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多酚体外调节的微生物群显示对艰难梭菌的定植抗性降低,但可以中和细胞毒性

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发表时间:2020-05-21 10:08作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

摘要

尽管多年来对肠道微生物群- 艰难梭菌相互作用的认识有所提高,但对提供定植抗性的基本机制以及针对感染的预防措施的理解仍然不完整。在这项研究中,分别从石榴和蓝莓中提取的抗生素克林霉素和多酚提取物组合在一起,用于调节微型生物反应器阵列(MBRA)中的粪便微生物群落。艰难梭菌(核糖体027)接种调制的社区随后的7天定期监测包括对艰难梭菌的评估TcdA和TcdB的生长和活性以及MBRA细菌群落结构的分析(V3V4 16 S宏基因组学)。多酚会影响多个共生细菌群,并与克林霉素一起显示不同的协同和拮抗作用。暴露于克林霉素或多酚会导致对艰难梭菌的定植性丧失的成功增长艰难梭菌在下降最为显著相关柯林斯毛螺此外,我们证明了梭状芽孢杆菌降低了艰难梭菌毒素TcdA和TcdB的活性。该功能在不同产孢梭菌菌株,并有可能作为非抗生素药物缓解艰难梭菌感染。

介绍

艰难梭菌感染(CDI)是一种毒素介导的炎症,导致腹泻和结肠炎,最常见于医院环境。肠道菌群的紊乱平衡(通常是由于抗生素治疗引起的)是艰难梭菌成功定居胃肠道(GIT)和感染发展1所必需的

肠道菌群通过不同的机制提供了对艰难梭菌的定植抗性生长或孢子萌发的抑制可通过的初级胆汁酸的生物转化而实现234,以及pH的降低通过有机酸生产56其他作用方式包括改变艰难梭菌对肠细胞的粘附力7,益生菌菌株(如罗伊氏乳杆菌)与病原体8的共聚集或仅通过竞争粘附位点。选定的真菌和细菌菌株会降低大肠杆菌的活性。艰难梭菌毒素TcdA和TcdB。在1996年,从酵母菌鉴定出一种丝氨酸蛋白酶,可抑制毒素TcdA 9,而最近在克劳氏芽孢杆菌10中描述了一种具有类似作用的蛋白酶的破坏艰难梭菌群体感应,一个机构,用于毒素合成的调节是至关重要的,还可以导致毒素活性的降低1112

多酚是植物中的次生代谢产物,在食物中含量丰富,包括不同的水果,蔬菜,种子和草药,以及咖啡,茶和葡萄酒等饮料13它们目前被广泛研究,因为它们的抗氧化和抗炎性质的14,而且还表现出对共生细菌群的有益效果,同时抑制的潜在病原体,包括生长艰难梭菌1516在这项研究中所用的两个蓝莓和石榴提取物先前报道,以促进肠道共生细菌的生长,抑制潜在病原体的171819或对有益肠道调制成果社区202122

这项研究的目的是测试在体外条件下多酚的预暴露是否会影响微生物群落,从而减轻抗生素的负面影响并随后提高对艰难梭菌的定植抗性体外在本研究中使用的系统(MBRA)之前显示为适合于有关的研究艰难梭菌 -微生物群相互作用23

结果

不同的多酚和克林霉素以不同的方式调节细菌群落

在一组24个微型生物反应器(MBRAs)中,接种了来自两个健康受试者的粪便样本,其中3个单独用克林霉素治疗,3个使用不同的多酚提取物(PE,蓝莓或石榴)处理,3个分别与每种多酚组合使用克林霉素(参见材料和方法,图   5)。石榴PE用作两种浓度的调节因子,分别为100 mg / L和400 mg / L。剂量依赖性变化显示在补充图   S1中,而主要文章中仅显示了在400 mg / L的浓度下通过调制获得的结果。使用三个未处理的生物反应器作为对照。

经过五天的菌群培养(图   1a,第5天),我们观察到与开始流动之前的样品(第0天;图1a相比,所有处理中细菌富集程度均预期降低   在随后的时间点中,OTU的数量保持稳定,直到实验终止(14天;图   1a)。与开始流动之前采集的样品相比,我们观察到了不同代表的拟杆菌属的相对丰度的后调制增加,以及在肠道中发现的其余四个主要门的减少(图   1b)。在调制阶段之后,系统中无法检测到一些关键的肠道菌群共生体,包括双歧杆菌(OTU46和OTU79),Akkermansia(OTU34)和多个代表梭菌,最突出Faecalibacterium(OTU39)。这些以初始相对样品的平均相对丰度分别为0.8%(OTU46),0.2%(Out79),1.5%(OTU34)和1.2%(OTU39)出现在流动开始之前。使用MBRA系统的先前研究类似地报道了在相似的连续培养条件下生长过程中某些梭菌成员(包括费氏杆菌)的减少或消失,但是在这种情况下,阿克曼氏菌系统中成功生长24

图1
图1

生物反应器支持稳定社区的发展。整个实验期间观察到的唯一的OTU的数量。颜色表示用多酚提取物(PE)处理,虚线表示使用克林霉素作为调节因子的处理。顶部的字母表示实验阶段:M –调制期,W –洗脱期和CD – 艰难梭菌接种后时期。b在流动开始之前(流动之前,黑色)和所有其余时间点(流动开始之后,灰色)显示的样品细菌门的相对丰度的方框图。

克林霉素调节对微生物组成的影响最大(AMOVA,p <0.001)。克林霉素暴露的微生物群谱归为一组,而仅用PE处理的群落更接近于未处理的对照(Bray-Curtis相似性树状图,图   2a)。然而,在门菌落水平上仅观察到与克林霉素相关的微小变化(图   2a),最显着的是杆菌科 / 菌毛比(p <0.001)的增加。2b中显示了最重要的差分表示OTU   ,补充图S1中显示了完整的LEfSe分析  

图2
图2

多酚和克林霉素以不同的方式调节微生物群。Bray-Curtis差异树状图表示法与3种优势细菌门的相对丰度的条形图表示法。样品名称根据调制阶段使用的多酚提取物(PE)进行着色。绿色表示对照治疗,蓝色表示蓝莓PE,橙色表示石榴PE。缩写“ Cli”表示接触克林霉素。bLEfSE分析显示,暴露于PE,克林霉素或两者组合的社区与对照组相比。LDA值以热图表示,红色表示特定OTU降低,而蓝色表示增加。OTU分类标准之前的字母表示分类标准级别:g-属,f-家庭,o-顺序,p-门。c根据治疗方法对独特OTU数量和Shannon均匀度进行箱形展示。

在未处理的对照中检测到最大数量的唯一OTU。当单独应用时,克林霉素和PE会降低细菌富集度(独特的OTU数量,p <0.001;图   2c)。有趣的是,在克林霉素和PE的两种组合中(克林霉素+蓝莓PE和克林霉素+石榴PE),与仅用克林霉素治疗的生物反应器相比,检测到的OTU减少量较少(p <0.001;图   2c)。石榴PE单独或与克林霉素联合治疗均导致社区均匀性增加(Shannon均匀性,p <0.001;图   2c)。另一方面,当与克林霉素联合使用时,蓝莓PE的治疗进一步降低了群落的均匀度(Shannon均匀度,p <0.001;图。 2c)。

蓝莓和石榴PE以不同的方式调节细菌群落(AMOVA,p <0.001)。然而,与对照治疗相比,两种PE的微生物结构都有一些共同变化。这些包括在增加真杆菌(OTU5)和梭状芽孢杆菌在XIVA(OTU14)和减小柯林斯(OTU43)和梭菌(OTU44)。其他差异表示的OTU是PE特定的。最显着的是,用蓝莓PE进行调制会导致梭状芽胞杆菌 XIVa(OTU3),漆鞭草科(OTU7),黄酮分解素(OTU12),Eggerthella(OTU49)和未分类的Firmicutes增多。(OTU55)。调制与导致增加在石榴PE Ruminococcaceae(OTU27)和梭状芽胞杆菌IV(OTU67)(图   1B)。完整的LEfSe分析显示在补充图   S1中

PEs和克林霉素的组合对微生物群的处理产生了特定的模式,表明两者之间具有拮抗和协同作用。最值得一提的是,我们发现细菌类在单独接触克林霉素后减少,但当PE与克林霉素一起使用时不受影响。其中,蓝莓PE最小化了克林霉素对Blautia(OTU16)和Clostridium XVIII(OTU18)的不利影响石榴PE可以最大程度地降低克林霉素对拟杆菌(OTU10),黄酮分解素(OTU12)和漆螺科(OTU19)的不利影响蓝莓和石榴PE均减轻了克林霉素对XIVa梭菌的不利影响(OTU9)。另一方面,我们还观察到了PE和克林霉素的协同作用。克林霉素和任一种PE的组合均可导致Anaerotruncus(OTU100)的降低,而单独使用PE或克林霉素则不会受到影响(图   2b)。较低PE浓度(100 mg / L)时的石榴效应与PE浓度为400 mg / L时观察到的结果一致(补充图   S1)。

多酚暴露后艰难梭菌的定 殖性下降

调节期过后,我们进行了2天的冲洗期,以使社区稳定下来并从系统中冲洗出调节因子(PE和克林霉素)。从这一点开始,向生物反应器提供没有调节因子的培养基。随后,在第7天,我们将所有艰难梭菌营养细胞接种到所有生物反应器中,最终浓度约为10 5 CFU / mL。在接下来的7天中定期测量艰难梭菌的生长和细胞毒性

如预期的那样,对照(未处理)微生物群落对艰难梭菌显示出定植抗性,而在调制期间用克林霉素处理的微生物群落中艰难梭菌成功生长(图   3a)。我们假设PE会调节微生物群,使其对克林霉素诱导的变化具有更大的适应力,从而导致暴露于PE和克林霉素组合的生物反应器中产生定植抗性。与我们的预期相反,艰难梭菌在暴露于PE的所有处理中成功生长(单独或与克林霉素联合使用)(图   3a)。

图3
图3

艰难梭菌的生长和细胞毒性相关的细菌群落特征。分别显示了细胞系HT-29和Vero的艰难梭菌生长时间表(log10 CFU / mL)(a)和细胞毒性(log10相对细胞毒性单位(RCU)/ 艰难梭菌 CFU)(c)虚线表示在调制阶段暴露于克林霉素。b,d OTU与艰难梭菌生长(b)和细胞毒性(d)的 Pearson分析红色表示与艰难梭菌生长或细胞毒性呈负相关,而蓝色表示呈正相关。

几个群落特征与艰难梭菌的生长显着相关(图   3b)。观察到的独特OTU数量(社区丰富度)与艰难梭菌浓度呈负相关(Pearson's r = -0.49,p值<0.001)。两个个OTU与大多数显著负相关艰难C.增长分别柯林斯(OTU43;皮尔森r = -0.56,调整p-值<0.001)和毛螺(OTU7;皮尔森r = -0.53,调整p-值<0.001)(图。   图3b)。艰难梭菌生长最显着正相关的OTU 真细菌(OTU5; Pearson的r = 0.41,调整后的p值= 0.035)(图   3b)。与总体细菌多样性(香农指数)没有相关性。相关模式的详细介绍在补充图S2中可用   另外,我们报道,在低于2000 mg / L的浓度下,本研究中使用的PE均未对艰难梭菌的生长或细胞毒性表现出任何直接影响(补充图   S3)。

PE调节的微生物群落的一部分可降低细胞毒性,但不影响 艰难梭菌的 生长

通过在两种细胞系HT-29(对TcdA更加敏感)和Vero(对TcdB更加敏感)上进行测试来测量生物反应器上清液的细胞毒性。来自两个细胞系的测量值是相关的,尽管HT-29细胞系的值明显较低(图   3c)。艰难梭菌接种后两天,我们另外用ELISA测定法分别定量了TcdA和TcdB,结果与细胞毒性测定法一致(补充图   S4)。

毒素的活性与艰难梭菌的生长有关(HT-29和Vero的Pearson r分别为0.33和0.27,p值分别为0.001和0.009)。生物反应器除外,在该反应器中,微生物菌群与克林霉素一起暴露于石榴PE中(图   3c)。在这里,与在调制阶段暴露于克林霉素的其他治疗相比,每个艰难梭菌 CFU 的相对细胞毒性单位(RCU / 艰难梭菌 CFU)要低得多(p <0.001)。这表明艰难梭菌生长良好,但细胞毒性下降。使用Pearson相关测试,我们确定了与细胞毒性降低相关的OTU(图   3d)。我们发现,在图3d中列出的OTU中   梭菌(OTU22)或蓝藻(OTU16)的增加在最大程度上对应于生物反应器特异性细胞毒性的减少(补充图   S5)。

产孢 梭菌降低了毒素TcdA和TcdB的活性,但不影响 艰难梭菌的 生长

从生物反应器的内容,我们成功地分离出了四个与OTUs相对应的细菌菌株,这些OTUs与细胞毒性的降低有关。使用16 S rRNA基因测序(桑格方法),我们将它们鉴定为两个不同的产气荚膜梭菌菌株(MBRA菌株1和2),即产臭梭菌Blautia sp菌株,分别对应于梭状芽胞杆菌(OTU22),梭状芽胞杆菌 XIVa(OTU33)和蓝藻(OTU16)。

将分离的菌株与艰难梭菌共培养以测试其对艰难梭菌生长和细胞毒性的影响。梭菌菌株(MBRA菌株1)能够降低每个艰难梭菌 CFU 的毒素活性(p <0.001),而未观察到艰难梭菌生长的影响Blautia sp没有观察到这种效果C. oroticum(图   4)。我们还测试了7种不同的环境产梭菌菌株,并在所有情况下均观察到对艰难梭菌毒素TcdA和TcdB的抑制作用(补充图   S6)。

图4
图4

与不同细菌菌株共培养后,每个CFU的艰难梭菌细胞毒性。C. 孢子囊菌,C.oroticumBlautia sp从MBRA含量中分离菌株,同时使用梭状梭状芽胞杆菌大肠杆菌作为对照。菌株与艰难梭菌共培养进行了测试该图显示了每个艰难梭菌 CFU±SD(n = 3)的相对细胞毒性单位(病毒细胞)的平均值

讨论区

在本研究中,我们显示了MBRAs中人类粪便微生物群落的体外调节可以可复制的方式导致不同的艰难梭菌定殖相关结果。与我们的预期相反,PE的调节降低了对艰难梭菌的定植抗性艰难梭菌的生长以及毒素TcdA和TcdB的活性与复杂社区中的特定细菌群相关。此外,我们已经证明了产梭菌艰难梭菌毒素TcdA和TcdB 都有直接的抑制作用

蓝莓和石榴PE调制微生物群以不同的方式,这是仅部分地与先前公布的数据一致1821差异可能是由于不同的多酚提取物组成和浓度以及不同的微生物群落和生物反应器特性所致,从而使这些研究难以进行比较。与我们的期望相反,两种多酚都调节了微生物群落,使其对艰难梭菌的定殖性丧失先前已报道多酚对艰难梭菌生长的直接抑制作用16但是,以前没有关于艰难梭菌的研究在多酚调节的微生物群落中(体内体外定殖艰难梭菌无关,研究主要报道了多酚对共生菌群的有益作用13但是,我们的发现表明多酚可能对某些共生细菌群有不利影响,最重要的是与梭菌不同的代表

重要的方面是补充的多酚的浓度和递送方式。在我们的研究中,所用浓度的计算是相对于成年胃肠道的平均流明,每茶匙多酚提取物的每日摄入量的近似值。类似的浓度也过去被别人利用252627我们还以低剂量连续在培养基中连续提供多酚提取物,以免一次摄入日剂量。总体而言,很难在实验室条件下模拟多酚提取物的日消耗剂量。多酚提取物以及体内的进一步浓度和应用依赖性效应 因此,需要进行研究以确保在消费品中安全使用多酚。

两种多酚与克林霉素对不同的细菌群均表现出协同和拮抗作用,主要代表梭菌拮抗作用则鲜有报道282930协同效应是,在另一方面,更常见的和有趣的,因为潜在的感染治疗期间降低抗生素的剂量313233通常对常见病原体研究这些作用。但是,还应该对共生细菌群进行调查。影响共生梭状芽胞杆菌的不良协同效应在未来的研究中很有趣,因为它们有可能刺激易感人群中的病态发展。

微生物群落的发展是生物反应器特有的,在相同疗法的重复试验中也有所不同,如先前报道的[ 24]在引用的研究中,作者详细讨论了MBRA中社区的发展和稳定性,以及复制品之间差异的可能原因。然而,在我们的病例中艰难梭菌定植和细胞毒性相关的结局是治疗特异性的,细菌群落的关联非常重要。

的代表毛螺柯林斯被最显着地与抑制相关的艰难梭菌的生长,无论是在与先前报道的数据一致。Lachnospiraceae的成员被强调可以在异基因造血干细胞移植后保护患者免受CDI的侵害34,并且能够减轻无菌小鼠中CDI的相关症状35以前有报道称Collinsella在CDI患者中减少36此外,无论是毛螺柯林斯已知参与胆汁酸的生物转化373839尽管如此,可用的数据仍无法弄清在我们体外系统中观察到的与艰难梭菌生长相关的确切机制

先前报道的细菌和真菌介导的抑制艰难梭菌毒素9104041不包括生孢梭菌已经观察到由热敏感的次级代谢产物介导的毒素活性的抑制作用是德氏乳杆菌40,乳酸乳球菌41克劳氏芽孢杆菌10已显示产生丝氨酸蛋白酶的布拉氏酵母9(作为唯一的益生菌菌株以及与细菌益生菌菌株的组合)可有效预防原发性CDI 42但是,由于真菌病的风险较高,因此不建议孕妇和免疫力低下的患者食用益生菌和真菌43在这种情况下,共生细菌菌株(如孢子囊梭菌)可以提供更安全的选择。我们没有进一步检查观察到的活性的分子基础。

总之,微生物群暴露于蓝莓和石榴PEs导致对艰难梭菌的定植抗性降低需要将来的体内研究;然而,我们的结果表明,多酚是强大的微生物群调节剂,与克林霉素也表现出协同和拮抗作用,因此应作进一步研究以更安全地使用。尽管定植抗性下降,但石榴PE在某些情况下仍可能通过促进孢子囊菌的扩增而抑制艰难梭菌毒素的活性进一步显示,产梭菌可中和主要艰难梭菌毒素TcdA和TcdB 的细胞毒性

材料和方法

多酚提取物的制备

在提取过程开始之前,在斯洛文尼亚对成熟的蓝莓(Vaccinium myrtillusL.)进行采样,并在-20°C下保存7天。已经描述了该方法44并在此简要介绍。将冷冻的样品(50 g)在150 mL冰冷的脱氧甲醇中匀浆,然后先用氮气冲洗几分钟。通过在室温下在黑暗中摇动(Shaker EV403,Tehtnica,Zelezniki,斯洛文尼亚)提取匀浆3小时。离心提取物,并将上清液保存在-20°C。在室温下,在黑暗中,将沉淀物再次在100 mL脱氧甲醇中萃取2小时,然后将悬浮液离心。为了在多酚萃取后完全去除甲醇,首先将样品在Speed-Vac中干燥,然后在-80°C下冷冻并冻干。通过此步骤,我们可以完全去除有机溶剂。最后,将两个上清液合并,用氮气冲洗几分钟,然后保存在− 20°C直至分析44

在Istria(Marasi)的正常成熟期收获石榴(Punica granatum L.)果实。将石榴籽或假种皮从果皮和中果皮中分离出来。将石榴的不同部分(中果皮,假种皮榨汁和果皮)冻干并压成粉末45在这里,我们使用了干果皮中的乙醇提取物,该果皮是通过在70%乙醇中提取冻干粉状果皮四小时而制得的。将提取物离心并使用旋转蒸发和冻干干燥。将提取物保持在-20℃下直至需要。为了进行实验,将所有提取物溶解在蒸馏无菌水中,以避免酒精对微生物群的额外影响

微型生物反应器阵列(MBRA)实验设置

本研究中使用的MBRA设置设计和培养基制备在Auchtung 人中进行了详细介绍46重要的是,MBRAs允许同时运行24个独立的连续流生物反应器。生物反应器的内部容积为25毫升,工作容积为15毫升。MBRAs设置在厌氧气氛(5%CO2–5%H2–90%N2)中的厌氧室中,恒定温度为37°C。不断补充培养基,并以1.875 mL / h的流速清除废物。MBRA系统位于磁力搅拌板上,可在操作过程中不断搅拌生物反应器浆料。

生物反应器接种了来自两个受试者的粪便样本。这两个粪便样本是从一组18至65岁之间的匿名捐献者样本中随机选择的,这些捐献者自称是健康的,并且在过去6个月内没有服用抗生素。匿名捐赠者库中包括男性和女性捐赠者的样本。在Auchtung 等人的文章中介绍了接种前粪便样品的收集和制备24粪便样本的收集由密歇根州立大学的机构审查委员会审查并批准,所有研究程序均根据相关指南进行。所有捐献样品的个人在捐献之前均已获得知情同意。

接种后,将群落静置在MBRAs中稳定24小时(图   5a)。用同样的系统在先出版物确定基于在微生物多样性变化的24小时的期间是足够用于稳定24在流动开始之后,向生物反应器提供添加到BDM介质46中的调节因子的不同组合,从而导致8种独特的处理,每种处理均重复三次(图   5b)。反应器介质用磷酸盐缓冲液和5%CO 2缓冲/0.2%碳酸氢盐缓冲系统。先前的实验表明,该缓冲系统足以缓冲由于培养基中代谢的10倍过量的复杂碳水化合物的代谢而导致的pH值变化。抗生素克林霉素和两种多酚提取物(PE;蓝莓和石榴)被用作调节因子。没有研究在生物反应器的补充过程中培养基和调节因子的物理化学转化。克林霉素的终浓度为250 mg / L,蓝莓多酚提取物的终浓度为400 mg / L,石榴多酚提取物的终浓度为100 mg / L和400 mg / L。在dH 2中制备多酚提取物溶液O.在接下来的5天中与流动同时开始进行PE调节,而在接下来的4天中,在1天后开始使用克林霉素进行调节(图   5a)。

图5
图5

实验设计的示意图。一个与事件的实验的时间进程注意到在时间轴上。时间表下方的表格显示了在哪些时间点执行了不同的测试。b根据所使用的调节因子,设置24个生物反应器(8个独特的处理,一式三份)。

调节期后,向MBRAs提供BDM培养基2天(清洗期),以稳定群落并从生物反应器中清洗出调节因子。随后,我们将所有艰难梭菌培养物(CD2015;核糖型027)接种到所有生物反应器中,最终浓度约为10 5营养细胞/ mL。在接下来的7天中,定期对每个生物反应器进行采样。我们测试了艰难梭菌的生长,孢子形成和细胞毒性以及细菌群落组成(图   5a)。

我们没有测量供体粪便中多酚的基础浓度,也没有测量生物反应器中产生的多酚衍生代谢产物。

艰难梭菌 细胞浓度的测量

通过将生物反应器内容物的系列稀释液平板接种在含有50μg/ ml利福平和20μg/ ml红霉素的艰难梭菌选择性培养基TCCFA 上,确定菌落形成单位(CFU)的总数

细胞毒性试验,用于半定量测定 艰难梭菌 毒素TcdA和TcdB的活性

对HT-29细胞(对TcdA更敏感)和Vero细胞(对TcdB更敏感)进行了细胞毒性测试。将细胞系HT-29或Vero的冷冻培养物(-80°C)在水浴中(37°C放置5分钟)解冻。将内容物(1 mL)与5 mL新鲜培养基(DMEM(Gibco)+ 10%胎牛血清(FBS)在37°C)在细胞培养瓶(25 cm 2)中合并将细胞培养物在5%CO 2和37°C 下孵育单层形成后,将细胞用胰蛋白酶消化,并转移到装有9 mL DMEM(Gibco)+ 10%FBS的75 cm 2烧瓶中,并在5%CO 2下孵育和37℃。在准备用于检测的成熟细胞之前,将细胞离心(5000 rpm,5分钟),计数以确定浓度,并用新鲜DMEM(Gibco)+ 10%FBS稀释至终浓度5×10 4细胞/ mL。然后将悬浮液等分在96孔板中(每孔100μL),并在5%CO 2和37°C 下孵育24小时

首先将生物反应器内容物离心(20000 rpm,20分钟),然后过滤上清液(0.2μM过滤器,PES膜),以制备上清液。将上清液的五倍系列稀释液添加到形成的细胞单层中,并在5%CO 2和37°C 下孵育24小时

细胞毒性作用的得分确定如下:1)无细胞四舍五入效应(0分),2)从大约30%到70%的细胞被四舍五入(0.5分),以及3)超过70%的细胞的四舍五入(1分)。随后将每个分数用作基数10的指数,以获得相对细胞毒性单位(RCU)。

用商业测试检测艰难梭菌 毒素TcdA和TcdB

根据推荐的方案,每种毒素分别另外用TGC-E002-1试剂盒(tgcBIOMICS,德国)进行定量。根据标准稀释曲线确定每种毒素的浓度,该标准稀释曲线是使用试剂盒中提供的纯化毒素TcdA和TcdB获得的。

MBRA细菌群落的16S rRNA基因测序

将MBRA含量的样品(1 mL)以14000 rpm离心1分钟以获得沉淀,将其保存在-80°C下直至进一步使用。使用改良的方案,用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)提取总DNA。使用360μL缓冲液ATL重悬沉淀,并在MagnaLyser(Roche)中以7000 rpm匀浆70 s。接下来,添加40μL蛋白酶K,然后在55°C孵育1小时。在下一步中,添加200μL缓冲液AL,然后在70°C孵育30分钟。加入200μL96–100%乙醇后,将内容物转移到柱管中,后续步骤遵循QIAamp DNA Mini试剂盒中提供的规程。提取的DNA储存在-80°C,直至进一步使用。

通过对16 S rRNA基因的V3V4可变区测序来确定细菌群落结构。使用引物对Bakt_341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')-Bakt_805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')(约460 bp片段47),根据16 S元基因组测序文库制备(Illumina)方案制备文库在Illumina MiSeq平台上进行测序(配对末端测序,2×300 bp)。

序列数据分析和统计

遵循Kozich 等人推荐的协议,使用mothur(v.1.36.1)48进行了质量过滤49使用席尔瓦参考碱(第123版)进行比对。使用mothur实现的UCHIME算法识别嵌合体。使用mothur实施0.80引导值的RDP训练集(第12节)来推断分类法。

我们总共获得了7576427个读数(最小值:14453,最大值:81825,每个样本的平均值:39460.56)。我们删除了总体丰度低于0.01%的读物,并使用以mothur进行的随机采样将每个样品的读物数量稀疏到14000个。

进行了下游分析(含硫)(α多样性指数(Shannon指数,Shannon均匀度指数的计算),β多样性指数(Bray-Curtis和AMOVA测试)和总体水平分析(线性判别分析效应大小,LEfSe)50。是在R环境(版本3.1.3)51中使用软件包“ vegan” 52执行的,除了图   5是在PowerPoint(Microsoft)中创建的,所有图形演示都是在R环境中使用“ ggplot2” 53软件包进行的

测试不同菌株对 艰难梭菌 生长和细胞毒性的影响

测试中使用了三种艰难梭菌菌株,均属于027型核糖体其中包括用于MBRA实验(CD2015)的艰难梭菌菌株和来自NLZOH收集的两种菌株(ZZV12-4777和ZZV14-5907)。将艰难梭菌菌株与成功从生物反应器内容物中分离出的四种菌株进行了测试。其中包括两个产梭菌菌株,C。oroticumBlautia sp。株。用整个16 S rRNA基因的Sanger测序进行鉴定。根据以前发表的协议,在Applied Biosystems 3500系列遗传分析仪(Thermo Fisher Scientific)上,使用通用细菌引物对27fevb(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')-1495revb(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')进行Sanger测序。54随后将序列与MiSeq读数进行比较。高度确定地,我们能够证明这些菌株分别对应于梭状芽孢杆菌(OTU22),梭状芽孢杆菌 XIVa(OTU33)和蓝藻(OTU16)。通过在OD 600 nm处的吸光度测量来确定所有测试菌株的生长曲线。

在6孔板中以5 mL工作体积进行共培养测定。体外艰难梭菌菌株和所研究的细菌菌株(C. sporogenes,C。oroticumBlautia sp。)(50μL)的过夜培养(24 h)添加到5 mL厌氧Wilkins-Chalgren Anaerobe肉汤中(WCAB)。在厌氧气氛下于37°C孵育24小时后,我们采样了1 mL。通过将连续稀释液铺在艰难梭状芽胞杆菌(BioMerieux)上进行总CFU计数如上所述进行细胞毒性测定,但是仅在细胞系Vero上进行。

艰难梭菌菌株和9个生孢梭菌菌株另外测试了无细胞的作用生孢梭菌上上清液艰难梭菌毒素的TcdA和TcdB的。从生物反应器浆液中分离了两个孢子虫菌株(MBRA菌株1和2),而从NLZOH收集物中获得了七个。艰难梭菌菌株培养过夜(24小时)。培养48小时后取样孢子囊芽孢杆菌菌株。样品经过过滤灭菌(PES膜,0.2μM,Sarstedt)。艰难梭菌/ C。的组合 孢子原将上清液(体积比为1:1)在厌氧条件下于37°C摇动孵育12小时。TcdA和TcdB毒素活性通过ELISA测试(TGC-E002-1,tgcBIOMICS)进行定量测量。

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