摘要
酪氨酸蛋白激酶，黏着斑激酶（FAK）在内皮细胞中的过表达暗示了其对血管生成和肿瘤生长的需求，但是周细胞FAK如何调节肿瘤血管生成尚不清楚。我们显示周细胞FAK调节黑色素瘤，肺癌和胰腺B细胞胰岛素瘤的多个小鼠模型中的肿瘤生长和血管生成，并提供证据表明周细胞FAK的损失增强了受体酪氨酸激酶，Axl的Gas6刺激的磷酸化，并上调了Cyr61 ，促进肿瘤生长。我们进一步表明，周细胞衍生的Cyr61指示肿瘤细胞升高促血管生成/促肿瘤生成的跨膜受体组织因子的表达。最后，在人类黑素瘤中，我们发现当50％或更多的肿瘤血管是周细胞FAK阴性时，黑色素瘤患者分为肿瘤大小增加，血管密度增加和转移的患者。总的来说，我们的数据揭示了由周细胞FAK控制的周细胞肿瘤生长的未知机制。
周细胞是血管周围细胞，其作用，通过相互作用和串扰与内皮细胞（EC）1，2，3，在生理性血管是公认的。然而，周细胞参与调节肿瘤生长的分子机制仍是未知的。公认的是，在肿瘤中，内皮细胞的周细胞的相互作用和串扰引线的误调节到微血管的不稳定4，5，可以调节肿瘤生长，进展和转移6，7。最近，越来越多的证据支持对周细胞和肿瘤细胞之间的串扰一个新的角色8，9。
酪氨酸蛋白激酶，粘着斑激酶（FAK）在许多癌症类型中均被上调，导致FAK抑制剂的发展，目前在临床试验中10。不幸的是，用FAK抑制剂进行单药治疗并未显示出整体益处，并且提出了在各种肿瘤细胞类型中通过FAK精确调节肿瘤生长的问题。FAK被认为调节粘附，增殖，迁移，和EC的存活11和FAK在血管发生中的作用已经使用研究EC FAK敲除动物模型12，13，14。进一步的工作表明在肿瘤血管生成的启动EC FAK的要求15，16。然而，从未研究过周细胞FAK在肿瘤发生中的作用。
在这里，我们通过控制Gas6刺激的Axl激活，将周细胞FAK鉴定为肿瘤血管生成和肿瘤生长的负调节剂。此外，我们已经确定了人类黑素瘤样品中血管周FAK表达与肿瘤血管生成和生长之间的关系。总之，这些数据突显了周细胞，EC和肿瘤细胞之间的串扰在调节肿瘤血管生成和生长中的重要作用，而不是单独与EC相互作用，并且使周细胞FAK在此过程中起重要的调节作用。
周细胞FAK在肿瘤生长中的作用尚不清楚。为了开发一种评估周细胞FAK缺失如何影响肿瘤生长的遗传工具，我们使用了Cre-lox重组删除pdgfrβcre +细胞中的FAK 。Pdgfrβcre-; fak fl / fl和pdgfrβcre + ; fak fl / fl小鼠以正常的孟德尔比出生，在未受挑战的组织中无体重，性别分布或大血管形态缺陷（补充图 1a-d）。FAK表达在pdgfrβcre + ; fak fl / fl小鼠的内皮细胞或成纤维细胞中不受影响，但在从pdgfrβcre + ; fak分离的周细胞中特异性缺失在蛋白质和RNA水平上的fl / fl小鼠，PdgfrβRNA水平均无变化（补充图 1e，f）。
为了检查周细胞FAK损失对肿瘤生长和血管生成的影响，pdgfrβcre +；向fak fl / fl和pdgfrβcre-; fak fl / fl小鼠皮下注射B16F0黑色素瘤或Lewis肺癌（LLC）细胞。在这两种模型中，pdgfrβcre +的肿瘤均明显变大。fak fl / fl动物与pdgfrβcre-fakfl / fl对照相比（图 1a）。为了将这些作用扩展到自发性肿瘤模型，我们将pdgfrβcre + 交叉；fak fl / fl小鼠与RIP标签小鼠，胰腺胰岛素瘤的模型17。在15周龄时，RIP-Tag; pdgfrβcre +; fak fl / fl小鼠显示出比RIP-Tag大的肿瘤；pdgfrβcre-； fak fl / fl对照，表明在这种癌症自发模型中，周细胞FAK的丧失也足以控制肿瘤的生长（图 1b）。pdgfrβcre + 中肿瘤生长的这种增加；fak fl / fl小鼠与肿瘤血管密度增加相关（图 1c），而在未受挑战的皮肤中这种现象并不明显（补充图 1g）。重要的是，在肿瘤中负担pdgfrβcre +；T记者小鼠，证实了在与肿瘤血管相关的周细胞中Cre表达的特异性。详细地，来自pdgfrβcre-; mTmG和pdgfrβcre + ; mTmG小鼠的血管在宿主细胞中均显示了番茄（mT）信号，但是在Cre切除GFP（mG）后仅在pdgfrβcre + ; mTmG小鼠肿瘤周细胞中观察到了（补充图。 1h）。检查未受挑战的皮肤时，TdTom；pdgfrβcre-小鼠没有明显的TdTom信号（数据未显示）。重要的是，免疫荧光染色PDGFR β表示在真皮血管的76％表现出弱信号PDGFR β在未受攻击的成年小鼠皮肤的周细胞中表达不佳。此外，TdTom中的TdTomato（TdTom）信号；pdgfrβcre +小鼠在大约36％的真皮血管中显示TdTom。该结果表明，真皮血管壁细胞中的pdgfrβ- cre活性较弱（补充图 1i），这可能解释了未受挑战的pdgfrβcre + 皮肤缺乏血管表型。fak fl / fl小鼠。对FAK的免疫染色证实了pdgfrβcre + 在肿瘤中体内周细胞FAK的丢失；fak fl / fl小鼠（补充图 1j）。这些数据验证了在所使用的实验设置中，pdgfrβ驱动的体内FAK缺失仅限于肿瘤周细胞。
一个 B16F0黑素瘤和Lewis肺癌（LLC）皮下肿瘤生长增加pdgfrβcre +; fakfl / FL相比小鼠pdgfrβcre-; fakfl / FL小鼠。代表性肿瘤的图像。数据显示平均值±标准差n = 17（B16F0）和7（LLC）pdgfrβcre-； fakfl / fl和25（B16F0）和8（LLC）pdgfrβcre +; 每种肿瘤类型的fakfl / fl小鼠。** p = 0.009。比例尺，500μm。b自发性胰腺胰岛素瘤的肿瘤体积在RIP-Tag中增加；pdgfrβcre +; fakfl / fl小鼠与RIP-Tag的比较 ;pdgfrβcre-; fakfl / fl小鼠。图表表示平均总宏观肿瘤体积±sem n = 9 RIP-Tag；pdgfrβcre-; fakfl / fl和11 RIP-Tag ; pdgfrβcre +; fakfl / fl小鼠。** p = 0.0042。SV40染色的胰腺肿瘤的代表性图像。比例尺，0.5厘米。Ç肿瘤血管密度在生长的肿瘤增加pdgfrβcre +; fakfl / FL相比pdgfrβcre-; fakfl / FL小鼠。图表表示平均值±sem n = 3pdgfrβcre-; fakfl / fl和3pdgfrβcre +;fakfl / fl B16F0肿瘤，** p = 0.009；19 pdgfrβcre-; fakfl / FL和12 pdgfrβcre +; fakfl / fl LLC肿瘤* p = 0.0207; 7 RIP-标签 ; pdgfrβcre-; fakfl / f和10 RIP标签；pdgfrβcre +; fakfl / fl肿瘤，** p = 0.0097。内粘蛋白染色切片的代表性图像。B16F0和LLC肿瘤切片的比例尺为200 µm。RIP-Tag肿瘤切片的比例尺为300 µm。d与肿瘤血管周细胞相关联地减小pdgfrβcre +; fakfl / fl和RIP标签; pdgfrβcre +; fakfl / fl小鼠。图表代表α-SMA阳性血管的百分比±sem n = 5pdgfrβcre-; fakfl / fl，6pdgfrβcre +; fakfl / fl，10个RIP标签；pdgfrβcre-; fakfl / fl，9 RIP-Tag ; pdgfrβcre +; fakfl / fl小鼠肿瘤。** p = 0.0043（B16F0），** p = 0.003（RIP标签）。È血管渗漏是从肿瘤相似pdgfrβcre-; fakfl / FL和pdgfrβcre +; fakfl / fl老鼠。图表显示相对于血管面积的± Hoemst面积±sem n =来自4pdgfrβcre-; fakfl / fl小鼠的肿瘤中的25个高倍视野和来自4pdgfrβcre +的肿瘤中的34个视野。fakfl / fl小鼠。f。来自pdgfrβcre +的血管相关内皮细胞；fakfl / fl小鼠增殖增加。下图显示了插入物Ki67，DAPI，黏蛋白的代表性高倍图像。图表代表每单位面积±sem，n = 24和27个场在4pdgfrβcre-; fakfl / fl，5pdgfrβcre + 中增殖的内皮细胞的百分比。fakfl / fl分别为小鼠肿瘤。* p = 0.0457。a – e双面曼恩-惠特尼U型检验；c，d，f双面学生t检验；ns不重要。源数据作为源数据文件提供。
鉴于FAK在细胞迁移和粘附性的作用，因此不一定令人惊讶的是周细胞FAK缺乏降低NG2阳性和α-SMA阳性的显著的关联（即也证明是PDGFR β阳性）周细胞与肿瘤血管（图 1d，补充图 2和 3）。尽管如此，与对照小鼠相比，这些小鼠的肿瘤中的血管渗漏没有增加（图 1e）。与血管周细胞相关联的严重损失已报道影响微血管扩张，基底膜沉积和灌注18，19。肿瘤血管的组织学检查显示对微血管扩张，层粘连蛋白沉积，VE-钙粘着蛋白定位（补充图 4a–c）或基因型之间的灌注（补充图 5）没有影响。这表明pdgfrβcre + 减少了血管的周细胞投资。fak fl / fl小鼠肿瘤不会影响血管渗漏或灌注。与图1c中观察到的增强的肿瘤血管生成相一致 ，在pdgfrβcre +中生长的B16F0肿瘤中内皮细胞增殖显着增加。与对照小鼠相比，fak fl / fl小鼠（图 1f）。在pdgfrβcre +中给出促血管生成表型；fak fl / fl小鼠，我们接下来检查了对肿瘤免疫细胞浸润的影响，特别是因为F4 / 80 +巨噬细胞被认为可以控制血管生成20。在pdgfrβcre +中生长的皮下或RIP-Tag肿瘤中，未观察到CD45 +或F4 / 80 +免疫细胞浸润的明显缺陷。fak fl / fl小鼠，提示免疫细胞浸润不是控制肿瘤生长的主要因素（补充图 6）。简而言之，与内皮FAK的丢失相比，周细胞FAK的丢失16，在三种癌症模型中足以增强肿瘤生长和血管生成，同时减少了周细胞-微血管结合。
确定哪些生长因子可能是pdgfrβcre +中增强的肿瘤血管生成的原因；在fak fl / fl小鼠中，将合成海绵皮下植入pdgfrβcre-; fak fl / fl和pdgfrβcre +；fak fl / fl小鼠，并用PBS（对照），PDGF-B，PlGF或VEGF刺激血管生成。有趣的是，尽管在基因型之间未观察到PBS刺激的血管生成的差异，但我们并未发现响应PDGF-B，PlGF和VEGF的血管密度增加，而是减少了（图 2a）。尽管在pdgfrβcre + 中生长因子诱导的血管生成中，周细胞的血管覆盖率显着降低；fak fl / fl小鼠，通过周细胞的已知标记物α-SMA免疫染色确定（图 2b）。在体外，在WT周细胞中响应于血清的随机细胞迁移被增强，而在FAK无效的周细胞中则没有，这表明FAK的缺乏消除了血清依赖性的迁移速度（图 2c）。在细胞水平上，尽管FAK缺失，但周细胞在与各种基质（包括纤连蛋白，胶原蛋白I，胶原蛋白IV，层粘连蛋白1或纤维蛋白原）的粘附性上均无缺陷（图 2d），并且在细胞增殖方面也无缺陷（图 2e））或其他焦点接触蛋白的表达，包括纽蛋白，塔林蛋白，paxillin和phospho-paxillin（补充图 7a）。由于PDGF-B刺激增强周细胞迁移和增殖通过PDGFR活化β，我们检验了PDGF-B刺激的WT和FAK信号KO周细胞。PDGFR的水平β，对- PDGFR β，ERK1 / 2和p-ERK1 / 2，AKT和P-AKT，JNK / SAPK和对JNK / SAPK是两个基因型（图之间相似 2F）。尽管从pdgfrβcre + 分离的内皮细胞中FAK缺失并不明显。fak fl / fl小鼠，因为我们的体内结果显示，在这些小鼠中生长的肿瘤中内皮细胞的增殖得到增强，因此我们检查了从中分离出的内皮细胞中的VEGF-受体2（VEGFR2）水平和下游ERK1 / 2磷酸化pdgfrβcre-; fakfl / fl和pdgfrβcre +; fakfl / fl小鼠。在来自pdgfrβcre-； fak fl / fl或pdgfrβcre + 的内皮细胞之间，VEGF刺激的p-VEGFR2：VEGFR2或p-ERK1 / 2：ERK1 / 2水平没有差异。fak fl / fl小鼠或PlGF刺激的内皮细胞之间，表明在pdgfrβcre +中生长的肿瘤中内皮细胞增殖增强；fak fl / fl小鼠归因于周细胞FAK缺乏的继发作用（图 2g）。这些结果表明，周细胞FAK的缺失不影响PDGF-B介导的信号转导，并且来自pdgfrβcre-； fak fl / fl和pdgfrβcre的ECs+; fak fl / fl小鼠在VEGF或PlGF刺激后没有受到内在影响。总之，这些数据表明，除了VEGF，PDGF-B和PlGF外，其他促血管生成因子也参与了pdgfrβcre +中增强的肿瘤发生。fak fl / fl小鼠。
一个 VEGF刺激，PDGF-B刺激的和PlGF的刺激的血管生成在体内均在显著降低pdgfrβcre +; fakfl / fl小鼠。图表表示 在pdgfrβcre-，fakfl / fl和pdgfrβcre +中，n = 7 sem，n = 7和9 PBS和7和8 VEGF处理的海绵浸润区域中的血管定量。fakfl / fl小鼠。9和7 PDGF-B和8和8 PlGF处理过的海绵在pdgfrβcre-; fakfl / fl和pdgfrβcre +中；fakfl / fl小鼠；*** p = 0.0002（VEGF），** p = 0.0019（PDGF-B），**** p <0.0001（PlGF）。海绵内切蛋白切片的代表性图像。比例尺，100μm。b与血管α-SMA阳性周细胞相关联地从海绵均减少pdgfrβcre +; fakfl / FL的情况相比小鼠pdgfrβcre-; fakfl / FL小鼠。图表表示α-SMA阳性血管的百分比±sem，n = 5个海绵，分别来自pdgfrβcre-，fakfl / fl和pdgfrβcre +；fakfl / fl小鼠，*** p = 0.0004。海绵的α-SMA/弹性蛋白染色部分的代表性图像。比例尺，200μm。c FAK KO血清反应使周细胞迁移速度降低。图表表示在存在血清+ sem ** p <0.005，* p <0.01，n = 3个生物学重复的情况下，血清饥饿的WT和FAK KO周细胞以及WT和FAK KO周细胞的迁移速度。d WT和FAK KO周细胞对BSA，纤连蛋白，I型胶原，IV型胶原，层粘连蛋白1或纤维蛋白原的粘附力无差异。图表代表归一化为BSA（阴性对照）±sem n = 8次重复的基质上附着的细胞的相对数量。Ë WT和FAK KO周细胞prolif Ë以相似的速度 线图表示平均值±sem；n = 4孔/基因型，重复5次实验。f WT和FAK KO周细胞在响应PDGF-B的信号传递中没有差异。图代表p-ERK1 / 2 / ERK1 / 2比，p-AKT：AKT比和p-JNK：JNK比±sem的光密度定量。n = 2个实验重复。g。从pdgfrβcre-； fakfl / fl和pdgfrβcre + 分离的内皮细胞；fakf1 / f1显示在响应VEGF或PlGF的信号传导中没有差异。图代表具有VEGF的p-VEGFR2 / VEGFR2，具有VEGF的p-ERK / ERK和具有PlGF比率±sem的p-ERK / ERK的光密度定量。ñ = 3次实验重复。a – c双面学生t检验，ns不显着。源数据作为源数据文件提供。
除了VEGF，PDGF-B和PlGF，Gas6在癌细胞中也高度上调。GAS6可以在纳摩尔水平表达，并且被认为具有促血管生成的功能，但是GAS6介导的血管生成遗体的调节相对模糊21，22。在离体试验中，用重组Gas6（100 ng）刺激而不是PBS刺激，增强了pdgfrβcre + 在主动脉环中发芽的血管生成。fak fl / fl小鼠与pdgfrβcre-; fak fl / fl小鼠相比（图 3a）。这些数据表明外源性Gas6刺激的反应因周细胞FAK的丧失而升高。此外，在B16细胞的Gas6的CRIPSR-CAS 9耗尽减少在增强肿瘤生长pdgfrβcre+; fak fl / fl小鼠，但在pdgfrβcre-; fak fl / fl小鼠中无明显作用，表明肿瘤细胞衍生的Gas6参与了pdgfrβcre +中增强的肿瘤反应。fak fl / fl小鼠（图 3b）。
一个主动脉血管萌芽定量。图的平均值为±sem；n ＝ 17和12的PBS处理的pdgfrβcre-； fakfl / fl和pdgfrβcre +；fakfl / fl分别与21和23种Gas6处理过的pdgfrβcre-; fakfl / fl和pdgfrβcre +; fakfl / fl主动脉环；* p = 0.04。Gas6刺激的微血管的图像。比例尺，100μm。b Gas6在B16F0肿瘤中的表达。图表，平均值±sem；p = 0.06， CasCtrl和Gas KO的n = 3和4个部分。比例尺，50μm。肿瘤大小测量。图表，平均值±sem，*p = 0.011；n = 11pdgfrβcre +; fakfl / fl和13pdgfrβcre-; fakfl / fl小鼠。c细胞因子阵列，p-Axl定量。图表，平均值±sem，* p = 0.0467；n = 4个技术重复。mRNA Axl水平不变。图表，Axl mRNA，n = 3个生物学重复。d Western印迹，在Gas6刺激的周细胞中的p-Axl。密度测定图，平均值±sem n = 3次实验重复/基因型。* p = 0.0137，** p = 0.0069。e Axl mRNA耗竭。ñ = 3次实验重复。图表，Axl mRNA倍数变化。肿瘤生长（mm 3）：图，平均值±sem，** p = 0.0046，**** p <0.0001；FAK-null； Axl KO PC，n = 8只小鼠；Cas6 Ctrl; n = 5只小鼠，WT Ctrl；n ＝ 10只小鼠。肿瘤血管密度：图表，平均值±标准误，** p = 0.0017。Ñ = 28，32和视为FAK空14个字段; Axl的KO PC，Ñ = 4只小鼠; Cas6 Ctrl; n = 4只小鼠，WT Ctrl；n ＝ 3只小鼠。肿瘤切片的内切蛋白染色。比例尺，50μm。FGas6在周细胞中的表达。图，平均值±sem，左图，n ＝ 6个生物重复/基因型**** p ＜0.0001，*** p ＝ 0.0009；右图n = 3个生物重复/基因型。g周生p-Axl免疫染色。图，p-Axl中值染色强度。**** p <0.0001，双面Mann–Whitney U检验，n = 4个染色载玻片/基因型。比例尺，25μm。（h）蠕虫气体6。图表，平均值±标准误，*** p = 0.0001；n = 3个生物重复/基因型。肿瘤生长：线图，平均值±sem，** p = 0.0046，**** p <0.0001。FAK-无效； Gas6 KO：n = 14只小鼠，FAK- 无效； Cas9：n = 5只小鼠，WT; Cas9；n ＝ 10只小鼠。肿瘤血管密度；图表，平均值±sem，* p = 0.0179。n = FAK-null的28、15和15视场; Gas6 KO：n = FAK-null的4只小鼠; Cas9：n = 3只WT; Cas9; n ＝ 3只小鼠。肿瘤内粘蛋白免疫染色。比例尺，50μm。i蛋白质印迹；Pericyte p-Pyk2 / Pyk2和p-Src / Src。光密度比，平均值±sem，n = 3个实验重复/基因型。* p = 0.047（FAK KO 0 vs. FAK KO10），* p = 0.045（FAK KO 0 vs. FAK KO 20）。j Gas6 mRNA定量。图表，平均值±sem， 对于PF271处理的细胞，n = 3-4个生物学重复，对于未处理的细胞，n = 3-4个生物学重复。**** p <0.0006（WT vs.FAK KO），* p = 0.0127（WT vs.WT + PF271），* p = 0.0216（WT + PF271 vs.FAK KO + PF271），*** p = 0.0008 （FAK KO与FAK KO + PF271）。a – f，h – j双面学生t检验；Ë，h单向方差分析; ns不重要。源数据作为源数据文件提供。
与这些结果一致，蛋白质分析仪阵列分析确定磷酸化Axl（p-Axl）是受体酪氨酸激酶的TAM（T yro3，A xl和M er）家族成员和Gas6的主要受体。与WT周细胞相比，FAK KO周细胞中的磷酸受体酪氨酸激酶显着上调，尽管Axl的转录水平没有变化（图 3c）。这些结果表明，FAK KO周细胞中p-Axl的组成性升高可能是引发这些细胞对外源Gas6高度敏感的原因。确实，蛋白质印迹分析证实FAK KO周细胞具有显着增加的p-Axl水平，在Gas6（100 ng / ml）刺激后直至刺激后10分钟一直保持这种水平（图 3d）。据报道，Axl与Gas6的结合亲和力显着高于Tyro3 23，尽管在FAK KO 周细胞中p-Tyro3水平也有所增加（补充图 7b），但我们将周细胞Axl视为主要的Gas6受体。增强了由周细胞FAK控制的Gas6刺激的血管生成反应。
为了测试周细胞Axl在FAK调节的增强的肿瘤生长和血管生成中的功能需求，通过在FAK KO 周细胞（FAK-null； Axl KO周细胞）中的CRISPR-Cas9基因编辑来去除Axl 。在体内，通过将野生型C57bl6小鼠与B16F0肿瘤细胞和FAK-null; Axl KO，FAK-null; Cas9或WT; Cas9对照周细胞共同注射来测试在FAK KO周细胞中靶向Axl的作用。FAK KO周细胞中Axl的耗尽减少了与FAK空; Cas9周细胞共注射的小鼠中观察到的增强的肿瘤生长和血管生成（图 3e），表明FAK KO中 p-Axl升高。周细胞可能与pdgfrβcre +中肿瘤生长的增强有关；fakfl / fl小鼠。
先前发表的一项研究表明，Axl在同一细胞类型中交叉调节Gas6表达，并且内源性Axl和Gas6的这种共同调节在随后的下游信号传导中很重要24。支持这一并与FAK观察到的增强的p AXL表达水平相关KO周细胞的Gas6表达在FAK增加显著（高皮摩尔水平）KO与WT周细胞对照相比周细胞。另外，FAK KO 周细胞中的Axl耗竭降低了周细胞Gas6表达水平（图 3f）。相反，FAK KO周细胞中的Gas6耗竭也导致FAK-null; Gas6 KO中的p-Axl显着减少。周细胞，通过p-Axl染色强度测量（图 3g）。这些数据一起表明Axl和Gas6交叉调节了它们在周细胞中的表达水平。在体内，与FAK空; Cas9周细胞和B16肿瘤细胞共同注射的小鼠相比，FAK零周; Gas6 KO和B16F0肿瘤细胞共注射的小鼠中FAK KO周细胞中Gas6的损失也减少了肿瘤的大小和血管生成（图 3h）。因此，这些数据共同表明，在没有外源性Gas6的情况下，周细胞衍生的Gas6不足以影响血管生成，这在图3a中通过离体试验得以说明 。然而，在体内，由于FAK KO中 Axl / Gas6信号转导升高，导致肿瘤衍生的Gas 6反应增强。周细胞，这种反应导致pdgfrβcre +中肿瘤的生长增强；fakfl / fl小鼠。
虽然已经证明FAK的丧失与其家族成员Pyk2 25的补偿有关，但是先前已经报道了癌细胞26中Gas6 / Axl与Pyk2和FAK的交叉调节，但与Src无关。Western印迹分析证实了这些结果，表明FAK KO周细胞中p-Pyk2升高，而对p-Src没有明显影响（图 3i）。我们使用FAK / Pyk2双激酶抑制剂PF-562,271显示，在野生型周细胞中，FAK / Pyk2的抑制导致Gas6水平增加。然而，FAK KO周细胞中Pyk2的抑制导致周细胞Gas6的显着减少转录水平，表明推测的机制，通过内源性Gas6 / Axl的调节，p-Pyk2升高补偿了周细胞FAK的损失（图 3j）。这些结果表明（i）FAK调节Gas6水平，并且（ii）激酶抑制作用可以部分模拟FAK的基因消融作用。
为了确定删除周细胞FAK时控制增强血管生成的精确因素，进一步探索了由外源性Gas6刺激诱导的分子调控。在未刺激的条件下，在FAK KO与WT周细胞中未观察到血管生成调节剂（包括Vegf受体2）的明显变化（补充图 8a，b），支持观察到的血管生成上调需要外源刺激。值得注意的是，来自pdgfrβcre +的内皮细胞；fak fl / fl和pdgfrβcre-; fakfl / fl小鼠在p-Axl水平上没有变化，并且没有可检测到的Tyro3水平，这也强化了以下假设：在没有外源刺激的情况下，周细胞FAK的丧失不会对内皮细胞产生组成性影响（补充图 8c）。然而，与WT周细胞相比，通过与B16F0细胞共培养刺激周细胞上调了FAK KO周细胞中包括Cyr61在内的几种促血管生成蛋白的表达（图 4a和补充图 9a）。确实，外源Gas6刺激（100 nM）增强了FAK KO中 Cyr61的表达，但不增强WT周细胞，并且Cyr61表达的这种增加被FAK KO周细胞中Axl的缺失所消除（图 4b）。）。这些结果共同表明，FAK KO周细胞中Gas6表达水平的提高不足以刺激Cyr61表达，因此需要外源刺激。
一个细胞因子阵列。FAK KO周细胞中的Cyr61定量。图表代表平均值±sem阵列上Cyr61dot的代表图像。n = 3个生物学重复，一式两份。*** p ＝ 0.0005。用相同的裂解物对Cyr61进行蛋白质印迹证实了该结果。图表代表平均Cyr61密度测定法，n = 2次实验重复。b蛋白质印迹。在FAK KO周细胞中Cyr61表达增加。Axl（FAK-null; Axl KO）的耗竭废除了Cyr61表达。图表代表平均值±sem，n = 3个生物学重复。* p = 0.0213，** p = 0.009。C重组Cyr61刺激内皮细胞球体发芽。图表表示平均值±sem，**** p <0.0001。比例尺，100μm。n = 37个PBS处理的球体和30个Cyr61处理的球体。d蛋白质印迹。FAK空的Cyr61缺失; Cyr61 KO周细胞。图表表示平均Cyr61水平±sem，* p = 0.0133；n = 3个实验重复。e肿瘤生长。线图表示平均值±sem，** p = 0.0046，**** p <0.0001。FAK-无效; Cyr61 KO：n = 7只小鼠，FAK-无效; Cas9：n = 5只小鼠，野生型; Cas9：n = 10只小鼠。肿瘤血管密度。图表表示平均血管密度/ mm 2 ±sem，*** p = 0.0006。 从4个FAK-null处获得n = 28、30和14个视野; Cas9肿瘤; n = 4个FAK-null； Cyr61 KO 肿瘤， n = 3个WTCas9肿瘤切片。比例尺，50μm。内粘蛋白的免疫染色。f蛋白质印迹。WT和FAK KO周细胞中的p-AKT表达。线图显示平均值±sem，** p = 0.0043；n = 3个实验重复。g蛋白质印迹。PI3-激酶抑制剂（GDC-0941）降低了FAK中Gas6刺激后Cyr61的表达KO周细胞（10和20分钟）。图表代表平均值±sem Cyr61水平。** p = 0.0047；n = 3个生物学重复。h细胞因子阵列。组织因子（TF）定量。点印迹的代表性图像。图表代表平均值±semTF水平，n = 4个生物学重复。* p = 0.0295。Western印迹分析证实与FAK KO周细胞共培养的B16F0黑色素瘤细胞中TF产生增加。我西方印迹。B16F0细胞对外源Cyr61（10μg/ ml）的TF表达增加。图表代表平均值±sem n = 3次实验重复。** p = 0.0048。Ĵ蛋白质印迹。TF耗尽后，B16F0细胞中的TF表达降低。图表代表平均值±sem，n = 3个裂解物。** p = 0.0016。肿瘤体积测量。图表表示平均值±sem，* p = 0.0453；n = 10pdgfrβcre +; fakfl / fl和16pdgfrβcre-; fakfl / fl小鼠。a – d，f，g – j双面学生t检验。e，j单向方差分析；ns不重要。源数据作为源数据文件提供。
CYR61已知参与通过相互作用对内皮细胞和肿瘤细胞中表达整联调节细胞增殖27，28，29，30。内皮球体发芽测定证实了重组Cyr61的刺激具有促血管生成作用（图 4c）。为了测试肿瘤生长中FAK-null对周细胞Cyr61的需求；通过CRIPSR-Cas9基因编辑产生了Cyr61 KO周细胞（图 4d）。B16F0细胞与FAK-null; Cyr61 KO的共注射将B16F0细胞与FAK-null; Cas9对照周细胞共注射后，进入野生型小鼠的周细胞显着降低了肿瘤生长和血管生成的增强作用（图 4e）。FAK KO 周细胞中Cyr61的缺失对内源性周细胞Gas6表达水平也没有影响，这使Cyr61上游的周细胞Gas6处于上游（补充图 9b）。这些数据确定了FAK KO周细胞中周细胞Gas6 / Axl下游Cyr61的表达升高与体内血管生成和肿瘤生长的调节有关。
信令的Axl的下游是已知的通过多个信号通路，包括PI3K / AKT / mTOR的，MEK / ERK和NF-KB通路来介导31，32。我们的数据显示，尽管外源性Gas6刺激增强了p-Akt和p-p65 NFkB的表达（分别为图 4f和补充图 10a），但FAK KO 周细胞中的周细胞Gas6或Axl耗竭会降低p-AKT / AKT水平。显着地（补充图 10b）表明，外源Gas6刺激的FAK KO周细胞中增强的AKT活化需要周细胞Gas6和Axl。
尽管有这种观察，与将FAK-无效； Cas9周细胞与B16F0肿瘤细胞同时注射相比，将FAK- 无效； AKT KO周细胞与B16F0肿瘤细胞同时注射（补充图 10c）不影响增强的肿瘤生长或血管生成。 （补充图 10d，e）。但是，先前发表的研究表明，AKT的基因缺失可通过克服AKT丢失的多种替代途径诱导补偿，我们的数据表明，这可能是这种方法在体内理解周细胞AKT的相关性方面的局限性。作为替代方案，我们在野生型和FAK KO中抑制了AKT使用PI3激酶抑制剂GDC-0941并用Gas6刺激与否刺激周细胞。与基础条件相比，在无Gas6的情况下抑制AKT不会影响Cyr61的水平，这意味着尽管在FAK KO周细胞中观察到了基础p-AKT的增加，但不足以刺激Cyr61。但是，在FAK KO周细胞中，添加外源Gas6和AKT抑制确实能显着降低Cyr61，这在WT周细胞中未观察到，这意味着通过AKT调节Cyr61时需要外源Gas6（图 4g）。
除了Cyr61的对内皮细胞在调节血管生成应答的影响，以往的报告表明，Cyr61的直接影响肿瘤细胞促进Cyr61的增强的肿瘤生长的癌细胞侵袭和过表达33，34，35。因此，我们接下来研究了周细胞信号可能直接影响肿瘤细胞的机制。与WT周细胞共培养后，FAK KO周细胞与B16F0细胞共培养可增强B16F0凝血因子III /组织因子（TF）的表达，更适度的是Serpin E1与B16F0细胞相比（图 4h和补充图。 11）。TF是促肿瘤因子，参与加速肿瘤生长和进一步增强血管生成36。Serpin E1是尿激酶和组织型纤溶酶原激活物的分泌蛋白和调节剂。它参与通过细胞外基质的降解和基质金属蛋白酶37的激活来促进侵袭。Serpin E1在胃癌和肺癌中的组织表达增加与预后不良相关38。用Cyr61刺激B16F0肿瘤细胞增强了肿瘤细胞TF的表达，表明FAK KO 周细胞产生的升高的Cyr61 可能足以直接影响肿瘤细胞TF的表达（图 4i）。为了确定B16F0 TF对肿瘤生长的贡献，在B16细胞中消耗了TF，并将这些细胞（B16； TF KO）注入pdgfrβcre +中。fak fl / fl和pdgfrβcre-; fak fl / fl小鼠。B16F0细胞中TF的耗竭足以减少pdgfrβcre +中增强的肿瘤生长。fak fl / fl对fd fl / fl小鼠的肿瘤生长没有影响（图 4j）。这些数据共同证明，来自FAK空周细胞的Cyr61刺激足以增强B16F0 TF的表达，并且删除B16F0 TF可以挽救pdgfrβcre +中增强的肿瘤生长。fak fl / fl小鼠。
最后，我们确定周细胞FAK丢失与人类黑色素瘤进展有关。对原发性人皮肤黑色素瘤切片进行周细胞和FAK双重免疫染色，以确定周细胞FAK的水平，并建立了无法检测到周细胞FAK的血管百分比。结果显示，仅在子集的血管上检测到周细胞FAK（图 5a）。在各个患者样品中，周细胞FAK不可检测的血管百分比介于11％和100％之间（图 5b）。与我们的小鼠数据相似，我们显示出高比例的无法检测到周细胞FAK的血管（即，当超过50％的细胞无法检测到周细胞FAK时）将患者分层为血管密度增加的患者（图2）。 5c），增加的肿瘤负荷（通过增加Breslow厚度确定）（图 5d）和增加的转移（图 5e）。这些数据加在一起表明，无法检测到周细胞FAK的高比例血管与人类黑素瘤的肿瘤大小增大和进展有关，并暗示周细胞FAK的表达在人类癌症中具有保护作用。
a人类黑素瘤的代表性图像显示了周细胞FAK阳性（箭头）和FAK阴性（箭头）血管。比例尺，40μm。b图表表示个别患者的周细胞FAK阴性的血管百分比范围。n = 28个患者样本。c人类黑素瘤中肿瘤血管密度增加，其中超过50％的肿瘤血管是周细胞FAK阴性的。图表代表平均值±sem，n = 28个临床样本，* p = 0.048。dBreslow厚度是人类黑素瘤的重要指标，在人类黑素瘤中，有超过50％的肿瘤血管壁FAK阴性，Breslow厚度显着增加。图表表示平均Breslow厚度（mm）±sem，**** p <0.0001；n = 28个临床样本。e当超过50％的肿瘤血管PC FAK阴性时，转移的发生率显着增加。图表表示转移发生率（％）；n = 14个临床样本。f建议的FAK KO分子机理示意图周细胞调节肿瘤的生长。周细胞FAK的丧失升高了pPyk2-Gas6-Axl-AKT信号传导和随后的Cyr61表达，从而增强了血管生成。同时，Cyr61足以增强肿瘤细胞中TF的表达，从而增强肿瘤的生长。c，d双面学生t检验。源数据作为源数据文件提供。
总之，周细胞FAK的损失被周细胞p-Pyk2的增加所补偿，其增加了周细胞p-Axl并伴随着周细胞Gas6表达。这使FAK KO周细胞对源自肿瘤细胞的外源Gas6更具响应性，从而驱动周细胞AKT持续活化并增强Cyr61表达。这种周细胞来源的Cyr61足以增强肿瘤生长和血管生成，同时还促进TF表达，从而使体内加速的肿瘤生长和血管生成永久存在（图 5f）。
相较于以前的研究中，FAK在内皮细胞删除，导致肿瘤生长的多种癌症的小鼠模型中减少15，16，39，40我们的结果表明周细胞FAK提高了肿瘤的生长和肿瘤血管生成的丢失。此前，周已被证明在血管发育中发挥重要作用，血管收缩，血流量和止血的控制1，41，但超出了他们的角色定义不清。确实，尽管周细胞FAK的损失减少了周细胞-血液-血管的结合，但这不足以解释pdgfrβcre +中肿瘤血管生成和生长的增强。fakfl / fl小鼠。
GAS6和Axl的，公知的共调节它们的表达，在周细胞中表达24，并且在许多人类癌症中上调的21，22，42，43，但在周细胞的血管生成过程中的Axl信令中的作用是未知的。总体而言，我们的研究表明，周细胞FAK表达可通过调控周细胞Gas6-Axl-AKT信号通路和随后控制Cyr61来防止肿瘤生长的增强。CYR61在很大程度上是由周细胞分泌的44，45和在肿瘤生长中有牵连和血管生成29，33，39，46通过刺激EC增殖/迁移28。因此，FAK KO周细胞中周细胞Cyr61的过表达可能是周细胞FAK丧失可增强肿瘤血管生成的机制的一部分。此外，由于我们证明了Cyr61可以上调肿瘤细胞中TF的表达，并且已知TF可以驱动肿瘤的生长 47，因此我们的数据揭示了一种平行机制，在没有Cyr61的情况下，周细胞调节Cyr61和随后的肿瘤细胞TF可以促进肿瘤的生长。体内周细胞FAK。这建立了新的分子机制，通过该机制，除了周细胞-内皮细胞之间的相互作用之外，周细胞-肿瘤细胞之间的相互作用也可以控制肿瘤的血管生成和肿瘤的生长。
有趣的是，使用PF-271抑制FAK激酶也可以部分模拟周细胞FAK缺失，但是如果目前未知，则该结果的临床影响。
我们的数据强调，FAK在临床前模型和临床样品中均在癌症和血管生成的调控中具有多效性作用。
带有两个LoxP位点的Fox固定型FAK小鼠（FAKfl / fl）位于编码FAK氨基酸413–444的外显子侧翼，与表达Cre重组酶的小鼠在血小板衍生的生长因子受体ß（pdgfrß）启动子的控制下杂交，生成pdgfrβcre + ; fakfl / fl和pdgfrβcre-; fakfl / fl小鼠。pdgfrβcr +/- ； fakfl / fl小鼠与产生RIP-Tag的RIP-Tag2小鼠杂交；pdgfrßcre-； FAKfl / fl和RIP-Tag；pdgfrßcre +；FAKfl / fl老鼠。对于内部饲养的动物，按照FELASA啮齿类动物群落健康监测指南进行健康筛查（每季度一次），以根据FELASA筛查确认已知病原体的游离状态。未检测到临床体征。在12小时的黑暗黑暗周期（06：30–18：30光照； 18：30–06：30黑暗）中，在可控温度（21±1°C）下，将动物圈养成每只通风笼中的4–6只小鼠）和相对湿度（40-60％）。笼子里有1–1.5厘米厚的动物垫层，并具有丰富的环境，包括纸板箱式隧道和皱纹的纸巢材料。动物可以随意获得食物和水。将所有小鼠维持在混合的C57 / B16J / 129背景下。所有实验均使用8至10周龄的雄性和雌性小鼠。
将年龄和性别相匹配的pdgfrcreß+; fakfl / fl和野生型同窝对照（pdgfrcreß-; fakfl / fl）皮下注射1×10 6 B16F0黑色素瘤细胞或0.5×10 6 Lewis的腹侧肺癌细胞（ATCC）。随时间测量肿瘤尺寸，并使用以下公式确定肿瘤的生长：长×宽2 ×0.52。当肿瘤达到允许的最大法定大小时，处死小鼠，测量肿瘤大小，将肿瘤样品速冻或固定在4％多聚甲醛（PFA）中进行组织学分析。RIP标签;pdgfrßcre-; fakfl / fl和RIP标签;pdgfrßcre +; fakfl / fl在15周时杀死小鼠并收获肿瘤。测量总的宏观肿瘤体积。收获肿瘤并固定在4％PFA中用于组织学分析。通过计算大小和年龄相匹配的B16F0，LLC和L16大小的整个中线肿瘤切片上每毫米2内黏蛋白（V.7C7，sc-65495，Santa Cruz，1：100）染色的血管总数来评估血管密度Rip-Tag胰腺肿瘤。为了检查肿瘤血管的渗漏，在杀死小鼠之前1分钟静脉内注射Hoechst（100 mg，4 mg / ml）（14533，Sigma）。ImageJ TM使用软件对每个视野的Hoechst阳性面积进行定量，并将渗漏标准化为PE-PECAM（MEC13.3，102507，Biolegend，1：100）染色的灌注血管密度。有关肿瘤中血管灌注和血管直径的测量，请参见补充方法。
sgRNA是使用CRISPOR算法（http://crispor.tefor.net）设计的。靶向Akt1（基因ID：11651; CATTGAGCGCACCTTCCATG），Gas6（基因ID：14456; B16- CCGCGCCTACCAAGAGTTTTCG.PC-GTCGTTCTCGAACACCTCTC），Axl（基因ID：26362; TCGAAGCCACACCACCTCAG），scnRNA：CTC1 / CGyr61（sgRNA）的sgRNA序列;使用BsmBI酶位点将F3 /组织因子（TF）（基因ID：14006； ACAGTGTAGGTATAGTTGGT）克隆到Lenti-CRISPR-EGFP质粒（Addgene ID：75159）中。
将5.0×10 5个细胞以300× g离心5分钟，然后重悬于100μlR1缓冲液（Invitrogen）中。将CRISPR / Cas9-EGFP质粒DNA（10μg）添加到细胞中，并加载到100μlNeon电穿孔针头（Invitrogen）中。在Neon Electroporator（Invitrogen）上使用1350 mV对2个脉冲程序进行20 ms的电穿孔和对B16F0用2个脉冲程序进行1300 mV的20 ms的电穿孔。电穿孔后，将细胞在预热的补充培养基中营救，并铺于0.1％明胶中，并加入胶原蛋白和纤连蛋白包被的板2天。
转染后48h，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用200μlFACS缓冲液（PBS中的1％BSA和0.5 mM EDTA）收获。488 nm二极管激光器用于检测EGFP。在每个样品中，通过前向散射（FSC）激光对活的单线态细胞进行门控，无论表达水平如何，均使用FACS AriaIII流式细胞仪（BD Biosciences）在切尔西血流中对侧向散射（SSC）和EGFP阳性细胞进行分选细胞计数和光学显微镜检查设备（关于门控策略，请参见补充图 12）。
收集WT内皮细胞，B16F0细胞以及WT和FAK KO周细胞条件培养基（CM），并离心以除去细胞碎片，然后在4℃下短期保存。根据生产商的说明，使用Gas6 ELISA（ThermoFisher Scientific）在CM中测量Gas6水平。
将WT C57 / Bl6小鼠皮下注射到1×10 5 B16F0细胞的侧面，并与8×10 5 CRISPR / Cas9-KO周细胞混合。对于B16 CRISPR / Cas9-KO实验，将1×10 6 B16F0 CRISPR / Cas9-KO细胞注入pdgfrßcre +；fakfl / fl和pdgfrßcre-; fakfl / fl小鼠。注意，FAK-nullCas9和WTCas9肿瘤的生长和血管密度控制是为了在图相同3 E，H，图 4 e和补充图10，因为它们是来自同一实验运行的公共控件。
将五个微米的冷冻肿瘤切片风干10分钟，在PBS中清洗一次，在-20°C下在丙酮中固定10分钟，在PBS中清洗3次，然后在室温下用5％正常山羊血清封闭30分钟。封闭后，将切片与一抗在4°C下孵育过夜。使用的一抗针对内粘蛋白（V.7C7，1：100），NG2（AB5320，Millipore，1：100），α-SMA（A2547，Sigma，1：100），Ki67（ab15580，Abcam，1：100） ）。然后将切片用PBS洗涤，并用Alexa-氟孵育®缀合，在室温下45分钟的第二抗体（Invitrogen）中的Prolong安装幻灯片之前®金抗褪色试剂（Invitrogen）。甲醛固定切片通过在二甲苯中浸泡5分钟和3分钟进行脱蜡，然后在每种溶液中用在蒸馏水（100％，90％，70％和50％）中稀释的乙醇梯度再水化5分钟。用PBS洗涤一次后，通过在微波中将样品在10 mM柠檬酸钠（柠檬酸三钠稀释于蒸馏水，pH 6.0）中加热20分钟来进行抗原修复。然后将样品在3％过氧化氢甲醇稀释的室温下孵育5分钟。在1％正常山羊血清（NGS）和PBS中以1：200稀释的内粘蛋白或SV40（Pab101，sc-147，Santa Cruz）抗体在组织切片上于4°C孵育过夜。孵化后 将组织切片在PBS中洗涤3次，然后在室温下与适当的生物素标记的二抗（Dako）孵育1小时，该抗体在1％NGS PBS中以1：100稀释。用PBS洗涤后，将组织切片与ABC试剂（PK-6102，载体）孵育30分钟，再次洗涤，并添加DAB底物（SK-4100，载体）5-10分钟，直到切片变成棕色。洗涤后，将切片用苏木精/曙红复染，脱水并固定在DPX中。使用蔡司AxioPlan显微镜和AxioVision软件对玻片进行成像。对于FAK免疫染色（3285，Cell Signalling，1：100），与一抗孵育后，将玻片与猪抗兔生物素（E0353，DAKO，1：100）孵育，然后与链霉亲和素-HRP（FP1047，
为了量化周细胞覆盖率，用内粘蛋白（1：100）和α-SMA（1：100）对肿瘤切片进行免疫染色，并计数内粘蛋白+ /α-SMA+和内粘蛋白+ /α-SMA-血管的数量。由此计算出内粘蛋白+ /α-SMA+阳性血管的百分比。
对于PDGFR β染色和免疫细胞浸润染色见补充方法。
如前所述48分离胸主动脉并准备进行培养。简言之，将0.5mm厚的环进行血清被嵌入在1mg / ml的鼠尾I型胶原（Millipore）中，并培养在Opti-MEM前饥饿18小时，在37℃ ®补充有（Gibco）中的2.5％胎牛血清（ FCS），以PBS作为对照或100 ng / ml Gas6（R＆D）。发芽的微血管按照图例中的说明计数。在4％PFA中固定后，将环用FITC偶联的BS-1凝集素（L9381，Sigma，1：200）染色，然后使用带有抗褪色试剂（Invitrogen）的ProLong-Gold TM固定在载玻片上。使用蔡司AxioPlan显微镜和AxioVision软件进行成像。
将约1cm 2的两个高压灭菌的合成海绵（Daryl Harmon，Calgen Foam Ltd.提供的一种礼物）皮下植入麻醉小鼠的两个腹侧。每两天向海绵分别注射100μlPBS或100μl含10 ng / ml VEGF，10 ng / ml PDGF-B或10 ng / ml PlGF（Peprotech）的PBS。14天后，切下海绵并固定PFA以进行石蜡包埋。对海绵切片进行内粘蛋白免疫染色（1：100）以识别血管，并通过计数内粘蛋白阳性血管的数量/海绵切片的面积来评估密度。
将650株HUVEC接种在20微升含有0.25％甲基纤维素（Sigma-Aldrich）的培养基滴中，并通过“悬滴”法放置过夜以形成球体。第二天，将球体包埋在1 mg / ml胶原凝胶中，然后用Optimem +补充PBS或100 ng / ml Cyr61的1％FBS刺激。24小时后，将凝胶固定在2％PFA中，用若丹明鬼笔环肽（R415，ThermoFisher，1：1000）染色，并量化每个球体的所有芽的累积长度。
从pdgfrβcre + 中分离出原代小鼠肺EC和原代小鼠脑周细胞；fakfl / FL和pdgfrβcre-; fakfl / FL对照小鼠和如先前所描述培养49，50。对于内皮细胞，pdgfrβcre +；fakfl / fl和pdgfrβcre-; fakfl / fl切碎小鼠肺部，消化胶原酶（I型，Gibco），通过70μm细胞过滤器（BD Falcon）过滤，将得到的细胞悬液铺板在装有0.1％明胶（Sigma），10μg/ ml纤连蛋白混合物的烧瓶中（Millipore）和30μg/ ml大鼠尾部胶原蛋白（Sigma）。使用抗大鼠IgG共轭磁珠（Dynal），通过单个阴性（FCγ-RII/ III; Millipore，MABF838）和两个阳性细胞类型（ICAM-2; Pharmingen，553326）纯化内皮细胞。在原代内皮细胞的制备过程中，从第一个阳性分类中产生的非内皮细胞群中分离出了肺成纤维细胞。对于所有细胞类型，当细胞达到70％融合时会发生传代。用胰蛋白酶消化细胞，离心，用PBS洗涤，再铺在用于内皮细胞和周细胞的预涂烧瓶上，再铺在成纤维细胞的未涂烧瓶上。将成纤维细胞在DMEM + 10％FCS中培养至第4代，在MLEC（Ham's F-12，DMEM（低葡萄糖），10％FCS，肝素和内皮细胞有丝分裂原（Generon））中培养至第4-5代。简而言之，对于周细胞，从小鼠中取出大脑，切碎，在0.1％胶原酶中消化1小时，在22％BSA存在下离心，并在内皮细胞生长培养基（pMLEC）中进行培养，每3天更换一次培养基。在最初的两次传代中，周细胞培养物在pMLEC中生长，在第三次传代中，它们在含有2％FBS和抗生素的周细胞培养基（PM； ScienCell Research Laboratories）中生长。所有实验的组织培养板均涂有胶原蛋白（30 µg / ml），明胶（0.1％）和纤连蛋白（10 µg / ml）的混合物。通过以下标记，通过FACS对原代小鼠脑周细胞进行了表征：PDGFRβ，CD146，CD31（内皮标记），神经胶质纤维酸性蛋白和Mac1（成纤维细胞标记）。对原代小鼠肺内皮细胞进行CD31染色，然后进行FACS分析，并对内粘蛋白和波形蛋白（由EC表示）和α-sma（成纤维细胞标记）进行免疫染色。原代小鼠肺成纤维细胞进行免疫染色对波形蛋白（成纤维细胞阳性标记），NG2和endomucin（阴性标记为成纤维细胞），如先前所描述51。
WT和FAK KO在Optimem中将约70％汇合的周细胞血清饥饿24小时，然后用PDGF-B（30 ng / ml）（Peprotech）或Gas6（100 ng / ml或500 ng / ml）（R＆D）处理0、5， 15、30和60分钟。将约80％汇合的EC血清饥饿24小时，然后用VEGF（30 ng / ml）或PlGF（30 ng / ml）（Peprotech）处理0、5、15、30和60分钟。对于PI3K抑制剂实验，血清饥饿24小时后，在用Gas6刺激之前，将1μMPI3K抑制剂（GDC-0941）在培养基中孵育24 h。对于周细胞和EC，均在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液中制备裂解物。为了分析蛋白质水平，将细胞进行SDS-PAGE并转移到硝酸纤维素膜（Amersham Biosciences）上进行蛋白质印迹。探测印迹中的PDGFRß和总PDGFRß（3161、3169，细胞信号转导，1：1000），磷酸和总ERK1 / 2（9101，9102，细胞信号转导，1：1000），磷酸和总AKT（4685，9611，细胞信号转导，1：1000），AKT 1（2967， Cell Signalling，1：1000），磷酸化和总SAPK / JNK（9251，9252，Cell Signalling，1：1000），磷酸化和总VEGFR2（9698，2478，Cell Signalling，1：1000），磷酸化p65和总p65（3033，8242，细胞信号，1：1000），p-Axl（E-AB-34244，Elabscience，1：5000），磷酸Tyro3（PA5-40270，ThermoFisher，1：2000）和Tyro3（5585） ，Cell Signalling，1：1000），Cyr61（ABC102，Millipore，5μg/ ml），Pyk2和p-Pyk2（3090、3291，Cell Signalling，1：1000），Src和p-Src（2108、6943，Cell Signalling，1：1000），微管蛋白（T5168，Sigma，1：5000），GAPDH（AB2302，Millipore，1：5000）和HSC-70（Santa Cruz，sc-7298，1：5000-1：10,000）。使用ImageJ获得光密度的光密度读数TM软件（对于未裁剪的扫描，请参见补充图 13）。
将FAK-null； Gas6 KO和FAK-null; Cas9对照周细胞接种在玻璃盖玻片上24小时。用PBS洗涤细胞，并在室温下用4％PFA固定15分钟，然后再次洗涤。细胞在室温下用0.4％TritonX-100的PBS渗透15分钟，并用PBS洗涤，然后封闭20分钟（2.5％山羊血清+ 1％BSA + 0.1％PBS-T）。将细胞与在封闭溶液中以1：100稀释的p-Axl一抗（R＆D，AF2228）在4°C下孵育过夜，然后用PBS洗涤3次，然后与Alexa Fluor山羊抗兔488（Invitrogen，A32731，1：在室温下在封闭溶液中稀释500倍）1 h。用PBS洗涤细胞3次，用水洗涤一次，并用Prolong Gold + DAPI（Invitrogen）固定。
使用血管生成阵列（ARY015，R＆D Biosystems）比较WT和FAK KO周细胞的血管生成谱，并使用磷酸RTK阵列（ARY014，R＆D Biosystems）比较磷酸RTK谱。简而言之，细胞裂解物的制备如下：将样品缓冲液添加到细胞培养物中，刮下细胞并转移至1.5 ml Eppendorf管中。超声处理后，将样品调整至阵列条件，并按照制造商的说明与检测抗体混合物混合。将裂解物在斑点印迹膜上于4°C孵育过夜。洗涤膜，与抗生蛋白链菌素-HRP在室温下温育30分钟，再次洗涤并将ECL施加到膜上以揭示点。
将WT或FAK KO周细胞与B16F0肿瘤细胞在周细胞培养基中以5∶1的比例共培养。24小时后，将细胞通过FACS使用PDGFR分离β为正为周细胞但不为B16F0肿瘤细胞：受体抗体（100 NBP1-43349，Novus公司生物，1）。一旦分选，将细胞在样品缓冲液中裂解，并如上所述使用血管生成阵列进行分析。对于磷酸RTK阵列，然后如上所述裂解WT和FAK KO周细胞，并使用磷酸RTK阵列进行分析。使用ImageJ TM软件进行光密度分析。简而言之，将来自多个实验的同一行阵列在相同的曝光时间进行合并，并进行光密度分析。
使用CytoSelect™48孔细胞粘附测定（CBA-070，Cell Biolabs）测量WT和FAK KO周细胞粘附特性。将分离的细胞（25,000个细胞/孔）接种在每种基质上45分钟，按照制造商的说明洗涤并固定。应用Cell Stain溶液，并用酶标仪在560 nm处测量OD。
将WT和FAK KO周细胞接种在24孔板中，并使用ZOOM系统（Essen Bioscience）每6小时对图像进行一次成像。使用ZOOM软件（Essen Bioscience）通过分析一段时间内的细胞图像来量化融合度。细胞汇合度表示为显微镜视野的覆盖百分比。
使用Dunn Chambers分析了随机迁移。Dunn Chambers储存在7倍洗涤剂中，用水洗涤以除去任何蜡，在蒸馏水中冲洗，并在使用乙醇之前进行灭菌。在培养基中冲洗小室，并用OPTI-MEM填充内孔和内孔。WT和FAK KO将周细胞接种在涂覆的22mm玻璃盖玻片上，并培养过夜。第二天，细胞用PBS洗涤，血清在无血清培养基（OPTI-MEM I + GlutaMAX，Gibco，Invitrogen，Paisley，UK）中饥饿3小时。将盖玻片倒入Dunn Chambers上，在外部孔中留出间隙，并在三侧用热蜡混合物（凡士林：石蜡：蜂蜡—1：1：1：1）密封。通过毛细作用从外孔中除去培养基，并在用周细胞培养基填充之前用OPTI-MEM冲洗。然后将室用蜡密封并安装在Zeiss Axio100倒置显微镜上。使用10倍N-Achroplan相衬物镜（NA 0.25）通过相衬成像获取图像。使用Sensicam（PCO Cook）CCD相机收集细胞图像，使用Micro Manager采集软件（NIH，开源）每10分钟拍摄一次帧，持续16小时。随后将所有获取的延时序列显示为AVI文件，并使用ImageJ跟踪延时序列中的单元格。跟踪导致生成与每个帧中每个单元格有关的位置坐标序列，然后使用Wolfram Mathematica 7软件对这些序列执行运动分析。
使用RNeasy mini试剂盒根据制造商的说明（Qiagen UK，曼彻斯特，英国）从细胞中提取RNA。使用Applied Biosystems高容量cDNA反转录（RT）试剂盒（Fisher Scientific）按照制造商的说明进行互补DNA（cDNA）合成。500纳克的小鼠细胞cDNA用于RT-qPCR。使用样品cDNA（带有FAM标签），内部对照Gapdh（带有VIC标签）和特定的TaqMan探针（Axl，Gas6，Fak，Pdgfrβ）进行RT-qPCR 。使用TaqMan Universal PCR Master Mix（PE Applied Biosystems，Fisher Scientific）在96孔板上进行qPCR。使用qPCR在40个循环中扩增来自每个样品的一百六十纳克cDNA。目标mRNA标准化为使用2- ΔΔCT方法确定相对于初始实验对照的Gapdh和每个基因的表达水平。
将人黑素瘤中福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品切片，脱蜡，并在沸腾的10 mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中进行抗原回收，将5 mm切片在PBS中洗涤3次，用1％正常山羊血清（NGS）0.1％封闭TritonX-100（TX-100）1小时。对小鼠单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白Cy3偶联物（Sigma-Aldrich，C6198，1：100）和FAK（3285，Cell Signalling，1：100）进行双重免疫染色。如免疫染色部分所述进行染色。为了进行数据分析，将FAK和α-SMA双阳性血管的百分比计算为FAK和α-SMA双阳性血管在α-SMA阳性血管总数中的数量。
平均值之间差异的统计显着性是通过单因素方差分析确定的 ，除非另有说明，否则未配对的双面学生t检验，p <0.05被认为具有统计学意义。对于肿瘤生长统计，进行非参数Mann-Whitney U秩和检验以比较每天的肿瘤体积。
所有程序均由我们的当地动物伦理委员会伦敦皇后玛丽大学批准，并根据英国内政部的规定执行。
人类黑素瘤样本是在患者签署并获得知情同意并获得伦理委员会批准的情况下获得的。黑色素瘤样品已获得东伦敦和城市卫生局道德批准（07 / Q0604 / 23 MM：东伦敦和城市卫生局：“恶性黑色素瘤发病机理的分子机制”），并于2018年3月进行了较小的修订：ReDa 005044Q1 。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
支持本研究结果的所有相关数据可应要求从相应的作者处获得。本文提供了源数据。
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