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丹参酮IIA通过减少Akt-c-Myc信号介导的有氧糖酵解来抑制口腔鳞状细胞癌

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发表时间:2020-05-19 11:44作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

丹参酮IIA通过减少Akt-c-Myc信号介导的有氧糖酵解来抑制口腔鳞状细胞癌

摘要

有氧糖酵解是人类癌细胞的标志之一。己糖激酶2(HK2)的过表达在维持无限的肿瘤细胞生长中起着至关重要的作用。在本研究中,我们发现口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞表现出有氧糖酵解表型。此外,HK2在OSCC患者来源的组织和细胞系中高表达。HK2的耗尽在体外和体内抑制了OSCC细胞的生长。通过天然产物筛选,我们确定了丹参酮IIA(Tan IIA)通过抑制HK2介导的糖酵解是OSCC的潜在抗肿瘤化合物。Tan IIA减少了葡萄糖消耗,乳酸的产生,并促进了OSCC细胞的固有凋亡。机制研究表明,Tan IIA抑制Akt-c-Myc信号传导并促进E3连接酶FBW7介导的c-Myc泛素化和降解,最终在转录水平上降低HK2表达。总之,这些结果表明靶向HK2介导的需氧糖酵解是OSCC治疗的有希望的抗肿瘤策略。

介绍

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的类型的人类口服的恶性肿瘤之一,而且发生率和死亡率已在过去的十年里增加12越来越多的证据表明,遗传易感性,吸烟,饮酒和咀嚼槟榔终身的历史密切相关的口腔鳞癌增加风险345甚至手术治疗代表了早期病例为主,口腔鳞状细胞癌往往是确诊时已是晚期,转移仍然是主要的原因导致治疗失败,和鳞癌患者的5年总生存期(OS)为<50%678目前,尚无靶向治疗可用于OSCC治疗。因此,进一步阐明OSCC肿瘤发生的潜在机制,以及发现新的抗肿瘤靶标和药物仍然是OSCC预防和治疗的迫切需求。

在人类癌细胞中经常观察到糖酵解的失调。肿瘤细胞优先采取糖酵解,但不三羧酸循环,作为其能量源,即使在氧气存在下910糖酵解由一系列酶催化,包括己糖激酶(HK),这是一个不可逆的步骤,将葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖需要限速酶。目前,四种HK同工酶已经确定,只有HK2在多种人类癌症类型中过度表达1112HK2的高蛋白质水平增加葡萄糖/营养素摄取和促进大分子的生物合成,这是需要无限的肿瘤细胞生长的维持1314除了在葡萄糖代谢中的关键作用,HK2可以形成与线粒体外膜电压依赖性阴离子通道(VDAC)形成复合物,以减少细胞色素c,最终赋予治疗性和促进的释放癌细胞存活141516因此,HK2是用于癌症治疗的有希望的抗肿瘤靶标。

在这项研究中,通过天然产物筛选,我们确定了从丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中分离出来的主要成分丹参酮IIA(Tan IIA)作为OSCC治疗的潜在抗癌化合物。我们研究了Tan IIA在体外和体内对OSCC细胞的抑制作用,并研究了这种抗肿瘤活性的潜在机制。

材料和方法

细胞培养和抗体

用于缓冲液制备的SDS,DMSO,NaCl和Tris碱购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。蛋白酶体抑制剂MG132和环己酰亚胺(CHX)获自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。胎牛血清(FBS)和细胞培养基,例如DMEM和RPMI-1640培养基,是Invitrogen(纽约州格兰德岛)的产品。包括SCC9,SCC15,SCC25和CAL27在内的人类口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。永生化的口腔上皮细胞hTERT-OME购自Applied Biological Materials(ABM)Inc.(加拿大卑诗省里士满)。所有细胞均保持在37°C的恒温培养箱中,并含5%CO 2根据ATCC协议,每两个月进行一次支原体检查。抗HK2(#2867),c-Myc(18583),HK1(#2024),p-Akt(#4060),Akt1(#2938),p-GSK3β(#5558),GSK3β(#12456),Bax的抗体(#14796),VDAC1(#4866),α-微管蛋白(#2144),细胞色素c(#4280),裂解半胱天冬酶3(#9664),β-肌动蛋白(#3700),泛素(#3936,# 43124),裂解的PARP(#5625),抗兔IgG HRP(#7074)和抗小鼠IgG HRP(#7076)购自Cell Signaling Technology,Inc.(Beverly,MA)。针对Ki67(ab16667)的抗体来自Abcam(英国Cambridge)。FBW7(40–1500)抗体购自赛默飞世尔科技(Waltham,MA)。通过化学发光(#34076,Thermo Fisher Scientific)可视化抗体缀合物。

天然产物筛选

天然产物库(目录号L1400-01 / 02)是Selleck Chemicals(德克萨斯州休斯顿)的产品,用于筛选的88种目标化合物(补充表1)选自该天然产物库。将CAL27细胞铺板在48孔板中,并用单剂量的2μM天然化合物或DMSO(对照)处理12小时。在湘雅医院(中国长沙),对细胞培养基的上清液进行葡萄糖和乳酸分析。用BCA蛋白测定法浓缩经化合物处理的CAL27细胞,并用作葡萄糖消耗和乳酸产生速率标准化的上样对照。所有筛选的化合物均列在表S1中我们选择Tan IIA作为本研究的候选化合物有两个原因。首先,基于天然产物的筛选,只有Tan IIA在2μM的浓度下将葡萄糖消耗和乳酸生成降低了25%以上,这表明Tan IIA对糖酵解具有最重要的抑制作用。其次,Tan IIA是中草药丹参的主要成分,目前用于临床治疗槟榔碱和槟榔提取物引起的口腔粘膜下纤维化(OSF),这是一种口腔癌前病变。因此,值得研究OSCC中Tan IIA的潜在抗肿瘤机制。

MTS分析

如先前所述进行MTS测定17将OSCC细胞以每孔3000个细胞的浓度接种到96孔板中。过夜孵育后,将细胞用丹参酮IIA处理各个时间点。按照制造商的说明,使用从Promega(#G3580,Madison,WI)购买的细胞增殖测定试剂盒(MTS)检查细胞活力。

非锚定细胞生长

如前所述18进行非锚定细胞生长试验简而言之,在六孔板中将含有10%FBS / 0.5%琼脂的Eagle基础培养基制备为培养层。计数OSCC细胞,并用含Eagle基础培养基的10%FBS / 0.3%琼脂稀释至终浓度为8000细胞/ ml,并在带有底部培养层的六孔板中过分覆盖。在5%CO 2培养箱中于37°C培养2周后,计算菌落数

临床组织样本采集

中南大学湖南省肿瘤医院病理科收集了20例经书面知情同意的患者的OSCC组织及相匹配的相邻非肿瘤组织的20例病例,中国湖南长沙。所有患者术前均未接受任何治疗。将样品在液氮中冷冻,并制备蛋白质以进行蛋白质印迹分析。

蛋白质印迹

使用来自赛默飞世尔科技的商业RIPA缓冲液(#PI89901)制备全细胞提取物(WCE)。通过BCA蛋白测定(#23228,Thermo Fisher Scientific)浓缩WCE,并如先前所述进行19 IB分析简而言之,将总共30μg的WCE与加样缓冲液一起煮沸5分钟,然后进行SDS-PAGE电泳并将其电转移到PVDF膜上。将膜在室温下用5%脱脂奶封闭1小时,然后在4°C下与一抗孵育过夜,然后在室温下与第二抗体孵育30分钟。通过化学发光使靶蛋白可视化。

HK2敲除稳定细胞系

两种不同的单向导RNA(sgRNA)用于生成HK2,Akt1和c-Myc稳定的敲除细胞(补充表2)。将sgHK2质粒转染到OSCC细胞中,并用嘌呤霉素(1μg/ mL)选择3周。单个菌落用于进一步研究。

糖酵解分析

如先前所述进行糖酵解分析20简而言之,将OSCC细胞接种在48孔板中,并用DMSO(对照)或丹参酮IIA处理12小时。在中南大学湖南省肿瘤医院(长沙)的实验室分析了葡萄糖的消耗和乳酸的产生。相对葡萄糖消耗和乳酸产生速率通过蛋白质浓度标准化。

泛素化分析

如前所述21进行了泛素化分析对于IP介导的内源泛素化分析,将细胞用补充了10 mM N-的改良RIPA缓冲液(20 mM NAP,pH7.4、150 mM NaCl,1%Triton,0.5%脱氧胆酸钠和1%SDS)裂解。乙基马来酰亚胺(NEM)和蛋白酶抑制剂。将裂解液超声处理30 s,在95°C下煮沸15分钟,然后用含RIPA缓冲液的0.1%SDS稀释,然后以16,000× g离心。 在4°C下放置15分钟。对上清液进行IP测定,然后对靶蛋白的泛素化进行IB分析。对于镍下拉测定法,将细胞用补充的Ni-NTA裂解缓冲液(6 M盐酸胍,0.1 M Na2HPO4 / NaH2PO4、0.01 M Tris / HCl,pH 8.0、5 mM咪唑和10-mMβ-巯基乙醇)裂解。蛋白酶抑制剂和10 mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)。将裂解物超声处理30 s,然后在室温下与50 ml Ni-NTA-琼脂糖(QIAGEN Inc,Valencia,CA)孵育4小时。最后一次洗涤后,将Ni-NTA珠与含有200mM咪唑的加载缓冲液一起煮沸。通过IB分析确定泛素化。

体内肿瘤生长

所有动物实验均得到中南大学(中国长沙)机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。OSCC异种移植模型是通过将CAL27(2×10 6)或SCC15(5×10 6)细胞向6周龄无胸腺裸鼠(n  = 5)的右侧面注射而构建的每两天记录一次肿瘤体积和小鼠体重。当肿瘤体积达到〜100 mm 3时,荷瘤小鼠开始接受复合治疗将小鼠随机分为两组。对照组给予媒介物对照组,而经化合物处理的组通过腹膜内注射给予丹参酮IIA(每两天10 mg / kg)。根据下式确定肿瘤体积:长×宽×宽/ 2。在终点处,将肿瘤块固定并进行免疫组织化学(IHC)染色。

免疫组织化学染色

固定小鼠异种移植肿瘤,并如先前所述进行IHC分析22简而言之,通过随后与二甲苯和乙醇一起温育以完成石蜡的去除,将组织玻片脱蜡并再水化。通过将组织玻片浸入柠檬酸钠缓冲液(10 mM,pH 6.0)中并煮沸10分钟来进行抗原修复。用ddH 2 O 洗涤3次后,将玻片与3%H 2 O 2孵育在甲醇中溶解10分钟以灭活内源辣根过氧化物酶,然后用PBS洗涤3次。将载玻片在室温下用PBS中的50%山羊血清白蛋白封闭1 h,并与第一抗体在湿室中于4°C杂交过夜。将组织玻片与二抗在室温下孵育45分钟,然后用DAB底物观察。苏木精用于复染。

血液分析

通过心脏穿刺将小鼠血液收集到EDTA涂层的试管中。在湘雅第三医院实验室分析了红细胞(RBC),白细胞(WBC),血红蛋白(Hb),丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)和血液尿素氮(BUN)。中南大学(中国长沙)。

统计分析

使用GraphPad Prism 5(GraphPad 5.0,美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行统计分析。定量数据表示为平均值±sd。使用Student's t检验或ANOVA 评估差异p  <0.05的概率值用作统计显着性的标准。

结果

高表达HK2是维持OSCC细胞致瘤特性所必需的

为了研究人OSCC细胞的葡萄糖代谢特征,我们在常氧培养条件下检查了四种OSCC细胞和永生化口腔上皮细胞的糖酵解功效。我们的数据显示,与永生化口腔上皮细胞hTERT-OME相比,CAL27细胞表现出最高的糖酵解功效,因为2-DG摄取(图1a)和乳酸生成(图1b)显着增加。另外,CAL27和其他OSCC电池中的O 2消耗比率也显着降低(图1c),表明OSCC细胞中的氧化磷酸化受到抑制。这些结果表明,糖酵解被用作测试的OSCC细胞系中的主要葡萄糖代谢途径。HK2催化有氧糖酵解的第一步限速步骤。我们推测HK2可能在OSCC细胞中的糖酵解上调中起作用。因此,我们首先确定了OSCC细胞和永生化的口腔上皮细胞中HK2的蛋白水平。如图1d所示,HK2在包括CAL27,SCC25,SCC15和SCC9在内的人OSCC细胞系中过表达,而CAL27细胞则表现出最强的HK2表达。我们进一步检查了20例成对的OSCC和邻近组织中HK2的表达。我们的数据显示HK2的蛋白水平在OSCC组织中显着上调(图1e)。这些结果表明,其中表达较高蛋白水平的HK2的细胞具有更大的糖酵解潜力。接下来,我们使用HK2高表达的CAL27和SCC15细胞生成HK2敲除稳定细胞系。结果显示,HK2的消耗显着抑制了软琼脂中OSCC细胞的集落形成(图1f)。此外,敲除HK2导致CAL27细胞活力降低,MTS分析证实了SCC15细胞(图1g)。重要的是,敲除HK2会抑制CAL27和SCC15细胞的糖消耗和乳酸产生(补充图1A,B)。相反,永生化的上皮细胞hTERT-OME中HK2的过度表达会增加葡萄糖的消耗和乳酸的产生(补充图1C,D)。异种移植小鼠模型显示HK2的耗竭导致CAL27衍生的异种移植肿瘤的体内肿瘤发展显着延迟(图1h–j)。这些结果表明HK2在OSCC组织和细胞系中过表达,敲除HK2降低了OSCC细胞的致瘤特性。

图1:HK2在口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞中高表达。
图1

ac在常氧条件下,一组OSCC细胞(SCC15,SCC9,CAL27和SCC25)和正常口腔上皮细胞中的2-DG摄取量(a),乳酸生成(b)和O 2消耗量(c)。d在OSCC和hTERT-OME细胞中HK2表达的免疫印迹(IB)分析。e在30例匹配的OSCC患者组织和邻近组织中,HK2表达的代表性IB结果。T肿瘤,N邻近非肿瘤组织。f表达sgCtrl或sgHK2的CAL27和SCC15细胞的集落形成。比例尺,50 µm。G表达sgCtrl或sgHK2的CAL27和SCC15细胞的细胞活力。页首,HK2表达的IB分析。底部,MTS细胞活力分析。hj表达sgCtrl或sgHK2的CAL27细胞的体内肿瘤生长。h肿瘤体积。i肿瘤块的图像。比例尺,1厘米。j肿瘤块的重量。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。

Tan IIA通过下调HK2抑制OSCC细胞的糖酵解

为了发现可以抑制OSCC细胞中糖酵解和HK2的天然化合物,我们使用CAL27细胞进行了天然产物筛选。结果表明,与DMSO处理的细胞相比,只有Tan IIA降低了25%以上的葡萄糖消耗和乳酸生成(图2a–c)。然后,我们专注于Tan IIA进行进一步研究。为了确认Tan IIA对糖酵解的抑制作用,我们处理了三种OSCC细胞,分别以不同剂量的Tan IIA表达HK2的高(CAL27),中度(SCC15)或低(SCC9)水平。结果表明,Tan IIA减少了葡萄糖消耗(图2d)和乳酸的产生(图2e)。)剂量依赖性。此外,Tan IIA对CAL27细胞的抑制作用强于SCC15和SCC9细胞。SCC9细胞对Tan IIA处理具有相对抗性,只有5 µM Tan IIA显着降低了糖酵解作用(图2d,e)。这些结果表明,沉迷于糖酵解的OSCC细胞对Tan IIA治疗更敏感。重要的是,Tan IIA处理显着增加了CAL27和SCC15细胞中O 2的消耗,呈剂量依赖性(补充图2)。),表明Tan IIA恢复了OSCC细胞中的氧化磷酸化作用。基于这些结果,我们推测糖酵解的抑制作用可能会损害Tan IIA对有氧糖酵解OSCC细胞的抑制作用。然后,我们用糖酵解抑制剂2-DG或DMSO对照处理CAL27和SCC15细胞。结果表明,Tan IIA降低了2-DG和DMSO处理的OSCC细胞的细胞活力(图2f,g)。而且,用2-DG处理减弱了Tan IIA对CAL27和SCC15细胞的抑制作用。重要的是,2-DG在CAL27细胞中挽救了比SCC15更强的抑制作用(图2f,g)。这些结果进一步证实表现出高糖酵解速率的OSCC细胞对Tan IIA处理更敏感。接下来,我们研究了Tan IIA处理后多种糖酵解酶的mRNA水平(图2h)。我们的数据显示,在测试的酶中,HK2的转录降低最多。此外,Tan IIA还降低了PKM2的mRNA水平,而不是HK1,Glut1,PFK1 / 2和LDHA(图2h)。IB结果进一步证实了Tan IIA在CAL27和SCC15细胞中均抑制了HK2的表达,而抑制了HK1的表达(图2i)。我们的数据表明,Tan IIA是通过减少HK2表达在OSCC细胞中抑制糖酵解的候选化合物。

图2:丹参酮IIA(Tan IIA)抑制OSCC细胞中的糖酵解。
图2

ab筛选的化合物对CAL27细胞的葡萄糖消耗(a)和乳酸产生(b)的抑制作用。c Tan IIA的化学结构。de Tan IIA对OSCC细胞的葡萄糖消耗(d)和乳酸产生(e)的抑制作用fg MTS分析了用2-DG,Tan IIA或联合处理后的CAL27(f)和SCC15(g)细胞的细胞活力ħ用丹参酮IIA治疗糖酵解酶的mRNA水平的定量RT-PCR分析。一世在Tan IIA处理的CAL27和SCC15细胞中HK2和HK1表达的IB分析。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。

Tan IIA激活OSCC细胞的固有凋亡

因为HK2的线粒体定位是细胞存活和凋亡抑制所必需的,所以我们接下来检查了Tan IIA处理的OSCC的细胞活力。结果表明,Tan IIA降低了CAL27,SCC15和SCC9细胞的细胞活力(图3a)。重要的是,活细胞数量减少了时间和剂量依赖性(图3b,补充图1E,F),表明用Tan IIA处理导致OSCC细胞死亡。接下来,我们用凋亡抑制剂z-VAD-fmk和坏死病抑制剂necrostatin-1 / GSK'872预处理OSCC细胞。结果显示,z-VAD-fmk而非necrostatin-1或GSK'872不能挽救Tan IIA诱导的细胞活力下调(图3c)。)。此外,胱天蛋白酶3的活性(图3d)以及裂解的胱天蛋白酶3和-PARP的蛋白质水平(图3e)是剂量依赖性上调的。流式细胞仪数据显示,Tan IIA处理可增加凋亡细胞的数量(图3f)。通过分离亚细胞级分,我们进一步证实了Tan IIA抑制了线粒体HK2的存在(图3g)。此外,Tan IIA处理后,细胞色素C从线粒体向细胞质的释放呈剂量依赖性增加,线粒体相关Bax的表达增加(图3h)。)。该证据表明Tan IIA激活了内在的细胞凋亡信号传导。若要确定Tan IIA诱导的凋亡是否是HK2依赖性的,我们在CAL27和SCC15细胞中异位表达HK2。结果显示,用Tan IIA处理,HK2的过表达可以挽救细胞活力(图3i),并减少死亡细胞的数量(图3j)。同样,在HK2过表达的OSCC细胞中,胱天蛋白酶3活性(图3k)和凋亡细胞的细胞数(图3l)降低。IB数据进一步证实,HK2的过表达抑制了裂解的胱天蛋白酶3和-PARP的表达(图3m),并抑制了Tan IIA诱导的线粒体细胞凋亡的激活(图3b )。3n)。总体而言,这些结果表明,Tan IIA以HK2依赖性方式激活OSCC细胞中的内在凋亡。

图3:Tan IIA降低HK2蛋白水平并诱导内在凋亡。
图3

一个用丹参酮IIA处理OSCC的细胞的细胞生存力的MTS分析。b对经过Tan IIA处理的OSCC细胞中活细胞群体进行的台盼蓝排除试验分析。c MTS分析用各种抑制剂和Tan IIA处理的OSCC细胞的细胞活力。d, ê胱天蛋白酶3活性(d),和裂解的caspase 3和-PARP(蛋白水平È在丹参酮IIA处理的CAL27细胞)。f流式细胞仪分析Tan IIA处理的CAL27细胞中凋亡细胞的数量。g IB分析Tan IIA处理的CAL27细胞线粒体部分中的HK2表达。H用Tan IIA处理CAL27细胞,分离亚细胞级分并进行IB分析。 MTS OSCC细胞转染HK2并用丹参酮IIA处理的细胞存活率的测定分析。j台盼蓝排除法分析HK2转染的和Tan IIA处理的OSCC细胞中的活细胞数量。ķ胱天蛋白酶在HK2 3活性染和丹参酮IIA处理的CAL27细胞。l流式细胞仪分析了HK2转染的和Tan IIA处理的CAL27细胞中凋亡细胞的数量。在HK2转染的和Tan IIA处理的CAL27细胞中进行的半胱天冬酶3和-PARP裂解的m IB分析。ñCAL27细胞用HK2转染,并用Tan IIA处理24小时。分离亚细胞级分并进行IB分析。* p  <0.05,** p  <0.01,*** p  <0.001。

Tan IIA促进c-Myc的泛素化依赖性降解

癌蛋白c-Myc是HK2表达最重要的转录因子之一23我们的数据显示Tan IIA降低了HK2的mRNA水平,因此我们确定Tan IIA是否抑制OSCC细胞中的c-Myc。结果表明,Tan IIA剂量依赖性地降低了c-Myc的蛋白质水平(图4a)。此外,敲除c-Myc抑制了OSCC细胞中的HK2表达(图4b)。qRT-PCR结果表明Tan IIA不抑制c-Myc的转录,因为在Tan IIA处理的OSCC细胞中c-Myc的mRNA水平不受影响(图4c)。此外,用蛋白酶体抑制剂MG132处理后,在Tan IIA处理的OSCC细胞中恢复了c-Myc表达(图4d),表明Tan IIA促进了c-Myc降解。实际上,Tan IIA将c-Myc半衰期从1小时缩短至15分钟(图4e)。因为FBW7是c-Myc降解所需的E3连接酶,所以我们首先检查了c-Myc与FBW7之间的相互作用。共同IP数据显示Tan IIA促进了c-Myc和FBW7之间的相互作用(图4f)。泛素化分析表明,Tan IIA在CAL27细胞中增强了c-Myc泛素化(图G)。为了确认Tan IIA诱导的c-Myc泛素化依赖于E3连接酶FBW7,我们使用siRNA减少了CAL27细胞中FBW7的表达。我们的数据表明,敲除FBW7可使Tan IIA减毒促进c-Myc泛素化(图4h)。接下来,我们确定敲低FBW7是否影响OSCC细胞中的糖酵解。结果显示,FBW7的减少挽救了OSCC细胞中的糖酵解表型,因为在FBW7敲除的OSCC细胞中葡萄糖消耗(图4i)和乳酸生成(图4j)得以恢复。一致地,在Tan IIA处理的OSCC细胞中,FBW7的敲低增加了细胞活力(图4k)。总体而言,这些数据表明,Tan IIA促进FBW7介导的c-Myc破坏是OSCC细胞中糖酵解抑制所必需的。

图4:Tan IIA促进c-Myc泛素化和降解。
图4

用Tan IIA处理的OSCC细胞中c-Myc表达 IB分析。b sgCtrl和sgc-Myc表达OSCC细胞中c-Myc和HK2表达的IB分析。经Tan IIA处理的OSCC细胞中c-Myc mRNA水平的c qRT-PCR分析。ns,无统计学意义。d将 OSCC细胞用Tan IIA处理24小时,将MG132添加到细胞培养基中,再孵育6小时,然后对全细胞裂解液(WCE)进行IB分析。 OSCC细胞用Tan IIA处理24小时,将环己酰亚胺(CHX)添加到细胞培养基中,并按照指示的时间孵育,对全细胞裂解液(WCE)进行IB分析。F在Tan IIA处理的CAL27细胞中c-Myc与FBW7之间相互作用的共IP分析。g在Tan IIA处理的CAL27细胞中c-Myc泛素化的泛素化分析。用siCtrl或siFBW7 shRNA转染h CAL27细胞,然后用Tan IIA处理24 h,然后对WCE进行泛素化分析。ij CAL27细胞用siCtrl或siFBW7 shRNA转染,然后用Tan IIA处理24小时,对细胞培养基进行葡萄糖消耗(i)和乳酸生成(j)分析。ķ将CAL27细胞用siCtrl或siFBW7 shRNA转染,然后用Tan IIA处理24小时,然后进行MTS分析以进行细胞生存力分析。** p  <0.01,*** p  <0.001。

Akt拯救了Tan IIA处理的OSCC细胞中的c-Myc表达

c-Myc泛素化和降解24要求GSK3β介导的Thr58磷酸化我们的数据显示Tan IIA促进c-Myc泛素化,我们推测Tan IIA激活GSK3β。IB数据表明,用Tan IIA处理可以剂量依赖性地抑制Akt的磷酸化。作为下游靶标,Ser9上GSK3β的磷酸化持续降低(图5a),表明GSK3β的活性增加。此外,通过sgRNA敲除Akt1抑制了Ser9上GSK3β的磷酸化,并降低了OSCC细胞中c-Myc和HK2的蛋白质水平(图5b)。同样,葡萄糖的消耗(图5c)和乳酸的产生(图5d))随后在Akt1 sgRNA表达细胞中减毒。共同IP数据显示,敲除Akt1促进了c-Myc与FBW7之间的相互作用(图5e)。接下来,我们确定Akt1的过表达是否能挽救该表型。IB数据表明,即使在Tan IIA存在下,组成型激活的Akt1(Myr-Akt1)的异位过表达也恢复了S473上的Akt磷酸化(图5f)。此外,Myc-Akt1转染抑制了GSK3β的激活,因为S9的磷酸化明显增强。而且,c-Myc和HK2的蛋白质水平持续增加(图5f)。糖酵解分析结果进一步证实,Myc-Akt1的过表达增加了葡萄糖的消耗(图5g)。)和经Tan IIA处理的OSCC细胞中的乳酸生成(图5h)。此外,Tan IIA诱导的c-Myc的多聚泛素化在Myc-Akt1转染的细胞中大大降低了(图5i)。MTS数据显示,与未处理的细胞相比,Myc-Akt1将细胞活力从40%恢复到80%(图5j)。一致地,在Myc-Akt1过表达的OSCC细胞中,裂解的胱天蛋白酶3和-PARP的蛋白质水平(图5k)以及胱天蛋白酶3的活性(图5l)显着降低。总体而言,我们的数据表明Akt可以拯救Tan IIA处理的OSCC细胞中的c-Myc表达。

图5:Tan IIA以依赖于Akt信号传导的方式抑制c-Myc表达。
图5

CAL27细胞用Tan IIA处理24小时,然后对WCE进行IB分析。b将稳定表达sgCtrl和sgAkt的CAL27表达CAL27细胞用Tan IIA处理24小时,然后将WCE进行IB分析。cd用Tan IIA处理稳定表达sgCtrl和sgAkt的CAL27细胞24小时。对细胞培养基进行葡萄糖消耗(c)和乳酸产生(d)分析。e用Tan IIA处理sgCtrl和sgAkt稳定表达的CAL27细胞24 h,对WCE进行co-IP分析。如果将 CAL27细胞用Myr-Akt1转染并用Tan IIA处理24小时,则将WCE进行IB分析。Għ CAL27细胞用秘耳-Akt1的并用丹参酮IIA处理24小时,将细胞培养基进行的葡萄糖消耗()和乳酸生产(ħ)分析。 CAL27细胞用Myr-Akt1转染并用Tan IIA处理24小时,然后对WCE进行泛素化分析。 CAL27细胞用Myr-Akt1转染并用Tan IIA处理24小时,然后进行MTS分析以分析细胞活力。用Myr-Akt1转染kl个 CAL27细胞,并用Tan IIA处理24小时,然后将WCE进行IB分析(k)和caspase 3活性分析(l)。***p  <0.001。

Tan IIA抑制OSCC细胞的体内肿瘤发展

为了进一步确定Tan IIA的体内抗肿瘤作用,我们使用CAL27和SCC15细胞进行了异种移植小鼠模型。结果显示,载体治疗组的CAL27衍生的异种移植肿瘤的肿瘤体积为625±111mm 3相反,Tan IIA治疗显着抑制了体内肿瘤的生长,因为肿瘤体积仅为281±56 mm 3(图6a)。我们进一步检查了载体和Tan IIA治疗组的肿瘤重量。结果表明,与媒介物治疗组相比,Tan IIA的肿瘤重量减轻了50%以上(图6b,c)。同样,我们观察到Tan IIA对SCC15衍生的异种移植肿瘤具有相似的抑制作用。结果表明,在Tan IIA治疗的异种移植肿瘤中,肿瘤体积和重量均显着降低(图6d–f)。IHC染色显示,施用Tan IIA可以减少Ki-67阳性细胞的数量,并且p-Akt,c-Myc和HK2的蛋白质水平会持续降低(图6g)。这些结果表明,Tan IIA在OSCC异种移植模型中显示出潜在的抗肿瘤作用。

图6:Tan IIA抑制OSCC细胞的体内肿瘤生长。
图6

ac用媒介物或Tan IIA治疗的CAL27衍生的异种移植肿瘤的肿瘤体积(a),图像(b)和重量(c)。df用媒介物或Tan IIA治疗的SCC15衍生异种移植肿瘤的肿瘤体积(d),图像(e)和肿瘤重量(f)。比例尺,1厘米。g用媒介物或Tan IIA处理的CAL27衍生的异种移植肿瘤中Ki67,p-Akt,c-Myc和HK2的IHC染色。*** p  <0.001。比例尺,25μm。

为了确定Tan IIA在体内的毒性,我们用载体和Tan IIA处理检查了小鼠体重。结果表明,Tan IIA不能显着降低体重(补充图3A,B)。一致地,血液分析显示,Tan IIA并未引起RBC和WBC计数的显着增加或减少。此外,重要器官如骨髓,肾脏和肝脏的功能未受影响。在媒介物和Tan IIA处理的小鼠中,Hb,AST,ALT和BUN相似(补充图3C)。Tan IIA的最大耐受剂量(MTD)尚待确定,但以在小鼠中安全有效的剂量测试了该化合物。

讨论区

口腔癌是目前第六大常见癌症,全球癌症相关死亡的最常见原因之一,排名第八12超过90%的口腔癌被诊断为OSCC,优选发生在舌头上。OSCC的肿瘤发生是复杂的多种危险因素,如饮酒和烟草的使用的机制,已鉴定为涉及这种恶性肿瘤525最近的研究表明,葡萄糖代谢的失调在OSCC的肿瘤发生中起着至关重要的作用。免疫调节蛋白B7-H3通过PI3K / Akt / mTOR信号传导促进OSCC有氧糖酵解26葡萄糖转运蛋白1(Glut1)的上调诱导代谢从三羧酸循环转移到有氧糖酵解27此外,PKC2的过表达与侵袭性临床病理特征和OSCC 28预后不良有关EGF 29和HGF 30信号的激活促进OSCC中的糖酵解重编程。糖酵解和Warburg效应的促进诱导人OSCC细胞的癌干样细胞特性29此外,HK2的过表达通过SOD2-H 2 O 2途径增强了舌鳞癌的转移潜能31在本研究中,我们发现HK2在OSCC组织和细胞系中过表达,HK2的消耗降低了OSCC细胞在体外和体内的致瘤特性。我们的数据表明,用小分子Tan IIA抑制HK2介导的糖酵解可抑制OSCC细胞生长和肿瘤形成。这些结果表明,糖酵解的放松是人类OSCC的标志。

Tan IIA是从丹参中提取的最重要的亲脂性成分之一丹参酮IIA呈现在多个人类疾病显著药理活性,例如左心室肥大的抑制和衰减的动脉粥样硬化3233最近,Tan IIA由于在各种癌症模型中具有潜在的抗肿瘤功效而受到越来越多的关注。Tan IIA可抑制血液和实体瘤,包括白血病34,非小细胞肺癌35,大肠癌36,前列腺癌37和肝细胞癌38机制研究表明,Tan IIA诱导的细胞周期停滞和凋亡治疗抑制了血管生成和转移,并增强了化疗药物的抗肿瘤作用33重要的是,谭IIA抑制葡萄糖代谢,导致宫颈癌细胞凋亡39但是,尚不清楚Tan IIA对OSCC的抑制作用。我们发现抑制Akt-c-Myc-HK2轴在Tan IIA诱导的抗肿瘤活性中起关键作用。当前,一组天然产物包括藤黄醇40,丹酚酸B 41和木糖醇42已经鉴定了通过抑制糖酵解来抑制OSCC细胞。此外,通过小分子化合物HK2介导的糖酵解衰减受损各种人类癌症,如非小细胞肺癌和结肠癌的恶性表型434445这些证据表明靶向糖酵解是一种有前途的抗肿瘤策略,值得进一步研究。

HK2的过表达促进癌细胞存活,其中肿瘤细胞可以逃避凋亡并且与化学/放射疗法抗性密切相关。例如,E3连接酶Skp2增加HK2的线粒体定位并驱动肿瘤生长和对顺铂的化学耐药性46HK2通过增强顺铂诱导的自噬作用赋予卵巢癌细胞顺铂耐药性47此外,B7-H3以HK2依赖性方式促进大肠癌细胞有氧糖酵解和化学抗性48抑制LncRNA-UCA1通过抑制通过microRNA-125a / hexokinase 2途径的糖酵解来抑制小儿AML的化学耐药性49此外,HK2的消耗会增加对神经胶质瘤放疗的敏感性50,子宫颈癌 51和喉癌 52我们的数据表明,天然产物Tan IIA抑制OSCC细胞中HK2的表达,并激活线粒体凋亡信号。HK2的过表达损害Tan IIA诱导的细胞死亡并恢复OSCC细胞中的糖酵解。

HK2是在由转录因子c-Myc和HIF-1α的转录水平上调节2353此外,有效HK2表达也需要非编码RNA,例如长的基因间非编码RNA(lincRNA-RoR)54和miRNA(miR-218)55我们的数据表明,Akt活性通过调节c-Myc稳定性在促进OSCC细胞HK2表达中起主要作用。Tan IIA抑制Akt磷酸化并促进c-Myc和E3连接酶FBW7之间的相互作用,从而最终增强FBW7介导的c-Myc泛素化和降解。Akt的过表达恢复了OSCC细胞中c-Myc和HK2的表达,并破坏了Tan IIA诱导的糖酵解抑制。

总体而言,这项研究表明HK2的高表达是维持OSCC细胞恶性表型所必需的。天然产物Tan IIA通过以Akt-c-Myc-HK2信号转导依赖性方式减少糖酵解来抑制OSCC细胞。该证据扩展了我们对Tan IIA的抗肿瘤机制的理解,并表明Tan IIA是用于OSCC预防和治疗的潜在抗肿瘤剂。




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