铜绿假单胞菌肺炎引起内皮细胞释放细胞毒性淀粉样蛋白，可以从重症患者的支气管肺泡灌洗液和脑脊液中回收这些蛋白。将这些细胞毒性淀粉样蛋白引入侧脑室会损害小鼠的学习和记忆能力。但是，尚不清楚肺起源的淀粉样蛋白是否（1）是神经营养性的，以及（2）是否引起海马树突的结构重塑。因此，我们在脑切片中进行了电生理学研究，并对从暴露于内皮源性淀粉样蛋白的动物身上获得的尸体组织进行了结构分析，以评估这些问题。淀粉样蛋白通过脑室内，气管内和腹膜内注射通过三种不同途径给药。脑室内注射淀粉样蛋白后，消除了突触的长期增强作用。脑室内淀粉样蛋白注射后4周，荧光透析或高尔基浸渍标记显示树突棘密度降低，海马锥体神经元棘突不稳定。相比之下，引入呼吸道的内皮淀粉样蛋白引起最明显的树突状脊柱密度降低，但是腹膜内注射这些淀粉样蛋白并不影响脊柱密度。我们的发现表明，感染引起的肺内皮淀粉样蛋白具有神经营养作用，并降低神经元树突棘密度 然而，这些淀粉样蛋白的腹膜内注射并不影响脊柱密度。我们的发现表明，感染引起的肺内皮淀粉样蛋白具有神经营养作用，并降低神经元树突棘密度 然而，这些淀粉样蛋白的腹膜内注射并不影响脊柱密度。我们的发现表明，感染引起的肺内皮淀粉样蛋白具有神经营养作用，并降低神经元树突棘密度体内。施加到气管的淀粉样蛋白可以通过循环传播并穿过血脑屏障进入大脑，启动血脑屏障细胞之间的前馈淀粉样蛋白可传递性，或通过其他方式进入大脑。然而，肺源性淀粉样蛋白抑制海马信号传导并导致神经元结构损伤。
许多危重患者可能与谵妄发生的重症监护病房逗留期间相关的长期认知障碍遭受1，2。虽然危重病人谵妄和认知能力下降之间的因果联系仍不清楚，他们不能完全归因于年龄，性别，相对大脑缺氧，麻醉剂和镇静剂，和遗传倾向3，4，5，6，7。然而，感染已经成为认知功能障碍的一个重要原因，因为这两个社区和医院获得性肺炎导致神经功能障碍8，9。虽然尚不清楚社区获得性肺炎如何损害学习和记忆，但在了解医院内肺炎神经功能障碍的原因方面取得了一些进展。脓毒症导致内皮糖萼脱落内皮硫酸乙酰肝素，然后可能进入大脑并损害脑源性神经营养因子介导的神经系统处理10。此外，肺部感染导致产生肺本身内的淀粉样蛋白物质和淀粉样蛋白的物种可以在感染的患者的脑脊髓液，其中它们具有神经毒性中回收11，12，13，14。硫酸乙酰肝素和细胞毒性淀粉样蛋白可能与神经炎的其他原因分开并与之结合而引起神经毒性。
我们最近对从有和没有单微生物细菌性肺炎的危重患者中收集的标本中的淀粉样蛋白进行了定量。相比于非感染患者时，确诊为院内获得性肺炎患者在他们的支气管肺泡灌洗液和脑脊液增加细胞毒性淀粉样变平8，14。至于细菌性肺炎感染的先天性应答，肺动脉内皮产生并释放淀粉样蛋白13，14。接受气管内铜绿假单胞菌滴注或在无细菌的情况下接受脑室内注射内皮淀粉样蛋白的啮齿动物表现出学习和记忆障碍15。显著，而从内皮暴露于PA103（一个产生的淀粉样蛋白的铜绿假单胞菌菌株具有官能3型分泌系统）IMPAIR学习，从内皮淀粉状蛋白暴露于ΔPcrV（有缺陷的3型分泌系统的铜绿假单胞菌菌株）不。这些结果表明，在铜绿假单胞菌 3型分泌系统和效应外切酶是必需的用于肺部内皮生产和细胞毒性淀粉样蛋白的释放11，12，13，14。值得注意的是，这些淀粉样蛋白具有of病毒的特征，因为它们具有热稳定性，对RNase和DNase不敏感，对蛋白酶具有抵抗力，可传播且可自我复制，并且还对所用的β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau（τ）抗体具有免疫反应性检测阿尔茨海默病的大脑的神经病理学蛋白11，12，13，14，15。内皮淀粉样蛋白的神经毒性是可移除的，通过使用选择性抗体immunodepletingAβ和τ络合物8，14。综合起来，这些研究表明，肺炎诱导的细胞毒性淀粉样蛋白从肺中释放出来，在血液中循环，并存在于脑脊液中，在原发性感染清除后，它们可能会严重损害大脑的功能。
最近的研究已经证明，从患病的大脑纯化并直接注入或者腹膜腔或全身的淀粉样蛋白的循环种类是传送和亲神经16，17，18。更具体地说，这些淀粉样蛋白从循环系统转移到易感的大脑区域，并诱导淀粉样蛋白聚集模式，类似于在大脑中从19中纯化出的淀粉样蛋白。然而，目前缺乏有关疾病如何引起外周细胞毒性淀粉样蛋白产生的证据，即不是起源于大脑，而是通过循环和进入大脑进行生物分布。
在这项研究中，我们检查了感染引起的细胞毒性淀粉样蛋白在引入脑脊髓液，气管和腹膜腔后是否可以进入大脑，并且它们是否引起海马树突棘的结构重塑。它有良好的记载，神经元树突棘的解剖成熟和增加棘密度与突触可塑性和学习直接相关，而老化和神经病理学原因脊柱修剪20，21，22，23，24。因此，获得的淀粉样蛋白的内皮后张贴PA103或ΔPcrV感染在体外，我们将它们注射到小鼠的脑室内（ICV），气管内（INT）或腹膜内（IP）空间中，记录海马场电位，并比较4周内的树突棘类型及其密度。
为了量化海马CA1锥体神经元上的突触后棘，将路西法黄，Alexa染料或生物胞素透析到细胞中，然后进行分析。结果是可比的，因此我们在整个研究过程中都使用了路西法黄，因为它最不可能从溶液中沉淀出来并堵塞移液管吸头。细胞透析后，将脑切片固定并使用共聚焦激光扫描显微镜成像（图 1A，B）。使用方法中描述的自定义定义设置，以半手动方式跟踪树突和树突分支（图 1C），并检测到树突棘并将其分为四种脊柱类型-蘑菇，粗短，细和丝状足（图1D）。 。
定量树突棘。（A）包含代表性的路西法黄填充的CA1锥体细胞的单个切片的代表性照片。用20倍物镜捕获该图像，并对Z堆栈投影中的荧光信号求平均值。选取框区域显示在（B）中。（B）用60X物镜捕获放大的切片，并平均荧光信号以显现树突和树突棘。选取框区域显示在（C）中。（C）树突和刺的3D重建。（D）如（C）所示的放大部分）显示了按形状分类的4种类型的棘。从最成熟到最不成熟：蘑菇（蓝色），粗短（黄色），稀薄（红色）和丝状（绿色）。
为了研究内皮来源的淀粉样蛋白如何影响突触可塑性并调节神经元树突棘，我们向脑室内（ICV）注射了ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白（请参阅方法以了解详细说明和淀粉样蛋白制备）。注意，ΔPcrV-淀粉样蛋白或PA103-淀粉样蛋白表示将细胞暴露于各个细菌后收集的无细菌的肺内皮上清液。注射ICV后两周，我们获得了6个小鼠大脑（3个ΔPcrV-淀粉样蛋白和3个PA103-淀粉样蛋白）。为荧光染料透析和可塑性记录敏锐地准备了脑片。我们将每个大脑中的8-12个CA1锥体细胞贴片填充10分钟以上，同时每3分钟监视一次细胞并记录其特性以确保持续透析（图 2）。不同树突形态的神经元（例如，分叉与非分叉的初级树突）或位于CA1细胞层不同深度或部分的神经元之间，电生理特性均无明显差异。因此，包括了所有静息膜电位低于-55 mV且电阻特性没有明显漂移的神经元-共研究了23个ΔPcrV-淀粉样蛋白处理的神经元和20个PA103-淀粉样蛋白处理的神经元。在这些中，确定9个ΔPcrV-淀粉样蛋白处理的神经元（40％）和5个PA103-淀粉样蛋白处理的神经元（25％）被荧光素黄充分填充，用于分析树突棘密度和类型。补片填充后，将脑切片固定并免疫染色以检测突触前末端。但是，免疫染色并不能产生干净的结果，而且我们无法量化功能性突触（突触前末端与突触后脊柱紧密相邻）。尽管如此，我们仍然能够追踪到树状树（图。 图2A，B）和3D重建了尖斜树突和基底树突中的突触后棘（图 2C-F）。
将PA103淀粉样蛋白注射到脑室可减少根尖棘。（A，B）包含代表ΔPcrV-淀粉样蛋白（A）和PA103-淀粉样蛋白（B）动物的代表性路西法黄填充的CA1锥体细胞的单个z堆栈切片的照片。用20倍物镜捕获图像，并显示平均的Z-stack荧光信号。右侧显示了从包含相同细胞的所有部分重建的细胞体和完整树突状树的轨迹。用60倍物镜捕获顶部和底部树突的选框区域，并显示在（C – F）中。（C – F）根尖的放大显微照片和3D重建（C，D）或基底（ë - ˚F）树突和棘从ΔPcrV淀粉样蛋白（C，E）或PA103淀粉状蛋白（d，F）的小鼠。刺的类型用颜色编码：蘑菇，蓝色；粗短的，黄色的；又薄又红 白色的水平条表示4 µm。
脑室中的PA103淀粉样蛋白可降低根尖脊柱密度并破坏根尖脊柱的稳定性。（A，B）条形图描绘了来自ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白处理的小鼠的CA1锥体细胞的顶端（A）或基础（B）树突树中脊柱密度的平均差异。（C，D）饼图显示了脊柱类型在根（C）或基底（D）树突中的分布。（E）条形图描绘了在动物用ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白处理后，顶端树突中脊柱类型的平均差异。* p = 0.006；t检验
随后对路西法黄填充的3D重建树突棘密度和类型进行了量化。经ΔPcrV-和PA103-淀粉样蛋白处理的神经元之间的平均脊柱密度差异在心尖斜树突上有统计学意义（分别为12.4±1.3和6.4±1.0;每个n = 5个细胞，p = 0.006，t检验;图。 3A），但不包括基底树突（分别为11.8±1.7和11.0±1.0； n = 5个细胞，p > 0.05，t-检验；图 3B）。在经ΔPcrV-和PA103-淀粉样蛋白处理的神经元之间，根尖树突上的脊柱类型也似乎有所不同，但在基底树突上却没有差异（图 3C，D）。因此，我们进一步比较了从最成熟的蘑菇刺到粗短刺和未成熟丝状伪足刺的顶端树突棘类型。图 3E显示，在PA103-淀粉样蛋白处理的神经元中，脊柱类型的分布从蘑菇状和粗短棘状转变为细棘状，表明大脑中的PA103-淀粉状蛋白使突触后棘不稳定。
CA1锥体神经元上的突触后棘是动态的。学习和记忆的增加棘密度并提高脊柱熟化24，25。因此，我们接下来询问脊椎密度降低是否会导致长期增强（LTP）降低，这是一种用于学习和记忆的细胞模型。我们对动物进行了ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白的ICV注射（每只3只小鼠）后两周，我们进行了急性脑切片记录，以研究Schaffer侧突触处的LTP。在ΔPcrV-淀粉样蛋白脑中，Theta爆发刺激诱导的突触增强持续了超过1小时。然而，在用PA103-淀粉样蛋白治疗的大脑中，LTP显着降低（ΔPcrV：158±10.7％; PA103：115±4.3％; n =每个4片，p = 0.02，t检验;图。 4）。这一发现可能归因于ICV注射两周后根尖脊密度降低，这与我们先前的研究一致，该研究表明接受ICV PA103-淀粉样蛋白的小鼠学习和记忆受损15。这些结果，加上在染料透析细胞中的发现，表明PA103淀粉样蛋白可降低CA1脊柱密度并损害动物学习。
脑室中的PA103淀粉样蛋白会损害长期增强作用。从海马中诱发的场电位记录长期增强作用。（A）图显示了标准化的fEPSP斜率，从ΔPcrV或PA103-淀粉样蛋白处理的小鼠的海马中记录，基线为10分钟，随后是高频刺激和60分钟的响应记录。* p = 0.02；t检验比较55-60分钟时的fEPSP反应。（B）在刺激后15分钟（中等）和60分钟（最浅）的基线（最暗）的代表性fEPSP迹线。每条迹线描绘了每个时间点的平均10条fEPSP迹线。垂直和水平条分别表示0.1 mV和5 ms。
为了进一步量化ICV注射的PA103-淀粉样蛋白在延长的时间段内对树突棘减少的影响，我们利用了CA1锥体神经元的高尔基浸渍法。高尔基染色的神经元在形态上与路西法黄色透析细胞相似。我们离线重建了远端和近端（斜或外侧）根尖段，并量化了每个树突分支的脊柱密度和类型（图 5A，B）。与来自充满染料的神经元的结果一致，根尖树突树上的棘对PA103淀粉样蛋白神经毒性敏感。具体来说，在第3和第4周，近端树突的脊柱密度降低，而仅在第4周时，远端树突的脊柱密度降低。在近端和远端树突分支之间未发现其他明显差异。基底树突类似地定量。远端和近端节段的结果相似，并且PA103-或ΔPcrV-淀粉样蛋白不影响脊柱密度或脊柱类型。因此，汇集了来自近端和远端树突的结果（图 5C）。我们报告说，ICV PA103-淀粉样蛋白后4周，根尖脊柱密度明显降低（4.7±0.3； n =每周8个细胞；p = 0.0013; 与Tukey 进行事后比较的方差分析：第1周：8.8±0.7）。相反，在基底树突中没有观察到脊柱密度的明显变化。
脑室内，气管内或腹膜内注射PA103-淀粉样蛋白后，树突棘随时间的变化。（A，B）从注射ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白的小鼠ICV获得的代表性根尖树突棘的负显微照片。树突和已分类（颜色编码）的树突棘的相应3D重建如下所示。（C – E）条形图描绘了通过脑室内注射，气管内滴注或腹膜内注射用ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白治疗的小鼠的顶端（上）和基底（下图）树突棘密度的平均差异。*与使用Tukey 事后检验进行方差分析的第一周相比，具有统计意义。
我们的结果表明，当存在于脑部的脑脊液中时，肺内皮源性细胞毒性淀粉样蛋白会降低CA1锥体神经元的顶端树突棘密度。重要的是，非细胞毒性的肺源淀粉样蛋白不会损害脑神经元。由于ΔPcrV-和PA103淀粉样蛋白是肺源性淀粉样蛋白，因为以前的研究已经证明，当注入循环从神经病理病变的大脑淀粉样蛋白提取易位至脑16，17，18接下来，我们检查了气管内（INT）滴注或腹膜内（IP）注射内皮淀粉样蛋白是否会降低CA1树突棘密度。如在ICV注射后所述，进行类似的高尔基染色定量。结果显示，PA103-淀粉样蛋白INT不仅可以更早地降低根尖脊柱密度（第3周：4.9±0.9; p = 0.010;第4周：5.5±0.7; p = 0.026; n =每周8个细胞，采用Tukey 事后分析的ANOVA 与第1周相比：7.9±0.6；图 5D），但在气管滴注后第3和4周时，基础脊柱密度也降低了（第3周：2.8±0.4；p = 0.001；第4周：4.5±0.7；p = 0.003 ; n =每周8个细胞，采用Tukey post hoc进行 ANOVA与第1周相比：7.3±0.6）。然而，递送IP的内皮淀粉样蛋白不影响脊柱密度（图 5E）。
接下来，根据脊椎的解剖形状（例如，蘑菇，粗短或稀薄）进一步对脊椎进行分类，并将脊柱型密度结果绘制为条形图（图 6）。结果显示，ICV PA103-淀粉样蛋白注射后4周脊柱密度降低归因于粗短和细棘减少（第4周：粗短：1.7±0.5，p = 0.015;稀：0.82±0.27，p = 0.002; n = 8 ；与第1周比较的t检验：粗短：4.4±0.6；瘦：2.4±0.3；图 6A）。INT PA103-淀粉样蛋白滴注后，第3周和第4周根尖脊柱密度的下降仅归因于粗短刺的减少（第3周：1.9±0.4，p = 0.016；第4周：2.7±0.5，p = 0.021； n = 8;与第1周相比的t检验：5.6±0.4；图 6B上部面板）。然而，在基底树突中，脊柱密度的降低是由于蘑菇和粗短刺的减少所致（第3周：蘑菇：0.68±0.11，p = 0.042;粗茎：1.7±0.3，p = 0.003;第4周：蘑菇：0.58±0.07 ，p ＝ 0.039；粗短：3.7±0.4，p ＝ 0.028； n ＝ 8；与第1周相比的t检验：蘑菇：1.1±0.1；粗短：5.8±0.6；图6B下图 。
通过PA103-淀粉样蛋白注射途径，树突棘类型分布随时间变化。（A – C）条形图总结了通过脑室内注射，气管内滴注或腹膜内注射用ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白治疗的小鼠的顶端（上）和基底（下图）树突类型。在显示脊柱密度降低的治疗中进行统计比较。*与使用t检验的第一周相比的统计显着性。（D – F）顶端和基底树突的形状参数（脊柱头部直径/颈部直径）的累积频率（％）。颜色迹线显示在用ΔPcrV-或PA103-淀粉样蛋白处理的小鼠中，从第1周和第2周或第3周和第4周计算出的脊柱形状参数。
我们通过计算脊柱头颈直径的比值进一步量化了脊柱形状的变化，因为该计算将最灵敏地反映出蘑菇和短粗/细刺之间的变化。蘑菇脊柱的比率将> 1.1，而粗短刺或细刺的比率将≤1.1，如按我们的参数分类（请参见“方法”）。治疗后第1周和第2周以及第3周和第4周的比率表示为累积频率迹线（图 6D-F）。我们的结果表明，注射IC103和INT的PA103-淀粉样蛋白后，顶端树突棘的曲线右移（即，头/颈直径比增加），表明蘑菇增加或粗短/细棘减少（图 6D，E，上面板）。有趣的是，尽管在INT PA103-淀粉样蛋白注射后基底树突棘密度降低了，但累积频率迹线并未受到影响，这表明蘑菇和粗短刺的同时降低可能相互抵消，从而导致头颈部直径比的累积频率不变（图 6E，下部面板。
总体而言，结果表明，虽然将PA103-淀粉样蛋白引入ICV或INT途径后，蘑菇棘在顶端树突中保持了其解剖结构，但在INT滴注后，其基底树突中的蘑菇棘减少了。总的来说，尽管整个脊柱密度降低，但根尖状树突棘类型的减少不成比例，而在基底树突中保持了脊柱类型的分布。因此，PA103诱导的内皮细胞细胞毒性淀粉样蛋白：（i）引起树突棘缩回；（ii）通过气道递送时降低根尖和基底树突密度，（iii）损害根尖的薄而短的棘突，和iv）减少通过气道引入的蘑菇和粗短刺，并降低基础脊柱密度。我们的工作与细胞毒性内皮淀粉样物质可在肺中传播的工作模型是一致的。进入大脑的淀粉样蛋白会导致树突棘修剪和进行性神经病理。
医院获得性肺炎诱发从肺内皮生产细胞毒性淀粉样蛋白的8，14。这些淀粉样蛋白可以从携带单株铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌肺部感染的患者的支气管肺泡灌洗液和脑脊液中回收。这些细胞毒性物质的产生似乎需要细菌毒力因子的存在。例如，细胞毒性内皮淀粉样蛋白的产生取决于铜绿假单胞菌 3型分泌系统及其外切酶。即，缺乏3型分泌系统的铜绿假单胞菌菌株和突变体及其效应物不会产生细胞毒性淀粉样蛋白8，15。直接将内皮细胞毒性淀粉样蛋白递送到脑室会损害动物的学习和记忆能力15。在这里，我们显示了感染引起的肺内皮淀粉样蛋白降低了神经元树突棘密度，此外，淀粉样蛋白递送到气道中足以引起这种不断发展的神经毒性。由于这些淀粉状蛋白传播并且是可穿透的内皮细胞之间的13，14，我们的发现进一步表明，当将其重新引入幼稚的肺部时，淀粉样蛋白负荷可能会随着时间的推移而放大或保持可持续。因此，一旦肺部细菌感染引起细胞毒性淀粉样蛋白的产生，即使没有活性感染，淀粉样蛋白负担也可能普遍存在。虽然细胞毒性淀粉样蛋白产生的起始原因是肺部感染，但我们表明，在没有感染的情况下，原发性感染和将细胞毒性淀粉样蛋白直接引入肺中都会导致隐匿性神经病变，其特征是长期增强能力减弱和树突状细胞减少脊柱密度。
自圣地亚哥·拉蒙·卡哈尔（SantiagoRamóny Cajal ）的开创性工作以来，可视化和量化树突棘的方法已取得了显着进步（参见评论26）。在这项研究中，我们利用具有高分辨率光学成像和高尔基体浸渍方法，这两者已被广泛用于量化在突触后棘变化荧光染料标记，带结果媲美电子显微镜的量化27，28，29。比较这两种方法，我们的结果表明透析标记对检测脊柱密度变化更为敏感，因为在ICV注射后，荧光标记的细胞在两周时显示减少，而在高尔基体浸渍的细胞的减少在一个月后变得显着。此外，PA103-淀粉样蛋白ICV注射后，两种方法之间的脊柱类型变化也不同。尽管我们没有进一步探讨差异，但两种方法均显示，ICV注射后仅根尖棘减少。锥体神经元上的突触后棘是兴奋性突触的重要组成部分。与疾病相关或淀粉样蛋白引起的树突状修剪可能涉及神经毒性和神经炎症反应，包括补体，星形胶质细胞和小胶质细胞的激活30，31，32。目前尚不清楚由肺源性淀粉样蛋白引起的脊柱密度降低和脊柱重塑的机制，这超出了本研究的范围。这是我们正在进行的工作的积极重点。然而，我们正在进行的初步结果表明，在接受有害的内皮淀粉样蛋白的动物中，活化的小胶质细胞和星形胶质细胞增多症的患病率增加了（数据未显示），表明神经炎很可能参与其中。
将脑淀粉样蛋白从脑脊髓液清除到血液中是维持健康的大脑功能所需要的生理过程33。相反，从患病的大脑中提取并注入血液或腹膜的外源淀粉样蛋白能够在血液中循环并进入中枢神经系统，并在那里积累和传播。值得注意的是，这些疾病的淀粉样蛋白的物种的种子相同的大脑区域从它们起源，破坏的相同类型的神经元的最容易的淀粉样蛋白物质，并重新创建神经缺陷16，18，19，34。当前研究的一个关键方面是所研究的细胞毒性内皮淀粉样物质是从肺中分离出来的细胞产生的。当再施用于肺部时，淀粉样蛋白可能会在肺部或其他地方扩增，或者随着时间的推移增加其细胞毒性潜能，并传播到大脑中，引起树突状修剪。内皮淀粉样蛋白的神经毒性取决于铜绿假单胞菌3型分泌系统及其毒力因子，因为感染ΔPcrV的细胞不会产生淀粉样蛋白，而淀粉样蛋白会损害动物学习，长期增强能力或树突状脊柱密度。值得注意的是，这些内皮来源的细胞毒性淀粉样蛋白的作用类似于病毒，对Aβ和τ抗体具有免疫反应性，并在肺部感染期间在肺中产生，但它们具有神经营养特性。
尽管在这项研究中我们没有量化内皮淀粉样蛋白从腹膜到血液的转运，但IP注射的PA103-淀粉样蛋白（300 µL）并没有降低脊柱密度。这些结果表明，无论是太少注射淀粉状蛋白被吸收进入血液循环，或者说进入的这条路线将需要较长的时间来转运和损伤的神经元在大脑中16，35。注射的淀粉样蛋白不含细菌；应避免败血症引起的晚期糖基化终产物（RAGE）受体的上调，后者将体液淀粉样蛋白转运到脑实质中36。值得注意的是，与之形成鲜明对比的是，PA103-淀粉样蛋白的气道滴注显着降低了脊柱密度，这表明与ICV注射相比，应用于气道的内皮淀粉样蛋白以加剧对神经元损害的方式传播。
ICV注射的PA103-淀粉样蛋白降低了树突棘的密度，但是这种作用仅限于放射状层和腔隙分子层内的顶端树突。另一方面，INT注射的淀粉样蛋白会损害顶端和基底的树突状细胞-本质上是CA1锥体细胞的所有树突状细胞输入。有趣的是，顶端和基底树突棘的减少受到不同的影响。根据脊柱类型的分类，我们的结果表明，ICV和INT注射后，粗短刺和细刺减少，而顶端树突中的蘑菇刺保持完整。为了进一步量化此变化，我们按头颈直径比对脊椎进行了排序，因为此计算会将蘑菇刺（头颈直径比较大）与粗短刺或细刺（小比率）区分开。累积频率图显示，ICV和INT注射增加了脊柱头部/颈部的直径比，与短粗或较薄的脊柱密度降低一致。与根尖状树突棘相反，基底树突棘密度的降低是由于INT注射后蘑菇和粗短刺的减少。蘑菇和粗短茎对头/颈部直径比的相反影响有效地相互抵消，从而导致累积频率不变。尽管这一发现是出乎意料的，但CA1锥体神经元接收来自CA3神经元（即Schaffer侧支途径）和内嗅皮层（即功能途径）的输入。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑 符合粗短或脊柱密度降低的情况。与根尖状树突棘相反，基底树突棘密度的降低是由于INT注射后蘑菇和粗短刺的减少。蘑菇和粗短茎对头/颈部直径比的相反影响有效地相互抵消，从而导致累积频率不变。尽管这一发现是出乎意料的，但CA1锥体神经元接收来自CA3神经元（即Schaffer侧支途径）和内嗅皮层（即功能途径）的输入。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑 符合粗短或脊柱密度降低的情况。与根尖状树突棘相反，基底树突棘密度的降低是由于INT注射后蘑菇和粗短刺的减少。蘑菇和粗短茎对头/颈部直径比的相反影响有效地相互抵消，从而导致累积频率不变。尽管这一发现是出乎意料的，但CA1锥体神经元接收来自CA3神经元（即Schaffer侧支途径）和内嗅皮层（即功能途径）的输入。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑 基础树突棘密度的降低是由于INT注射后蘑菇和短棘的减少。蘑菇和粗短茎对头/颈部直径比的相反影响有效地相互抵消，从而导致累积频率不变。尽管这一发现是出乎意料的，但CA1锥体神经元接收来自CA3神经元（即Schaffer侧支途径）和内嗅皮层（即功能途径）的输入。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑 基础树突棘密度的降低是由于INT注射后蘑菇和短棘的减少。蘑菇和粗短茎对头/颈部直径比的相反影响有效地相互抵消，从而导致累积频率不变。尽管这一发现是出乎意料的，但CA1锥体神经元接收来自CA3神经元（即Schaffer侧支途径）和内嗅皮层（即功能途径）的输入。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑 Schaffer侧支通路）和内嗅皮层（即执行通路）。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑 Schaffer侧支通路）和内嗅皮层（即执行通路）。INT应用的淀粉样蛋白有可能能够通过鼻逆行进入大脑37，38，39或神经支配 40特异性影响CA1细胞的基础树突输入。有鉴于此，研究表明，鼻/嗅觉连接为治疗干预提供了通往大脑的直接途径 41。我们认为这是无法解释我们发现的机制，因为淀粉样蛋白被注入到声带下方的气管中，并且即使吞咽了应用的淀粉样蛋白，小鼠也不会打喷嚏或反流。然而，很明显淀粉样蛋白及其相关的神经病理学是通过神经元连通性传播的，使支配肺的神经成为可能的逆行淀粉样蛋白途径 42。
目前，尚不清楚解释为什么将淀粉样蛋白引入气道导致更严重的神经损伤的潜在机制，尽管我们提供了以下考虑因素：（1）INT施用的淀粉样蛋白的量（50 µL）仅高于该剂量。注入的ICV（1.5 µL）；（2）使用INT的淀粉样蛋白可进一步放大或增加肺或大脑的效力。首先，我们使用50 µL INT，因为我们通常将40–50 µL的活菌滴入气道，以确保在整个肺泡中分配足够的溶液。尽管如此，INT注射的淀粉样蛋白的体积比ICV注射的淀粉样蛋白高33倍。第二点尤其重要。对于滴入的淀粉样蛋白在肺内皮细胞中的传播14，它们需要穿过上皮层或对其造成伤害。或者，淀粉样蛋白也能够在肺上皮或其他细胞类型中繁殖。肺泡占较大的表面积，并且每个肺泡都补充有有效毛细血管交换所必需的多个毛细血管。将上皮和内皮暴露于肺源淀粉样蛋白很可能会进一步产生肺源淀粉样蛋白，这些淀粉样蛋白可以释放到循环系统中，并通过血液分配到大脑，从而导致树突棘修剪。
在重症监护环境中，细菌性肺炎患者会接受抗生素清除有毒细菌，细胞毒性淀粉样蛋白会在气道，肺部或循环中滞留，并且可能引发神经病理学级联反应，以前并未被认识到。这项研究提供了第一个直接证据，即肺源淀粉样蛋白会损害神经元解剖结构，并伴有树突状脊柱修剪。
制备并使用先前描述的方法从细胞上清液中收集内皮淀粉样蛋白13，14。简而言之，使用铜绿假单胞菌菌株PA103和非毒力对照菌株ΔPcrV。感染前，将细菌菌株从冷冻原种划线到Vogel-Bonner基本盐培养基上，并在37°C下孵育过夜。收集细菌并在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释至菌落形成单位/ mL（CFU / mL）的比例为2×10 8CFU / mL。从Sprague-Dawley肺获得的初级肺微血管内皮细胞的汇合单层接种PA103或ΔPcrV，感染复数（MOI）为20：1。接种后4小时收集上清液，以2,000×g离心10分钟，并通过0.22 µm过滤器灭菌，以确保含有淀粉样蛋白（即PA103-淀粉样蛋白和ΔPcrV-淀粉样蛋白）的内皮上清液不含细菌，随后被阴性电镀研究所证实。这些内皮上清液无论是包含细胞毒性或无细胞毒性的淀粉样蛋白，这取决于细菌菌株是否拥有功能3型分泌系统14，43，44。ΔPcrV感染后获得的内皮上清液（即ΔPcrV-淀粉样蛋白）对内皮细胞没有细胞毒性，并且不会在内皮单层中形成间隙，而PA103感染后获得的上清液（即PA103-淀粉样蛋白）具有细胞毒性，破坏了内皮细胞单层。体外损害体内学习。值得注意的是，PA103淀粉样蛋白的细胞毒性可归因于β淀粉样蛋白（Aβ）和tau（τ）低聚物，如我们先前的研究所示44。使用免疫沉淀去除这些内皮淀粉样蛋白（Aβ和τ）可以消除细胞毒性，而从抗体复合物中洗脱的淀粉样蛋白可以挽救细胞毒性。因此，本文在PA103-或ΔPcrV-感染后获得的内皮上清液分别表示为PA103-淀粉样蛋白或ΔPcrV-淀粉样蛋白。
受试者为13至17周龄的C57BL / 6 J雄性小鼠。所有程序均按照《美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南》中所述的指南进行。南阿拉巴马大学机构动物护理和使用委员会批准了所有程序。在用氯胺酮/甲苯噻嗪（90/5 mg / kg，腹膜内）到达麻醉平面后，对小鼠进行以下注射程序。
使用类似于我们的先前描述是一个立体定位方法进行脑室内（ICV）注射15，45。简而言之，将小鼠用电动注射器（UMP3T-1； World Precision Instruments，Sarasota，FL）安装在立体定位平台上。将1.5 µL内皮来源的淀粉样蛋白（即PA103淀粉样蛋白或ΔPcrV淀粉样蛋白）以0.2 µL / min的剂量注入两个半球的侧脑室。每次注射后，我们让针头静置5分钟，然后退出。腹膜内（IP）注射以300μLPA103-淀粉样蛋白或ΔPcrV-淀粉样蛋白推注。气管内（INT）滴注的方式类似于我们先前描述的动物感染方法15，只是使用了内皮来源的淀粉样蛋白。简而言之，将50 µL PA103-淀粉样蛋白或ΔPcrV-淀粉样蛋白推注到小鼠的气道中。每次注射后，在伤口闭合之前，我们允许动物在35°手术台上停留1-2分钟。使从该过程中恢复的动物安乐死，并在指定的时间点收集大脑。
总共六只小鼠（每只三只用于PA103和ΔPcrV-淀粉样蛋白ICV注射）用于脑切片记录和细胞内染料填充研究。ICV后两周，深度麻醉小鼠通过断头处死，急性海马切片制备8，并记录进行46，47，48经过以下修改。在稳定的基线后> 10分钟，提供了Theta爆破刺激。Theta脉冲串刺激包括以100 Hz的频率进行5次刺激的单个脉冲串，每个扫描以5 Hz的频率传递10个脉冲和以10 s的间隔传递3个扫描。使用EPC10放大器（HEKA）获得记录。模拟信号被进一步放大10倍，并使用Axopatch放大器（Axon仪器）以5 kHz的频率进行滤波，并使用Patchmaster软件（HEKA）以20 kHz的频率进行数字化。对于组织学，将固定和高尔基染色的大脑在30％蔗糖PBS中以70 µm切片。
用配备Nomarski DIC / IR的Leica DMLFS显微镜和配备Andor Revolution DSD2单元的改进型Dodt梯度对比光学元件，可以观察到CA1区的锥体神经元。使用全细胞膜片钳配置中，我们透析10分钟，将细胞用含有（以mM计）的内部溶液140 KMeSO 4，8的NaCl，1的MgCl 2，10个HEPES，5 MgATP，0.05 EGTA和1萤光黄CH（pH 7.3）49。我们在透析过程中每3分钟监测一次接触电阻，输入电阻和膜电位。仅当神经元的静息电位在-70至-55 mV之间，稳定的输入电阻和超调动作电位时，才包括神经元。输入和串联电阻由〜30 pA（500 ms）超极化电流注入脉冲确定。完成后，轻轻移出移液管，并将脑切片在4％多聚甲醛中室温固定1小时。将固定的脑切片在0.1M PBS中清洗3次，每次10分钟，然后在Nikon A1-R激光共聚焦显微镜上成像。
按照提供的程序，使用市售的FD Rapid GolgiStain试剂盒（FD NeuroTechnologies，哥伦巴，马里兰）制备高尔基-科克斯染色。简而言之，在对动物进行深度麻醉之后，对它们进行生理盐水的心脏灌注。获得大脑，在双蒸馏水中漂洗，然后浸入高尔基浸渍溶液中。24小时后更换浸渍溶液，然后在黑暗中保持2周。高尔基体浸渍后，将大脑转移到清洁液中3天，在最初的24小时内更换一种溶液。按照试剂盒中的说明，将以70 µm制备的脑片固定在涂有明胶的载玻片上（FD NeuroTechnologies），在硝酸银中孵育，在蒸馏水中漂洗，在分级乙醇中脱水，在二甲苯中澄清，并在Permount下盖上盖子。
从单细胞透析和高尔基染色制备物捕获的显微图像进行了类似的处理（图 1）。简而言之，使用基于ImageJ的FIJI将来自相同设置的原始图像编译成TIFF格式图像的z堆栈（NIH 50），使用惠更斯套件（Scientific Volume Imaging BV，荷兰）中针对每个显微镜系统和镜头量身定制的算法进行去卷积，然后使用Neurolucida（MBF Bioscience，Williston，VT）进行手动追踪。脊柱的分析是在可见至少30 µm的CA1锥体神经元节段中进行的。使用以下设置进行自动树突棘检测：外部范围3.0 µm，最小高度0.5 µm，检测灵敏度90％，体素最小计数30。使用以下设置进行脊柱分类：头颈直径比1.1，头长比为2.5，蘑菇头大小为0.35 µm，fi的长度为3 µm。为了评估脊柱形态的变化，使用预先定义的标准，将选定节段中的刺分为蘑菇刺，粗短刺，细刺和丝状伪足，然后计算每个神经元在每个类别中的脊椎比例。树突棘密度表示为每10 µm树突长度的刺数。脊柱类型的相对分布是根据每种类型的脊柱计算得出的，这些分布相对于脊柱总数进行了标准化，并以百分比表示。
为了检验关于脑脊髓液中的肺内皮淀粉样蛋白破坏神经元脊柱形态的假说，将内皮衍生淀粉样蛋白ICV注射到小鼠的大脑侧脑室。为了进一步比较肺或肠/全身循环中内皮源性淀粉样蛋白是否会对神经元造成类似的损害，分别进行了INT滴注或IP注射。在记录和透析过程中预先选择了充满黄色荧光素的神经元。整理图像后，如果可以跟踪单个细胞体和均匀染色的树突，则可以确定CA1锥体神经元已被荧光黄充分填充。显示斑片状或间断树突的染色神经元被排除；然而，树突棘没有作为染色质量的标准。对于每个单元格
高尔基浸渍细胞的定量与染料填充细胞的定量相似，但有以下差异：树突棘的密度在近端（斜向或外侧；距躯干150-300 µm）和远端（在月桂层-分子层内；> 400）定量根树突状树的分支的somata）的µm。还从基底树突的近端（〜50 µm）和远端（> 100 µm）节段（在层中）定量树突棘密度。每周每处理四只小鼠（n = 4只小鼠）。每个树突分支（即，顶端近端，顶端远端，基底近端或基底远端）对四个细胞进行定量，并对每只动物取自同一树突分支的结果平均。使用每只动物的近端和远端的脊柱密度值进行统计分析和绘图（即，每只小鼠n = 2）。这也适用于基部顶端/远端树突分析和图。统计分析的计算方法如前所述15。简而言之，使用Igor Pro（WaveMatrics）和Excel（Microsoft）编写的自定义宏将离线数据分析制成表格。使用Igor Pro或Prism（Graphpad）进行统计比较。数据以平均值±sem表示，并进行 t检验或方差分析（ANOVA），然后进行事后Tukey比较（指定）。
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