而在例如肝细胞癌中，mtDNA拷贝数却有所减少（综述于32）。与我们的数据相反，范等人。显示乳腺癌患者mtDNA拷贝数减少33。另一方面，在耐药的人喉癌细胞34中发现增加了mtDNA含量。
我们检查了线粒体融合和裂变过程中涉及的几种酶的表达，以研究UGCG OE后是否赞成其中一种过程。出人意料的是，UGCG OE不会导致融合或裂变增加，但可能导致线粒体周转率增加。这通过分别增加的抵消酶mRNA或蛋白质表达降低而显示，并且结果证实了数据，与对照细胞相比，在MCF-7细胞中UGCG Kd后参与线粒体融合和裂变过程的蛋白质的mRNA水平没有显着改变。PINK1通过在线粒体内膜电位高时迅速处理来评估线粒体的内部状态。不健康的线粒体无法导入并降解PINK1，导致激酶在胞质部位积聚，这代表线粒体功能障碍。位于PINK1的胞质位点募集Parkin导致线粒体外膜蛋白的泛素化（在35）。由于在UGCG OE后PINK1 mRNA表达增加，由于我们检测到的线粒体膜电位降低，PINK1合成可能增加。Parkin mRNA的表达没有改变，但PINK1仍可以募集该蛋白来标记这些线粒体，从而导致裂变率增加。如果真是这样，我们将有望产生最低的MFN1和OPA1（促融合蛋白）产量，因为这两种蛋白均被PINK1 / Parkin信号通路阻断。但是我们测量到OPA1蛋白浓度增加，而MFN2蛋白水平降低。帕兰克（Pallanck）讨论了PINK1在受损的线粒体中积累导致MFN2磷酸化，随后的Parkin募集和线粒体降解的模型（综述于 36）。MFN2也被认为具有抗肿瘤作用，并在各种人类癌症（包括MCF-7乳腺癌细胞系37）中以低水平表达。UGCG OE后，MFN2蛋白水平进一步降低，这分别表明线粒体损伤和降解程度降低。MCF-7 / UGCG OE细胞中氧化代谢增加也表明了这一点。与MFN2相比，MFN1的GTPase活性更高，而MFN1与MFN1 38相比，MFN2对GTP的亲和力更高，这表明MFN1和MFN2表现出功能差异。在衰老过程中，人类正常真皮成纤维细胞中MFN1和OPA1的增加与OCR和ATP水平的增加有关39。此外，FIS1（裂变蛋白）的mRNA表达增加，而总DRP1和磷酸化DRP1（Ser616）蛋白水平不变。在Ser616处DRP1的磷酸化通常促进线粒体裂变40。总而言之，我们无法说明线粒体的融合或分裂过程是否正在日益执行。据推测，UGCG OE后超氧化物水平的增加导致线粒体膜电位降低，并导致线粒体周转增加（图 5）。Ruiz 等在K562（慢性粒细胞性白血病）细胞中也显示出呼吸增加，超氧化物水平和融合裂变速率（OPA1和DRP1产量增加）。。作者认为，线粒体周转率的增加可导致线粒体变小，凝结和“增强”，从而导致细胞增殖增加41。
我们在2018年6的研究中证实了我们先前的结果，该结果显示ER标记物PDI在3、5、6、7和9级分（蔗糖密度离心）中积累。与对照细胞6相比，这些馏分还显示出增加的GlcCer水平。因此，结合这项研究的结果，我们可以证明，UGCG OE导致GlcCer在质膜的特定区域积聚，并导致ER /线粒体级分中的GlcCer和LacCer积聚（图 5）。）观察到的UGCG介导的对线粒体酶活性（OXPHOS）的影响可能是由ER /线粒体级分的脂质组成发生变化而触发的，其中包含ER-线粒体接触位点。有趣的是，MCF-7细胞中的UGCG Kd消除了UGCG OE对内质网/线粒体级分中脂质组成的影响，并导致线粒体中ATP合酶蛋白浓度降低。我们假设这一发现导致减少MCF-7 / UGCG Kd细胞增殖的作用，我们在2018年的研究中显示6。2010年，Ciarlo 等人。结果表明，在用[D] -PDMP进行UGCG抑制后，裂变分子向线粒体的募集受到损害，因此淋巴样细胞的裂变减少。此外，凋亡减少了42。这些发现同样表明UGCG对线粒体筏状结构的影响，但也表明UGCG对细胞能量代谢的细胞类型特异性影响。由于我们已经显示了MCF-7细胞6质膜的GEM组成的UGCG OE依赖性改变，很可能也发生了细胞内膜的改变。线粒体内膜和内膜在功能和结构上有很大不同，这会严重影响细胞器的功能（参见43）。此外，研究表明，对线粒体动力学和形态重要的内质网-线粒体接触位点受类脂筏结构的影响（综述见5）。）。此外，这些接触部位协调了mtDNA复制的许可，在MCF-7 / UGCG OE细胞中增加了分裂，将新复制的核苷分配给子代线粒体44。即使线粒体膜中的鞘脂浓度低，其影响也很大。神经酰胺的积累导致在线粒体外膜45中形成大通道，从而导致凋亡诱导阶段促凋亡蛋白的释放。已知线粒体具有独立的神经酰胺池，但不清楚从何处递送（见46）。）。但是，发现与对照细胞相比，存活率更高的MCF-7 / UGCG OE细胞的ER /线粒体部分中的总神经酰胺水平没有变化，这表明不诱导线粒体吞噬（可以将自噬诱导排除在外）22。有趣的是，MCF-7 / UGCG OE细胞的ER /线粒体组分中的C 18：0 -Cer浓度特别增加。我们已经显示出，C 18：0 -Cer合成神经酰胺合酶1（CerS1），其从ER转运到线粒体介导细胞应激和细胞死亡47，在MCF-7细胞48中未表达。CerS4也能够产生C 18：0 -Cer，但是在UGCG OE后其mRNA表达降低9。因此，增加的C 18：0 -Cer浓度可能与增加的二氢神经酰胺去饱和酶（DES）活性有关。矛盾的是，我们还测量了C 18：0 -dh-Cer水平的升高。C 18：0 -dh-Cer是DES的底物，我们假设浓度会降低，这是矛盾的。据我们所知，神经节苷脂GM1和GD3是唯一复杂的GSL，这都与线粒体脂质筏状为止（综述结构 5，49）。GD3与线粒体脂质筏状结构的相互作用可能导致线粒体膜电位发生变化，可能是通过增强线粒体电子传输链复合物III的ROS形成以及随后的线粒体通透性转换孔的打开和细胞色素c依赖性的caspase 3活化而引起的。 （在5中进行了审查）。由于GM1和GD3在GlcCer的下游，因此复杂的GSL可能还负责UGCG OE后观察到的变化。但是，尚不清楚在高尔基体中合成的GSL如何到达ER和/或线粒体。Annunziata 等。提出通过ER膜和质膜之间的接触将GM1在ER膜中重新分布（在49中进行了综述）。值得注意的是，b-系列衍生神经节苷脂如GD3和GD2表现出肿瘤增强功能和一个 -series衍生神经节苷脂如GM1，GM2和GM3常常表现出肿瘤抑制功能（综述2）。
GOLPH3是在本地化的膜蛋白的反式 -Golgi和囊泡从出芽反式 -Golgi。其中，GOLPH3特异性结合4-磷酸磷脂酰肌醇，其促进囊泡出口以运输至质膜50。发现致癌基因GOLPH3参与了各种实体瘤的进展，尤其是乳腺肿瘤51，并且与许多癌症的不良临床结果有关。与这些发现相反，MCOL-7 / UGCG OE细胞中GOLPH3基因表达降低。GOLPH3敲低导致相互连接的高尔基带状小管的分裂，导致单个高尔基水箱叠层的分裂。因此，来自这些堆叠的囊泡运输减少了（在52中综述）。GOLPH3减少介导的MCF-7 / UGCG OE细胞中囊泡运输的减少可能是GEM受限制的（不是在整个质膜中）GSL水平增加的解释，这是我们在2018年描述的6。Wang 等。揭示了GOLPH3调节了对化学疗法5-氟尿嘧啶的敏感性（5-FU）。更准确地说，增加的GOLPH3表达与接受5-FU治疗的患者预后良好相关，并预测大肠癌细胞对5-FU的敏感性更高53。由于GOLPH3在MCF-7 / UGCG OE细胞中的表达降低，而MCF-7 / UGCG OE细胞对化学治疗的敏感性较低6，Wang 等人的发现。与我们的结果一致。
我们的数据表明，UGCG与乳腺癌细胞的能量代谢密切相关。这种连接使细胞能够执行增加的糖酵解和OXPHOS，从而维持充足的能量供应和增强细胞增殖所需的构件。分子触发因素可能是ER /线粒体级分的鞘脂成分发生变化，导致OXPHOS蛋白活性增加。这伴随着线粒体更新的加速（图 5）。
由于我们可以证明UGCG导致MCF-7细胞中的谷氨酰胺依赖性，从而导致糖酵解，OXPHOS（当前研究）和细胞增殖增加[ 22]，因此通过UGCG抑制谷氨酰胺代谢和GlcCer合成的药理作用可能有益于乳腺治疗癌症患者。这将是用于乳腺癌治疗的新颖治疗策略。有几种谷氨酰胺代谢抑制剂，例如苄基丝氨酸和L-γ-谷氨酰对硝基苯胺（GPNA，谷氨酰胺转运蛋白抑制剂）或CB-839（谷氨酰胺酶I抑制剂），但疗效低或毒性低（见54）。可以通过降低剂量来降低GPNA，CB-839或其他药物的潜在副作用，并与UGCG抑制剂共同治疗可以提高药物疗效，因为我们假设这两种抑制剂在抑制乳腺癌细胞增殖的过程中将协同发挥作用。
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