合成生物学是创建可以合理设计以实现独特和组合功能的疗法的强大工具。在这里，我们利用非致病性大肠杆菌Nissle是开发用于治疗癌症的生物疗法的多功能平台。工程细菌菌株称为SYNB1891，将STING激活靶向肿瘤中的吞噬性抗原呈递细胞（APC），并激活互补的先天免疫途径。SYNB1891治疗可产生有效的抗肿瘤免疫力，并在鼠肿瘤模型中形成免疫记忆，并强烈激活人APC。SYNB1891旨在满足可制造性和法规要求，其内置的生物防护功能不会损害其功效。
随着免疫肿瘤学领域的成熟以及临床上对更多疗法的评价，我们对肿瘤免疫细胞相互作用的复杂性的认识不断加深。尽管免疫疗法已成为许多癌症的治疗标准，但仍然有大量未满足的医疗需求仍主要针对55-87％对检查点抑制剂无效的患者1。组合治疗谋求扩大响应率2，在先天免疫激动剂，如一个新兴的兴趣toll样受体（TLR）3，4和干扰素基因的刺激器（STING）激动剂5，6，7，以驱动肿瘤内抗原呈递细胞（APC）激活并将肿瘤抗原呈递给效应T细胞。小分子STING（smSTING）激动剂，因为它们的生产的I型干扰素（IFN）和后续代抗肿瘤免疫中的作用特别令人感兴趣的5，6，7。最近的发现开始阐明smSTING激动剂的潜在缺陷，因为它们可能导致激活“脱靶”细胞类型（例如效应T细胞）中的STING，从而导致细胞凋亡8，并最终阻碍免疫记忆的形成9。。将STING激动剂靶向肿瘤内APC的不同方法可以减少这些非靶向的全身性作用，并提高此类方法的整体疗效。
某些细菌是主动将STING激动剂靶向APC的理想载体，因为它们被主动吞噬，并具有通过刺激模式识别受体（PRR）（例如TLR）来触发互补免疫途径的额外好处。基于细菌的疗法在癌症中的使用可追溯到1891年，用于鉴定和测试Coley毒素10。最近，许多研究已证明各种细菌来选择性殖民肿瘤，主要定位于低氧肿瘤核心和有时导致肿瘤消退的固有能力11，12，13，14，15，16，17。这些疗法主要集中在减毒病原细菌的使用上。非致病菌与益生菌长历史使用和人类中建立的安全简档，诸如大肠杆菌的Nissle 1917（的Ec N）或Symbioflor-2，表示为生活癌症治疗的更有利的发展细菌底盘17，18。特别是，的Ec N具有多种有利的特性，包括增加的血清灵敏度19，易受广泛的抗生素18，其限定的基因组景观和最重要的其engineerability 18，20。
在这项研究中，我们评估Ec N作为平台对肿瘤微环境（TME）进行局部调节，证明肿瘤限制性定植，肿瘤内代谢活性，局部免疫激活以及对肿瘤生长的影响的平台。然后，使用合成生物学技术，我们设计了一种称为SYNB1891 的Ec N 菌株，以将STING激活靶向肿瘤中的吞噬APC，并通过细菌底盘触发互补的先天免疫途径。合成生物学代表一个有前途的手段来开发治疗复杂，设计合理的功能21，22。虽然这些技术已被广泛使用以证明许多方法的概念证明，但大多数技术未能实现支持有效转换为临床评估的设计要素。我们将临床产品的标准放在设计流程的最前沿，我们演示了逐步融入设计元素以创建一种活生生的疗法，该疗法可产生STING激动剂环状双安培（CDA），包含双重安全性和生物遏制的特点，并适合大规模生产。在这里，我们评估了有关小鼠和人类模型系统中最终临床候选药物的作用机理和药理特性。重要的是，SYNB1891在整合了所有这些关键设计元素后仍保持了完整的功能，这使其安全，
与先前的研究一致23，24，25，26，27，在肿瘤内（IT）递送的Ec Ñ膨胀和定殖的各种小鼠肿瘤类型，包括B16.F10，EL4，A20，4T1，并在同系CT26肿瘤野生型免疫活性小鼠（图 1a）。在肿瘤中，Ec N表现出100-1000倍的快速膨胀，在24到72小时之间达到稳态，并且由于在血液中未检测到细菌而仍局限于肿瘤中（图 1a-c）。为了评估Ec N的持久性和代谢活性，我们使用了包含LuxABCDE的工程菌株生物发光报告盒（EC N-Lux）28。注射后，EcN-Lux在肿瘤中扩展，持续存在并显示出长达14天的一致的代谢活性（以生物发光测量）（图 1b）。生物发光还能够宏观地定性监测肿瘤和周围组织内细菌的定位。注射后，在肿瘤块内和整个肿瘤中检测到生物发光。然而，直到注射后72小时，在肿瘤周围的皮下空间都没有检测到它（补充图 1a）。肿瘤内治疗在早期时间点导致肿瘤和血清中IL-6和TNFα的剂量依赖性增加（图。 1d，e和补充图 1b，c），然而，在肿瘤内，反应的幅度和持续时间明显更高。最后，与盐水注射对照相比，其施用Ec N导致肿瘤生长显着延迟，但并未导致肿瘤完全消退（图 1f）。总体而言，这些数据证明Ec N作为递送载体用于治疗癌症的效用，其表现出定位，持久性，肿瘤组织内的代谢活性和中等水平的抗肿瘤活性。这样的属性对于持续递送相关的免疫治疗有效载荷是重要的。
通过集落形成单位（CFU）测定（B16F10，EL4，CT26），在肿瘤内（it）注射后约72小时内，从指示的肿瘤模型中注入约1×10 6 CFU的Ec N，肿瘤匀浆中的初始剂量和细菌丰度n =每组5只小鼠，A20，4T1 n =每组7只小鼠）。数据代表两个独立实验。b在n = 5只小鼠中，在注射后的指定时间点，通过CT26肿瘤的CFU（左轴）和相对生物发光单位（RLU）（右轴）测量细菌丰度，用1×10 6CFU Ec N- LuxABCDE注射与注射生理盐水的对照组相比。数据代表两个独立实验。c – e CT26荷瘤小鼠（ 每组n = 5）用指定剂量的细菌治疗过一次。用1×10 6或1×10 7 CFU Ec N（c）处理的小鼠的肿瘤匀浆（实心圆圈）或血液（空心圆圈）中的细菌丰度，以及肿瘤（d）和血清（e）的IL-6定量）在指定的时间点显示（* P = 0.0175，*** P = 0.0001，**** P <0.0001，采用Tukey多重比较测试的双向方差分析。数据代表两个独立实验。f在第1天，第4天和第7天用生理盐水对照或1×10 7个 CFU Ec N（n = 9小鼠/生理盐水和n = 7小鼠/ Ec N组）治疗的CT26荷瘤小鼠的代表性肿瘤生长数据（** P = 0.0062，在研究的第19天比较生理盐水和EC N治疗组的两尾未配对学生t检验）。个体肿瘤体积见补充图 1 d。数据代表三个独立的实验中（每圈一– e）代表一只动物。a – f数据是sem的平均值
STING桥先天和通过的APCs的活化，产生I型干扰素的，新抗原交叉呈递的适应性免疫细胞毒性T细胞，并随后的肿瘤特异性T细胞应答的引发5，6，7。环状二核苷酸（CDN中）结合并激活斯汀，触发I型干扰素29，30。从生理学上讲，CDNs可以在检测胞质双链DNA 29或通过侵入细胞内细菌产生后，源自宿主环状GMP-AMP合酶（cGAS）。cGAS的CDN产物2'3'-cGAMP是由真核细胞制备的，而原核生物则产生并利用其他CDN（例如CDA，环二GMP和3'3'-cGAMP）来进行关键的信号传导过程。31。我们通过系统原型设计并结合了用于大规模生产和向临床翻译的疗法所必需的各种成分，从而开发了可产生STING激动剂的 Ec N治疗菌株。这些步骤包括选择产生CDN的酶，选择可诱导的启动子，掺入营养缺陷型以确保安全性和生物容纳性，以及消除在菌株工程和开发过程中使用的任何抗生素抗性。
3 CDA生产酶的面板（通过编码DNCV从霍乱弧菌，CDAS从枯草芽孢杆菌和DACA从李斯特菌）中表达的Ec氮气下四环素诱导型启动子（P TET），将得到的CDA生产水平进行了评价体外。选择腺苷酸环化酶（DacA）进行进一步评估，因为它在Ec N中诱导基因后产生最高水平的CDA （图 2a）。共表达dacA的Ec N（SYN-P tet - dacA）使用RAW 264.7永生化的巨噬细胞系导致IFNβ1的剂量依赖性分泌，而未诱导的SYN-P tet - dacA则没有（图 2b）。为了评估体内活性，先给予 SYN-P tet - dacA或未经工程改造的EcN，然后腹膜内（ip）将无水四环素（aTc）注入B16.F10黑色素瘤荷瘤小鼠中。B16.F10被选作相关肿瘤模型，因为这代表了发炎很差肿瘤通常是在小鼠中难治性免疫治疗32，33。类似于体外获得的结果，工程Ec生产CDA与未经工程改造的Ec N 相比，体内N 可以增加IFNβ1的诱导（图 2c）。此外，在开始治疗后八天，SYN-P tet - dacA治疗显着降低了肿瘤的生长（补充图 2a–c）。虽然使用工程化和非工程化的Ec N 均可导致先天性相关细胞因子（例如TNFα，GM-CSF，IL-6，IL-1β和CCL2）的早期增加（补充图 2d）， SYN-P tet - dacA在剂量开始后第8天，这种治疗导致T细胞相关细胞因子（如IL-2，粒酶B和IFNγ）的表达发生转变（补充图 2e）。总的来说，这些数据表明CDA在Ec N中的工程表达使得能够额外激活I型IFN，并且可能在体内引发有效的T细胞抗肿瘤免疫。
一个环状二AMP（CDA）丰度从用PBS培养的指示菌株的细菌细胞沉淀（非诱导）或100ng / mL的ATC（诱导的）4小时。数据代表三次独立的实验。b与未诱导的（+ PBS）或预诱导的（+ aTc）SYN-P tet - dacA共培养4 h的RAW 264.7细胞产生IFNβ1。c给 B16.F10荷瘤小鼠注射1×10 6个 CFU的Ec N或SYN-pTet-dacA细菌或盐水对照组（ 每组n = 5只小鼠）。4小时后，所有小鼠腹膜内接受10μgaTc。注射后24小时显示肿瘤内IFNβ1（** P = 0.0011（vs生理盐水），**P = 0.0016（相对于Ec N），采用Tukey多重比较测试的单向方差分析。补充数据见图2a-e。d给 B16.F10荷瘤小鼠注射盐水或5×10 6 CFU的细菌菌株，该菌株含有组成型表达的mCherry（RFP）和诱导型GFP（ 每组n = 4只小鼠，第 16 h P组为n = 2 tet -gfp和16 h P cmt -gfp）。为了诱导GFP小鼠，注射盐水（对照），aTc，水杨酸钠（Sal）或对异丙基苯甲酸酯（Cmt）。显示了诱导后指定时间肿瘤中诱导细菌的百分比（RFP +细胞中的GFP +）。Ë在有氧（未诱导）或有氧（诱导）条件下培养的所示菌株的细菌细胞沉淀物中的CDA丰度。˚F总的CFUs从B16.F10肿瘤回收用1×10它注射6个一原养型的CFU的的Ec N或含有双应变的thyA和dapA的营养缺陷型在所指示的时间点（Ñ = 3每组每个时间点只小鼠）。克 CDA丰度从有氧（未诱导）或厌氧（诱导的）的条件下培养所述指示菌株的细菌细胞沉淀。数据代表五个独立实验。H如（b）中所述，由4-h巨噬细胞和细菌细胞共培养物与所示细菌菌株产生IFNβ1 。i包含所有工程成分的最终SYNB1891细菌菌株的示意图。a，b，g，h n =每个时间点每组2个生物学重复。c，d，f表示平均值和sd。b – f，h数据代表两个独立的实验。每个圆圈代表单个动物或独立的实验重复。
从生产的角度来看，严格控制dacA基因回路是至关重要的，因为三磷酸腺苷（ATP）的快速消耗和/或细菌信号分子CDA的产生可能会阻碍大规模生物质的产生和细菌的适应性，因此使用诱导型启动子变得至关重要。由于四环素类药物不能用作临床研究的诱导剂，因此我们评估了其他几种启动子/诱导剂系统。为了评估体内活性，我们在B16.F10肿瘤细菌定殖后，将诱导型启动子-GFP盒导入Ec N株，该株组成性表达mCherry（RFP）和全身性施用诱导剂。这种方法可以检测RFP +通过流式细胞术从肿瘤细胞悬液中分离细菌并通过GFP定量基因诱导（图 2d）。利用这种方法，我们评估了水杨酸盐（P sal），枯草酸盐（P cmt）和富马酸盐和硝酸盐还原酶（P fnrS）启动子的活性，并分别与它们相关的激动剂，水杨酸，枯草酸盐和低氧结合。 。虽然所有的启动子各自的诱发剂的给药后一小时内表现出的功能性，所述低氧诱导P fnrS 34，35选择该菌进行进一步开发是因为该启动子显示出最高的肿瘤内有效载荷诱导水平，其中65-95％的细菌被诱导。这些数据是一致的结果报告的鼠伤寒沙门氏菌，其中一组缺氧敏感的启动子，如硝酸还原酶启动子，示出了相比于脾脏，以使肿瘤特异性诱导36。此外，由于TME的低氧性质，P fnrS不需要施用外源剂，并且可以在发酵罐中的细菌扩增期间严格控制氧浓度。缺氧诱导CDA生产的可行性确认为的Ec含有P N fnrS - DACA体外在厌氧条件下循环（图 2e）。
从安全和监管的角度来看，生物防护控制是用于临床使用基于细菌活治疗的关键元件37，38。通过删除胸苷酸合酶基因（thyA）引入胸腺嘧啶营养缺陷型已被证明是有效的生物抑制机制，因为游离thy在大多数细胞外空间中都不易获得37。我们发现TME含有足够浓度的游离thy，以使Ec N thyA突变体得以增殖和定殖（补充图 2f）。）。二氨基庚二酸（damino）是细菌细胞壁的组成部分，不是由真核生物产生的，因此我们假设dap营养缺陷型菌株将无法在哺乳动物宿主环境中生存。实际上，dapA基因的缺失（编码4-羟基-四氢吡啶甲酸合酶）导致了Ec N 突变株，该突变株无法在肿瘤中扩展或持续存在，并且随着时间的流逝而被清除（补充图 2f）。因此，我们通过引入dapA和thyA设计了双重安全机制在多种类型的肿瘤中，证实了分别缺失以防止肿瘤内和肿瘤外细菌增殖，以及双重突变体不能在体内增殖（图 2f和补充图 2g）。
以确保稳定制造期间和以满足监管准则在P fnrS - DACA电路插入到基因组中的dapA，的thyA双突变体和所有的抗生素抗性基因除去。最终临床候选菌株称为SYNB1891，在体外与RAW 264.7巨噬细胞共培养时（图2h）保持了其厌氧诱导的CDA产生（图 2g），与剂量相关的生物学活性（ 对人类固有的敏感性）血清（补充图 2h）和对目前临床上使用的多种抗生素的敏感性（补充图 2i））。总而言之，这些不同模块组件的选择和验证构成了我们的临床候选菌株SYNB1891，该菌株由具有双重dapA和thyA营养缺陷型的工程化EcN 组成，在厌氧诱导性P fnrS启动子的控制下dacA基因的基因组整合和去除抗生素抗性基因（图 2i）。
要开始对SYNB1891的作用机理进行反卷积，我们处理了野生型（WT），Tmem173 gt（STING -/-）或Tlr4 lps-del（TLR4 -//-）小鼠的小鼠骨髓树突状细胞（BMDC）并以5μg/ ml的浓度使用相关的通路控制，如纯化的脂多糖（LPS）和基准选择性smSTING激动剂2'3'-c-di-AM（PS）2（Rp，Rp） ）类似于先前报道的6。BMDC对SYNB1891的I型干扰素产生极大地依赖于STING信号传导，因为STING -/- BMDC无法诱导高水平的IFNβ1表达（图 3a）和补充图 3a）。Ec N底物本身和LPS以TLR4依赖性但STING依赖性的方式诱导了低水平的IFNβ1表达（图 3a和补充图 3a），这表明TLR4激活在I型IFN诱导中可能起次要作用SYNB1891。响应smSTING激动剂的IFNβ1表达在TLR4 -/- BMDC中得以保留，而在STING -/- BMDC中却丢失（图 3a和补充图 3a）。此外，与对照组相比，SYNB1891和smSTING激动剂治疗导致共刺激标记cd86的上调水平相似（补充图。 3b）。尽管与SYNB1891相比，IFNβ1的产量增加了约1.5倍（图 3a），但smSTING激动剂导致产生的其他促炎细胞因子（如IL-6，IL-12，TNFα和IL-1β）少得多或没有。治疗后18小时（图 3b，c和补充图 3c–g）。LPS-TLR4信号传导可能有助于这些其他细胞因子的表达，因为缺乏TLR4信号传导明显减弱了响应SYNB1891，对照Ec N和LPS 的Il6和Il12a mRNA的表达（图 3b，c）。总的来说，SYNB1891治疗导致的最大生产相对于所有分析的细胞因子的EcN控制，表明细菌底盘和CDA的工程表达在SYNB1891的总体免疫激活机制中起着重要作用（补充图 3c-g）。
a – c WT，TLR4 -/-和STING -/- BMDC用对照Ec N（MOI：25），预诱导的SYN1891（MOI：25），LPS（100 ng / mL）或smSTING激动剂处理（5微克/毫升）4小时（ 每个基因型每组n = 3个生物学重复）。来自每种基因型的BMDC单独孵育作为阴性对照。 使用Tukey的多重比较测试分析细胞的Ifnb1（a），Il6（b）和Il12a（c）mRNA 的上调（**** P <0.0001双向ANOVA），请参见补充图 3a。（用于IFN-β1蛋白质定量）。d – g代表性的荧光图像和吞噬作用定量。WT BMDC与预诱导的SYNB1891- gfp（MOI：25）在对照培养基（d，e）中孵育1小时，或在细菌孵育之前（f）与细胞松弛素D（10μM）预处理1 h 。冲洗掉未内在化的细菌，并对细胞染色以进行显微镜检查。细胞核用Hoechst（蓝色）标记，F-肌动蛋白用ActinRed 555探针（红色），SYNB1891- gfp染色用抗GFP（绿色）标记，吞噬体跨膜蛋白LAMP-1用抗LAMP1（紫色）标记。白色箭头指向共同位于DC肌动蛋白细胞骨架内的细菌（d – f）。这些细菌被用LAMP-1（e）染色的吞噬膜包围。每个视野中每个树突状细胞的细菌数（FOV）以（g）进行量化。在实验中评估了12个FOV（对照组为7个，CytoD组为5个），每个处理的定量细胞数大于200（** P <0.0001，两尾未配对Student t检验）。图像和数据代表2个独立实验。^ h，我RAW 264.7巨噬细胞或（j，k）WT BMDC按（a）所述进行处理（ 每组n = 3个生物重复）。在所示的组中，将细胞用细胞松弛素D（10μM）预处理1小时。仅在培养基中孵育的巨噬细胞或BMDC用作阴性对照。分析细胞的上调IFNB1（克，我）和IL6（ħ，Ĵ）的mRNA（* P = 0.0182，** P = 0.0017-0.006，*** P = 0.0005，**** P <0.0001具有Tukey多重比较测试的双向方差分析，有关蛋白质定量的信息，请参见补充图 3h-k。a – c，g – k数据代表每种细胞类型的两次或更多次独立实验，并显示了平均值和sd。每个圆圈代表一个独立的实验重复。
接下来，我们使用吞噬作用抑制剂细胞松弛素D来评估SYNB1891的主动细胞摄取对其在巨噬细胞（RAW细胞）和BMDC中的整体作用机理的贡献。细胞松弛素d抑制肌动蛋白聚合，并防止吞噬作用，但其对细胞内吞作用或可溶性小分子的胞饮作用的影响最小39，40。为了量化吞噬细菌，分别使用核和F-肌动蛋白染色鉴定单个BMDC并划定它们的细胞边界。小鼠BMDC与SYNB1891修饰共表达GFP（SYNB1891- gfp），表明许多细菌细胞被内化（例如与F-肌动蛋白染色共定位）并驻留在含有溶酶体相关膜蛋白（LAMP-1）的成熟吞噬体内（图 3d，e）。在两种细胞类型中，用细胞松弛素D预处理均能显着抑制BMDC内部观察到的细菌细胞数量（图 3f，g），并用SYNB1891处理后，IFNβ1的表达消失（图 3h，j和补充图 3h，k）。相反，在用smSTING激动剂治疗后，细胞松弛素D不会显着影响IFNβ1的诱导（图 3h，j和补充图 3h，k）。）。吞噬作用的抑制并未显着影响响应细菌或LPS处理的TNFα产生（补充图 2j），但使IL-6表达降低了2.5-5倍（图 3i，k）。这些数据表明，Ec N可以触发吞噬细胞表面促炎性细胞因子的分泌，尽管需要内在化以最佳地增强信号传导，诱导IFNβ1和激活STING。每种细胞因子和吞噬作用的它们的表达受到冲击的相对表达水平的Ec N，SYNB1891和smSTING激动剂治疗总结在补充图 3升。
总的来说，这些数据表明SYNB1891被吞噬，并且需要主动摄取来依赖STING诱导I型IFN反应，从而为优先激活APC提供了自然机制。此外，数据证明了由SYNB1891 的Ec N 底物提供的多效活性，其通过像TLR4这样的PRR激活了平行的先天免疫信号传导途径，并导致了互补性促炎细胞因子的表达。
为了评估其体内活性，我们将不同剂量水平的SYNB1891单次注射到已建立的B16.F10鼠黑色素瘤肿瘤中，并评估其随时间的药代动力学和药效学。正如预期的那样，并入SYNB1891 的dapA突变会导致其随时间从TME中清除，细菌在所有时间点都无法通过菌落形成单位（CFU）测定在血液中检测到（图 4a和补充图 4b，c）。使用SYNB1891特异性探针的定量PCR（qPCR）被用作检测血液中细菌是否存在而与细胞活力无关的辅助手段。尽管在给药后直至24小时内，大多数静脉注射小鼠（作为阳性对照）都检测到SYNB1891 DNA，但在接受最高剂量注射的5只小鼠中，只有1只在2和6时血液中可检测到SYNB1891的水平-h（补充图 4d，e）注入后。SYNB1891治疗延迟了肿瘤的生长，并在某些动物中导致了不可检测的肿瘤（图 4b）。在给药后24和72小时检测到肿瘤内CDA的产生，证实了SYNB1891在体内的功能活性（图 4c）。I型干扰素（图 4d，e）以及各种促炎性细胞因子，包括TNFα，IL-6，IL-1β，IFNγ和GM-CSF（图 4f–j），均以剂量依赖性方式被诱导，突出了两种CDA的双重活性和Ec N细菌底盘。与先前使用smSTING激动剂41的报告一致，在用SYNB1891 治疗后还观察到IL-15的显着上调（图 4k）。这些数据共同证明了SYNB1891的剂量依赖性药理作用，其在体内的靶标结合及其作为局部炎症及其潜在抗肿瘤活性的有效诱导剂的效用。
一个 - ķ B16.F10荷瘤小鼠用单剂量它盐水的处理，1×10 7，1×10 8或1×10 9 CFU的SYNB1891 0研究日（Ñ = 5喷射每细菌组小鼠每个时间点，对于盐水组n = 5只注射小鼠进行第1天和第7天分析，对于细菌组1×10 9 CFU SYNB1891对于第3天n = 4分析肿瘤，对于第7天和10 n = 3分析肿瘤解剖时无可见肿瘤块）。一个肿瘤匀浆和血液在所指示的时间点内细菌丰度后它注射1×10 9CFU（对于1×10 7和1×10 8剂量，请参见补充图 4b，c）。b在研究的第10天，在指定的时间点处治疗的小鼠的总肿瘤重量，这些小鼠在解剖时没有可见的肿瘤块（未检测到肿瘤（NTD））（* P = 0.0163（橙色星号表示组vs 1×10 9 CFU） SYNB1891），第7天采用Tukey多重比较测试的单向方差分析； **** P <0.0001（蓝色星号表示组vs 1×10 8个CFU）SYNB1891，粉色星号表示组vs 1×10 7CFU SYNB1891）通过Tukey的多重比较测试对细菌群进行双向ANOVA。个别肿瘤体积在补充图呈现。 4 A）。c肿瘤匀浆中的循环di-AMP丰度，以及（d – k），肿瘤上清液中IFNα1（d），IFNβ1（e），TNFα（f），IL-6（g），IL-1β的细胞因子丰度（h），IFNγ（i），GM-CSF（j）和IL-15（k）在指定时间点注射后来自治疗小鼠（* P = [0.016–0.031]，** P = [0.0011 –0.0041]，*** P = [0.0001-0.0003]，**** P <0.0001在指定的时间点进行Tukey多重比较测试的单向方差分析。数据代表两个独立的实验，均值和标准误差表示。（a）和（c – k）中的每个圆圈代表一只动物。
持久的反应是成功免疫疗法的标志。为了评估SYNB1891的功效，我们在一周的过程中以三次it注射治疗了B16.F10荷瘤小鼠，并对其进行了长期监测。与盐水注射对照组相比，SYNB1891治疗导致肿瘤生长的剂量依赖性显着延迟，并且驱使30-40％的动物产生持久的肿瘤排斥反应（图 5a和补充图 5a-c）。虽然注射对照EC N导致肿瘤生长显着延迟，但并未导致肿瘤完全排斥。使用先前报告的有效剂量（每只动物50μg）的基准smSTING激动剂6，我们对细菌底盘（SYNB1891）单独使用细菌底盘（Control Ec N），单独使用STING激活（smSTING Agonist）或工程化STING激动剂的长期功效进行了正面对比。尽管两种STING激动剂方法均可有效控制肿瘤生长长达2周，但与smSTING激动剂治疗（10％生存率）相比，SYNB1891治疗具有更高的长期疗效（40％生存率）（图 5b和补充图） 。 图5d，E）。
a在研究的第1、4和7天，将B16.F10荷瘤小鼠用生理盐水（对照组），SYNB1891或缺乏P fnrs - dacA回路的对照组Ec N 进行治疗。肿瘤生长数据以完全应答者（CR）的比率显示。（** P = 0.0058（蓝色星星，表示组与Ec N），**** P <0.0001（粉红色星星，表示组与SYNB1891）单向方差分析，具有第14天的Tukey多重比较检验； ** P = 0.0078（粉红stars- 的Ec N随SYNB1891，双尾非配对吨测试。个别肿瘤体积在补充图呈现。 5 A）。b按（a）中所述治疗B16.F10荷瘤小鼠，另外的治疗组接受3剂50μgsmSTING激动剂。显示了长期生存（** P = 0.006，*** P = [0.0004-0.0006]，所示组的Mantel-Cox对数秩比较，有关肿瘤生长数据，请参见补充图 5d，e）。c如（a）中所述用盐水或不同量的SYNB1891 处理A20荷瘤小鼠。显示了肿瘤的生长数据和CR的比率（** P = 0.0014（蓝色星号表示组vs 10 8 CFU SYNB1891），*** P = 0.0004（粉红色星号表示组vs 5×10 8） CFUs SYNB1891）**** P <0.0001（橙色星体表示组vs 10 9CFUs SYNB1891）对第21天进行单向方差分析和Tukey的多重比较测试，请参见补充图 6a，b，了解单个肿瘤的体积和长期生存）。d如（a）中所述，用盐水或SYNB1891-cmR（具有氯霉素抗性基因的SYNB1891）治疗A20荷瘤小鼠。通过施用抗CD4或抗CD8抗体（作为对照注射的同型抗体）来耗尽T细胞。显示了长期生存。（* P = 0.041，**** P <0.0001，NS =不显着，Mantel-Cox对数秩比较）。e按照（c）并在第50天研究时保持无肿瘤，可通过对侧胁腹皮下注射A20细胞以及未与年龄匹配的对照组进行再攻击。肿瘤生长数据显示（个人肿瘤体积在补充图1中。 6 ℃）。a – e n =每组10只小鼠。显示了a，c，e平均值和sem。数据代表两个（b，d，e）和三个（a，c）独立实验。
为了将我们的发现扩展到其他肿瘤类型，我们对A20 B细胞淋巴瘤肿瘤进行了类似的研究。A20的肿瘤与SYNB1891的处理导致对肿瘤控制的剂量依赖性效果与10 8，5×10 8和10 9 CFU的剂量导致30％，50％，并用完全的肿瘤排斥，分别小鼠的80％（图。 图5c和补充图 6A，b ）。为了评估A20模型中T细胞对SYNB1891功效的贡献，我们在治疗开始之前以及整个研究过程中使用消耗抗体来去除CD4 + T细胞或CD8 + T细胞。当小鼠接受同种型对照或CD4 +消耗T细胞的抗体表现出40-50％的完全应答率，接受CD8 +消耗T细胞的抗体的小鼠中有0％可以长期存活（图 5d）。最后，用A20细胞在对侧胁腹再次攻击经SYNB1891处理的动物，这些动物保持A20至少60天无肿瘤。与年龄匹配的幼稚对照组显示出快速的肿瘤生长不同，所有治愈的小鼠在再次攻击后仍保持无肿瘤状态（图 5e和补充图 6c）。这些数据表明，SYNB1891治疗可激活CD8 + T细胞，这是长期疗效和可能形成保护性免疫记忆所必需的。
总体而言，这些数据证明了Ec N细菌底盘和STING激动剂CDA的产生在两个遗传背景下的两个不同的鼠类肿瘤模型（B16F10和A20）中对有效而持久的抗肿瘤免疫应答产生的互补作用（ C57BL / 6和BALB / c）。
为了评估SYNB1891在人APC中的活性，我们首先评估了利用含有干扰素调节因子（IRF）报告基因的修饰人单核细胞THP-1细胞系诱导STING途径的过程。SYNB1891处理导致强大的剂量依赖性IRF诱导，该诱导在STING -/-细胞中丢失（图 6a），而在cGAS -/-细胞中降低（图 6b）。与鼠类APC细菌底盘不会诱导大量IFN-β1相比，用未经工程改造的对照Ec N 处理人THP-1细胞可导致中等剂量依赖的STING途径诱导（图 6b）。但是，仅细菌底盘就完全丧失了刺激cGAS中IRF的能力-/-细胞。（图 6b）。这些数据表明了SYNB1891在刺激人APC中的STING中的双重作用机制，包括通过SYNB1891产生的CDA直接激活STING以及激活cGAS，这可能是通过检测细胞质细菌DNA来实现的（补充图 7a）。用SYNB1891处理含有NF-κB报告基因的THP-1细胞也导致了NF-κB途径的剂量依赖性活化，在STING -/-细胞中部分降低了〜1.6倍（图 6c）。）。这些结果还表明，SYNB1891通过STING依赖性和STING依赖性途径触发NF-κB诱导。
使用含有干扰素调节因子（IRF）-萤光素酶报告基因和NF-kB响应比色报告基因的a - d THP-1永生人类单核细胞。将含有内源性STING等位基因（STING + / +）或缺少STING基因（STING -/-）的 THP-1细胞用不同比例的预诱导SYNB1891或单独的培养基处理过夜。通过具有相对发光单位（RLU）的发光来分析细胞的IRF报道分子的活化。b野生型THP-1细胞（CGAS + / +）和那些缺乏CGAS基因（CGAS - / - ）用预诱导的SYNB1891或对照处理的EcN的比例不同，或单独使用培养基过夜。分析了细胞的IRF报道分子的活化，并显示了相对于未处理的培养基单独对照，处理过的细胞中IRF诱导的倍数。c，如（a）中所述用预诱导的SYNB1891 处理STING + / +和STING -/- THP-1细胞。通过比色测定法在OD655分析细胞的NFκB活性。a – c n =每个APC：每组2个生物重复：细菌比率。d包含IRF荧光素酶报告基因和内源HAQ TMEM173（STING）等位基因，H232或R232等位基因的敲入或TMEM173敲除的THP-1细胞 该基因用预诱导的SYNB1891（MOI：100）或单独的培养基处理过夜。如（b）中所述分析细胞的IRF报告 基因激活（* P = 0.0118，**** P <0.0001，采用Tukey多重比较测试的单向ANOVA， 每组n = 4个生物学重复）。e，f单核细胞衍生的原代人DC用Control Ec N（MOI：25），预诱导的SYN1891（MOI：25），LPS（100 ng / mL）或smSTING激动剂（5μg/ mL）处理4 h 。在指定的组中，将细胞用细胞松弛素D（10μM）预处理1 h。仅在培养基中孵育的人DC用作阴性对照。分析细胞的IFNB1上调（e）和IL6（f）mRNA（**** P <0.0001，采用Tukey多重比较测试的双向方差分析， 每组n = 3个生物学重复）。a – f数据代表两个独立实验。d – f显示平均值和sd的数据。每个圆圈代表一个独立的实验重复。
接下来，我们评估了一组THP-1细胞系的STING通路活性，该细胞系包含三种最普遍的人类TMEM173（STING）变体：R232占57.9％，HAQ占20.4％，H232占等位基因的13.7％。人口分别为42。与未刺激或STING -/-对照相比，SYNB1891处理在所有三个等位基因上均导致约9至28倍的IRF诱导（图 6d）。与先前的研究一致6，HAQ等位基因表现出最高的诱导水平，R232和H232等位基因分别表现出中等和较低的活性。接下来，我们评估了SYN1891活性和吞噬作用在原代人单核细胞来源的树突状细胞（DC）中的作用。类似于在鼠的APC获得的结果，治疗SYNB1891初级人DC的导致的强表达IFNB1，各种促炎细胞因子的表达（如IL6，TNFα的，IL-1B，和IL12A）和各种DC成熟厂商的上调（如CD86和CD40）（图 6e，f和补充图 7b-1）。同时使用任一对照Ec治疗N或SYNB1891导致各种促炎细胞因子和DC成熟标记物的表达水平相似，SYNB1891处理导致对IFNB1的诱导明显更高。既IFNB1和IL6表达与细胞松弛素d降低预处理之后，提示的刺痛的那个最佳刺激和NF-κB途径，需要由人体APCs（图活性细菌吞噬作用 6E，F）。用高达25μg/ mL的smSTING激动剂进行治疗可产生相当水平的CD86表达，但IFNB1，CD40，IL6和IL12A的水平较低相对于SYNB1891的表达，没有检测到高于背景的IL1B（图 6e，f和补充图 7b-1）。
在一起，这些结果证实了我们的发现从小鼠模型向人类APC转化，以诱导SYNB1891处理后诱导I型IFN和NF-κB相关的细胞因子，以及代表绝大多数人类的一系列TMEM173等位基因变体。
在这项研究中，我们使用合成生物学技术和药物开发标准来设计和创建能够进行局部STING激活的工程化细菌菌株，以及适合在人类临床试验中制造和评估的产品。SYNB1891的功能经过合理设计，方法是将合成 CDA的酶dacA掺入嗜肿瘤的细菌底盘中，以将STING激活靶向TME中的APC。另外，由于革兰氏阴性细菌底盘Ec N通过PRR激活触发互补的促炎途径。通过两个不同的营养缺陷型thyA和dapA控制肿瘤内部和外部的细菌增殖，从而整合了安全性和生物控制功能，并通过去除抗生素抗性基因来通过现有治疗方法清除细菌。最后，通过利用P fnrS启动子来控制dacA表达，在制造过程中STING激动剂的产生被抑制以产生生物质，随后在进入低氧TME时被诱导。
结果显示，所得的生物治疗药物SYNB1891产生高水平的CDA，并在小鼠和人类APC中以吞噬作用依赖性方式诱导有效的I型IFN产生。从机制上讲，smSTING激动剂非特异性地穿透多种细胞类型，而细菌载体如SYNB1891则通过主动吞噬作用优先到达APC的细胞内空间。这是潜在地避免“脱靶” STING-途径活化在非APC如T细胞，其中STING活化可能是有害的抗肿瘤免疫的形成的重要特征8，9。在鼠肿瘤模型中，SYNB1891治疗可产生有效的抗肿瘤免疫力，长期疗效并建立免疫记忆。因此，尽管最近的一项研究表明，高剂量的smSTING激动剂可对免疫记忆的发展产生抑制作用9，但无论剂量水平如何，用SYNB1891治疗和治愈的所有带有A20肿瘤的小鼠均对继发性肿瘤攻击具有抵抗力。除了STING激活外，还发现SYNB1891可以触发其他促炎细胞因子的表达，这可能会导致长期的疗效。由于EcN的固有肿瘤嗜性和血清敏感性，在肿瘤内注射该免疫刺激载体导致对TME集中的细胞因子应答。从安全的角度来看，这有利于最大程度地减少全身暴露，但从生物学的角度来看，这有利于产生确定的趋化因子梯度，从而引导免疫细胞向肿瘤内转运。最后，将鼠标模型的结果转换为人类通常是一个巨大的挑战。小鼠与人类细胞对合成的smSTING激动剂DMXAA的免疫反应性就是一个相关的例子，在小鼠模型中临床前结果令人鼓舞，但缺乏人类STING激动剂的活性43。此外，TMEM173基因（编码hSTING）存在于人类的几个常见的等位基因，具有不同的结合特性与激动分子42。SYNB1891治疗在人树突状细胞和含有多种最常见的人STING（TMEM173）基因变异的人单核细胞中诱导I型IFN产生。发现了鼠类和人类系统之间的重要差异，包括在对人APC进行SYNB1891处理后cGAS对STING活化的贡献。
除了对SYNB1891的具体描述及其在免疫肿瘤学中的作用机理外，我们的研究还证明了合成生物学在合理设计与人类疾病作斗争的微生物方面的价值。以前已经研究了多种基于细菌的疗法来治疗癌症，其中大多数使用减毒病原体，如鼠伤寒沙门氏菌，诺氏梭菌和单核细胞增生李斯特菌11。基于利斯特氏菌的方法通常使用减毒株作为疫苗载体，利用细菌的内在能力强行侵袭APC并工程化表达针对每个患者的肿瘤相关抗原或独特新表位44，45，46，47。与传统的疫苗方法类似，这需要事先鉴定有效的靶抗原。虽然基于沙门氏菌和梭状芽胞杆菌的治疗剂也需要使用高度减毒的菌株，但此类方法主要利用了这些病原菌的溶瘤潜能 48。临床上这些溶瘤菌株要么没有显示出强大的功效，要么受到剂量限制性毒性的阻碍 11。相反，SYNB1891使用非致病性菌株EcN，它具有潜在的有利安全性，并具有广泛的用于基因操作和工程化的工具。使用合成生物学技术，我们合理地设计了一个Ec N株，它表达STING激动剂CDA，并在肿瘤内注射后向TME中的APCs定向激活，以产生并支持抗肿瘤免疫反应。
由于先前具有令人信服的临床前证据的细菌疗法未能证明对患者有效，因此SYNB1891的临床测试对于评估我们的发现对人类疾病的可译性至关重要。SYNB1891肿瘤内注射在经皮可及的晚期或转移性恶性肿瘤患者中的一项I期临床试验已经启动（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04167137）。虽然将首先评估经皮给药途径的安全性和耐受性，但放射线引导下肿瘤内注射的进一步研究将能够治疗内脏病变。安全性和有效性的积极迹象将为开发其他工程菌株提供支持，这些菌株具有根据特定癌症和患者亚型的需求量身定制的合理设计的功能。尽管合成生物学在人类治疗学中的应用仍处于起步阶段，但我们的工作凸显了其潜力，并为开发用于临床评估的未来方法提供了指导。
没有使用统计方法来确定样本量。根据肿瘤体积将用于体内实验的小鼠随机化，研究人员在实验或结果评估期间不会盲目分配。
SPF C57BL / 6，BALB / c，STING -/-（C57BL / 6J- Tmem173 gt / J）和TLR4 -/-（B6.B10ScN - Tlr4 lps-del / JthJ）雌性小鼠购自Jackson实验室。将动物在特定的无病原体条件下饲养在气候控制的饲养室中，环境温度为21±2°C，相对湿度范围为30％至70％，并自动控制12小时的明暗循环。将小鼠用于7至9周龄的实验。根据动物福利法，由Mispro的机构动物护理和使用委员会（Mispro生物技术服务，马萨诸塞州剑桥市400 Technology Square，Mispro生物技术服务，02139）审查并批准了与动物实验有关的动物住房和所有程序。
为了使用烧瓶小规模制备培养物，将细胞接种在14 ml培养管中的4 ml含适当抗生素和/或补充剂的2-YT培养基中，在37°C摇动（250 rpm）过夜。第二天，将细胞培养物在125毫升带挡板的烧瓶中，在40毫升新鲜的2-YT培养基中，于37°C摇动（250 rpm）2–3小时，以1：100稀释，并加入适当的抗生素和/或补充剂。对于基因回路诱导，取决于启动子系统，通过添加脱水四环素（Sigma； aTc；终浓度为100 ng / ml）或将烧瓶置于提供气氛的厌氧室（Coy）中诱导细胞诱导4-5小时85％的氮气，10％的二氧化碳和5％的氢气。诱导后，将细胞洗涤并通过4000 g离心分离在4°C下放置10分钟。利用细胞沉淀通过LC-MS / MS分析环二-AMP（参见，通过LC-MS / MS对环二-AMP（CDA）定量）。如果需要储存细胞储备液以备将来使用，则可通过离心收集细胞储备液，用冷PBS缓冲液洗涤，重悬于含有15％甘油和PBS的制剂缓冲液中，然后储存于-80°C。首先验证所有用于体外或体内试验的细菌原种均具有> 90％的活力，纯度，该纯度由与菌株营养缺陷型相关的抗生素或代谢物存在/不存在下的生长确定，并具有寻找诱导后有效负载表达的功能。
将细胞接种在500 mL的FM3培养基中，该培养基中补充有二氨基庚二酸和胸苷，并置于500 mL的超长瓶中（Thomson）。使细胞在37℃下以350rpm摇动过夜生长。第二天，将110 mL过夜培养物用于在Eppendorf BioFlow 115生物反应器中接种4 L FM3（起始OD600为〜0.5）。通过搅拌，空气和氧气补充将发酵罐的溶解氧控制在60％，并使用氢氧化铵将发酵罐的pH控制在7。5小时后，在OD600〜30下收获细胞。通过4500 g离心收集细胞在4°C下放置30分钟，重新悬浮在配方缓冲液中，并保存在-80°C下。OD600在BioPhotometer Plus分光光度计（Eppendorf）上测量。在使用前，如上所述评估冷冻原液的存活率（＞ 90％），纯度和功能性。
补充表1提供了该出版物中使用的菌株清单 。大肠杆菌 Nissle 1917（EcN），在此命名为SYN001，购自德国微生物和细胞培养物保藏所（DSMZ不伦瑞克，大肠杆菌 DSM 6601）。通过在含有300 ng / mL链霉素的LB平板上划线〜10 11个SYN001细胞，并将形成的单个菌落突变为对链球菌的耐药性命名为SYN094，从而获得具有链球菌抗性的SYN001。合成了在组成型启动子控制下带有luxABCDE操纵子的质粒，并通过Genewiz亚克隆到pST载体中。三种不同的环状二核苷酸合酶基因dncV，dacA和cdaS进行了密码子优化，由IDT合成，并亚克隆到含有卡那霉素抗性基因，复制号p15A的中等拷贝数起点并在P tet启动子的调控下的Synlogic载体中。类似地，通过IDT或Genewiz合成了在P tet，P sal或P cmt启动子控制下编码GFP蛋白的基因，并将其亚克隆到具有p15A起源和卡那霉素抗性的同一Synlogic载体中。P的控制下的编码基因GFP蛋白fnrS 37，38启动子也被亚克隆到含有氨苄青霉素抗性基因，低拷贝数复制起点pSC101和组成型启动子驱动的编码mCherry荧光蛋白的基因的Synlogic载体中。这些质粒用于将带有整合盒的SYN001或SYN094电穿孔到malEK基因座中，以组成型表达mCherry蛋白。电穿孔后（Eporator，Eppendorf，1.8 kV脉冲，缝隙长度为1 mm的电杯）被选为含有适当抗生素的LB琼脂（Sigma，L2897）上的菌落。为删除的dapA的基因，的thyA基因和噬菌体片段（Φ），使用PKD3或pKD4作为模板DNA进行单轮PCR的37，38。设计引物以产生一个dsDNA片段，该片段具有与Ec N染色体中的靶基因基因座或片段相邻的同源性，以及与frt位点侧接的氯霉素或卡那霉素抗性基因。产生的敲除片段通常包含约40-60个Ec碱基对在其5'和3'端具有N同源性（基因组缺失的DNA序列）。通过电穿孔用敲除片段转化含有质粒pKD46的亲本菌株。在含有适当抗生素（30 ng / mL氯霉素或100 ng / mL卡那霉素）和适当营养缺陷补充剂（二氨基庚二酸酯（100μg/ mL）和/或胸苷（3 mM））的LB琼脂上选择菌落，并通过PCR验证正确的重组事件保存经验证的菌落以备将来操作，用与上述类似的方法，将含有组成性表达的GFP蛋白的质粒构建到具有pSC101起源和氨苄青霉素抗性基因的Synlogic载体中，并用dapA，thyA将其转化为对照Nissle菌株和噬菌体敲除。通过将基因插入Ec N染色体来产生产生环di-AMP的菌株。基因间座位exo / cea被确定为合适的整合位点。使用众所周知的λRed重组方法，将染色体插入Ec N基因组。对于这种插入，包含〜1000bp的5'和3'（1）基于pKD4质粒的Ec Ñ基因组的同源性用于重组建，接着（2）插入P的fnrs -dacA片段插入通过等温组件的质粒（HiFI DNA Assembly Master Mix，NEB），（3）通过PCR从质粒中扩增插入片段（包括EcN个同源区域和卡那霉素抗性盒，Q5高保真预混液，NEB），（4）通过电穿孔通过pKD46重组插入片段并随后去除pKD46，以及（5）通过pCP20和随后的pCP20去除抗生素抗性盒去除。可根据要求提供用于临床候选菌株SYNB1891构建的所有DNA序列和基因组插入和缺失的详细方案。Genbank / EMBL / DDBJ登录号：CP007799中列出了大肠杆菌Nissle 1917的完整基因组序列。补充表2和补充图8列出了产生CDA的酶的质粒图谱和DNA序列 。 。该基因组图谱，SYNB1891的相应引物操纵基因组序列和在补充图可用 9和补充表格 3 - 7。可以根据材料转让协议（MTA）的要求提供本手稿中描述的工程菌株，可以通过与相应的作者联系来提出要求。Synlogic将审核所有请求，以验证请求是否受任何知识产权或保密义务的约束。
波士顿临床分析实验室（CLSI）根据临床和实验室标准协会（CLSI）第M100章“抗菌药物敏感性测试的性能标准”，对SYNB1891对一组常用抗生素的敏感性进行了评估。使用独立的生物制剂和测定装置进行了三项抗生素耐药性试验。SYNB1891在含有100 µg / mL DAP和10 mM胸苷琼脂的LB上生长，然后制备悬浮液，然后使用分光光度计将其调节至已知浓度。使用调整后的浓度制备草坪板。总共评估了16个抗生素盘。对于每个测试的圆盘，通过用200μL调整后的悬浮液接种LB / DAP /胸苷琼脂板的表面来制备草坪板。将每个盘无菌放置在板的中心。将样品板在30–35°C下孵育18–24 h。通过将空白盘放在接种板上制备阴性对照。孵育后，使用校准的卡尺测量抑制区域。每个未取整的结果都以毫米为单位记录。
在测量OD密度之前，将冷冻管在冰上融化并充分混合。将10 10 个细胞放入深孔板中的1 mL PBS中，通过移液混合（每个样品一式两份）。将板旋转至2750 g，在4°C下放置10分钟。弃去培养基，并将带有沉淀的板作为零时间对照样品保存在-80°C。为了诱导产生环二-AMP的电路，将融化后的冷冻管中的500 µL培养物加入3.5 mL最低培养基（1×M9 + 50 mM MOPS + 2％葡萄糖+ 100 ng / mL二氨基庚二酸+ 3 mM胸苷），并在37°C，250 rpm摇动30分钟后恢复。然后将培养物移入厌氧室，在37°C下静态孵育2 h。孵育结束后，将试管取出，通过顶点混合，并测量OD密度。类似于零时间对照样品，10 10将细胞放入深孔板中的1 mL PBS中，通过移液（每个样品一式两份）混合均匀，离心沉淀并保存在-80°C。然后将样品送去进行LC-MS / MS分析，分析环二-AMP（参见LC-MS / MS对环二-AMP（CDA）的定量分析）。对于进一步的体外实验，将诱导的细菌在无菌PBS中洗涤两次，并通过Cellometer X2（Nexcelom Bioscience）计数细菌数。
B16.F10黑色素瘤（ATCC，CRL-6475），EL4 T细胞淋巴瘤（ATCC，TIB-39），A20 B细胞淋巴瘤（ATCC，TIB-208），4T1乳腺癌（ATCC，CRL-2539）和CT26结肠癌细胞（ATCC，CRL-2638）细胞在ATCC（37°C恒温箱，5％CO 2，湿润）规定的标准条件下以推荐的培养基配方进行培养。胰蛋白酶消化后收集贴壁细胞系。将所有细胞系在Dulbecco的磷酸盐缓冲液（DPBS）盐水中冲洗两次，以去除多余的FBS，然后重悬在DPBS中进行植入。为指定的细胞系植入了以下数量的细胞：B16.F10（2×10 5），EL4（5×10 5），A20（1×10 6），4T1（1×10 5）和CT26（1 ×10 6）。如每个实验所示，使用26号针头将小鼠皮下注射到剃刮的左右侧面，并允许肿瘤形成直至达到40至300mm 3之间。然后根据肿瘤体积将小鼠随机分为治疗组，以建立平均肿瘤体积大致相等的组。肿瘤内注射涉及将针直接插入肿瘤的最大部分，并缓慢，持续地释放内容物。经由尾静脉进行静脉注射。为了进行功效研究，在研究的第1、4和7天对荷瘤小鼠进行了治疗。如所示，将50μL细菌，smSTING激动剂或生理盐水（作为注射对照）注射到肿瘤中。肿瘤体积（V）是通过电子卡尺测量的，其中V =长度×宽度2 ×0.5。肿瘤超过2000 mm 3的小鼠根据IACUC协议安乐死。除非另有说明，否则将实验组中50％或更多的小鼠从研究中移除后，将不进行进一步的肿瘤测量，并且对该组中所有剩余的小鼠实施安乐死，除了没有可触知的肿瘤块的任何小鼠。监测所有完全应答者（CR）小鼠，或在指定的时间点之前没有可触知的肿瘤的小鼠，直到最终治疗剂量后至少研究第60天和至少50天为止，以确保未观察到肿瘤复发。在一些研究中，通过在细菌治疗开始前1天腹膜内注射200μg重悬于DPBS中的抗体（终体积100μl）来消除T细胞，并且在整个研究过程中每周两次使用同型匹配抗体作为对照，使用以下抗体注射： IgG2b同型对照（克隆：
在指定的时间点对小鼠实施安乐死并通过解剖将肿瘤切除。将收获的肿瘤置于预先装有含有500μl无菌DPBS的2.8 mm不锈钢珠（Sigma，Z763829）的无菌小珠均质器管中，称重并使用Fast Prep-24均质器（MP Biomedicals）均质5分钟。整个肿瘤匀浆用于定量环二AMP和细菌定量（见下文）。将肿瘤上清液用于分析肿瘤内细胞因子，并如下制备。将Triton-X100（Thermo Scientific，BP151-100）在DPBS中稀释以产生10％Triton-X100储备液，并添加到肿瘤匀浆中，使最终浓度为1％Triton-X100。用力吸取处理过的匀浆，涡旋混合，并在10,000离心g 10分钟。然后收集肿瘤上清液，转移到96孔板中，用HALT蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，1861278）处理，冷冻并保存在-80°C下，以便在同一运行中定量所有样品和时间点。
为了执行菌落单位形成（CFU）分析，将通过心脏穿刺收集并用EDTA处理的完整肿瘤匀浆或血液转移到96孔板中，将10x系列稀释液稀释到DPBS中，并在LB-琼脂糖平板上划线10μl稀释样品。根据要定量的细菌菌株的抗生素抗性或营养缺陷型，向LB-琼脂糖平板补充3 mM胸苷（Sigma，T1895），100μg/ mL二氨基庚二酸（Sigma，D1377），30μg/ mL链霉素（Sigma， S9137-100G）或300μg/ mL氯霉素（Sigma，C0378-100G）。将板在37℃下孵育过夜，并从存在30个或更多菌落的最低稀释液中量化形成的菌落数。CFU细菌定量分析的检出限为每毫升样品约100 CFU，定量极限为每毫升〜3000 CFU。使用Synergy Neo微孔板读数器（BioTek Instruments）测量与96孔不透明平板中100μL肿瘤匀浆的相对生物发光（与盐水处理的对照的背景相比）。为了检测切除的肿瘤和/或周围组织的细菌发光，将样品放入G：Box（Syngene）凝胶doc系统中。捕获白光下的图像以描绘B16F10肿瘤与周围健康的皮下皮肤组织之间的边界。在没有光的情况下捕获细菌发光，该光具有完整的光圈和2分钟的曝光时间。为了检测血液和肿瘤中的SYNB1891细菌DNA，开发了SYNB1891探针特异性qPCR测定法，并使用美国纽瓦克市QPS，LLC的良好实验室规范进行了验证。将肿瘤和经EDTA处理的血液速冻并运输到QPS进行分析。根据定制的SYNB1891正向，反向引物和探针（Life Technologies，ThermoFisher Scientific）根据分析程序（方法）'1813-1804进行qPCR分析。SYNB1891引物/探针特异性序列如下：正向引物“ 5'-AGGATACTCATGTTGGAAAAGTCCAT-3'”；反向引物“ 5'- CCCGCATCCCACGCTAAC-3'”；探针“ 5'-6FAM CTTGCCCCCCTTATATMGBNFQ-3'”。qPCR检测限为每1 µg总DNA 10份SYNB1891 DNA，每个样品的定量限为25拷贝。
如上所述收获肿瘤并分离肿瘤上清液。通过心脏穿刺收集血液，并将其转移到装有EDTA的血清分离管中（BD，365967）。通过在室温下使血液凝结30分钟，然后以15,000 g离心90 s来分离血清。将血清层转移到96孔板中，用HALT蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，1861278）处理，并保存在-80°C直至分析。使用定制的MILLIPLEX小鼠细胞因子磁珠检测试剂盒（MILLIPLEX）定量分析来自肿瘤上清液的IL-6，TNFα，IL-1β，MCP-1，IL-2，颗粒酶B和IFN-γ，并测定血清IL-6和TNFα的水平按照制造商的说明进行多重测定，Millipore Sigma，并在MAGPIX分析仪（Luminex）上进行分析。按照制造商的说明，使用VeriKine小鼠干扰素βELISA试剂盒（PBL）从培养基和肿瘤中定量IFNβ。使用小鼠Quantikine ELISA试剂盒（R＆D系统）按照制造商的说明从培养基中定量IL-6和TNFα。所有ELISA均在96孔板上进行，并使用Synergy Neo Microplate Reader（BioTek Instruments）通过比色读数进行分析。按照制造商的说明，使用Biolegend的Mouse Inflammation LEGENDplex Custom流分析仪试剂盒（Biolegend）对肿瘤中的IFNα，IL-6，GM-CSF和IL-15水平进行定量，并在Cytoflex LX流式细胞仪（Bechman Coutler）上进行分析。
植入B16.F10肿瘤，使其体积达到100-200 mm 3。根据肿瘤体积将小鼠随机分为多个实验组，并在肿瘤内注射生理盐水或5×10 5 CFU组成型表达mCherry（RFP）的细菌，并在诱导型启动子的控制下包含绿色荧光蛋白（GFP）盒。细菌注射后48小时，给小鼠注射PBS（作为对照），10μg无水四环素（aTc），6 mg p-腹膜内注射注射异丙基苯甲酸酯（Sigma; cumate，cmt）或100 mM水杨酸钠（Sigma;阿司匹林，sal）。诱导后1或16小时对小鼠实施安乐死，通过解剖收集肿瘤，并通过40μM细胞过滤器通过机械破坏将其置于单细胞悬液中。将样品置于96孔圆形底板中，并在Macsquant VYB流式细胞仪（Miltenyi Biotec）上进行分析。通过大小和RFP的表达将细菌与小鼠细胞区分开，并量化诱导细胞的百分比（GFP +）。流式细胞仪设置和门控策略显示在补充图 10中。
为了量化体外CDA的产生，如上所述，细菌在需氧室中生长和诱导（请参见摇瓶中菌株的生长和预诱导）。离心收集细菌细胞，用DPBS冲洗两次，使用Cellometer X2（Nexcelom）计数，将10 10个细胞转移到96孔板中，并在-80°C冷冻。如上所述收获肿瘤并匀浆。将肿瘤匀浆转移至96孔板，冷冻并在-80℃下保存。然后通过LC-MS / MS从细菌沉淀或肿瘤匀浆中定量CDA。简而言之，用9份甲醇提取肿瘤匀浆，涡旋振荡，并以2300 g离心在4°C下放置5分钟。在分析之前，将上清液用0.1％甲酸稀释10倍。分离CDA，并在Vanquish UHPLC / TSQ Altis LC-MS / MS系统（Thermo Fisher Scientific）上检测。进样（1 µL），并在Ace Excel 2 µm 100ÅC18-AR 100×2.1 mm色谱柱（Advanced Chromatography Technologies Ltd.）上分离，并使用线性梯度为0至98％的B与A从1混合的B洗脱分析物在50°C下以0.6 mL / min的速度离心至3分钟（A：0.1％甲酸; B：乙腈，0.1％FA）。使用正电喷雾电离模式下化合物比质量转换659.1> 136 m / z的选定反应监测（SRM）检测CDA。使用0的1 / X加权线性7点标准曲线对峰进行积分，并使用峰面积计算未知物的浓度。
来自三个供体的新鲜健康人血清样品获自马萨诸塞州沃特敦的研究血液成分有限责任公司。将来自每个供体的等分试样在56°C加热灭活30分钟（等分试样达到温度后）。将诱导的SYNB1891-cmR细菌（参见厌氧体外回路诱导）以1×10 7个细胞/ ml 的浓度重悬，并将50 µl细菌添加到450 µl人血清中（未处理或热灭活）。接着，细菌在37℃下振荡温育Ť = 0，45，90，和180分钟，然后铺在CFU计数连续稀释在补充了胸苷，二氨基庚二酸和氯霉素的LB琼脂糖平板（见从细菌量化体内样品）以确定对血清裂解的敏感性。
根据ATCC的建议，在含有10％FBS和青霉素-链霉素（100 IU / ml和100 mg / ml）的DMEM-GlutaMAX培养基中维持小鼠RAW264.7巨噬细胞系（ATCC）。为了产生鼠类骨髓来源的树突状细胞，从胫骨和股骨无菌收获骨髓细胞，使用无菌红细胞裂解缓冲液Hybri-Max（Sigma）裂解红细胞，并在含有10％DMSO（Sigma）的FBS中冷冻）在-80°C下。将骨髓细胞解冻，冲洗以除去DMSO，然后以5×10 5的浓度重新悬浮培养基中含有5％FBS，50uM 2-巯基乙醇，青霉素-链霉素（100 IU / ml和100 mg / ml）和20 ng / ml GM-CSF（BioLegend）的RPMI 1640-GlutaMax中的细胞数/ mL。第3天后，除去所有非粘附细胞，并在使用前将粘附的树突状细胞簇在新鲜培养基中再培养6天。每隔一天用新鲜培养基替换一半的培养基。
为的BMDC的显微成像，将细胞接种在聚D - 升 -赖氨酸覆盖的玻璃盖玻片在24孔板在5×10的浓度5细胞/孔的RPMI含有5％FBS，无抗生素1640-Glutamax培养基。细胞粘附后，在某些孔中用细胞松弛素D（10μM）预处理细胞1 h。然后活预诱导的SYNB1891 -gfpMOI为25的细菌被添加到BMDC中。将板以350g离心2分钟，以使细菌与DC接触，并在37°C下孵育1 h，以进行吞噬作用。1小时后，通过用冰冷的DPBS冲洗3次来洗去未内在化的细菌，并将细胞在室温下于PBS中的4％PFA中固定20分钟。用1 mL PBS冲洗细胞2-3次（每次1分钟），并用通透缓冲液（PBS中的0.2％皂苷，0.03 M蔗糖，1％BSA）通透10分钟。然后用封闭缓冲液（2％山羊血清，1％BSA，0.1％冷鱼皮明胶，0.1％皂苷和0.05％Tween-20的PBS溶液，pH7.2）处理细胞60分钟，并用抗GFP的一抗染色（兔抗GFP，Abcam，目录号ab6556）和LAMP-1（大鼠抗小鼠LAMP-1（1D4B），eBioscience，目录号14-1071-82）在稀释缓冲液（1：250）中稀释（ PBS，0。0％Tween-20、1％BSA，0.1％皂苷）在4°C下过夜。第二天，将细胞在1 ml稀释缓冲液中洗涤3次，每次5分钟，并用二抗驴抗兔IgG（Alexa488，ThermoFisher Scientific .. A-21206）和山羊抗大鼠IgG（Alexa 647，在室温下以1：750的稀释度在稀释缓冲液中使用ThermoFisher Scientific，＃A-21247）。接着，将BMDC在1mL稀释缓冲液中洗涤3次，每次5分钟，根据制造商的方案，用NucBlue和ActinRed 555探针（ThermoFisher Scientific）将细胞核和F-肌动蛋白染色。染色后，将BMDC用DPBS冲洗两次，盖玻片用ProLong固定 ThermoFisher Scientific。＃A-21206）和山羊抗大鼠IgG（Alexa 647，ThermoFisher Scientific，＃A-21247）在稀释缓冲液中于室温以1：750稀释60分钟。接着，将BMDC在1mL稀释缓冲液中洗涤3次，每次5分钟，根据制造商的方案，用NucBlue和ActinRed 555探针（ThermoFisher Scientific）将细胞核和F-肌动蛋白染色。染色后，将BMDC用DPBS冲洗两次，盖玻片用ProLong固定 ThermoFisher Scientific。＃A-21206）和山羊抗大鼠IgG（Alexa 647，ThermoFisher Scientific，＃A-21247）在稀释缓冲液中于室温以1：750稀释60分钟。接着，将BMDC在1mL稀释缓冲液中洗涤3次，每次5分钟，根据制造商的方案，用NucBlue和ActinRed 555探针（ThermoFisher Scientific）将细胞核和F-肌动蛋白染色。染色后，将BMDC用DPBS冲洗两次，盖玻片用ProLong固定®金抗褪色封固剂（ThermoFisher Scientific），在室温干燥过夜。使用EVOS™FL Auto 2成像系统（Invitrogen）使用40倍（孔径0.75）和60倍（孔径1.42）物镜对细胞成像。采集后对比度调整是使用ImageJ软件进行的。补充图11显示了量化树突状细胞内共存细菌的代表性示例 。量化视野中每个树突状细胞的平均细菌数（FOV），并显示为树突状细胞内在化的细菌与每个FOV的树突状细胞总数之比。
将RAW264.7巨噬细胞或BMDC以5×10 5个细胞/孔的浓度接种在0.5 mL 不含生长细胞因子和抗生素的相应培养基中（见巨噬细胞和树突细胞培养物），浓度为5×10 5个细胞/ 孔。将人单核细胞衍生的初级DC（StemCell Technologies，70041）解冻，并根据制造商的规程准备用于下游应用。将人DC以1×10 5个细胞/孔的浓度接种到96孔板中的0.2 mL含10％FBS的RPMI 1640-GlutaMax培养基中。细胞粘附后两小时，一式三份刺激细胞：活菌EcN或活诱导的SYNB1891细菌，MOI为25；浓度为100 ng / mL的超纯LPS（Invivogen）；浓度为5或25μg/ mL的稳定smSTING激动剂（2'3'-c-di-AM（PS）2（Rp，Rp），Invivogen）。将板以350 g离心2分钟，使细菌与DC或巨噬细胞接触，然后在37 o C 下孵育 1 h，以使处理内在化。1小时后，非内在化细菌，LPS或smSTING激动剂用温DPBS冲洗两次，加入含有抗生素的新鲜培养基，并将细胞在37 o C下孵育 C.根据读数，在处理后2、4、6或18 h收获细胞或培养基进行分析。仅在培养基中温育的巨噬细胞和DC用作阴性对照。收集细胞上清液和细胞，并分析细胞因子蛋白的存在和基因表达。使用Quantikine ELISA试剂盒（R＆D Systems）通过标准比色读数或定制的MILLIPLEX小鼠细胞因子磁珠板试剂盒（MILLIPLEX Multiplex Assay，Millipore Sigma）检测小鼠细胞因子IL-6和TNF-α，以检测IL-6，IL -1β和IL-12p70，并在MAGPIX分析仪（Luminex）上进行分析。使用PBL AssayScience ELISA通过标准比色读数来检测小鼠IFN-β1。在一些实验中，在刺激以停止吞噬之前，用细胞松弛素D（在相应培养基中为10μM）预处理细胞1 h。在刺激的第一个小时直至洗涤之前，细胞松弛素D存在于培养基中。
根据制造商的方案，使用TurboCapture 96 mRNA试剂盒（Qiagen）分离细胞RNA。对于cDNA制备，使用具有RNase抑制剂的高容量cDNA反转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific），根据制造商的规程，从分离的RNA中合成cDNA。对于20μl反应，按如下方法制备2X RT主混合物：10X RT Buffer 2μL，25X dNTP mix 0.8μL，10X随机引物2μL，MultiScribe RT（50 U /μl）1μL，RNAase抑制剂1μL，Nuclease-游离H2O为3.2μL，mRNA为10μL。在T100 Thermal Cycler（Bio-Rad）中，PCR板在25°C下运行10分钟，在37°C下运行120分钟。用于定量小鼠Ifnb1（Mm00439552_s1 Taqman探针），小鼠Il6（Mm00446190_m1），小鼠Il12a（Mm00434169_m1），小鼠cd86（Mm00444540_m1），人IFNB1（Hs01077958_s1），人IL-6（Hs00174131_m1），人肿瘤坏死因子（Hs00174128_m1），人CD86（Hs01567026_m1），人CD40（Hs01002915_g1），人IL-12A（Hs01073447_m1）和人IL-1B（Hs01555410_m1）mRNA表达，使用Taqman分析探针和TaqMan Fast Advanced Master Mix进行10μLqPCR反应，其中包含以下成分：2X Master Mix 5μL，Taqman基因探针（20×）0.5μL（FAM标记）， Taqman小鼠或人β-肌动蛋白（内源性对照）*探针（20x）0.5μL（VIC标记），cDNA 4μL。在QuantStudio 6实时PCR系统（Applied Biosystems）中，在MicroAmp™光学384孔反应板中于95°C进行20 s的反应，并进行40个循环（1 s-95°C，20 s-60℃）。基因表达是通过使用比较例C分析Ť方法（ΔΔC Ť法）。Prism7.0 c软件（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚）用于所有统计分析。
包含IRF荧光素酶报告基因和NF-κB碱性磷酸酶（SEAP）报告基因的THP1-Dual细胞（thpd-nfis），具有稳定敲除cGAS基因和THP1的THP1-Dual KO-cGAS（thpd-kocgas）细胞。从InVivoGen购买具有稳定STING基因敲除功能的双KO-STING（thpd-kostg）细胞，并按照制造商的协议进行培养。使用了包含以下TMEM173（STING）等位基因的THP-1细胞系：H232（InVivoGen，thpd-h232），HAQ-THP1内源性等位基因（InVivoGen，thpd-nfis）和R232（InVivoGen，thpd-r232）。收获细胞，沉淀并重悬在50％新鲜的RPMI 1640-GlutaMax培养基中，该培养基含有10％FBS（RPMI-10）和50％来自扩增细胞培养的上清液，以及1×10 5将每孔225μL中的细胞转移到96孔细胞培养板中。预诱导细菌表达CDA（如上所述），在冷DPBS中漂洗3次，然后重悬在RPMI-10中。将细菌（以指定的比例）或单独的培养基添加到THP-1细胞中，以达到250μL的总体积。将细胞孵育过夜，沉淀，并将上清液转移至用于荧光素酶的96孔白色不透明板或用于检测磷酸酶活性的96孔透明板。按照制造商的协议重建并使用Quanti-Luc（InVivoGen，rep-qlc1）或Quanti-Blue（InVivoGen，rep-qbs1）解决方案，以测定THP-1培养基的荧光素酶或磷酸酶活性。使用Synergy Neo酶标仪（BioTek Instruments）测量发光或光密度信号。棱镜7。
Prism7.0 c软件（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚）用于所有统计分析。统计测试的详细信息在相应的图例中给出。使用学生的t比较值测试以比较两组或单向方差分析与Tukey的多重比较后测，以比较多个组平均值与一个独立因素（例如治疗组）的方差。当我们对因变量具有两个因素（例如治疗和时间（或基因型））的影响时，我们采用了双向ANOVA和Tukey的多重比较后测。在达到实验终点后将一些小鼠从研究组中撤出的体内实验情况下，我们使用单向ANOVA与指定时间点Tukey的多次比较后验进行了组之间的比较。对于Kaplan–Meier生存实验，我们进行了对数秩（Mantel-Cox）测试。
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