肿瘤发展所需要的肿瘤形成的可塑性，从而使癌细胞获得干细胞样特性，这代表了主要的治疗挑战。我们报道，在乳腺癌细胞中，NANOG，SNAIL和NODAL转录本表现出以不同的5'非翻译区（5'UTR）为特征的多种同工型，从而在缺氧条件下刺激了这些同工型的一个子集的翻译。相应蛋白质的积累诱导了可塑性和向干细胞样表型的“命运转换”。从机理上讲，我们观察到mTOR抑制剂和化学治疗剂可诱导NANOG，SNAIL和NODAL子集的翻译激活mRNA与缺氧相似，形成干细胞样表型。通过拮抗由eIF2α磷酸化引起的翻译重编程的药物（例如ISRIB）可以克服这些影响，这表明综合应激反应可驱动乳腺癌的可塑性。总体而言，我们的发现揭示了诱导乳腺癌细胞可塑性的机制，并为旨在克服耐药性和消除转移的治疗策略提供了分子基础。
超过20％的乳腺癌患者会因治疗耐药性和转移而死亡。这两个过程都需要癌细胞适应诸如缺氧或化学疗法等压力。这种适应性可以通过增加乳腺癌细胞富集乳腺癌细胞的干细胞样特征（BCSC）的可塑性介导1，2。
缺氧诱导乳腺癌细胞的可塑性和干细胞样表型的3，4，5。虽然这个过程是知之甚少，报告表明，缺氧诱导的干细胞性因子包括NANOG，SNAIL，和NODAL表达式6，7，8。此外，干细胞样表型和干因子的高表达都与转移扩散和化学抗性有关1。缺氧导致蛋白质合成的能量节约减少，这是通过抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物/机制靶标和诱导未折叠的蛋白质反应9的综合应激反应（ISR）介导的。，10，11。mTORC1抑制通过eIF4F复合物装配体（eIF4E：eIF4G：eIF4A）4E-BP依赖性抑制作用，减少了向核糖体的mRNA募集12。EIF2α磷酸化，ISR的标志，减少了三元复合物（eIF2：tRNAiMet：GTP）回收，从而限制了引发剂tRNA的传递13。尽管蛋白质合成减少，但某些mRNA仍优先翻译，这要归功于其5'非翻译区（5'UTR）的功能，例如上游开放阅读框（uORF）14。这些途径共同驱动适应性应激反应，节省能量，同时能够表达包括ATF4在内的生存因子15。新兴数据表明，mTOR抑制和eIF2α磷酸化促进干细胞样表型。例如，mTOR抑制通过激活4E-BPS促进神经干细胞的自我更新16，17和eIF2α的磷酸化是在卫星细胞维持自我更新的和人类胚胎干细胞至关重要的18，19。这些研究表明，翻译重编程可能调节干细胞相关的可塑性，但是该过程在BCSC表型获得中的作用仍然难以捉摸。
在本文中，我们证明乳腺癌细胞具有NANOG，SNAIL和NODAL的多种转录同工型，它们的5'UTR不同，其中一些在低氧状态下显示优先翻译，从而促进蛋白质表达的增加。该翻译诱导的干细胞程序导致BCSC表型的获得。像缺氧一样，mTOR抑制和化学治疗剂也通过翻译重编程诱导可塑性。最后，我们证明，抑制与所述ISR 我 ntegrated 小号绺ř esponse 我 NHI 乙itor（ISRIB）阻碍采集的干细胞样表型和乳腺癌细胞的治疗的抗性。
干细胞相关蛋白质，包括NANOG，SNAIL，和NODAL，已经显示出诱导上皮至间质转变（EMT），并与在乳腺癌患者不良预后相关20，21，22，23。NANOG和SNAIL还可诱导BCSCs 20，21，24 ; 但是，尽管只有一份报告25，但NODAL在诱导乳腺癌干样表型中的作用尚不明确。由于NODAL可能与SNAIL和NANOG等因素合作，以支持可塑性和诱导茎样特性26，我们调查了NODAL是否诱导BCSC表型。我们采用了广泛用于BCSCs官能读数，如单细胞球形成测定27，28和流量CD44高/ CD24low细胞的流式细胞术监测2，29（选通在补充图 7）。重组人NODAL（rhNODAL）增加了腔样T47D和MCF7细胞的球形成（图 1a；补充图 1a），并丰富了MCF7，T47D和三阴性SUM149细胞中CD44high / CD24low细胞的数量（补充图 1b–d）。NODAL在富含BCSC的3D培养物中上调（图 1b），并用激活素受体样激酶（ALK）抑制剂30（SB431542，1μM ）抑制NODAL耗尽或NODAL信号转导减少了MDA-MB-231细胞的球形成（图 1c，d）。这些数据证实了NODAL在代表腔样和三阴性乳腺癌亚型的细胞系中促进了BCSC表型。
a相对于未处理的细胞（n = 3），由用rhNODAL处理的T47D细胞（0、50、100 ng / mL）形成的平均球数。b MDA-MB-231细胞的NODAL免疫印迹：2D单层，3D生物反应器和在超低附着（ULA）平板中生长的肿瘤球。表达shRNA agianst NODAL（shN）或对照（shC）的细胞，β-肌动蛋白是负载对照。由表达NODAL shRNA的MDA-MB-231 c在暴露或未暴露于rhNODAL（100 ng / mL）或d暴露于SB431542（1，10μM）的情况下形成的平均球体（n = 3）。e 具有代表性图像的来自960个T47D细胞的平均球体预先暴露于24小时缺氧或常氧（n = 3）。微米棒= 250μm。F缺氧或常氧24小时后，CD44 高 / CD24 低 T47D细胞的平均百分比（n = 3）。定义CD44和CD24亚群的代表性散点图。在常氧或低氧条件下培养48小时的T47D细胞的g RNAseq基因集富集分析。EMT基因的热图表明低氧上调（n = 3）。h由960个T47D细胞形成的平均球，这些细胞预先暴露于缺氧或常氧的24 h±SB431542（10μM）中，并具有代表性图像（n = 3）。微米棒= 500μm。i在缺氧处理的（0-24 h）T47D细胞中，平均NODAL转录本拷贝数qRT-PCR与已知标准和蛋白质水平（免疫印迹）的关系（n = 3）。Ĵ SNAIL转录平均log 2倍变化（QRT-PCR）和缺氧处理的SUM149细胞（0，6小时）（蛋白质水平（免疫印迹）ñ = 3）。k T47D细胞在低氧与正常状态下的多核糖体图谱和整体翻译。平均百分比与多核糖体相关的mRNA（> 3个核糖体）。l在k和m多核糖体相关的RPLPO，VEGF中使用的T47D细胞中，多核糖体相关的EEF2，RPLPO，VEGF和ATF4 mRNA 比率的平均log 2倍变化，与20％O 2（n = 3）一起培养1小时24小时的H9 hESC中的ATF4，NANOG，SNAIL和NODAL mRNA水平。Ñ 4E-BP，在使用从T47D细胞RPS6和eIF2α的磷酸化的免疫印迹ķ。4E-BP1，rpS6，eIF2α和β-肌动蛋白负荷对照和低氧阳性对照VEGF。缺氧表示为红色，常氧表示为蓝色。数据代表独立实验。误差棒表示平均值±SD。配对样本的双面t检验。星号表示p值 <* 0.05，** 0.01，**** 0.0001。通过ANOVA测试的多个比较。相同的字母表示与p的关系 ≥0.05。不同的字母表示统计差异（p <0.05）。
缺氧被认为可以增加癌细胞的可塑性，丰富BCSC表型。因此，我们调查了NODAL在缺氧诱导的可塑性中的作用。T47D和SUM149细胞在缺氧条件下维持24小时。我们观察到缺氧相关的肿瘤球形成增加，以及CD44high / CD24low细胞增加而细胞活力未降低（图 1e，f；补充图 1e），表明低氧诱导BCSC。此外，在20％或1％O 2中培养48 h的T47D细胞的RNA测序表明，低氧还具有EMT信号（图 1g；补充表 1）。）。最后，SB431542处理消除了T47D和SUM149细胞中低氧诱导的球体形成，证实了NODAL在管腔和三阴性乳腺癌细胞系中响应低氧而促进了可塑性（图 1h；补充图 1f）。
为了研究缺氧如何在乳腺癌细胞中诱导干细胞相关蛋白（如NODAL），我们检查了缺氧持续0-24小时的T47D细胞中NODAL蛋白和mRNA表达。NODAL蛋白水平在缺氧的6至24小时（1％O 2）之间增加了2至3倍，而NODAL mRNA水平在3 h时降低并在24 h时部分恢复（图 1i；补充图 1g）。在SUM149细胞中，观察到SNAIL mRNA和蛋白质水平之间存在相似的不一致（图 1j）。在T47D细胞中，SNAIL和NANOG蛋白水平的增加似乎超过了其转录本的上调（补充图 1h））。这些发现强烈表明，在缺氧条件下，NODAL，SNAIL和NANOG蛋白表达受到翻译调控。
为了评估翻译，我们采用了多核糖体分析，通过蔗糖梯度超速离心法将有效翻译与无效翻译的mRNA分开31。如其他系统[ 11]，[ 32 ]所报道的那样， 24小时缺氧治疗导致T47D，MCF7和H9细胞的整体翻译降低40-90％（图 1k，补充图 1i，j）。使用数字液滴RT-PCR（ddPCR）比较总和有效翻译的mRNA片段（与> 3个核糖体相关），我们评估了缺氧条件下已知翻译抑制或诱导的mRNA的多体分布14。预期地，在T47D细胞中，低氧减少了含有真核延伸因子2（EEF2）和核糖体蛋白，大的P0（RPLPO）mRNA 的5'末端寡嘧啶（TOP）的翻译（图 1l），同时增强了活化转录因子4的翻译（ ATF4）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA（图 1l）。在hESCs中，NANOG，NODAL和SNAIL mRNA 的翻译在缺氧条件下持续或增加，类似于VEGF和ATF4且与RPLPO相反（图 1m）。通过调节mTOR和ISR信令应力等原因缺氧自适应平移重编程33，34，35，36。免疫印迹证实，在T47D细胞中，低氧会降低mTORC1活性-表现为eIF4E结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白S6（rpS6）（1％O 2； 24 h）的磷酸化降低，同时诱导了ISR，如增加eIF2α磷酸化（图 1n，补充图 1k）。VEGF蛋白同时上调（图 1n，补充图 1k）。类似的结果，证实缺氧通过抑制mTORC1诱导翻译重编程，并且在MCF7和H9-hESC细胞中观察到eIF2α磷酸化，其中总4E-BP1的电泳位移表明磷酸化降低，与eIF2α磷酸化增加相吻合（补充图 1l）。 。这些结果表明，与ISR诱导的ATF4或帽独立翻译的VEGF转录本的翻译相似，缺氧条件下编码干性因子的mRNA NANOG，NODAL和SNAIL的翻译上调。
为了确定低氧条件下维持SNAIL，NODAL和NANOG mRNA 的翻译的机制，我们使用了RefSeq和可公开获得的CAGE数据，并结合5'RACE来检查其5'UTR，因为翻译效率主要取决于5' UTR功能14。我们发现NODAL，SNAIL和NANOG基因包含多个转录起始位点（TSSs），这导致mRNA的同工型在其5'UTR中不同，但在其编码序列中却没有差异（图 2a–c）。在NANOG基因座中，我们验证了先前描述的350个核苷酸（nt）5'UTR 37以及另一种291 nt 5'UTR（图 2a）。我们在SNAIL基因座中观察到两个TSS ：一个产生417 nt 5'UTR，另一个产生85 nt 5'UTR（图 2b）。在NODAL基因座中，有四个5'UTR，分别由14、42和298和416 nt组成（图 2c）。我们假设具有相同ORF但5'UTR不同的多种mRNA亚型的可用性可能在压力（例如缺氧）和非压力条件下都促进了NANOG，SNAIL和NODAL的翻译。这些5'UTR中的某些可以进行选择性翻译，而在不干扰翻译的情况下，其他功能则更具功能。这与单同工型mRNA（例如ATF4）形成对比在非压力条件下会被翻译抑制，并在压力下优先翻译。为了研究缺氧条件下NODAL，SNAIL和NANOG亚型是否被差异翻译，将在20％或1％O 2中培养24小时的MCF7细胞进行分级分离，以获得与单核小体，轻和重多核小体相关的mRNA（补充图 2a）。然后使用同工型特异性qRT-PCR确定与每个馏分相关的转录物百分比。作为在ISR和缺氧期间选择性翻译的转录本的阳性对照38，我们证实了ATF4和VEGFA转录物在低氧培养的对比含氧量正常的细胞（补充图朝着重的多核糖体移位 2 B和C ^）。相反，在低氧条件下，β-ACTINmRNA被翻译抑制（补充图 2d）。5'UTR mRNA同工型显示差异反应。在缺氧状态下，NANOG 350 mRNA同工型的翻译得以维持，但相对于常氧，在缺氧状态下，NANOG 291 mRNA同工型被翻译诱导了（图 2d）。反过来，与较短的5'UTR异构体相比，较长的SNAIL mRNA异构体在缺氧条件下的翻译效率较低（图 2e））。最后，在缺氧条件下，NODAL 298和416 5'UTR mRNA的翻译效率比较短的（42和14 nt）同工型更高（图 2f）。这些发现提出了一种翻译调节模型，其中具有不同5'UTR特征的mRNA亚型可在缺氧条件下实现NANOG，SNAIL和NODAL蛋白的翻译和相应的积累。
A-C所述的图表一个 NANOG，b SNAIL，和Ç NODAL基因座显示多个转录起始位点（深绿色，白色箭头），从而导致多个5'UTR序列（黑色）。虚线表示拼接事件。蓝色矩形代表ORF，亮绿色条代表翻译起始位点。d-f的 mRNA异构体d NANOG，ë SNAIL，和˚F NODAL与mononsomes，低MW多核糖体，并从用于低氧或含氧量正常培养24小时的MCF7细胞中提取高MW的多核糖体相关联。条形代表在每种情况下与每个分数相关的转录本的平均百分比±SD（n = 3，NODAL n = 4）。线和星号（*）表示条件之间的显着差异（p <0.05）。用p5'UTR萤火虫构建体转染的细胞中的g–i荧光素酶活性具有g NANOG（n = 4），h SNAIL（n = 3）或i NODAL（n = 4）的各种5'UTR，然后暴露6次h为常氧或低氧。条形代表相对于常氧±SD的低氧条件下的平均荧光素酶活性。不同的字母h的统计值不同，并且g和i中以星号（*）表示的值在统计上与控制值不同，但彼此之间没有差异（p <0.05）。j p5'UTR萤火虫构建体转染的带有野生型或uORF1突变的ATF4 5'UTR的荧光素酶活性，然后暴露于常氧，毒胡萝卜素（TG; 0.1μM）或低氧6小时。条形代表相对于暴露于常氧±SD的细胞的平均荧光素酶活性。星号（*）表示的值在统计上与野生型5'UTR不同（p <0.02，n = 3）。ķ用p5'UTR萤火虫构建体转染的细胞中的荧光素酶活性具有野生型或uORF突变的NODAL 298 5'UTR，然后暴露于常氧或低氧6小时。条形代表相对于暴露于常氧±SD（n = 3）的细胞的平均荧光素酶活性。误差棒表示平均值±SD。配对样本的双面t检验。星号表示p值 <* 0.05，** 0.01。通过ANOVA测试的多个比较。同样的字母表示有关系p ≥0.05。不同的字母表示统计差异（p <0.05）。
为了进一步测试该模型，我们将NANOG，SNAIL和NODAL的每个5'UTR克隆到p5'UTR萤火虫构建体39中，转染细胞，将其暴露于20％或1％O 2中，然后测量荧光素酶活性。这些报告基因检测可作为内源同工型表达的替代物，可对每个5'UTR进行分析，而在编码区或3'UTR中没有潜在的混杂元素。根据多核糖体谱分析数据，NANOG的两个5'UTR都在缺氧时促进了翻译，而较短的SNAIL 5'UTR则比较长的SNAIL 5'UTR促进了翻译（图 2g，h）。我们还发现416和298 nt的NODAL 5'UTR在缺氧条件下的翻译效率比42 nt或14 nt的5'UTR更高（图 2i）。）。298和416 nt的NODAL 5'UTR分别包含一个和四个推定的uORF。由于416nt 5'UTR的复杂组织和剪接，我们检查了NODAL 298中单个uORF的功能（补充图 2e）。ATF4是行之有效的作为在一uORF依赖性方式ISR期间平移激活的mRNA的39，40，41。uORF1的起始密码子的突变废除抑制uORF2的ISR介导的超控，并且允许的优先翻译主ORF 39，40，41。为了分析NODAL 298 uORF赋予的翻译调控，我们用携带野生型或uORF突变NODAL 298 5'UTR以及野生型或uORF1突变ATF4 5'UTR 39的p5'UTR萤火虫构建体转染了细胞。如预期的那样，缺氧和毒胡萝卜素（TG，100 nM，作为ISR的阳性对照）均增强了表达ATF4 5'UTR构建体的细胞中的萤光素酶活性，并被uORF1突变消除了这种活性（图 2j）。与ATF4 5'UTR相似，缺氧增强了NODAL 298 5'UTR的翻译，并且当uORF发生突变时，这种作用减弱了（图 2k）。）。但是，值得注意的是，在NODAL 298中，uORF的功能与ATF4中的不同，因为它在无压力的常氧条件下具有明显的促翻译功能。低氧条件下的NODAL表达是通过选择性翻译含有5'UTR的较长uORF的亚型而实现的。这种翻译调节模式不同于ISR下ATF4的翻译激活。ATF4具有单个同工型，可通过延迟的重新启动来激活，而NODAL则不同地利用具有同工型的特定uORF进行有效翻译。与NODAL相反，SNAIL和NANOG的 5'UTR异构体更短，似乎没有假定的uORF，在缺氧条件下比较长的对应物更有效地翻译。这种差异可以通过转换较短且不太复杂的5'UTR所需的较低能量要求来解释。这些结果表明，NANOG，SNAIL和NODAL mRNA的同工型特异性翻译导致缺氧时它们的表达增加，尽管特定5'UTR特征调节其翻译的机制不同。
我们的结果表明，低氧可能通过选择性翻译驱动NANOG，SNAIL和NODAL蛋白质的合成而增加BCSC表型。从机制上讲，发生选择性翻译是因为NANOG，SNAIL和NODAL具有多个5'UTR，其中一些在整体蛋白质合成抑制过程中被翻译。因此，我们假设mTOR抑制（抑制蛋白质合成并诱导eIF2α磷酸化）可能诱导BCSC，并伴随着NODAL，NANOG和SNAIL的特定5'UTR亚型的选择性翻译（如图3a所示）。 ）。为此，我们研究了活性位点mTOR抑制剂INK128和ISRIB对整体和mRNA同工型（NODAL，SNAIL和NANOG）特异性翻译的影响。将在媒介物ISRIB（10 µM），INK128（INK; 20 nM）或INK128 + ISRIB中培养的MCF7细胞分级分离24小时，以获得与单核小体，轻和重多核小体相关的mRNA。INK128减少了整体蛋白合成，同时抑制了mTORC1和ISR活化，分别通过降低4E-BP1和rpS6磷酸化以及提高eIF2α磷酸化来说明（图 3b；补充图 3a-d）。ISRIB抵消TC回收的磷酸化eIF2α的依赖性抑制通过加强eIF2B GEF活性42，43; 然而，与ISRIB的共处理并不能减轻因INK128而引起的翻译的整体减少（图 3b）。为了确定mRNA亚型的利用率是否发生改变，然后使用亚型特异性qRT-PCR确定与每个馏分相关的转录物百分比。作为ISR驱动的选择性翻译的对照，我们确认了在与对照相比，INK128培养的细胞中，ATF4 mRNA向着重多核糖体转移。ISRIB协同治疗逆转了该翻译上调（图 3c），证实ISRIB靶向mSR抑制的ISR介导作用。类似缺氧的影响，INK128诱导的移位NANOG 291 mRNA中同时的翻译效率重多核糖NANOG350 mRNA略有减少（图 3d）。同样，较短的5'UTR SNAIL同工型转变为重的多核糖体，而较长的5'UTR SNAIL mRNA同工型的翻译得以维持（图 3e）。最后，在mTOR抑制下，NODAL 298和416 5'UTR mRNA的翻译效率得以维持或提高（图 3f）。像在缺氧中一样，当抑制mTOR时，可供选择的5'UTR的可用性使NANOG，SNAIL和NODALmRNA 的翻译成为可能。重要的是，我们还确定ISRIB可以减轻这些mRNA亚型的选择性翻译（图 3d–f）。总体而言，这些结果表明，mTOR抑制通过特定5'UTR亚型的ISR依赖性选择性翻译，促进编码干细胞因子（如NANOG，SNAIL和NODAL）的mRNA的翻译。
图1是工作模型的示意图，其中缺氧导致mTOR活性降低和整合应激反应（ISR）的激活，这通过eIF2α磷酸化来表示。翻译机制的这些改变导致整体蛋白质合成的减少，以及包含特定5'UTR功能（包括uORF）的NANOG，SNAIL和NODAL的mRNA亚型的一部分的选择性翻译。下面介绍的实验旨在测试mTOR抑制（用INK128处理）是否可以复制缺氧期间观察到的现象，以及ISRIB是否可以减轻这些影响。b来自暴露于媒介物（DMSO），MLN0128 / INK128（INK; 20 nM），ISRIB（10 nM）或INK + ISRIB 24小时的MCF7乳腺癌细胞的裂解物的多核苷谱和免疫印迹分析表明，INK降低了整体翻译（INK和ISRIB + INK p <0.01）伴随着4E-BP1和rpS6磷酸化降低以及eIF2α磷酸化增加。这些读数不受ISRIB的影响。总的4E-BP，rpS6和eIF2α水平不变。β-肌动蛋白被用作上样对照。f NANOG，e SNAIL和f NODAL的c ATF4 mRNA和d–f mRNA亚型 与来自b的 MCF7细胞裂解物的单核小体，低分子量多核糖体和高分子量多核糖体相关。条形代表在每种情况下与每个分数相关的转录本的平均百分比±SD（n = 3）。误差棒表示平均值±SD。通过ANOVA测试的多个比较。星号表示与对照治疗相比p值 <* 0.05，** 0.01。通过ANOVA测试的多个比较。同样的字母表示有关系p ≥0.05。不同的字母表示统计差异（p <0.05）。
mTOR抑制剂在乳腺癌患者中的临床试验显示有限的生存获益44。缺氧会降低mTOR活性（图 1n），并在乳腺癌细胞中诱导可塑性和干细胞样表型（图 1e–g）。此外，像缺氧一样，mTOR抑制作用可选择性翻译NANOG，SNAIL和NODAL mRNA亚型（图 3）。因此，我们调查了mTOR在诱导干细胞样表型中的作用。与对照细胞相比，用mTOR抑制剂INK128（INK; 20 nM）处理1–24 h的T47D和MCF7细胞在6至12 h内两倍上调了NODAL蛋白水平（图 4a；补充图。 4a）。在T47D，MCF7和SUM149细胞中，INK128以与rhNODAL（100 ng / mL）相同的程度增加了球形成频率和不依赖于锚定的生长，被用作阳性对照（图 4b，c；补充图。 4b–e）。与SB431542（10μM）共同处理可减轻INK128诱导的球形成和锚定非依赖性生长，提示NODAL信号传导介导INK128对BCSC表型的影响，而与乳腺癌亚型无关。一致地，INK128增加了T47D，MCF7和SUM149细胞系中CD44high / CD24low细胞的百分比。SB431542阻止了这种增加（图 4d；补充图 4f，g）。BCSCs的特征还在于干细胞标记物（如NANOG和OCT4）的表达，并且典型地经历了EMT 1。相对于媒介物处理的对照细胞，INK128在T47D和SUM149乳腺癌细胞中诱导干细胞样EMT签名（图 4e，f；补充图 4h，i）。恢复24小时后，这种效果的维持表明，INK128可能诱导重编程，从而增强可塑性并维持乳腺癌细胞中的干细胞样特性。考虑到干细胞样特性与转移之间的紧密联系，我们用INK128处理乳腺癌细胞24小时，通过尾静脉将其注入小鼠肺部，然后在8周后使用HLA染色定量转移。该模型用作限制稀释试验的一种形式，因此可以确定肿瘤起始频率（如每注射的细胞数形成的转移灶数量），而不会混淆可能导致肿瘤发生的变量（例如较大肿瘤生长所需的血管生成改变）。影响皮下有限稀释法的解释。使用这种方法 4克）。
从0到24 h INK 20 nM处理过的T47D细胞（n = 3）进行 NODAL免疫印迹。b 带有代表性图像的960个预暴露于DMSO，INK（20 nM），rhNODAL（100 ng / mL）或INK + SB431542（10μM）的T47D细胞的平均球数24小时（n = 4）。微米棒= 250μm。c按b进行培养的T47D细胞的集落数平均倍数变化（n = 3）。d用DMSO，INK或INK + SB431542处理的CD44 高 / CD24 低 T47D细胞的平均百分比（n = 6），具有代表CD44和CD24亚群的代表性散点图。e平均记录2相对于DMSO 或INK（20 nM）的NANOG，SOX2，OCT4，TWIST，ZEB1，SNAIL，VIM转录本的DMSO qRT-PCR 进行24倍或24小时INK的倍数变化，然后用24 h培养基处理过的T47D细胞（n = 3） 。f在24 h DMSO或INK（20 nM）处理的T47D细胞中，NANOG，OCT4和SNAIL的免疫印迹分析。g尾静脉注射经过预处理的SUM149细胞后8周（用DMSO或INK（20 nM）注射24 h）（n = 10）后，小鼠肺集落具有代表性的肺集落图像（棕色）。h每两天接受DMSO或INK（30 mg / kg）的小鼠持续两周的平均PDX401肿瘤体积。箭头指示停止治疗（n = 8）。一世 具有代表性图像的h（DMSO n = 6，INK n = 7）终点肿瘤的96,000个PDX401细胞的平均球数。微米棒= 500μm。j用4E-BP1 shRNA，shRNA加扰（SCR）对照，4E-BP1 ORF或空载体转染的T47D细胞的NODAL和4E-BP1免疫印迹。k用j（n = 3）中描述的96个T47D细胞的平均第一代和第二代球体计数以及代表性图像。微米棒= 250μm。l Kaplan–Meier图：4E-BP1 RNA-Seq表达与1100例乳腺癌患者样本的存活率相关（5.4岁，p = 0.0187）。肿瘤与健康组织中的4E-BP1 RNA-Seq转录本丰富度（正常，n = 113；肿瘤，n = 1062；p = 2.2×10 -16）。数据代表独立实验。误差棒表示平均值±SD。箱须图表示中位数，IQR，须晶延伸到最大值和最小值。配对样本的双面t检验。星号表示p值 <* 0.05，** 0.01。通过ANOVA测试的多个比较。同样的字母表示有关系p ≥0.05。不同的字母表示统计差异（p <0.05）。
为了确定mTOR抑制作用是否会增加已建立的异质性肿瘤中干细胞样细胞的数量，我们用INK128（30 mg / kg，每隔第二天从2天内开始）对携带三阴性乳腺癌患者源性异种移植物（PDX401）的小鼠进行治疗肿瘤直径达到5毫米）。免疫组织化学（IHC）分析证实，phopsho-4E-BP1水平与缺氧呈负相关[由碳酸酐酶9（CA9）描绘]，并且在用INK128处理的小鼠中被下调（补充图 4j）。给予INK128不会改变肿瘤的生长，而在停药后实际上会增加（图 4h））。而且，从用INK128治疗的动物中生长的肿瘤解离的癌细胞比用媒介物治疗的癌细胞具有更高的BCSC频率（图 4i）。总体而言，这些数据提供了强有力的证据，证明mTOR抑制可在体内诱导乳腺癌细胞的可塑性和干性。
为了确定调节mTOR下游的翻译机制是否调节NODAL表达，我们改变了4E-BP1- mTOR 在T47D和MCF7细胞中抑制翻译的主要介质45的表达。4E-BP1过表达增加了两种细胞系中的NODAL水平（图 4j；补充图 4k）。NODAL水平相对不受4E-BP1敲低的影响，这可能是由于NODAL的基础水平较低以及与4E-BP2和4E-BP3表达相关的冗余所致。重要的是，4E-BP1过表达也增加了球的形成（图 4k；补充图 4l）。先前的研究表明，乳腺肿瘤中4E-BP1的水平很高，并且4E-BP1可能参与了与缺氧相关的翻译重编程38。因此，对来自TCGA中的1100名乳腺癌患者的RNA测序数据的分析表明，在原发性肿瘤中高水平的4E-BP1预示了诊断后的前5年的不良存活（图 4l）。
缺氧11，41和急性mTOR抑制46，47已被显示增强eIF2α的磷酸化。我们观察到缺氧（图 1n；补充图 1l）和mTOR抑制作用会在24小时后增加eIF2α磷酸化（图 3b）。INK128处理的持续时间较短（但不是媒介物对照），也会在T47D和SUM149细胞中引起eIF2α磷酸化增加约2倍（图 5a；补充图 5a，b）。在INK128存在下，有效翻译干细胞蛋白需要ISR激活（以eIF2α磷酸化标记）（图 3）。），因此我们试图确定ISR是否通常可以诱导干细胞蛋白（如NODAL）以及低氧诱导的干细胞样表型是否需要eIF2α磷酸化。首先，我们在T47D和MCF7细胞中用氮杂环丁烷-2-羧酸盐（AZE; 5 mM）激活了ISR 1-24小时。AZE在暴露后6小时内诱导NODAL蛋白水平升高了2到4倍（图 5b；补充图 5c）。接下来，我们耗尽了MDA-MB-231细胞中的内源性eIF2α，然后表达了野生型（WT）或非磷酸化突变体（S51A）48。S51AeIF2α突变体的表达阻止了响应TG（0.1μM; 6 h）的ATF4蛋白上调（图 5c；补充图 5d）。MDA-MB-231暴露于0.5％O2 24小时增加的干细胞相关的基因和球体形成频率表达在表达WT细胞而不是突变体eIF2α的（图 5D，E）。与WT细胞相比，由S51AeIF2α细胞生成的球体在正常氧状态下小70％，在缺氧状态下小90％（补充图 5e）。这表明eIF2α磷酸化是低氧诱导乳腺癌可塑性和干细胞样表型所必需的。
0、3或6 h INK（20 nM）处理的T47D细胞（n = 3）产生的 eIF2α-p，eIF2α和4E-BP1免疫印迹。b NODAL免疫印迹0-24小时AZE（5 mM）处理的T47D细胞（n = 3）。c用媒介物处理内源性eIF2α耗竭且稳定表达具有S51A突变的野生型eIF2α（WT）或HA标记的eIF2α的对照MDA-MB-231（EV）和MDA-MB-231细胞（敲入，KI）或TG。eIF2α-p和ATF4与eIF2α和β-Actin加载对照的免疫印迹。d在常氧或低氧条件下培养24 h的MDA-MB-231 WT（白色）和KI（黑色）中TWIST，ZEB1，SNAIL，VIM转录本的qRT-PCR定量的qRT-PCR定量的平均log 2倍变化（n = 3）。e相对于常氧MDA-MB-231 WT球（n = 3），具有代表性图像的MDA-MB-231 WT和KI预先暴露于缺氧或常氧24小时的平均球数（n = 3）。˚FeIF2α的-P，从24小时载体（DMSO），ISRIB（10纳米），INK128（20 nm）或Salubrinal（20μM）处理T47D细胞与β肌动蛋白和eIF2α的样对照（eIF2α的和NODAL免疫印迹Ñ = 3）。克平均log 2的倍变化NANOG和SNAIL通过qRT-PCR在Salubrinal处理T47D细胞（0，3，或与（20μM6小时））的mRNA水平（Ñ = 4）。H使用β-肌动蛋白和β-微管蛋白上样对照（n = 3）对经salubrinal（20μM）处理的0、3或6 h T47D细胞进行NANOG和SNAIL免疫印迹分析。i尾静脉注射SUM149细胞并用DMSO或Salubrinal（20μM）（n = 10）预处理24小时后，小鼠肺集落有8周，并显示代表性的肺集落图像（棕色）。j每隔第二天治疗2周的小鼠的平均SUM149肿瘤体积（DMSO，INK（30 mg / kg）或INK + ISRIB（2.5 mg / kg））。箭头指示停止治疗（p <0.01，n = 7）。k平均球数来自96,000个SUM149细胞，其与j（n = 12），并具有代表性球体图像。微米棒= 500μm。数据代表独立实验。误差棒表示平均值±SD。箱须图表示中位数，四分位间距（IQR），晶须延伸到最大值和最小值。配对样本的双面t检验。星号表示p值 <* 0.05，** 0.01。通过ANOVA测试的多个比较。同样的字母表示有关系p ≥0.05。不同的字母表示统计差异（p <0.05）。
为了证实这些发现，我们用唾液碱（通过抑制PP1 / GADD34增加磷酸化eIF2α）将T47D乳腺癌细胞处理了24小时，然后测量了干细胞和EMT标记物的表达。salubrinal（10μM）诱导T47D细胞中的NODAL蛋白水平（图 5f；补充图 5f）。相反地，NODAL水平通过ISRIB（10nm）的，其允许ISR诱导期间高效TC甚至循环降低42，43（图 5F ;补充图 5F）。使用qRT-PCR和免疫印迹，我们确定与媒介物相比，salubalinal（长达6小时的处理）诱导了SUM149细胞中的NANOG和SNAIL蛋白，但不诱导mRNA（图 5g，h; 补充图 5g，h）。作为体内延伸，我们将SUM149细胞暴露于salubrinal中24 h，然后通过尾静脉将其注入小鼠肺部。我们在8周后使用HLA染色对转移进行了量化，并确定预先暴露于salubrinal会增加转移菌落的起始，类似于对INK的观察到的转移（图 5i和 4g），这表明mTOR和ISR串扰促进了乳腺的出现。癌细胞可塑性。
为了评估BCSC表型获得过程中的mTOR和ISR串扰，我们用媒介物（DMSO），INK128（30 mg / kg）或INK128（30 mg / kg）和ISRIB（2.5 mg / kg）处理了携带SUM149异种移植肿瘤的小鼠。从肿瘤直径达到5mm开始，每隔第二天给小鼠给药2周。IHC分析证实，磷酸4E-BP1水平与缺氧呈负相关（由CA9表示），与对照相比，在用INK128处理的小鼠中其降低了（补充图 5i）。ATF4水平由INK128诱导（指示ISR诱导），而ISRIB则将其废除（补充图 5j）。在SUM149异种移植模型中，两种治疗均降低了肿瘤的生长（图 5j）。）。从用INK128处理过的动物中生长的肿瘤中分离出来的癌细胞的BCSC频率要高于用媒介物处理过的癌细胞，而ISRIB的共同治疗则消除了这些增加（图 5k）。由于ISRIB在不降低肿瘤生长的情况下降低了BCSC的频率，因此在该模型中可能专门针对获取BCSC。总体而言，这些数据表明，通过mTOR抑制促进BCSC表型的部分是由ISR介导的，ISRIB可以通过减轻缺氧或TOR抑制剂诱导的可塑性来改善治疗反应和疾病结果。
化疗已被证明可诱导BCSCs 49。我们观察到紫杉醇（20 nM），一线乳腺癌化疗，增加eIF2α磷酸化，同时降低T47D和SUM149细胞中的磷酸4E-BP1水平（图 6a；补充图 6a）。此外，紫杉醇诱导的干细胞和EMT相关蛋白NANOG，SNAIL和SLUG的表达在治疗3至6小时内至少翻了两倍（图 6b；补充图 6b）。这证实了与缺氧或INK128一样，紫杉醇也能诱导ISR并抑制mTOR信号传导，这与获得干细胞样表型相吻合。
0至12小时紫杉醇（20 nM）处理的T47D细胞（n = 3）的 eIF2α-p，eIF2α和4E-BP1免疫印迹。b在0、3或6 h紫杉醇（20 nM）处理的T47D细胞（n = 3）中，NANOG，SNAIL和SLUG的免疫印迹。c在存在或不存在ISRIB（10 nM）的情况下，紫杉醇（2.5–50 nM）处理的T47D细胞的平均存活率（p <0.05，n = 3）。d每两天治疗2周的小鼠的平均SUM149肿瘤体积（DMSO，ISRIB（2.5 mg / kg IP），紫杉醇（15 mg / kg IV）或紫杉醇（15 mg / kg IV）+ ISRIB（2.5 mg /公斤IP））。箭头指示停止治疗（p <0.01，治疗n = 8，DMSOn = 6）。e 具有代表性图像的d（n = 6）中，从96.6万个存活的SUM149细胞的平均球体计数从终点肿瘤中分离出来。微米棒= 250μm。f每两天治疗2周的小鼠的平均SUM149肿瘤体积（DMSO，ISRIB（2.5 mg / kg IP），紫杉醇（20 mg / kg IP）或紫杉醇（20 mg / kg IP）+ ISRIB（2.5 mg /公斤IP））。箭头指示停止治疗（p <0.01，n = 10）。g 用代表性图像对f（p <0.01，n = 7）的H＆E染色的SUM149肿瘤坏死区域内的活细胞进行定量。H接受每周2次紫杉醇（15 mg / kg静脉内）或紫杉醇（15 mg / kg静脉内）+ ISRIB（2.5 mg / kg IP）治疗的小鼠的平均MDA-MB-231肿瘤体积。我在小鼠平均数PDX401肿瘤体积接收地我纳克治疗从d（Ñ = 6）。j 具有代表性图像的96,000个PDX401细胞的平均球数与i（n = 6）的末端肿瘤分离。微米棒= 250μm。k Kaplan–Meier图显示低PERK表达与存活率相关（HR 1.80（1.24–2.62），p = 0.0019）。PERK（eIF2αK3）转录本相对于正常乳腺组织（正常，n = 113; 肿瘤，n = 1062；PERK p = 1.52×10 -15，eIF2a p = 1.87e-10）。数据代表独立实验。误差棒表示平均值±SD。箱须图表示中位数，四分位间距（IQR），晶须延伸到最大值和最小值。配对样本的双面t检验。星号表示* p值 <0.05。通过ANOVA测试的多个比较。同样的字母表示有关系p ≥0.05。不同的字母表示统计差异（p <0.05）。
考虑到其对缺氧诱导的或INK128诱导的乳腺癌可塑性的缓解作用，我们评估了ISRIB是否能提高紫杉醇的疗效。在T47D和SUM149细胞上，在存在或不存在ISRIB（10 nM）的情况下测试不同浓度的紫杉醇（2.5–50 nM），我们确定ISRIB使两种细胞系对紫杉醇敏感（图 6c；补充图 6c））（通过菌落形成试验测量）。作为我们细胞培养研究的扩展，对携带SUM149乳腺脂肪垫肿瘤的小鼠进行了媒介物（DMSO），ISRIB（每隔一天IP 2.5 mg / kg腹腔注射），紫杉醇（每周15 mg / kg静脉注射）或紫杉醇/当肿瘤直径达到5毫米时，ISRIB联合疗法开始2周。肿瘤切片上的IHC证实紫杉醇增加了ATF4的水平。ISRIB将其予以扭转（补充图 6d）。所有治疗组均表现出肿瘤生长的减少，紫杉醇显着降低了有或没有ISRIB的肿瘤负荷（图 6d）。）。从紫杉醇处理过的动物中生长出来的肿瘤中分离出来的癌细胞，其干细胞样细胞的频率要高于用载体处理的细胞。ISRIB减轻了这种影响（图 6e）。由于毒性，乳腺癌患者经常接受次优剂量的紫杉醇治疗。为了确定ISRIB是否能改善次优化疗的疗效，对携带SUM149乳腺脂肪垫肿瘤的小鼠进行了媒介物（DMSO），ISRIB（2.5 mg / kg IP），紫杉醇（20 mg / kg IP）或紫杉醇/ ISRIB组合治疗当肿瘤直径达到5毫米时开始2周。使用这种范例，紫杉醇和ISRIB可以在相同程度上减少肿瘤的生长，ISRIB可以提高紫杉醇的疗效（图 6f）。）。此外，组织学检查表明ISRIB降低了这些肿瘤的坏死区域内的细胞活力（图 6g）。我们使用另一种三阴性乳腺癌模型（MDA-MB-231）确认了这些结果。用媒介物（DMSO），紫杉醇（15 mg / kg IV）或紫杉醇/ ISRIB（2.5 mg / kg IP）联合疗法治疗携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠。在2周时计算药物治疗小鼠的肿瘤体积。DMSO治疗的小鼠在治疗完成之前达到终点（750 mm 3）。值得注意的是，ISRIB在该模型中提高了紫杉醇的疗效（图 6h）。此对准与最近的一项研究显示，ISRIB在降低转移性前列腺癌的肿瘤负荷，其特征在于高水平的磷酸化eIF2α的特别有效50。
我们利用临床相关的PDX模型来确定ISRIB是否能提高紫杉醇的疗效。如最近所述，用紫杉醇IV和ISRIB通过管饲法对小鼠进行治疗50。我们在小鼠的乳腺脂肪垫中建立了PDX401（高分化三阴性）和PDX574（低分化三阴性）异种移植物。我们选择PDX574是因为它包含与NODAL共定位的高水平缺氧（以CA9标记），而分化良好的PDX401则几乎没有缺氧而NODAL含量较低（补充图 6e））以解释高和低的BCSC肿瘤。当肿瘤直径达到5毫米时，用DMSO，ISRIB（每天10 mg / kg口服，持续2周），紫杉醇（每周15 mg / kg，连续2周）或ISRIB和紫杉醇治疗小鼠。IHC对终点肿瘤的确证是紫杉醇增加了ATF4的水平，而ISRIB阻止了这些作用（补充图 6f，g）。ISRIB提高了对紫杉醇耐药性PDX574肿瘤的化疗效果（补充图 6h）。从紫杉醇处理过的动物中生长的PDX574肿瘤中分离出来的癌细胞的BCSC频率要高于用载体处理过的癌细胞，并且ISRIB大大减弱了紫杉醇的这种作用（补充图 6i）。）。反过来，紫杉醇完全消除了对紫杉醇敏感的带有PDX401的小鼠的肿瘤生长（图 6i）。尽管如此，从紫杉醇治疗的动物中生长的PDX401肿瘤中分离的癌细胞显示出比用媒介物治疗的细胞更高的BCSC频率，ISRIB再次减弱了这种作用（图 6j）。值得注意的是，BCSC频率的这些变化独立于肿瘤生长差异而发生，表明ISRIB选择性地阻止了BCSC相关表型的获得。
总的来说，这些模型证明了ISRIB可以减弱由低氧，mTOR抑制剂和紫杉醇等刺激引起的乳腺癌可塑性。因此，对TCGA中1100名乳腺癌患者的RNA测序数据进行的分析表明，在ISR期间磷酸化eIF2α的高水平PERK可预测诊断后10年存活率低，危险比约为1.8（图 6k）。）。
像缺氧这样的压力是肿瘤微环境的一个内在方面，可以通过化学疗法进一步放大。这些压力引起保护性翻译重编程，驱动可塑性。在试图了解干细胞因子被选择性翻译的机制中，我们观察到了源自独特TSS的多个mRNA同工型（每个具有不同的5'UTR特征）。NANOG，SNAIL和NODAL的mRNA亚型的子集的翻译通过允许有效翻译并摆脱应激诱导的翻译抑制而增强了对缺氧，mTOR抑制和化学疗法的响应的乳腺癌细胞可塑性（图 7）。mRNA同工型的独特5'UTR序列对翻译机制的变化具有独特的敏感性，从而导致特定同工型在压力条件下的差异翻译。直接抑制多能性因子（如NODAL）或干扰ISR，可以规避这种适应。这些数据建立了一种机制，通过该机制微环境压力诱导致瘤表型，并且癌症干细胞样特性的积累使得能够动态选择5'UTR。确定这种现象的普遍性并确定转录起始位点的选择是否会改变每个转录本的比率，将是很有趣的。
一个工作模型图，展示了多个具有相同编码序列但5'UTR序列不同的mRNA的表达如何促进适应低氧血症或mTORi。尽管简化了，但对应激的响应mRNA可以分为三大类：那些因应激而翻译效率降低的mTOR敏感5'UTR。那些在翻译抑制背景下表达不变的人-非应激诱导性5'UTR；以及那些在压力下可诱导的类似ATF4的5'UTR的翻译上调的蛋白。由这种翻译转换导致的表达平衡的改变将细胞从增殖化学敏感性状态转变为塑性化学抵抗状态。ISRIB会阻止由ISR诱导介导的选择性翻译，
几项研究表明，mTOR激活（与高蛋白合成率相关）也可以促进参与EMT 51的乳腺癌可塑性因子的表达。我们认为，在它们的初始诱导之后，在正向反馈环中转录维持的5'UTR亚型在不受压力的细胞中翻译良好。例如，一旦由缺氧引起，NODAL甚至在复氧后8仍能够维持其自身的表达。在高度增生（mTOR高；未受压）状态和相对休眠（mTOR低；受压）状态之间转换可能分别是肿瘤生长和可塑性的必要条件（图 7）。mTOR抑制剂已在临床上使用52。雷帕霉素及其类似物已被批准用于治疗癌症患者，包括乳腺癌患者，并且较新的活性部位mTOR抑制剂正在临床试验中44。在这项研究中，我们揭示了mTOR抑制剂通过启用NANOG，SNAIL和NODAL的翻译意外地诱导了乳腺癌细胞的可塑性。异构体的形式类似于缺氧。与化学疗法一样，mTOR抑制剂有望减少肿瘤的生长和转移。但是，长期治疗可能会加剧BCSC的积累，从而导致更具侵略性的疾病意外传播。这项研究表明，用ISRIB等化合物减轻ISR可以预防BCSC表型的获得。鉴于BCSC可塑性在治疗抵抗力和转移中的作用，ISRIB的使用可能会改善接受mTOR抑制剂或化学疗法治疗的乳腺癌患者的预后。
总之，我们强调了一种翻译调控机制，其中在应激过程中通过表达具有多种5'UTR序列的多个mRNA同工型来合成可塑性诱导因子。我们进一步证明，抑制这一过程（使用ISRIB）可能会阻止在低氧性肿瘤中或治疗后获得BCSC，因此可以防止适应性治疗耐药性和转移性传播。
获自ATCC（美国马那萨斯市）的T47D，MCF7和MDA-MB-231细胞保存在含有10％胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（Life Technologies; Carlsbad，CA，USA）中（生命技术）。根据ATCC的建议，使用0.25％（w / v）胰蛋白酶（Life Technologies）传代细胞。从Bioreclamation IVT购买的SUM149细胞在含5％热灭活的FBS，10 mM HEPES，1 µg / mL氢化可的松，5 µg / mL胰岛素的Ham's F-12培养基中生长。乳腺癌细胞已在Sick Kids Research Institute进行了认证，并在室内进行了支原体测试。来自WiCell（美国威斯康星州麦迪逊）的H9 hESCs在敲除的DMEM / F12（生命技术；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）中的CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（GlobalStem；盖瑟斯堡，美国马里兰）上生长，用20％的敲除血清替代品（生命技术），1X非必需氨基酸（Life Technologies），2 mM谷氨酰胺（Life Technologies），0.1 mM 2-巯基乙醇（BME; Thermo Fisher Scientific;美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和4 ng / mL碱性成纤维细胞生长因子（FGF） ）（生命技术）。为了进行实验，将细胞传到无饲养层的条件下。无饲养层的条件包括作为生长底物的Geltrex基质（Life Technologies）和mTeSR1培养基（Stem Cell Technologies；加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）。所有细胞均在37°C，5％CO的潮湿环境中生长 无饲养层的条件包括作为生长底物的Geltrex基质（Life Technologies）和mTeSR1培养基（Stem Cell Technologies；加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）。所有细胞均在37°C，5％CO的潮湿环境中生长 无饲养层的条件包括作为生长底物的Geltrex基质（Life Technologies）和mTeSR1培养基（Stem Cell Technologies；加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）。所有细胞均在37°C，5％CO的潮湿环境中生长2。
使用Xvivo系统（BioSpherix； Parish，纽约，美国）以指定的浓度给予缺氧。维持温度（37℃）和CO 2（5％）。通过在不同时间将细胞置于缺氧状态来控制培养时间，以便在接种后的同一时间分析所有样品。例如，在常氧下将0 h细胞培养24 h，在常氧下将6 h缺氧细胞培养18 h，然后在低氧下培养6 h，将在缺氧下将24 h缺氧细胞培养24 h。
为了增加Nodal信号，我们使用了NODAL表达载体（与空pcDNA3.3载体;的pcDNA 3.3™-TOPO ®克隆试剂盒; Invitrogen公司转染用脂质转染胺2000（Invitrogen公司），按照制造商的说明进行对于稳定选择，遗传（G418; 800毫微克/毫升）中的溶液用22，53，我们还使用重组人NODAL。（rhNODAL; R d）为了减小Nodal信号，我们使用NODAL靶向的shRNA（相对于乱序对照shRNA的）转染用脂质转染胺2000（执行Invitrogen公司），按照制造商的说明。对于稳定选择，嘌呤霉素（200-450毫微克/毫升）中的溶液用22，53。为了抑制NODAL信号，我们还使用了SB431542。SB431542选择性抑制激活素和TGF-β和NODAL信号传导，但不抑制BMP信号传导。
为了抑制mTOR激酶的活性，我们使用了MLN0128 / INK128（INK； 20 nM）。为了增加4E-BP1水平，我们使用了表达载体（pCMV6-Entry EIF4EBP1 True ORF金载体； OriGene）。为了敲低4E-BP1，我们使用了pGFP-V-RS EIF4EBP1人类shRNA（OriGene）对抗加扰和对照载体。按照制造商的说明，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。
为了诱导内质网应激，使用了氮杂环丁烷（AZE； 5 mM）或毒胡萝卜素（TG，0.1μM）。也使用了紫杉醇（Pac； 20 nM）。为了检查eIF2α磷酸化在BCSC表型低氧诱导中的作用，对照（EV）MDA-MB-231细胞或其中eIF2α被敲低然后被WTeIF2α或HA标记的突变eIF2αS51A取代的细胞（这些细胞是通过感染含有pMSCV逆转录病毒的细胞而产生的。通过FACS分选GFP阳性细胞；然后用表达对人eIF2αmRNA 3'UTR特异的shRNA的pGIPZ慢病毒重染；并选择2.5μg/ mL的嘌呤霉素。为了防止eIF2α磷酸化，使用了salubrinal（20μM）。为了克服eIF2α对三元复合物转换和翻译的影响，使用了ISRIB（10 nM）。
使用哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER； Thermo Scientific），Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Scientific）和磷酸酶抑制剂（Thermo Scientific）在板上裂解细胞。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher），根据制造商的说明书对蛋白质进行定量，并在FLUOstar Omega酶标仪（BMG LABTECH； Offenburg，德国）上进行测量。将含有20 µg蛋白的5％BME（Sigma-Aldrich；美国密苏里州圣路易斯）的4x Laemmli缓冲液（Bio-Rad； Hercules，CA，美国）煮沸10分钟，然后上样分析。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，然后将其转移到Immobilon-FL膜（Millipore）上。使用Precision Plus蛋白双色标准液（Bio-rad）估算分子量。用PBS 0中的5％牛奶封闭膜。 2）。用0.1％Tween PBS（Sigma-Aldrich）洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗（Bio-Rad）孵育，然后洗涤以去除多余的二抗。Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）用于检测信号。使用ChemiDoc™XRS +系统（Bio-Rad）或胶片对免疫印迹进行成像。使用ChemiDoc™XRS +系统（Bio-Rad）进行光密度测定。
使用Trans Blot Turbo（在25 V和1.3 A的设置下持续15分钟； Bio-rad）将蛋白质转移至低自发荧光的PVDF膜（Bio-rad），在室温下用Odyssey封闭缓冲液封闭1 h （Li-Cor; Lincoln，NE，USA），然后与一抗在含有0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich）的Odyssey封闭缓冲液中于4°C孵育过夜。然后在室温下以1 / 10,000的稀释度在含有0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich）和0.1％Tween的Odyssey封闭缓冲液中，用相应的Li-Cor抗小鼠或抗兔荧光二抗探测膜1小时。 。使用Li-Cor Odyssey Clx成像系统进行成像。以不会导致任何饱和像素的强度进行扫描。
使用ImageJ进行光密度测定。使用矩形工具隔离每个泳道。接下来，为每个泳道建立背景，然后测量所得调整峰的面积。如图例所示，将样品标准化为对照基因，并针对它们各自的未处理或载体对照进行测量。
细胞生长到60-80％汇合，然后在收获前在37°C下向细胞中加入0.1 mg / mL的环己酰亚胺5分钟。在多核糖体裂解缓冲液（15 mM Tris–HCl（pH 7.4）/ 15 mM MgCl 2 /0.3 M NaCl / 1％Triton X-100 / 0.1 mg / mL环己酰亚胺/ 100单位/ mL RNasein）中提取细胞。通过总RNA确定将要上样的每种裂解物的体积。蔗糖梯度（7–47％）以39,000 rpm（187,053× g）和SW41-Ti转子（Beckman Coulter，Fullerton，CA）在4°C下旋转90分钟。在254 nm的吸光度下连续监测梯度，并用Brandel BR-188密度梯度分级系统进行分级。将每个梯度收集到九个相等的馏分中。使用Peakchart软件从空白梯度的吸光度计算出蔗糖梯度的基线吸光度，并从每个样品的吸光度读数中减去。首先通过用蛋白酶K消化每个级分，然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀提取总RNA来进行RNA分离。将样品分成代表单核小体，轻（<3个核糖体）和重（大于三个核糖体）多核糖体的组。通过实时（RT）PCR分析等量的RNA。对于验证研究，将多核小体（超过三个核糖体）中的mRNA与总mRNA水平进行比较。对于多核糖体图谱，计算每个级分中转录本的百分比。
按照制造商的方案，使用PerfectPure RNA培养细胞试剂盒（5-Prime；德国希尔登）从培养细胞中提取总RNA。进行可选的DNase处理，并以50 µL洗脱RNA。使用Epoch读板仪（Biotek； Winooski，佛蒙特州，美国）将3 µL纯化的RNA用于定量。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems; Foster City，CA，USA），按照制造商的规程从纯化的总RNA中制备cDNA。随机提供的六聚体用于引发反转录，每种均使用1 µg RNA。“无模板”反应不含RNA，“无RT”反应不含逆转录酶。®和PrimePCR基因表达人类引物/探针组（Thermo Scientific和BioRab；请参阅补充表 3）。使用ΔCT方法将mRNA表达与未处理的对照进行比较。使用标准RT PCR设置在CFX96 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad； Hercules，CA，美国）上收集数据。活化95°C 10分钟; 熔点95°C 15 s; 退火/延伸55°C 1分钟。返回步骤2进行40个总循环。进行熔解曲线分析以确保产生单个扩增子。对于NODAL的绝对定量，在cDNA合成后，使用Power SYBR Master Mix（Life Technologies）进行RT PCR。一式三份地加载1 µL cDNA，以定量NODAL（1 µL = 50 ng起始RNA）。使用了以下引物：NODAL正向引物TACATCCAGAGTCTGCTG；和NODAL反向引物CCTTACTGGATTAGATGGTT。将克隆的NODAL PCR产物线性化，并进行稀释系列（拷贝数/ µL）。从这些样品构建标准曲线，并与样品一起运行以估计每个时间点的NODAL转录本数量。对于同工型特异性PCR，所有产品均通过测序验证。使用了以下引物：NANOG 350正向引物GAT GGG GGA ATT CAG CTC AGG；NANOG 350反向引物TCA AGA CTA CTC CGT GCC CA; NANOG 291正向引物AAC GTT CTG GAC TGA GC; NANOG 291反向引物AGG CAG CTT TAA GAC TTT TCT GG; SNAIL 417正向引物AAA GGG GCG TGG CAG ATA AG; SNAIL 417反向引物CGC CAA CTC CCT TAA GTA CTC C; SNAIL 85正向引物CGG CCT AGC GAG TGG TTC; SNAIL 85反向引物CAC TGG GGT CGC CGA TTC; NODAL小（42 + 14 + 298）正向引物CTG GAG GTG CTG CTT TCA GG; NODAL小（42 + 14 + 298）反向引物CAG GCG TGC AGA AGG AAG G; NODAL 298正向引物GTT TGG TAC CTA GAG CAG G; NODAL 298反向引物TCC AGG GAC GGG ATC TAG G; NODAL 416正向引物CCC TCG GCA TTC TCT TCC TG; NODAL 416反向引物ATC CCT GCC CCA TCC TCT C.
液滴数字PCR（ddPCR）用于测量来自总RNA和多体RNA的纯化RNA样品中每个靶标转录物的数量。使用了9 µL稀释的纯化RNA样品，10 µL的2x ddPCR Supermix探针（无dUTP）和1 µL的20x TaqMan基因表达引物探针。将每种反应混合物20 µL移入DG8滤芯（目录号）的样品孔中。将70 µL用于探针或EvaGreen的液滴生成油添加到油井中，然后盖上DG8垫圈。使用QX200 Droplet Generator生成液滴。将40 µL产生的液滴转移到96孔PCR板中。所有使用2x ddPCR Supermix for Probes的反应均使用95°C（10分钟），94°C（30 s），60°C（1分钟），98°C（10分钟）和4°C（无限的）。步骤2和3重复40次。所有ddPCR热循环条件均使用2°C / s的慢速调节斜率。将PCR板置于QX200液滴读取器中以读取液滴数目和荧光强度的幅度。
球形形成介质由DMEM / F12 + GlutaMax（生命技术），1x B27（生命技术），20 ng / mL表皮生长因子（EGF）（生命技术）和10 ng / mL FGF（生命技术）组成。处理后，使用0.25％（w / v）胰蛋白酶（Life Technologies）收获细胞，中和胰蛋白酶，并将细胞重悬在新鲜培养基中。将这些细胞通过40 µm孔过滤器（Thermo Fisher）过滤，以获得单细胞溶液。使用锥虫蓝对细胞计数，并在球形成培养基中稀释至合适的浓度以进行铺板。滴定细胞浓度以确保每组实验条件每孔少于1个球体。对于每种条件，将相等数量的细胞铺板，其中将200 µL稀释的细胞接种到96孔超低附着表面平板（Corning，NY，美国）的每个孔中。球体在10到21天之间生长。在倒置显微镜上对直径大于50μm的球进行计数，并记录每块板中球的总数。使用EVOS FL细胞成像系统（Thermo Fisher）以×4放大倍数捕获球体图像。为了富集球体，在生物反应器（Synthecon）中培养细胞。将10 mL RPMI + 10％FBS中的一百万个细胞装入生物反应器（Synthecon旋转细胞培养系统）。细胞在以〜7 rpm旋转的标准生长条件下生长3天 在倒置显微镜上计数50μm，并报告每块板中球的总数。使用EVOS FL细胞成像系统（Thermo Fisher）以×4放大倍数捕获球体图像。为了富集球体，在生物反应器（Synthecon）中培养细胞。将10 mL RPMI + 10％FBS中的一百万个细胞装入生物反应器（Synthecon旋转细胞培养系统）。细胞在以〜7 rpm旋转的标准生长条件下生长3天 在倒置显微镜上计数50μm，并报告每块板中球的总数。使用EVOS FL细胞成像系统（Thermo Fisher）以×4放大倍数捕获球体图像。为了富集球体，在生物反应器（Synthecon）中培养细胞。将10 mL RPMI + 10％FBS中的一百万个细胞装入生物反应器（Synthecon旋转细胞培养系统）。细胞在以〜7 rpm旋转的标准生长条件下生长3天 将10 mL RPMI + 10％FBS中的一百万个细胞装入生物反应器（Synthecon旋转细胞培养系统）。细胞在以〜7 rpm旋转的标准生长条件下生长3天 将10 mL RPMI + 10％FBS中的一百万个细胞加载到生物反应器（Synthecon旋转细胞培养系统）中。细胞在以〜7 rpm旋转的标准生长条件下生长3天54。在测量球体大小的情况下，使用ImageJ对背景进行阈值化，并获取球体的总面积。
将一百万个细胞在100 µL的Zombie Aqua（Fixable Viability Kit BioLegend; San Diego，CA，USA）中于室温下染色20分钟。去除僵尸水，并向每个样品中添加20 µL抗体稀释液，然后在冰上孵育10-15分钟。
抗体对：
图1f中使用的CD24 APC（REA832，MiltenyiBiotec，1:20稀释度），CD44紫蓝（REA690，Miltenyi Biotec，1：5稀释度）
FITC小鼠抗人类CD24（BD Biosciences； Franklin Lakes，新泽西州，美国，1：5稀释），PE小鼠抗人类CD44（BD Biosciences，1：5稀释）用于图 3d和补充图。1 b–d和3f，g
用200 µL FACs缓冲液（含1％FBS的PBS）洗涤细胞，沉淀，然后重悬于100 µL 2％PFA的FACs缓冲液中。为了进行采集，将细胞重悬于300 µL FACS缓冲液中以进行流量采集。使用双峰鉴别和活细胞门来鉴定目标细胞，并根据荧光减去一个对照（FMO）设置象限门（补充图 7）。
用Qiagen RNeasy试剂盒从低氧处理过的细胞中提取RNA，并通过Nanodrop进行定量；使用Qubit测量质量。RNA被运送到麦吉尔大学和魁北克基因组创新中心，在那里质量通过Bioanalyser进行了验证，然后是NEB / KAPA文库的制备和Illumina HiSeq的测序。使用FastQC进行读取的测序后质量检查，并使用Skewer除去衔接子序列。使用STAR将读数与GRCh37 / Hg19人类参考基因组比对。数据处理包括Bigwig，PCA，相关矩阵，并使用DeepTools生成了比对读取的覆盖图。使用Refseq批注通过FeatureCounts进行读取定量。使用edgeR软件包中的精确测试获得配对样品的表达值（低氧/低氧）。调整后p值（FDR）为0.05，用于确定统计学上的显着差异（通过Benjamini-Hochberg方法针对多个假设检验对p值进行了调整）。R的GAGE软件包用于将数据与Molecular Signatures数据库中的标记基因集进行比较，该标记集用于基因集分析。
为了克隆荧光素酶5'UTR报道分子，我们修饰了Dey等人的PTK-ATF4-Luc质粒（含有小鼠ATF4 5'UTR）。39使用QuikChange闪电定点诱变试剂盒（安捷伦；美国加利福尼亚州圣克拉拉）引入两个BsmBI限制性酶切位点，位于ATF4 5'UTR两侧。然后将ATF4 5'UTR替换为LacZ插入片段，以完成用于多种5'UTR一步克隆的pGL3-TK-5UTR-BsmBI-荧光素酶质粒。该质粒已经在Addgene（质粒＃114670）上提供。除“ Snail 417”外，订购侧翼为衔接子序列的5'UTR的目的是从Integrated DNA Technologies（Coralville，IA，USA）获得的gBlocks序列；列于补充表 4中），并使用BsmBI（New England BioLabs; Whitby，ON，Canada）将其克隆到pGL3-TK-5UTR-BsmBI-荧光素酶中。使用正向引物TATCGTCTCAACACCGAGCGACCCTGCATAAGCTTGGCGCTGAGCCGGTGGGCG和反向引物ATACGTCTCTCTTCCATAGTGGTCGAGGCACTGGGGTCG通过PCR生成“ Snail 417” UTR插入片段。“ NODAL 298” uORF突变体是使用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒和正向引物CCTCCGGAGGGGGGTTATATAATCTTAAAGCTTCCCCAG和反向引物CTGGGGAAGCTTTAAGATTATATAACACCCCCCTCCGGAGG生成的，目的是在上游起始密码子（ATG）内的G到A突变相对于翻译开始。使用聚乙烯亚胺（PEI，Sigma Aldrich；美国密苏里州圣路易斯）转染HEK293细胞。PEI和载体培养基的比例为5 µL PEI和0。在250 µL无血清DMEM中加入5 µg载体，并在室温下孵育10分钟。将250 µL混合物分配到包含250 µL DMEM的12孔板的每个孔中。HEK293细胞在转染混合物中孵育过夜。去除转染培养基，并用10％的DMEM血清代替，并在24小时内恢复细胞。然后用0.1 µM thapsigargin（TG）处理细胞3 h或0.5％O2 6小时（缺氧）。处理完成后，裂解细胞，并用萤火虫萤光素酶测定系统（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）测量萤光素酶活性。使用FLUOstar Omega酶标仪（BMG LABTECH）读取活性。
所有涉及动物的实验均得到艾伯塔大学动物使用小组委员会的批准（AUP00001288和AUP00001685）。为了避免与补充雌激素有关的潜在混淆变量，并且鉴于BCSC表型似乎受到普遍调节，而与亚型无关，因此我们选择将体内研究限于ER阴性模型。
如所述将SUM 149细胞预孵育，然后用胰蛋白酶消化并计数。将100μL无Ca 2+的 HBSS中的500,000个细胞注入雌性NOD-scid IL2Rgamma null（NSG）小鼠的尾静脉。在第8周处死小鼠（以形成肿瘤）。将肺用福尔马林固定并石蜡包埋，并根据制造商的说明书使用人特异性HLA抗体（补充表1）在此组织上进行IHC染色 。对于每个小鼠器官，从整个组织中均匀分布的区域获取3–6个切片，并计算每个小鼠器官的平均转移灶数。
将100 µL RPMI：Matrigel（1：1）中的500,000 SUM 149或MDA-MB-231细胞注射入7-8周龄雌性NSG小鼠的右胸乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到最大直径5mm时，将小鼠随机化并给予治疗。此时，将小鼠用DMSO媒介物对照，INK（灌胃30 mg / kg），ISRIB（2.5 mg / kg IP）或紫杉醇（20 mg / kg IP或15 mg / kg IV）治疗指定的时间。每周两次进行肿瘤测量，并使用数字卡尺测量切除后肿瘤的长度×宽度×深度，以计算体积。当肿瘤直径达到〜1 cm时处死小鼠。肿瘤被切成两半。将一半解离，将另一部分用4％甲醛固定，石蜡包埋，切片并用H＆E染色或用于免疫组化。
使用了通过与Oncotest（德国弗莱堡的查尔斯河）合作获得的两个PDX模型：PDX401是分化良好的基底样TNBC，而PDX574是分化差的基底样TNBC。通过一个小切口将可行的碎片（直径约1毫米）放入7-8周龄的雌性NSG小鼠的乳腺脂肪垫中。此时，将小鼠用DMSO媒介物对照，INK（灌胃30 mg / kg），ISRIB（2.5 mg / kg IP或10 mg / kg灌胃）或紫杉醇（20 mg / kg IP或15 mg / kg）治疗IV）在指定的时间。每周两次进行肿瘤测量，并使用数字卡尺测量切除后肿瘤的长度×宽度×深度，以计算体积。当肿瘤直径达到〜1 cm时处死小鼠。将一半解离，将另一部分用4％甲醛固定，石蜡包埋，切片并用H＆E染色或用于免疫组化。使用Kaplan-Meier方法构建总体生存的生存曲线，并通过对数秩检验确定显着性。
在使用台盼蓝进行活细胞计数之前，根据制造商的说明，使用人肿瘤解离试剂盒和带有加热器的温和MACS组织解离器（Miltenyi Biotec； Bergisch Gladbach，德国）将每个肿瘤的一半解离。
在每个组织块中均匀分布的三个肿瘤切片用H＆E染色。对每个肿瘤切片进行成像，以使整个切片在一个视野中可见。使用ImageJ分析了所有IHC图像。选择总肿瘤切片面积，并通过对背景像素强度进行阈值化来测量。坏死区域由与完整肿瘤细胞相比具有更高均匀强度的像素组成，并且针对较轻的坏死区域进行第二轮阈值处理来区分和测量坏死的总面积。通过确定坏死区域内的密集，黑暗区域来确定缺氧区域的活细胞。
用福尔马林固定，石蜡包埋的组织在二甲苯中进行去石蜡，通过乙醇系列进行水合作用，用柠檬酸盐缓冲液回收抗原以及过氧化物酶和无血清蛋白封闭。应用了NODAL，CA9，p4E-BP1、4E-BP1或ATF4特异性抗体（补充表 2）。将载玻片在TBS-T中冲洗，并用Envison + HRP抗小鼠IgG（Dako）处理。用DAB（棕色）底物产生颜色，并用Mayer's苏木精复染。样品在试剂级酒精中脱水，并盖上永久固定介质。阴性对照反应是使用小鼠IgG（同型抗体，其浓度与一抗相同）进行的。
2014年8月从TCGA数据门户网站获得了3级TCGA RNAseqV2 BRCA基因表达数据和临床信息。RNA测序RSEM值用于下游分析。对于TCGA RNA-seq样品，通过将缩放后的估算数据乘以106来计算相对丰度（每百万个转录本，TPM），并将其用于下游分析。
我们在RStudio编程环境（v0.98.501）中进行了所有分析和可视化。在适当的情况下，使用R / Bioconductor软件包ggplot2，plyr，pROC，存活率，GAGE和limma。使用接收者工作特征（ROC）曲线对4E-BP1和PERK表达进行二分频，以确定总体生存检查的终点的最佳临界值。高表达人群与低表达人群之间的定量差异通过学生t检验进行了评估；使用Fisher精确检验评估质量差异。使用Kaplan–Meier方法构建总体生存的生存曲线，并通过对数秩检验/ Wilcoxon检验确定显着性。
将细胞与紫杉醇±ISRIB在标准CO 2培养箱中孵育1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，制成单细胞悬液并铺板。7-14天后，用乙酸-甲醇（1：4）固定菌落，并用结晶紫（1:30）染色。
使用GraphPad Prism 7进行分析。学生的t检验用于将单个条件直接分析为适当的对照，并在适当的情况下使用配对的两个样本t检验。p值<0.05被认为具有统计学意义（用*表示）。为了分析多个条件之间的关系，采用Bonferroni和Holm事后检验进行所有成对比较的单向方差分析，以检测各组之间的统计学显着性差异，并校正家庭错误率（以字母表示）。p值 <0.05被认为具有统计学意义。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
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