全基因组关联研究（GWAS）已确定约20个黑色素瘤易感基因座，其中大多数没有功能特征。在这里，我们报告了一种方法，该方法将大规模平行报告基因检测（MPRA）与细胞类型特异性表观基因组和表达定量性状基因座（eQTL）集成在一起，以从多个GWAS基因座中鉴定易感基因/变体。从832个高LD变体中，我们从显示等位基因转录活性的14个基因座中鉴定了39个候选功能变体，其中一个子集证实了四个共定位的黑素细胞顺式 -eQTL基因。其中，我们进一步表征了包含HIV-1限制基因MX2的基因座（Chr21q22.3），并验证功能性内含子变体rs398206。rs398206介导转录因子YY1的结合以增加MX2水平，这与原代人黑素细胞中MX2的顺式 -eQTL 一致。斑马鱼模型中人MX2的黑素细胞特异性表达证明在BRAF V600E背景下黑色素瘤形成加速。我们的综合方法简化了GWAS的后续研究，并突出了MX2在黑色素瘤易感性中的多效性功能。
一系列全基因组关联分析的（GWAS）在过去十年中已经确定关于与皮肤黑素瘤相关20个基因组座位1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，突出到遗传贡献普通人群中的黑色素瘤易感性。一些这些位点的代表有关的基因或区域黑素瘤相关性状例如，色斑表型11，12，13，14，15和痣计数5，16，17。但是，除了这些基因座以外，普通人群对黑色素瘤的遗传易感性的潜在机制还不太清楚。对于少数这些基因座，GWAS峰下的易感性基因和变异体的广泛表征已导致深入了解黑素瘤易感性的分子途径。PARP1位于Chr1q42.1黑色素瘤基因座8中，它是一种易感基因，通过调节黑色素细胞主转录因子和癌基因MITF 18而在黑色素瘤发生的早期事件中具有促进肿瘤的作用，Chr5p15.33上的多癌基因座的特点是突出了TERT的作用在癌症易感性中包括黑色素瘤19。仍然，大多数常见的黑色素瘤危险基因座的分子机制仍无法解释。
测序技术的最新进展已使许多经典的分子分析得以大规模进行。大规模并行报告基因分析（MPRA）扩大规模常规的荧光素酶报道分子测定，用于在细胞中，相同的时间，然后通过大规模平行测序去卷积测试的DNA元件的转录活性，促进数万不同的短序列的评价20，21，22。这种方法的整合对于GWAS功能后续研究特别有吸引力，因为（1）连锁不平衡（LD）限制了统计精细映射，并留下了许多变异体作为潜在的功能候选者，并且（2）假设许多与性状相关的变异体通过顺式调控机制有助于等位基因表达，该机制可以通过报告基因检测来检测。因此，直接评估转录调控中的等位基因差异可以帮助在由LD关联的多个变异体中优先考虑可能的功能变异体。例如，最近的一项研究采用MPRA测试了来自75个GWAS基因座的2756个变体的红细胞性状，并确定了来自23个基因座20的 32个功能变体。
此外，表达定量性状基因座（eQTL）分析可能是从GWAS基因座中鉴定易感基因的有效方法，因为它可以告知表达水平与性状相关变体相关的基因。尽管有许多公开的eQTL数据集使用代表不同人体器官的组织，包括通过GTEx项目进行的表达23，大多数是基于大块组织样本（例如皮肤组织），而不是单个细胞类型。重要的是，黑色素瘤起源于黑色素细胞，但它们占典型皮肤活检的不到5％。为了剖析涉及黑素瘤易感性的细胞类型特异性基因表达调控，建立了使用来自106个个体的黑素细胞原代培养的黑素细胞eQTL数据集，并将六个黑素瘤GWAS基因座（占所有基因座的30％）定位到黑素细胞eQTL 24。此数据集识别多个候选易感基因不是使用从大容量皮肤组织，从GTEx其他组织类型，和黑色素瘤产生更大的样本大小的数据集eQTLs 24，突出细胞类型特异性eQTL数据集为功能随访-GWAS的效用地区。
在这项研究中，我们将MPRA和细胞类型的特定黑素细胞eQTL相结合，以扩大黑素瘤GWAS基因座的功能注释过程，并提名在斑马鱼模型中测试的最佳人选。使用我们的方法，我们确定了一种功能性风险变体，该变体会增加黑素细胞谱系细胞中HIV-1限制基因MX2的水平；随后在斑马鱼黑色素瘤模型的黑色素细胞中表达MX2会加速黑色素瘤的形成。
为了鉴定显示等位基因转录功能的功能性黑素瘤相关变体，我们使用了MPRA方法。在最近的GWAS荟萃分析1的 20个全基因组显着黑色素瘤基因座中，我们优先考虑了16个基因座，其中可以推测出潜在的顺式调控机制，但排除了先前由功能蛋白编码变体（MC1R，SLC45A2和TYR 11，12，13，14），或者未示出的黑素细胞中被表达（ASIP 15）。为了全面分析来自这些基因座的遗传信号，我们然后使用HyperLasso 25方法进行了统计精细映射。精细映射指定了其他独立信号（补充表 1），我们从中选择了30个变异体，并从初始荟萃分析结果1中添加了16个前导SNP 。为了优先处理黑色素瘤相关变体以通过MPRA测试，我们首先选择了 带有这46个主要和次要先导SNP的LD（r 2 > 0.4）中的2748个变体（方法；补充图 1；补充表 2）。其中，我们进一步确定了832个与潜在功能性黑色素瘤相关的基因组特征重叠的变体的优先级，这些变体与原代黑色素细胞和/或黑色素瘤短期培养物中的开放的染色质区域和启动子/增强组蛋白标记26（补充数据 1；补充表 3；方法） ; www.encodeproject.org ; www.roadmapepigenomics.org）。然后，我们构建从以前的研究中采用了使用方法，这些变种832库MPRA 20，21，22，27。测试了包含每个变体的风险或保护性等位基因的145 bp基因组序列在荧光素酶构建物中作为增强子或启动子元件的潜力。对于每个变体，其核心21个碱基的加扰序列也被测试为空（图 1a；方法）。转染到黑色素瘤细胞系（UACC903）中以代表黑色素瘤特异性反转录后，通过测序测量与每个测试的DNA元件相关的标签（条形码）序列的转录输出作用因子和HEK293FT细胞系以获得最大的转染效率。从这些数据中，我们最初观察到重复之间转录活性的高度相关性，并进一步将保守的质量控制措施用于下游分析（方法；补充图 2 – 6；补充表 4）。
一个 MPRA工作流程。寡核苷酸文库是使用145 bp的序列合成的，该序列包含每个具有风险或保护性等位基因的变体或正向和反向的核心21个碱基的加扰序列，其侧翼是酶识别位点和测序引物序列以及10 bp条形码（每个唯一序列10个标签）。将文库克隆到具有或不具有最小TATA启动子的萤光素酶构建物中。然后将克隆的文库转染到HEK293FT细胞或UACC903黑色素瘤细胞中，以生成表达的RNA标签文库。对输入的DNA和RNA文库进行测序，以评估与测试序列相关的标签计数。Luc：荧光素酶基因，AAAAA：poly-A尾巴。b每个黑色素瘤GWAS基因座的MPRA火山图。对于每个测试的16个基因座，显示了UACC903转染的等位基因差异的反向P值和效应大小。使用具有鲁棒三明治类型方差估计的双面Wald检验。使用Benjamini和Hochberg方法调整了多个比较。水平虚线表示UACC903组等位基因差异的FDR 1％截止值。来自每个基因座的最重要的变体被标记。39个重要MPRA变体的推定功能显示为激活子（红色圆圈），阻遏物（蓝色圆圈）或两者（紫色圆圈）（等位基因的表达水平分别高于，低于或高于扰乱序列的表达水平） ）。FDR 1％截止值以上的灰色变体是那些未通过附加标准的变体（合并数据中的等位基因差异或与加扰对照的显着偏离）。从Chr6p22.3和Chr7p21.1的基因座中未发现明显的变异。源数据作为源数据文件提供。
为了提名具有等位基因转录活性的变异体，我们着重研究在两个等位基因之间具有显着差异的变异体（FDR <0.01；具有稳健的三明治类型方差估计的双面Wald检验；使用Benjamini＆Hochberg方法调整的多个比较），然后进一步选择那些任一等位基因均显示与空值（加扰核心序列； FDR <0.01）有显着差异（补充图 2）。应用这些截止值后，在832个测试的变体中，有39个（〜4.7％）有资格在单独的UACC903黑色素瘤细胞数据集以及组合的总数据集中显示等位基因转录活性（方法；补充图 7a；补充表 5）。这些候选功能变体来自14个黑色素瘤GWAS基因座，每个基因座具有1–9个变体（中位数1.5个变体），表明MPRA在大多数基因座中将功能候选变体的范围从数十个减少到数百个高LD变体（图 1b；补充表 6；补充图 8）。这39个变体的转录活性显着高于阴性对照（8个高LD的SNP前导变体，但位于黑素细胞/黑素瘤细胞中的非DHS /非启动子/增强组蛋白标记中; P <2.2e-16 ，效果大小= 0.137； Mann–Whitney U检验；补充图 7b），以及其他变体（非显着变体；P <2.2e-16，效果大小= 0.109）。这39个变体在两个等位基因之间显示出适度的1.13至3.49倍（中位数为1.26倍）的转录活性差异，与常见癌症相关变体（UACC903细胞；补充表5）观察到的对风险的微妙影响一致 。然后我们问是否观察到的MPRA等位基因差异部分是由于转录因子的差异结合所致。为此，我们使用motifbreakR 28预测了每个待测变体的等位基因转录因子结合亲和力然后将预测的等位基因结合得分与从MPRA测量的等位基因转录活性相关联。值得注意的是，MPRA显着变体与非显着变体相比具有更高的相关性，表现为更大的Pearson r（Pearson r = 0.24 vs.-0.023；补充图 9a），而P值则为两项测试均不显着（ 分别为P = 0.149和0.556）。然后，我们询问MPRA显着性变体是否富含可信的因果变体或来自贝叶斯精细映射方法的概率分数更高的那些。为此，我们使用PAINTOR 29对黑色素瘤GWAS数据进行了统计精细映射同时整合初级黑素细胞特有的功能注释（方法）。当与精细映射结果重叠时，与其他具有可变FDR截止值的变体组相比，39个重要的MPRA变体（FDR <0.01）确实表现出最高的中位数概率得分，这是所有测试的变体的2.12倍富集得分（补充图 9b）。这些数据表明，MPRA可以通过测量等位基因转录活性，迅速缩小黑色素瘤GWAS基因座的数十个至数百个高LD变体的数量，使可能的功能候选变体范围缩小。
为了优先考虑通过调节附近基因表达而导致黑色素瘤风险的功能性变异，我们转向了来自106个个体的细胞类型特定的黑色素细胞eQTL数据24。在该数据集中鉴定出597,335个重要的顺式 -eQTL SNP（TSS +/- 1 Mb，FDR <0.05，未经LD修剪），在20个黑色素瘤GWAS基因座中有6个表现出显着的共定位/ TWAS 24。为了提名最合理的功能随访候选人，我们主要关注这六个具有黑色素细胞eQTL支持的基因座中的五个（1q21.3、1q42.12、2q33-q34、21q22.3和22q13.1） ）也已在我们的MPRA中进行了测试。尽管最初每个基因座在全基因组显着水平上有17到116个eQTL变体，但MPRA根据转录活性将它们进一步缩小到四个基因座中的3到9个功能性变体（补充表 6）。其中，来自四个基因座的总共九个变体在MPRA和eQTL之间显示一致的方向，其中局部基因的等位基因表达方向与MPRA等位基因转录活性相匹配（补充表 6；补充图 9c）。）。即，来自染色体带1q21.3的基因座的两个MPRA显着变异（rs2864871和rs6700022）是黑色素细胞CTSS的重要eQTL ，其中较低的CTSS水平与黑色素瘤风险相关。同样，来自其他三个基因座（2q33-q34、21q22.3和22q13.1）的两个到三个变体（rs2349075，rs529458487，rs398206，rs408825，rs4383，rs4384和rs6001033）也与黑素细胞eQTL重叠，而较低的CASP8，较高的MX2和较高的MAFF水平分别与黑色素瘤风险相关（补充表 7））。对于1q42.12，没有任何eQTL显着变异通过MPRA显着性临界值，因此没有优先级。因此，通过结合MPRA和细胞类型特异性黑素细胞eQTL，我们有效地确定了来自多个黑素瘤GWAS基因座的候选功能性变异和易感基因。
为了验证优先排序方案的效率，我们对MPRA和黑素细胞eQTL联合支持的四个基因座之一进行了全面的验证和功能表征。我们选择了21q22.3的基因座，其中MPRA确定了最显着的变异。在该基因座中，最初在MPRA中测试了22个变体（补充表 8），其中19个位于MX2基因的第一个内含子中（图 2a），其余三个位于上游。其中，三个变体在MPRA中非常重要，尤其是rs398206（图 2a）。，以洋红色显示）显示了所有832个测试变体中的最低P值。rs398206显示出强大的转录激活功能（比加扰序列高1.7至4.3倍），以及明显的等位基因差异，其中与黑素瘤风险相关的A等位基因驱动的萤光素酶表达明显高于保护性C等位基因（在UACC903细胞中为3.1倍） ，FDR ＝ 5.6e-206；图 2b）。随后在两个黑色素瘤细胞系中使用相同的145 bp序列进行的单独荧光素酶测定验证了这一发现（2.7至5.0倍等位基因差异，P = 1.1e-6-5.2e-11；两尾无配对t检验，假设方差不等；图 2c；补充图 9d）。rs398206还是原代黑素细胞中MX2基因表达水平的重要eQTL ，其中黑素瘤风险相关的A等位基因与更高的MX2表达相关（Slope = 0.70，P = 6.6e-15;线性回归;图 2d）。
a相对于MX2的基因组位置，显示了从Chr21q22.3黑色素瘤基因座在MPRA中测试的变体。仅显示了来自主要GWAS信号的MX2第一个内含子中的19个变体（来自次要信号的其他三个变体位于MX2基因区的上游）。显示了来自路线图表观基因组学项目的阴茎包皮黑色素细胞原代细胞的ChromHMM注释（主要核心标记分割）（红色/橙色红色：Active_TSS / Flanking_Active_TSS，黄色/绿色黄色：增强子/基因增强子，绿色/深绿色：Strong_transcription / Weak_transcription）。黑色素瘤FAIRE-seq跟踪的11个样本来自Verfaillie及其同事的研究26。显示了来自档案库75的合奏预测成绩单。b包含来自MPRA的rs398206的145 bp序列的转录活性显示为标准化标签计数（对数2（RNA TPM / DNA TPM））。UACC903黑色素瘤细胞的结果显示了正向（For）和反向（Rev）两个等位基因，其中启动子和增强子构建体的结果合并在一起。中心线显示中位数；方框限制表示由R软件确定的第25和第75个百分点；晶须从第25个百分位数和第75个百分位数延伸四分位数间距的1.5倍，离群值以点表示。密度反映在形状的宽度中。CUACC903显示了包含rs398206的145 bp序列的单个荧光素酶活性测定。使用包括最少的TATA启动子的pGL4.23构建体。从三个生物学重复中显示出一组代表性。SEM的平均值为n =6。所有构建体均显着高于pGL4.23（TATA）对照（P <0.0001，假设不等方差，为两尾，不成对t检验）。d的eQTL情节MX2在相对于rs398206原代黑素水平示出了三个基因型组。中心线显示中位数；框限制指示第25和第75个百分位数；晶须从第25个百分位和第75个百分位延伸到四分位间距的1.5倍。P-值和斜率是从线性回归中得出的，未应用多次测试校正。源数据作为源数据文件提供。
虽然黑色素细胞eQTL一直将MX2确定为21q22.3黑色素瘤基因座24的最佳候选易感基因，但我们进一步询问了来自黑色素细胞和44种GTEx组织类型的eQTL数据，以全面评估该基因座中潜在的黑色素瘤敏感性基因。当我们检查来自44种GTEx组织类型的eQTL数据时，rs398206 在其他五种组织类型（睾丸，转化的皮肤成纤维细胞，卵巢，胫神经和全血）中是MX2的重要eQTL，但没有其他基因显示出全基因组范围的重要eQTL rs398206（使用基于GTEx V6p定义的全基因组经验P值为每个基因设置的标称P值阈值； GTEx门户；https：//gtexportal.org）。
由于用于上述评估的黑素细胞顺式 -eQTL分析仅限于测试变异24 +/- 1Mb中的基因，因此我们探讨了rs398206是否是拓扑相关域（TAD）中任何基因的边缘eQTL染色质环介导的潜在基因调控，通常在该物理域内发生。从定义为TAD的rs398206（chr21：42,480,000–44,320,000; hg19）的基因组间隔中；通过http://promoter.bx.psu.edu/hi-c从为ENCODE数据集生成的SKMEL5黑色素瘤细胞系的Hi-C数据中检索/），总共有21个基因在黑素细胞中显着表达，并对其进行了eQTL分析。结果表明，MX2显示出具有rs398206的最显着的eQTL（P = 6.6e-15;线性回归），而经过多次测试调整后，TAD中的其他基因均未显示出甚至具有显着意义的eQTL（Bonferroni校正的临界值为 21 ，P <0.0024）基因；补充表 9）。这些数据确定了MX2是21q22.3黑色素瘤易感性基因位点最可能的易感性基因。
为了补充eQTL数据，我们还评估了黑素细胞中MX2的等位基因特异性表达（ASE）。rs398206位于另一种MX2转录本同工型（ENST00000543692;补充图 10a）的5'UTR区，其表达水平与黑素细胞中最丰富的全长转录本相关（ENST00000330714; Pearson r = 0.69，P ＝ 1.63e-16；补充图 11）。来自我们先前研究的RNA测序数据未发现存在 于MX2 24转录区的任何黑色素瘤相关SNP（GWAS P <5e-8）的全基因组显着ASE。，部分是由于该转录本的序列覆盖率较低，且表达水平较低。为了彻底检查该区域中的等位基因特异性表达，我们使用识别基因组DNA和cDNA的Taqman基因分型分析对黑素细胞cDNA中的rs398206进行了基因分型。结果表明，当cDNA中的等位基因比率相对于基因组DNA中的等位基因比率标准化时，在27个杂合子个体中带有A等位基因的转录物过度表达（单样本Wilcoxon检验，P = 2.49e-5;补充图 12） 。这些数据与eQTL数据一致，在eQTL数据中，与风险相关的A等位基因与较高的MX2表达相关。
为了彻底研究与rs398206相关的等位基因MX2表达的可能机制，我们在黑素细胞中进行了其他QTL分析，以解决基因调控的其他模式，包括剪接QTL（sQTL）和DNA甲基化QTL（meQTL）。使用LeafCutter 30进行sQTL分析表明，MX2 eQTL 的主要作用不是由其他同工型或剪接事件驱动的（补充图 10b-f；补充说明）。另一方面，meQTL分析在MX2附近的CpG探针上发现了rs398026的重要meQTL。规范启动子，其中与黑素瘤风险相关的A等位基因与较低的CpG甲基化相关，这与全长同工型的较高表达相一致（补充图 13）。MX2第一个内含子中的另外两个CpG探针（接近rs398206）也显示了黑色素细胞中rs398206的重要meQTL，其中较高的CpG甲基化与A等位基因风险相关。这些观察结果与以前的研究结果是，在启动子DNA甲基化是负的基因表达相关的保持一致，而转录区的正与基因表达相关的31，32，33，34，35。综上所述，eQTL，sQTL和meQTL数据与以下假设相符：MX2全长转录本通过转录机制主要在黑素细胞的rs398206处解释了eQTL。
为了鉴定介导在MPRA中观察到的等位基因差异的蛋白质因子，我们使用包含rs398206的21 bp DNA探针与A或C等位基因以及UACC903黑色素瘤细胞系的核提取物进行了比较质谱分析（图 3a）。在显示等位基因结合的蛋白质中，最突出的A-等位基因优先结合是针对阴阳1（YY1）的，阴阳1（YY1）是一种普遍存在的转录因子，在发育和癌症36和黑素细胞的色素沉着途径中起作用37。基于序列的基序预测也与此发现一致，表明rs398206周围的序列形成了有利于A等位基因的YY1的共有结合位点（图 3b））。随后的电泳迁移率变动分析（EMSA）验证了核蛋白的这种A等位基因优先结合是序列特异性的，如与未标记探针的竞争所示（图 3c）。抗体超迁移表明YY1存在于等位基因结合蛋白的这一子集中（图 3c），这已通过EMSA纯化的重组YY1蛋白质进一步验证（图 3c，d）。）。随后，我们使用抗YY1抗体进行了染色质免疫沉淀（ChIP），并在代表rs398206（AA，AC和CC）每种基因型的三个黑色素瘤细胞系中扫描了rs5503周围的〜5 Mb基因组区域。我们观察到AA细胞系中rs398206顶部的YY1结合显着富集，而AC系中的rs398206则较弱，但明显富集，而CC系中的rs398206则较弱（图 4a；补充图 14）。）。考虑到细胞系之间的差异（例如，DNA拷贝数差异，染色质在rs398206区域的可及性，YY1水平以及甲醛固定和染色质剪切效率的差异）也可能有助于差异化的YY1结合，我们还评估了等位基因特异性YY1在杂合AC细胞系（UACC647）中的结合。我们使用抗YY1抗体下拉的DNA片段对rs398206进行了基因分型。使用YY1抗体拉下的DNA片段显示出显着的A等位基因富集（Mann-Whitney U检验，P = 9.1e-3），而基因组DNA和连续稀释的输入DNA则显示了来自A和C等位基因的等效信号，表明清晰YY1在黑色素瘤细胞中的A等位基因优先结合（图 4b，c）。
一个使用UACC903的核提取物和21个碱基的双链DNA探针与A（风险）或C（保护）等位基因rs398206的定量质谱。右下象限显示A等位基因特异性相互作用蛋白，左上象限显示C等位基因特异性相互作用子。使用高（H）质量或低（L）质量标签的标签交换，x轴显示A绑定/ C 绑定比率，y方向显示C绑定/ A绑定比率-轴。两个轴均通过四分位数之间的截止值> 3的蛋白质用颜色编码表示从标签交换开始的一致（红色圆圈）和不一致（黄色圆圈）方向。显示了一致鉴定的蛋白质的名称。bYY1结合基序在顶部显示为位置权重矩阵（图案从HOCOMOCO数据库获得并使用weblogo3绘制）。rs398206周围的基因组序列显示在底部，具有与共有YY1结合基序匹配的风险相关A等位基因。基因组位置是hg19。c – d EMSA使用21 bp双链DNA探针和rs398206的a或c个等位基因以及UACC2331黑色素瘤细胞的核提取物（c）或纯化的重组YY1蛋白（d）。在c的最后泳道显示了使用抗YY1抗体的抗体超转移，其中A特异性条带（箭头）减小了。来自三个重复的代表性集合（c）和一个重复（d）。源数据作为源数据文件提供。
一个染色质免疫沉淀使用抗YY1抗体或正常IgG的随后通过qPCR。在顶部面板上，显示了使用5个qPCR引物组的扩增子的基因组位置，相对于MX2的第一个内含子中的rs398206（红色虚线）。来自三个黑素瘤细胞系的qPCR结果显示在底部面板上，在X轴标签上指示了rs398206的基因型。相对量显示为相对于输入DNA的倍数。绘制具有SD的PCR三次重复的平均值。显示了每种细胞系的一组代表性的三个生物学重复。b使用UACC647黑色素瘤细胞中的YY1 ChIP DNA对rs398206进行Taqman基因分型（rs398206为杂合子）。蓝色阴影区域标记了HapMap CEU DNA对照，显示了三个基因型簇的分离。分别绘制qPCR一式三份。显示了来自三个生物学重复的一组代表性样品。归一化的A和C等位基因强度分别显示为x和y轴上的dRn值。gDNA：基因组DNA。c来自三轮UACC647生物学复制的A / C等位基因比率的组合图。每个点代表从qPCR一式三份的2- （平均dCt（等位基因A-等位基因C））计算的A / C比。输入包括每个回合的三个10倍系列稀释液。用SEM绘制平均值。两尾曼恩·惠特尼U检验用于n = 9（输入）和3（YY1绑定）。源数据作为源数据文件提供。
基于这种强等位基因YY1的结合，我们接下来询问YY1是否调节内源性MX2表达水平。UACC903黑色素瘤细胞系中YY1的siRNA敲低表明，通过四组不同的siRNA 弱而一致地降低了MX2水平（降低14–32％，P = 1.5e-3–1.9e-5，一次样品Wilcoxon测试；图 5a；补充图 15a）指示YY1 对MX2水平的调节。为了进一步确定包含rs398206的基因组区域是否调节内源性MX2水平，我们使用dCAS9-KRAB-MeCP2 38通过CRISPRi靶向了该区域在同一黑素瘤细胞系中 直接与rs398206（gRNA 1、3和4）重叠或上游〜25 bp（gRNA 2）重叠的四个靶向基因组区域的gRNA导致MX2表达水平降低61–82％（P = 2.05e−4–3.19e−在图4中，单样本Wilcoxon测试；图 5b），而相同的gRNA对附近的MX1表达没有影响（补充图 15b）。由于rs398206位于MX2的内含子区域，因此对MX2的某些影响正式可能该表达可能是由于dCAS9-KRAB-MeCP2系统对转录机制通过的物理阻断。但是，使用不带转录阻遏元件的dCAS9的CRISPRi对MX2表达几乎没有或没有影响，这与CRISPRi对MX2的影响主要是转录相一致（补充图 15c–e）。
一个 YY1被撞倒在UACC647细胞中使用四个不同的siRNA，和MX2测定水平。GAPDH标准化的MX2 mRNA水平显示为相对于非靶向siRNA的倍数变化。 合并n= 6的四个生物学重复样本（总共n = 24）。b CRISPRi在UACC903细胞中使用dCAS9-KRAB-MeCP2和四种针对rs398206的不同gRNA。MX2 mRNA水平（GAPDH标准化）显示为相对于非靶向gRNA的倍数变化。 合并n = 6的三个生物学重复 样本（总共n = 18，除了gRNA-3，n = 17）。gRNA 1、3和4直接与rs398206重叠。gRNA 2靶向rs398206上游〜25 bp。AAVS1（靶向Chr19上与腺相关病毒整合位点的gRNA）。方框：中位数，介于25％至75％之间。晶须：百分之十至百分之九十。从非样本siRNA / gRNA的差异的一样品Wilcoxon测试（双面）显示P值。虚线表示非靶向siRNA / gRNA对照中的MX2水平。源数据作为源数据文件提供。
为了确定对通过YY1 调节MX2的 rs398206的其他支持，我们检查了涉及YY1的可用染色质相互作用数据。值得注意的是，YY1最近被证明可介导染色质环化并有助于TADs 39内基因启动子和增强子之间的相互作用。鉴于此，我们使用YY1抗体检查了这些已发表的Hi-ChIP数据中围绕rs398206的基因组区域周围YY1介导的染色质相互作用。在人类结直肠癌细胞系HCT116中，带有rs398206的5Kb bin显示出与包围MX2启动子区域39的相邻bin的强烈相互作用（PET计数= 18，P = 2.27e-80，超几何测试；补充图 16）。）。这些数据一起确定rs398206是通过Chr21q22.3黑色素瘤基因座中差异YY1结合调节MX2表达的功能性变体。
MX2最好其在先天免疫作为HIV-1的限制性基因功能已知的40，41。在GTEx组织类型中，在EBV转化的淋巴细胞，全血和脾脏中观察到最高的MX2表达水平，反映了其在先天免疫应答中作为干扰素刺激基因的主要作用（GTEx门户; https://gtexportal.org） 。另一方面，先前的研究也证明MX2在HeLa细胞的增殖中具有细胞自治功能，而无需IFNα介导的诱导42。在我们的主要黑素细胞数据集中，MX2在没有IFNα刺激的情况下，其以相对较高的水平表达（中位表达在所有表达的基因中排名最高的26.5％）。为了评估在表达黑素细胞共表达的基因和途径富集MX2在较高的水平，我们异形差异表达的基因之间MX2 -高（顶部25％; ñ = 28）和MX2 -低（最低25％; ñ = 28）黑素细胞来自106个人。我们在MX2高黑素细胞中鉴定了253个差异表达的基因（FDR <0.01和| log 2倍差异|> 1；补充数据 2），其中包括许多基于完整黑素细胞集中所有表达基因的成对比较的最相关的免疫应答基因（补充数据 3；补充表 10）。这253个差异表达基因中的显着富集途径包括可能与细胞免疫反应相关的那些途径，但也包括影响细胞生长和癌症的那些途径（图 6a；补充表 11），表明MX2可能具有黑素细胞特异性功能免疫功能。另一方面，对来自TCGA的黑色素瘤中免疫浸润的检查没有提供足够的证据证明MX2的作用除了与几种细胞浸润的弱相关性外，在肿瘤免疫监视中的应用（补充说明；补充图 17）。
对来自106个个体的MX2高黑素细胞与MX2低黑素细胞的差异表达基因进行的独创性途径分析。 使用来自106个个体的MX2高黑素细胞和MX2低黑素细胞之间的252个差异表达基因（FDR <1％和> 2倍变化）（基于MX2水平的顶部和底部分位数; 每个n = 28）作为分析的输入。富集P值基于双面Fisher精确检验，未应用多次检验校正。（BC）人原代黑素细胞C23（b）或黑素瘤细胞系UACC2545（c在xCELLigence系统上测量感染了MX2诱导型慢病毒构建体或Empty pINDUCER20载体的感染）。相对于多西环素添加时的细胞指数值进行归一化（垂直虚线：Dox）。强力霉素（dox）的量以ng / ml显示，并用颜色标记。绘制平均归一化细胞指数（彩色点）和SD（灰色垂直线）（n = 3）。显示了一组代表性的三个生物学重复。d机敏途径分析来自3个个体的MX2过表达与对照黑素细胞的RNA测序差异表达基因。MX2之间的158个差异表达基因（FDR <10％）使用3个个体的3个生物学重复的-过表达（100ng / ml强力霉素）相对于对照（无强力霉素）黑素细胞作为分析的输入。相对于高MX2黑色素细胞（a）或MX2过表达黑色素细胞（d），显着富集的规范途径（P <0.05和| Z-分数|> 1）用颜色编码。富集P值基于双面Fisher精确检验，未应用多次检验校正。每种颜色的阴影从弱到强代表Z分数的相对大小：正Z分数在1到2.646之间，负Z分数在-1到−3.464之间（a）或1到1.134之间的正值，以及-1.342到-2.236（d）之间的负值，其中最亮的红色接近1，最亮的蓝色接近-1。（e）GFP或MX2组成年鱼的代表性图片。在注射后第10周拍摄照片。f斑马鱼黑素瘤模型43（Tg（mitfa：BRAF V600E），p53 -/-，mitfa-/-）的无黑素瘤生存曲线。在一个细胞阶段向鱼注射miniCoopR mitfa：MX2或miniCoopR mitfa：EGFP并每周监测黑色素瘤的形成。将来自三个独立实验的无黑素瘤鱼的百分比合并并作图。使用对数秩检验。源数据作为源数据文件提供。
考虑到MX2黑色素细胞特定功能的可能性，我们假设黑色素细胞特定MX2表达可能在黑色素瘤形成的早期事件中起作用。为了检验该假设，我们首先询问MX2是否会在单个培养系统中影响原代黑素细胞和黑素瘤细胞的生长。使用xCELLigence系统进行的细胞生长试验表明，MX2的慢病毒表达可诱导（72小时诱导2-10倍；补充图 18a，b）导致100 ng / ml的黑素瘤细胞和原代黑素细胞的生长略有下降。强力霉素处理，而空载体转导的细胞未显示任何差异（图 6b，c）。为了开始理解哪些基因和途径可能受到MX2表达增加的影响，并可能是改变的黑素瘤细胞/黑素细胞生长的基础，我们对过表达MX2的黑素细胞进行了RNA-seq分析（72 h诱导2-10倍；补充图 18a，c）。与对照相比，过表达MX2的黑素细胞中差异表达的基因（158个基因，FDR <10％；来自3个个体的黑素细胞，每个生物重复3个；补充数据 4）显示了与免疫应答相关的途径以及涉及第二信使的途径的富集介导的激酶信号传导和细胞生长等（补充表 12；图 6d）。我们随后检查了在MX2诱导后较短时间点富集的途径（6小时，一个人的黑素细胞，3个生物学重复），并观察到一致的结果，突出了细胞内第二信使信号，癌症，细胞生长，神经递质，心血管信号以及细胞信号。免疫应答（补充说明；补充数据 5和6；补充表 13和14）。由于这些数据并未为特定机制假说提供强有力的支持，该假说将MX2增加对单一培养物中黑素细胞生长减少的影响与其与黑素瘤风险的关系联系起来，因此我们推测MX2的影响黑素细胞的生长可能取决于细胞环境和微环境而改变。
为了测试这个想法并确定黑素瘤发展或进展中MX2表达的黑素细胞特异性作用，我们结合斑马鱼黑素瘤模型与最常见的体细胞驱动黑素瘤BRAF V600E事件一起研究了人MX2的转基因表达。使用先前开发的miniCoopR转基因系统43，我们在BRAF V600E和p53 -/-背景下使用MITF启动子仅在黑素细胞谱系中过表达了人MX2。结果表明斑马鱼与转基因人类MX2 在这种遗传背景下 ，与具有GFP对照的鱼（19周的鱼的33％；n = 194）相比，该表达呈现出加速的黑素瘤形成（46％的鱼到19周发展为黑色素；n = 184）（P = 0.003； log -等级测试；图 6e，f）。虽然我们没有发现两组的肿瘤计数和色素沉着有显着差异，但在中位发病时，我们观察到MX2组的肿瘤大小比GFP对照组大（P = 0.028；卡方检验），与加速通过生存分析证明肿瘤形成（补充图 19））。我们进一步进行了斑马鱼黑色素瘤的组织病理学分析，未观察到MX2和GFP组之间肿瘤形态和侵袭的总体差异（补充图 20a-d）。磷酸组蛋白H3的免疫组织化学也未显示两组之间细胞增殖的显着差异（P = 0.47，两尾t检验，n = 5；补充图 20e-g）。这些数据一起与导致黑素瘤风险增加的MX2表达一致，但与体外数据一致（可能是通过细胞增殖增加以外的其他机制）。
在这项研究中，我们采用了一种整合方法，将MPRA与细胞类型的特定表观基因组学和eQTL数据相结合，以有效地提名来自20个已知黑素瘤GWAS基因座的功能变异和易感基因。我们证明MPRA是高吞吐量的变量优先级排序工具，是对统计精细映射的补充。而贝叶斯细映射方法可以提名用于功能测试可信因果少数变体，这些方法仍然可以通过对归咎，插补质量，人口LD参考，因果依赖性的假设限制，的功能注释的数据集的选择44，45。此外，仅通过遗传数据仍很难区分与LD紧密连锁的变体，并需要进行单独的功能测试。为此，MPRA提供了一种不可知的方法，可以快速筛选通过LD链接的大量变体，而无需依赖于有关LD结构或因果关系的假设。通过应用保守的截止值，我们从39个黑色素瘤GWAS基因座中鉴定出显示等位基因转录活性的39个变体，并显示与其他测试变体相比，它们更可能改变转录因子结合偏好，并且更有可能是因果关系。从每个基因座平均52个与活跃染色质区域重叠的高LD黑色素瘤相关变体开始，MPRA将候选变体的范围缩小至每个基因座平均2.78。这些结果凸显了我们的方法在利用功能测定法补充统计精细图和破坏LD结构中的实用性。为了进一步确定变体的功能，顺式调节局部基因表达，我们将39个MPRA显着变异体与黑素细胞eQTL数据整合在一起，最能代表黑素瘤起源的细胞类型。通过选择显示与来自eQTL的等位基因方向相同的等位基因方向的变体，我们提名了来自四个基因座的候选基因和变体的简短列表。特别是，从21q22.3染色体染色体上的基因座中，测试的22个总变异体中有5个 具有GWAS前导SNP（rs408825）的接近完美LD（r 2 > 0.99），包括鉴定该基因座的原始研究的前导SNP （rs45430）9（补充表 8）。尽管在本研究中使用PAINTOR进行贝叶斯精细映射和在先前研究中使用eCAVIAR进行eQTL共定位24如果为这些完美的LD SNP中的一些分配较高的概率分数作为黑色素瘤风险和/或eQTL的因果变体，则这组22个SNP的MPRA结果确定rs398206（r 2 = 0.94，SNP领先）是最重要的功能变体。将这一结果与黑色素细胞eQTL提名的MX2整合为最佳候选易感基因，我们对该基因座进行了全面的功能表征，包括生成动物模型作为原理证明。
此外，我们的整合方法有效地鉴定了来自其他三个黑色素瘤GWAS基因座的最合理的易感基因和功能变异。对于染色体22q13.1上的黑色素瘤基因座，MAFF水平升高与风险相关。MAFF是受EGF信号传导46调控的一种小的Maf蛋白，在氧化应激反应47中发挥作用，这与黑素生成有关，因为黑素细胞易受可归因于黑色素产生的氧化应激48。对于染色体带1q21.3和2q33-q34上的基因座，降低CTSS和CASP8水平分别与风险相关。CTSS是组织蛋白酶的一员，最初被称为溶酶体酶49。在某些癌症（乳腺癌和结直肠癌）的情况下，CTSS表达的增加与不良预后相关，但在其他癌症（肺癌）中，CTSS的表达也与预后较好相关。CASP8主要因其在细胞凋亡中的功能而闻名50，而GWAS也暗示CASP8基因座可用于乳腺癌51和基底细胞癌52。我们的结果为这三个基因提供了有力的支持，并需要进一步的深入表征。
我们的方法还成功地确定了目前尚不支持细胞类型特异性黑素细胞eQTL的9个黑素瘤基因座中的少量候选功能变体（每个基因座中位1个变体）（补充表 6）。这些变体可能代表了我们无法检测黑素细胞顺式的基因座的功能候选物-仅来自106种文化的eQTL。或者，由于我们的eQTL数据集基于在培养的原代黑素细胞中捕获的基因表达模式，因此这些变体有可能在此eQTL数据集中未捕获的特定细胞环境中发挥作用。假设我们的MPRA分析是在黑色素瘤细胞中进行的，则此类变体可能仅在致癌信号（例如，致癌性BRAF），肿瘤抑制因子丧失（例如，CDKN2A）或永生化的背景下起作用事件（例如，TERT的突变启动子）。在其他基因组规模的数据集（包括细胞类型特异性染色质相互作用数据，以及不同细胞环境的染色质特征）的背景下，对这些变异体的未来评估可能会加强或阐明这些基因座的潜在功能。
通过分子审讯，我们证明了黑色素瘤相关的内含子变体rs398206 通过修饰募集转录因子YY1的增强子来促进MX2的等位基因表达。我们对原代黑素细胞的多QTL分析进一步支持了转录机制，同时通过剪接排除了另一种机制。尽管我们的数据表明YY1转录因子通过功能性SNP 在MX2调控中起着主要作用，但其他反式作用因子，也可能是通过质谱鉴定出的其他蛋白，其等位基因差异不那么明显（例如，KLF9， ZBTB7A，PAX3），也可能在观察到的等位基因转录调控中起作用。
我们的斑马鱼模型进一步支持MX2作为黑色素瘤易感基因，当它在黑素细胞系细胞中表达时会加速黑色素瘤的形成。MX2已经主要被称为先天免疫的效应，赋予限制HIV-1感染40，41，其在melanomagenesis角色尚未研究很好。我们的发现表明，在BRAF V600E（一种频繁的体细胞驱动程序突变）的存在下，当MX2仅在黑素细胞系细胞中表达时，它在促进黑色素瘤形成中发挥作用。与斑马鱼模型中较高水平的MX2过表达不同，黑色素瘤风险和MX2增加在人群中与该常见功能变体相关的水平（rs398206风险等位基因频率= 0.61，EUR）相当适度，对于癌症相关的常见变体几乎总是如此。MX2水平升高的影响可能仅在黑色素瘤发展过程中的特定情况下起作用。我们针对MX2的单细胞类型生长测定法也显示了在黑素细胞谱系中MX2的生长效果，尽管皮肤上没有相邻的细胞类型，但方向相反。最近的一项研究还报道了MX2过度表达导致在原发性黑素细胞和黑素瘤细胞生长减少，而影响可能是在黑色素瘤细胞的一个子集相对53。我们的斑马鱼肿瘤增殖试验还表明，MX2加速黑色素瘤的形成可能不是由于增殖本身的增加。鉴于这种明显的复杂性，我们推测MX2在黑素细胞谱系细胞生长中的功能可能取决于细胞环境（例如体细胞驱动事件）和/或与微环境的相互作用（例如免疫细胞）。需要进一步的研究来弄清单细胞类型测定与斑马鱼模型之间的差异，以及MX2促进黑色素瘤促进的分子机制。尽管如此，我们的发现仍将MX2确立为在黑素瘤易感性和免疫反应中显示多效性作用的基因，并基于端粒生物学（TERT，Chr5p15.33）19和致癌基因诱导的衰老（PARP1，Chr1q42.1）18在普通人群中对黑色素瘤的遗传易感性。
Law和同事1报道的荟萃分析对20个全基因组重要位点进行了精细映射，方法与Barrett等人的方法非常相似。54。使用Law等人的结果。1在每个基因座的最显着变异体的任一侧，将窗口定义为1 Mb。唯一的例外是包括ASIP的区域基因（20q11.2-q12），其中定义了6 Mb区域，因为该区域显示了长距离连锁不平衡。黑色素瘤病例/对照状态依次在这些区域上回归到每个基因型和归因变异体，前四个主要成分作为协变量，以解释荟萃分析对12,419例病例和14,242例对照的分层（仅哈佛大学GWAS样本和无法进行Q-MEGA_610k研究的子宫内膜异位症对照）。每个区域进一步缩小到最极端的SNP两侧p值<10 -6的 500 kb的间隔在最初的单SNP分析中，删除了插补INFO得分<0.5（对于MAF> = 0.03的变体）或INFO得分<0.8（对于MAF <0.03的变体）的所有变体。HyperLasso 25中实施的贝叶斯启发式惩罚最大似然方法已应用于这些区域。HyperLasso的100次迭代然后进行，使用的所有变体中的每个区域和用于SNP效应的正常指数伽玛先验分布与形状参数1.0 55，56和尺度参数，使得1型误差为10 -4。研究（作为分类变量）和前四个成分均作为协变量包括在内。由于测试变量包含的顺序的随机性，因此产生了许多潜在的模型，其中包括一些可以被认为彼此“对应”的模型，因为它们仅通过替换非常不同的遗传变量而有所不同。强LD（r 2 > 0.9）。通过删除等效模型，可以生成一组简化的模型，然后通过将其似然性比最佳模型低任何可能性> = 10的任何模型进一步缩小，对于每个剩余模型，使用模型中的SNP以生成调整后的比值比。对于保留在任何模型中的SNP，定义了LD区块（基于HyperLasso结果和LD的强度），并从每个区块中选择了最重要的SNP（在多变量分析中）。精细映射中未发现TERT基因（5p15.33）附近区域的rs36115365，但已包含其作为变体选择，因为先前已根据功能证据对其进行鉴定19。随后的分析表明，在rs36115365和rs2447853（当时是该区域中最重要的SNP）处，与风险相关的等位基因处于LD阴性，而对后者进行调整后，rs36115365的P值为10 -4（补充表 1）。类似地，对于2p22.2染色体带上的基因座，最佳模型是2-SNP，但是在一些研究中rs163094的次要信号显示出较低的INFO得分，从而使插补的最优性降低，因此未用于变异选择。取而代之的是，包括了由1-SNP模型确定的最佳SNP（rs1056837；CYP1B1的错义变体）（补充表 1）。由于MC1R周围区域的影响黑色素瘤风险的基因（16q24.3）主要由几个公认的编码变体12解释，我们没有在精细定位数据中包括此区域。
其中由法律和同事在黑色素瘤的荟萃分析20全基因组位点显著1，我们优先考虑16个位点，其中潜在的顺 -regulatory机制可以应用。我们排除了涉及黑素瘤相关色素沉着表型（SLC45A2，TYR，MC1R和ASIP基因座）的其他4个基因座基因，因为对于这些基因中的许多基因，编码变体均显示出可改变蛋白质功能。为了选择16个黑色素瘤GWAS基因座的高LD代理变体（Law et al。，2015 1），我们使用以下标准：
1。
主要的铅单核苷酸多态性取自Law等。1篇荟萃分析论文，当有其他最佳SNP可用时，补充其他HyperLasso分析中的文章。
2。
对于8个基因座，HyperLasso分析指定了独立的多个次级信号，并且还添加了这些先导SNP。
3。
选择r 2 > 0.4的SNP，并使用1000个基因组3期EUR或CEU种群的一级或二级先导SNP作为高LD变异（n = 2748）。
为了区分与黑素细胞/黑素瘤开放染色质区域和/或活性启动子/增强组蛋白标记重叠的高LD变体，我们使用了以下一项或多项标准：
1。
变体位于人类黑素细胞DHS峰中，可通过ENCODE和Epigenome路线图数据库获得三个人中的一个或多个。
2。
变体分别位于一个或多个人的黑素细胞H3K27Ac ChIP-Seq峰内，两个或三个人的一个或多个人的H3K4Me1 ChIP-Seq峰内，分别可通过Epigenome Roadmap数据库获得。
3。
变体分别位于通过表观基因组路线图数据库可得的来自一个或多个个体的人黑素细胞H3K27Ac ChIP-Seq峰和来自两个或三个的一个或多个个体的H3K4Me3 ChIP-Seq峰内。
4。
变体位于人黑素瘤短期培养物中的FAIRE-Seq峰中，该峰来自Verfaillie等人的11个个体中的一个或多个。26。
基于上述标准，选择了832个黑色素瘤GWAS变体进行MPRA测试。我们还包括来自Chr1q21.3的8个其他变体 ，其前导SNP 的r 2 > 0.8，但与上面列出的任何功能性标记均不重叠，并将其指定为阴性对照。在832个变体中，在两个库中重复了306个以及8个阴性对照，以确保跨库一致性（请参阅MPRA寡核苷酸库设计）。这306个变体 的前导SNP 也是r 2 > 0.6，并受黑色素细胞或黑色素瘤数据的开放染色质和组蛋白标记注释的支持。补充数据1中列出了测试的变体的完整列表 。
寡核苷酸文库设计主要从以下发表作品的准则21，27有一些修改。安捷伦科技公司（加利福尼亚州圣塔克拉拉）合成了两个包含200个寡聚核苷酸的32,580个（文库1）和36,660个（文库2）独特序列的文库（两个文库中共有50,400个独特序列，两个文库中均有18,840个重复）。补充数据1和补充表 3中列出了GWAS基因座和重复变体所组成的每个文库 。对于每个变体，合成了145个碱基，包括正向和反向都具有风险或保护性等位基因的变体，以及10个不同的10个碱基随机条形码序列。序列的这两个部分被限制性内切酶KpnI（GGTACC）和XbaI（TCTAGA）的识别序列隔开，并被PCR引物的结合序列侧翼（200个碱基的寡核苷酸序列：5'-ACTGGCCGCTTCACTG-145个碱基-GGTACCTCTAGA-10个碱基的标签-AGATCGGAAGAGCGTCTCG-3'）。对于每个变体，也以相同的方式在正向和反向上测试了加扰序列（包含SNP和参考等位基因的21个核心碱基）。这相当于每个变体设计总共60个独特序列。当除测试SNP之外的其他SNP位于145 bp区域时，使用欧元人口中的主要等位基因。对于插入缺失，基于插入等位基因设定145个碱基的长度，而缺失等位基因短于145个碱基。随机生成10个基本标签序列，以便每个库具有多达36,660个唯一标签序列（每个库使用相同的36,660个标签序列）。对于10个碱基的标签序列和21个碱基混乱的核心序列，仅使用<4个碱基的均聚物，并避免了KpnI，XbaI和SfiI的酶识别位点。寡核苷酸序列的完整列表可以在补充数据中找到 每个文库使用660个标签序列）。对于10个碱基的标签序列和21个碱基混乱的核心序列，仅使用<4个碱基的均聚物，并避免了KpnI，XbaI和SfiI的酶识别位点。寡核苷酸序列的完整列表可以在补充数据中找到 每个文库使用660个标签序列）。对于10个碱基的标签序列和21个碱基混乱的核心序列，仅使用<4个碱基的均聚物，并避免了KpnI，XbaI和SfiI的酶识别位点。寡核苷酸序列的完整列表可以在补充数据中找到 7。
进行MPRA文库构建和测序以下公布的方案有一些修改21，27。对于文库克隆，使用Herculase II融合聚合酶（安捷伦）和2 µM提供SfiI酶位点的引物，通过乳液PCR扩增凝胶纯化（10％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶）寡核苷酸文库中的10个飞摩尔寡核苷酸（补充表 15）。），并按照Micellula DNA乳液和纯化试剂盒（EURx / CHIMERx，密尔沃基，威斯康星州）的说明进行操作。使用KAPA qPCR测定法对扩增的寡核苷酸进行定量，并通过在离子PGM上的DNA测序进行验证。使用Ion Plus片段文库试剂盒（Thermo Fisher，Waltham，MA）使用乳液PCR中的30 ng寡核苷酸制备扩增子文库，并在Ion PGM上进行测序，平均读取长度为203 bp和175 bp，分别为670万和560万次读取库1和库2的样本。为了验证寡核苷酸文库的设计，寡核苷酸内的21 bp序列（包括变异位点和+/- 10 bp）用于映射至每个测序读数。使用了Linux命令fgrep，仅保留了100％的序列匹配。然后，我们计算了由匹配序列表示的每个变体的总读取深度，然后计算经过验证的变体序列的比例。对于文库1和文库2，使用至少10个测序读数检测到超过97％的代表文库变体的独特序列。此外，我们发现两个库中代表正向和反向的序列的比例和读取深度相似。如果我们使用实际的标签序列作为诱饵，则可以验证82％的标签，但需要注意的是，由于在此扩增子位置上相对较差的测序质量，一些标签被扩增但未被检测到。首先，使用SfiI位点通过电穿孔将经过序列验证的寡核苷酸文库克隆到pMPRA1载体（Addgene，Watertown，MA）中，该细菌细胞的数量是寡核苷酸文库中独特序列数量的10倍。克隆的pMPRA1在145 bp测试序列和10 bp条码序列之间的KpnI和XbaI位点上进一步消化，其中分别从pMPRAdonor2和pMPRAdonor1（Addgene）连接有或没有最小启动子的luc2 ORF。通过电穿孔将连接产物以相同的方式转化为数量高出10倍的细菌细胞。在KpnI消化后，将克隆的最终转染文库在凝胶上验证为一条条带。
每个文库至少转染四次（每种启动子类型两次转染）到HEK293FT或UACC903黑色素瘤细胞中，目标转染细胞数比文库复杂度高100倍以上。使用通过单独的GFP转染和可视化测量的转染效率来估计转染细胞的数目。转染摘要列于补充表 4中。用Lipofectamine 3000转染细胞，转染后24小时收获细胞用于RNA分离。使用Qiagen RNeasy试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）分离总RNA，随后使用PolyA pure MAG试剂盒（Thermo Fisher）分离mRNA。然后使用Superscript III合成cDNA，使用Q5高保真聚合酶（NEB，Ipswich，MA）和引入Illumina TruSeq衔接子序列的引物，仅扩增包含10 bp独特条形码的短序列（补充表 15）。标签序列文库也使用输入DNA以相同方式制备。每个标签序列文库均在HiSeq2500的单泳道上测序（125 bp配对末端读取）。
使用来自输入DNA或RNA转录物测序的FASTQ文件，我们对完全匹配10 bp条形码序列（标签计数）和相同下游序列上下文（TCTAGAATTATTACACGGCGCG）（包括XbaI识别位点和3'）的读段（Illumina读段1）进行计数的luc2基因。对于每种转染（相当于一个测序运行），通过将每个标签计数除以序列匹配标签计数的总数除以一百万，可以计算出每百万个测序读数的标签计数（TPM）值。然后将TPM比率作为输入DNA TPM的RNA TPM并转换log 2。
从每个输入的DNA文库中，至少检测到92.1％的条形码序列，并且在10次读取或更高的读取率下覆盖了> 89.3％。从RNA样品中检测到条形码序列的87.4–93.3％，并且在10个读数或更高的读数下覆盖了84.8–90.8％（补充表 4）。显示10个标签或更少标签数量的条形码被排除在进一步分析之外。分析中包括的条形码的中值标签计数为：DNA输入为48,973–49,903，RNA输出为46,471–49,758。通过log 2的 Pearson相关性评估转染之间的可重复性转染重复之间每个条形码的TPM转化率。我们观察到每个转染HEK293FT细胞的文库的相关系数为0.944或更高，而UACC903细胞的相关系数为0.935或更高（中位数Pearson r = 0.984；补充图 3）。跨文库的重复序列之间也进行了相关性测试。我们观察到，HEK293FT细胞的相关系数为0.821或更高（补充图4），UACC903细胞的相关系数为 0.815或更高（补充图 5；中值Pearson r = 0.854）。为了避免输入的DNA数量少导致RNA / DNA TPM比率变化，我们从进一步的分析中删除了<6 TPM数量的标签。其余标签占所有检测到的标签的77.47％（补充图 6）。
我们使用标准线性回归模型分析了归一化的MPRA测量值（log 2转换的TPM比）。我们在调整Strand（正向或反向）的影响作为二元协变量，Transfection作为具有18个水平的分类协变量的影响后，使用Wald检验来测试等位基因对MPRA水平的影响（考虑到不同的启动子状态和细胞类型以及交叉转染变异）。为了考虑测量误差中的潜在异方差，我们在Long和Ervin 57的推荐下，在Wald检验中使用了鲁棒的三明治类型方差估计，并使用R包Sandwich进行了分析。为了评估包括变体在内的145 bp DNA元件的总体转录活性，我们使用了变体特异性加扰序列作为无效序列。使用相同的协变量（Strand和Transfection），将对数序列的Log 2变换的TPM比值相对于参考等位基因或替代等位基因进行回归。日志2每次转染中每个标签的TPM比率均被视为回归的实验重复。仅使用来自UACC903黑色素瘤细胞的数据进行了同一组分析，并进一步删除了来自两个文库之一（库1）的重复变体的数据，以进行后续的富集分析。仅在UACC903和组合集中均显示等位基因差异和从空值偏离（对于等位基因而言）的FDR <0.01的变体称为重要MPRA变体。完整的MPRA数据可在补充数据7中找到 。
重要的eQTL基因定义为黑色素细胞24中通过eCAVIAR（CLPP> 0.01）或TWAS（P值<0.05 /测试的基因数）明显鉴定的候选基因。在所有832个变体中，如果它们对其中一个重要eQTL基因显示出全基因组显着的黑素细胞eQTL P值（名义P值<基因水平的全基因组范围的阈值，如Zhang等人24所定义），则选择这些变体。六个基因（ARNT，CTSS，PARP1，CASP8，MX2和MAFF）的5个基因座中有显着的eQTL SNPs包含在MPRA中，而最终的MPRA显着变异体在4个基因座中与eQTL SNPs重叠，其中一个SNPs子集还显示了MPRA和黑素细胞eQTL之间四个基因（CTSS，CASP8， MX2和MAFF；补充表 6）。
使用motifbreakR软件包28和人类转录因子结合位点模型（HOCOMOCO）的全面收集58，对变体对转录因子结合位点的影响进行了预测。我们选择信息内容算法，并使用0.001阈值作为motifbreakR中转录结合位点匹配的最大P值。替代等位基因得分和参考等位基因得分之间的对数2倍变化用于预测每个变体的转录因子基序效应。
使用PAINTOR 3.0（http://bogdan.bioinformatics.ucla.edu/software/paintor）来估计黑色素瘤基因座内任何SNP的因果关系。我们在PAINTOR中使用默认参数（窗口大小为100Kb，最大因果数为2），并滤出了P值> 0.5的所有SNP，以提高计算效率。使用1000个基因组EUR数据计算每个窗口中所有SNP之间的成对LD。作为PAINTOR软件的一部分提供了功能注释，该注释与黑素细胞特异性基因组注释互补24。为了确定与所考虑的表型相关的注释，我们在每个注释上独立运行PAINTOR，然后为最终模型选择具有高对数贝叶斯因子的初级黑素细胞特有的4个注释，以计算因果关系的特质后验概率。这4个注释包括来自我们的黑素细胞数据集24的黑素细胞特异性表达基因，黑素细胞增强子，转录区域以及ENCODE和Roadmap中的组蛋白标记（H3T11ph）。除了不符合我们分析参数的变体之外，PAINTOR还为832个MPRA测试的变体中的462个分配了后验概率，并用于富集分析。
原发性黑素细胞eQTL数据来自我们先前的研究24，其中分析了106个主要是欧洲体面的个体。为了对包括rs398206在内的TAD中的基因进行边缘eQTL分析，基于RSEM定量> 0.5的表达阈值（根据期望最大化的RNA-Seq，按期望最大化59）选择了21个基因，并在至少10个样本中读取了≥6。使用FastQTL 60，标称P每个基因与rs398206的所有SNPs +/- 2 Mb之间产生一个-value值，以检验另一种假设，即基因型和表达水平之间的线性回归模型的斜率偏离0。与使用的协变量相同应用了eQTL分析（三大基因型PC和十大PEER因子）。经Bonferroni校正的P截止值 然后将21个基因的<0.0024应用于选择具有rs398206的边缘eQTL的基因。对于sQTL和meQTL，我们使用相同的基因型数据，群体结构协变量和统计方法，执行了与以前的eQTL研究相似的QTL分析。我们用标准化的剪接连接事件（sQTL）和标准化的甲基化值（meQTL）代替了标准化的基因表达水平。我们还根据这些表型值重新计算了前15个PEER因子。对于sQTL分析，使用STAR 61将RNA-Seq读图定位到基因组（hg19）上，然后按照作者描述的步骤（http://davidaknowles.github.io/）应用LeafCutter 30定量剪接连接。leafcutter / articles / sQTL.html）。对于meQTL分析，我们在Illumina Infinium Human Methylation 450 K BeadChip上进行了全基因组DNA甲基化分析。根据NCI癌症基因组研究实验室的制造商说明，测量所有106个原代黑素细胞样品的甲基化水平。使用RnBeads管道62和minfi程序包63（http://bioconductor.org/packages/minfi/）进行原始甲基化密度的测量和质量控制。我们总共保留了635,022个探针用于下游meQTL分析。没有发现批次效应，也没有电镀问题。为了获得meQTL分析的最终甲基化水平（β值），使用在minfi R软件包中实现的preprocessFunnorm算法进行归一化63。
从Thermo Fisher（马萨诸塞州沃尔瑟姆，全长转录本：Hs01550809_m1和AP323EZ; ENST00000543692：APYMKKU; ENST00000418103：AP2W9U3）获得针对MX2转录本同工型的独特连接的Taqman分析。定制化验设计基于Ensembl75 GRCh37注释。从主要来自欧洲体面24岁的106个个体的黑素细胞的原代培养物中分离出RNA ，并使用iScript Advanced cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）合成cDNA。Taqman测定一式三份进行（技术重复），取平均值至单个数据点，并标准化至TBP水平。基于RNA-seq数据，TBP选自16种常规人类对照基因，是黑素细胞数据集中变化最小的基因之一。
黑色素瘤细胞系（UACC903，UACC647，UACC2331，UACC502，UACC2545和UACC612）在含有RPMI1640、10％FBS，20 mM HEPES和两性霉素B /青霉素/链霉素的培养基中生长。测试所有细胞系支原体污染为阴性。
对于每个测试的SNP，从带有风险或保护性等位基因的HapMap CEU面板样品的基因组DNA中扩增出与rs398206完全相同的145 bp序列，包含在MPRA中测试的序列。将引物设计为携带15个碱基5'突出端，识别正向和反向KpnI单切后pGL4.23载体的任一侧，以促进重组（补充表 15）。然后使用In-Fusion HD Cloning试剂盒（Clontech）将含有145 bp序列的扩增片段克隆到pGL4.23载体中。按照制造商的说明书（Thermo Fisher），按照制造商的说明（Thermo Fisher），将脂质体与海肾荧光素酶共转染到黑色素瘤细胞系（UACC903和UACC502）中，形成24孔格式。转染后24小时收获细胞用于荧光素酶活性测定。所有实验均以至少6个重复的集合中的至少三个生物学重复进行。
用5'生物素标记合成了包含rs398206的21-mer DNA寡核苷酸的正向和反向链（Life Technologies;补充表 15），然后退火制成双链探针。使用NE-PER核和细胞质提取试剂（Thermo Scientific）从活跃生长的黑素瘤细胞（UACC2331）中制备核提取物。将探针与2 µg核提取物结合，并在结合缓冲液中与1 µg poly d（IC）（Roche，巴塞尔，瑞士）或100–750 ng YY1全长重组蛋白（31332，Active Motif，Carlsbad，CA）一起预孵育含有10 mM Tris（pH 7.5），50 mM KCl，1 mM DTT和10 mM MgCl2在4°C下放置30分钟。为了进行竞争测定，在添加探针之前5分钟，将未标记的竞争者寡核苷酸添加到反应混合物中。完成的反应在5％或4-20％的天然丙烯酰胺凝胶上进行，并使用LightShift化学发光EMSA试剂盒（Thermo Scientific）显影转移的印迹，并在Chemidoc Touch（Bio-Rad，Hercules，CA）上成像。
按照Active Motif ChIP-IT高灵敏度试剂盒的说明，当〜85％汇合时，黑色素瘤细胞（UACC903，UACC647和UACC612）用1％甲醛固定。然后将均质的7.5×10 6个细胞均质化，并使用Bioruptor（Diagenode）在高设置下超声处理15分钟，进行30秒开启和30秒关闭循环。依照制造商的说明，使用来自YY2（sc-1703x，Santa Cruz）或正常兔IgG（sc-2027; Santa Cruz）的抗体，对2×10 6个细胞的剪切染色质进行每次免疫沉淀。使用补充表15中列出的引物通过SYBR Green qPCR分析纯化的下拉DNA或输入DNA的靶位点富集 。如Weintraub及其同事报道39，设计了一个针对YY1结合的阳性对照引物，靶向RAF1基因启动子附近的已知YY1结合位点。从每个引物组的标准曲线驱动每个样品的相对量，并标准化为1/100输入DNA。对于rs398206的基因分型，将来自每个细胞系的输入DNA或基因组DNA以及从UACC647细胞系（rs398206的杂合子）中提取的DNA用作Taqman基因分型测定（测定ID：C_2265405_20）的模板DNA。所有实验均一式三份地进行至少三个生物学重复。
从生长在RPMI 1640培养基（Gibco）中生长的UACC903细胞中收集用于质谱分析的核裂解液，该培养基中添加了10％FBS，20 mM HEPES（pH 7.9），100 U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素（Gibco）64。通过Integrated DNA Technologies的定制合成对正链的5'-生物素化进行了排序，从而确定了包含rs398206的21 bp寡核苷酸探针（补充表 15）。使用1.5倍摩尔过量的反向链对正向和反向DNA寡核苷酸进行退火。如前所述，在96孔滤板系统上进行DNA下拉和珠上消化65。简而言之，每次下拉时，将500 pmol的退火DNA寡核苷酸固定在10μl（20μl浆液）链霉亲和素-琼脂糖珠（GE Healthcare，Chicago，IL）上。将固定的DNA寡核苷酸与500μgUACC903核提取物和10μg非特异性竞争者DNA（5μgpolydAdT，5μgpolydIdC）孵育。洗去未结合的蛋白质后，将珠子重悬于洗脱缓冲液（2 M尿素，100 mM TRIS（pH 8），10 mM DTT）中，用55 mM碘乙酰胺烷基化，并用0.25μg胰蛋白酶消化珠上。使用Stage Tip进行脱盐后，通过稳定的同位素二甲基标记对肽进行标记，如前所述65。每次下拉均一式两份进行，重复之间进行标签交换以消除标签偏差。合并匹配的轻肽和重肽，并上样到内部填充有1.8 um Reprosil-Pur C18-AQ（Dr. Maisch，GmbH）的30 cm色谱柱（加热至40°C）。使用Easy-nLC 1000（Thermo Fisher），以250 nL / min的流速在114分钟内使用9至32％Buffer B（80％乙腈，0.1％甲酸）的梯度从色谱柱上洗脱肽。将样品直接喷雾到Thermo Fisher Orbitrap Fusion三相质谱仪中。完整MS的目标值设为3e5 AGC目标，最大进样时间为50 ms。Full MS的分辨率为120,000，扫描范围为400-1500 m / z。选择电荷状态介于2和7之间的最强前体进行MS / MS分析，其强度阈值为10000，动态排除时间为60 s。MS / MS的目标值设置为2e4 AGC目标，最大进样时间为35毫秒。离子阱扫描速率设置为“快速”，隔离宽度为1.6 m / z，碰撞能量为35％。以数据相关的最高速度模式以3 s的周期收集扫描。热RAW文件由对UniProt的搜索与MaxQuant 1.6.0.1分析策划的人类蛋白质组（2017年6月发布）标准设置66。蛋白质比例通过中位数比例偏移进行标准化，并用于离群值调用。在两个生物学重复中的两个中，使用了1.5个四分位数范围的异常值截止。
使用ON-TARGETplus YY1 siRNA（J-011796-08，J-011796-09，J-011796-10和J-011796-11; Dharmacon）在UACC647黑色素瘤细胞系中进行YY1的siRNA敲除。非靶向siRNA和靶向GAPDH的 siRNA 分别用于阴性和阳性对照。使用Lipofectamine RNAiMax（Thermo Fisher），按照24孔格式反向转染程序，将6个picomole siRNA转染到5×10 4细胞中。转染后72小时收获细胞用于RNA分离。实验以6个重复的集合的4个生物学重复进行。使用RNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并使用iScript Advanced cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）生成cDNA。MX2使用Taqman探针组（Assay ID：Hs01550809_m1）专门检测全长同工型并将其标准化为GAPDH水平。将qPCR一式三份（技术重复）平均视为一个数据点。还收获细胞用于从每个生物学复制物中分离蛋白质，以通过蛋白质印迹分析评估敲低效率。用RIPA缓冲液（Thermo Scientific，Pittsburgh，PA）产生总细胞裂解物，并进行水浴超声处理。样品通过4-12％Bis-Tris ready凝胶（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚）电泳分离。使用的主要抗体是兔抗YY1（sc-1703x，圣克鲁斯）和小鼠抗GAPDH（sc-51907，圣克鲁斯）。在源数据文件中为相应的图提供了未经裁剪的凝胶图像和分子量标记图像用于蛋白质印迹分析。
CRISPRi在UACC903黑色素瘤细胞系（rs398206的AA基因型）中使用靶向rs398206或附近的基因组区域的四种不同gRNA进行了表达（gRNA序列在补充表15中列出 ）。使用sgRNA Scorer 2.0算法67确定了指导RNA靶位。使用非靶向gRNA和靶向腺相关病毒位点1（AAVS1）的gRNA作为对照。对于每种sgRNA，将正向和反向寡核苷酸退火，并使用BsmBI限制酶（NEB）克隆到带有sgRNA支架的载体中。对于CRISPRi，将400 ng含gRNA的载体，500 ng dCas9-KRAB-MeCP2（Addgene：110821）或dCAS9（Addgene：47316）和100 ng pCMV6-entry载体（携带新霉素抗性标记）共转染变成2×10 5使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）按照逆转染程序将细胞放大至12孔格式。进行24孔培养时，仅需使用一半的DNA，脂质转染胺和细胞。转染后24小时，用1 mg / ml遗传霉素（Gibco）处理细胞。选择药物后48小时收获细胞用于RNA和蛋白质分离。实验以至少5到6个重复的集合中的至少3个生物学重复进行。使用RNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并使用iScript Advanced cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）生成cDNA。使用Taqman探针组（测定ID：Hs01550809_m1）测量MX2水平，该探针专门检测全长同工型并针对GAPDH进行标准化水平。将qPCR一式三份（技术重复）平均视为一个数据点。UACC903细胞支原体检测为阴性。伴随转染并收获细胞以从一组具有代表性的dCAS9与dCas9-KRAB-MeCP2实验（补充图15c，d）中进行蛋白质分离，用于蛋白质 印迹，方法与上述相同。在NuPAGE 3–8％Tris-乙酸蛋白质凝胶（Thermo Fisher）上分离蛋白质。使用的主要抗体是小鼠抗CAS9（7A9–3A3，活性基序）和小鼠抗GAPDH（sc-51907，圣克鲁斯）。在源数据文件中为相应的图提供了未经裁剪的凝胶图像和分子量标记图像用于蛋白质印迹分析。
黑色素细胞在补充了黑色素细胞生长试剂盒（ATCC PCS-200-041）和1％两性霉素B /青霉素/链霉素（120-096-711，Quality Biological）的真皮细胞基础培养基（ATCC PCS-200-030）中生长在24之前描述。使用miRNeasy Mini试剂盒（217004，Qiagen）按照先前描述的方法进一步用CTAB-尿素处理分离总RNA 68去除多余的黑色素。使用iScript Advanced cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从总RNA合成cDNA。然后使用定制的Taqman基因分型探针组（ANRWEYM）对rs398206基因组DNA和cDNA进行基因分型，基于Ensembl档案75注释，识别基因组DNA和cDNA（ENST00000543692），且在cDNA的左侧引物中有5 bp 5'突出端。在总共rs398206杂合的44个样本中，有27个通过QC的样本（cDNA和基因组DNA中等位基因的Ct值均低于38）用于基于dRn值计算A / C等位基因比率。
在四环素诱导型启动子的控制下，使用pINDUCER20载体（Addgene）在MX2 cDNA上进行慢病毒转导，从而进行黑素瘤细胞和黑素细胞生长测定。从Origene购买了pCMV6-entry骨架中的MX2 cDNA克隆（RC206437），然后通过引入终止密码子并去除3'Myc-DDK标签，将全长MX2 cDNA序列亚克隆至pENTR-1A载体，然后再转移至pINDUCER20载体（衔接子序列列于补充表 15）。pCMV6-entry载体上的BamHI和MluI位点以及pENTR-1A上的BamHI和XhoI位点用于亚克隆。从皮肤癌标本资源核心中的Invitrogen和/或Yale SPORE获得原代人黑素细胞，并使用带有人黑素细胞生长补充剂2（Invitrogen）的M254（Invitrogen）培养基在标准培养条件下生长。为了生产慢病毒，将慢病毒载体与包装载体psPAX2，pMD2-G和pCAG4-RTR2共转染到HEK293FT细胞中。转染两天后收集病毒，并通过Vivaspin20浓缩。将细胞与病毒孵育24小时，然后进行药物选择（1 mg / ml Geneticin，Gibco），然后进行实验处理和测定。对于xCELLigence分析，将每种细胞类型的最佳数量的细胞接种到RTCA E-plate 16中，并生长直至细胞指数稳定。然后加入不同量的强力霉素，并监测细胞指数72小时。所有实验均一式三份进行3次生物学重复。对于每一轮，伴随感染细胞并在强力霉素处理72小时后收获以分离蛋白质，以通过蛋白质印迹法评估MX2水平。使用的主要抗体是兔抗MX2（NBP1-81018，Novus Biologicals）和小鼠抗GAPDH（sc-51907，圣克鲁斯）。在源数据文件中为相应的图提供了未经裁剪的凝胶图像和分子量标记图像用于蛋白质印迹分析。所有实验均一式三份进行3次生物学重复。对于每一轮，伴随感染细胞并在强力霉素处理72小时后收获以分离蛋白质，以通过蛋白质印迹法评估MX2水平。使用的主要抗体是兔抗MX2（NBP1-81018，Novus Biologicals）和小鼠抗GAPDH（sc-51907，圣克鲁斯）。在源数据文件中为相应的图提供了未经裁剪的凝胶图像和分子量标记图像用于蛋白质印迹分析。所有实验均一式三份进行3次生物学重复。对于每一轮，伴随感染细胞并在强力霉素处理72小时后收获以分离蛋白质，以通过蛋白质印迹法评估MX2水平。使用的主要抗体是兔抗MX2（NBP1-81018，Novus Biologicals）和小鼠抗GAPDH（sc-51907，圣克鲁斯）。在源数据文件中为相应的图提供了未经裁剪的凝胶图像和分子量标记图像用于蛋白质印迹分析。
从原代黑素细胞（n = 106）的RNA-seq数据中，我们分析了MX2高（最高25％；n = 28）和MX2低（最低25％；n = 28）样本之间的差异表达基因（DEG）。。使用Rsubread程序包69中的 featureCounts获得了每个带注释基因（GENCODE v19）的可映射阅读的总数。所述SARTools 70的工作流用于进行质量控制，应用差分分析，并基于来自计数数据报告MX2 -高和MX2-低基。edgeR 71选择统计方法来确定基于负二项式分布的差异表达。具有标准FDR <0.01和| log 2倍差异| 的最终DEG列表 > 1应用于智能路径分析（IPA）。我们还进行了MX2与在这106个原代黑素细胞中表达的其余37,854个基因之间的成对基因表达相关性。邦费罗尼校正施加到P皮尔逊相关性-值（P <0.05 / 37854或1.32e-06;相当于FDR <0.05）。选择表达水平 与MX2显着相关的基因（FDR <0.05，N = 377）进行IPA分析。
为了对过表达MX2的黑素细胞进行RNA-seq分析，基于其低的基础MX2表达水平，选择了来自三个个体（C23，C29和C53）的黑素细胞的原代培养物。如上所述，使用克隆到pINDUCER20或空载体中的MX2 cDNA 使细胞生长并用慢病毒系统感染。选择药物后，将细胞用0或100 ng / ml多西环素处理（每种细胞系总共三个条件：pINDUCER20- MX2为0或100 ng / ml多西环素感染的细胞，然后对空载体感染的细胞进行100 ng / ml多西环素处理72小时，然后收获RNA和蛋白质。对于每个细胞系，进行了三个单独的感染（生物学重复）并进行了测序，以进行转录组分析（总共对27个样品进行了测序：3个条件，3个细胞系和3个生物学重复）。对每个细胞系进行蛋白质印迹以估计MX2诱导水平。对于C23黑素细胞的短期诱导实验，使用100 ng / ml多西环素测试了不同的诱导时间（3、6、24和72 h），并选择6 h作为基于以下步骤进行RNA-seq分析的时间点：通过western blotting MX2诱导水平。在6小时和72小时的时间点收集了用100 ng / ml强力霉素处理的C23细胞，并与对照进行了对照，未进行三次生物学重复处理。以与先前所述相同的方式分离总RNA24。按照Illumina TruSeq标准mRNA文库方案构建测序文库。在NovaSeq 6000上进行150 bp的配对末端测序，以使每个样品至少读取5千万次（范围53.0–82.4 M）。接收到FASTQ原始数据，并由MultiQC RNA-Seq模块 72（ https://multiqc.info）执行质量控制。拟作图算法Salmon 73用于使用GENCODE人类成绩单数据库（版本29）对成绩单表达进行快速且具有偏差意识的量化。根据表达资格进行主成分分析，并根据结果，用DESeq2 74计算差异表达基因（DEG）。调整细胞系，生物学复制和文库构建批次。通过比较用（100 ng / ml）或未用强力霉素处理的pINDUCER20- MX2感染的细胞，表达阈值FDR <0.1被认为是MX2过表达后的DEG 。使用IPA对重要的DEG列表进行了分析，以进行途径富集分析。P <0.05的阈值和非零的z得分用于鉴定明显富集的途径。与空载体感染pINDUCER20- MX2的细胞相比，空载体感染后100 ng / ml强力霉素处理的细胞的DEG分析不进行任何处理作为对照。使用来自此对照分析的DEG进行的IPA分析（FDR <0.01截止时的1838个基因）与A2蛋白内皮信号转导途径（补充表12和16）除外，与通过MX2过表达富集的主要途径在同一变化方向上没有重叠 。
在黑素细胞特异性mitfa启动子的控制下，将MX2开放阅读框克隆到miniCoopR表达载体43中。在一个细胞阶段用miniCoopR mitfa：MX2或miniCoopR mitfa：EGFP（作为阴性对照）在一个细胞阶段注射Tg（mitfa：BRAF V600E），p53 -/-，mitfa -/-胚胎。受精（dpf）后第5天，对胚胎进行分类以挽救黑素细胞，直至成年。在注射后第10至19周之间每周监测一次肿瘤形成。阴性对照和MX2之间没有可观察到的差异组中黑素细胞的拯救效率或5 dpf幼虫的整体色素沉着。注射后第10周拍摄成年鱼的代表性照片。通过独立注射复制相似结果的DNA构建体进行了三个不同样品大小的独立实验。使用这三组的组合数据绘制Kaplan-Meier生存曲线，P使用对数秩检验计算-值。在两组中位发病时定性评估了每条鱼的色素沉着，大小和黑色素瘤的数量。合并来自三个独立实验组的数据，并使用卡方检验计算P值。为了进行组织学分析，将斑马鱼在20周龄时安乐死，并在4％的多聚甲醛中固定过夜。石蜡包埋，切片，苏木精和曙红（H＆E）染色是根据Brigham＆Women's Hospital Pathology Core的标准技术进行的。免疫组织化学在Leica Biosystems Bond III自动染色平台上进行。磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体（＃9701，细胞信号技术，丹佛斯，马萨诸塞州）运行于1：黑色素色素漂白后，使用柠檬酸抗原回收的Leica Biosystems精细检测试剂盒进行500倍稀释。使用带有Olympus DP70相机的Olympus BX41显微镜对组织切片进行成像。在每条鱼的7个不同的肿瘤区域上对p-H3灶进行计数，总表面为1毫米2。斑马鱼是根据我们的脊椎动物协议以人道方式处理的，该协议实现了置换，还原和提纯的原则（“三个Rs”），已获得波士顿儿童医院动物护理委员会的批准，其中包括详细的实验步骤，用于描述的所有体内实验在本文中。
所有基于细胞的实验在单独的细胞培养物中重复至少三遍。显示有代表性的组时，重复实验显示出相似的模式。对于所有图，均显示单个数据点，其中包括中位数或均值，范围（最大和最小值）以及第25和第75个百分位数（如果适用）。每个图例中均指示了统计方法，数据点数以及重复项的数量和类型。
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