摘要
融合基因是各种癌症类型的标志，是诊断，预后和治疗的重要决定因素。融合基因伴侣的选择和断点-位置混杂性限制了诊断检测，即使对于已知的和重复的配置也是如此。在这里，我们开发了FUDGE（来自基因富集的融合检测）以准确，公正地识别融合。FUDGE将目标选择的链特异性CRISPR-Cas9活性与融合基因驱动程序富集结合在一起-无需事先了解融合伴侣或断点位置-即可通过生物信息学流水线NanoFG进行长读纳米孔测序。FUDGE具有灵活的靶位选择，并且可以进行多重富集，以便一次测序即可同时分析多个样品中的几个基因。我们观察到平均665倍断点位富集，并在2天之内确定核苷酸分辨率融合断点。该测定法可识别癌细胞系和肿瘤样品融合体，而与伴侣基因或断点位置无关。FUDGE是一种用于诊断全癌融合检测的快速，通用的融合检测方法。
融合基因是许多人类癌症的标志。最近的研究表明，多达16％的癌症是由融合基因驱动的1。一些癌症类型，如前列腺癌或慢性髓性白血病（CML），其特点是一个特定的融合基因（TMPRSS2-ERG和BCR-ABL1，分别地），而其他的癌症类型没有表现出这样明确关联1，2。就融合基因构型和确切的断点位置而言，大多数融合基因高度可变。通常，一个基因是表现出组织特异性模式的复发性融合伴侣（例如KMT2A / MLL和ALK）3。但是，这些基因可以融合到许多伴侣上，以获得其致癌潜力。一个引人注目的例子是KMT2A（以前称为MLL），它是小儿急性髓细胞性白血病（AML）的主要融合伴侣，也是诊断为婴儿（即1岁以下儿童）的急性淋巴细胞性白血病（ALL）的主要融合伴侣。 ，并已报道了超过130层不同基因的结构4，5。
而融合检测是特异病征性对于某些癌症类型，它是预后或治疗选择在其它癌症类型的决定因素6，7。然而，融合基因构型的高度可变性极大地限制了诊断检测。当前的诊断策略包括（分开）荧光原位杂交（FISH）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定法，具体取决于融合伴侣的知识和断裂点变异性7。但是，这些测定费力且费时，并且可能无法鉴定融合伴侣。最近，特异性靶向复发性的融合配偶体下一代测序（NGS）测定法已被开发，目前在临床实践中实现的8，9。这些测定法在伙伴识别和输入材料（例如，适用于从福尔马林固定的石蜡包埋的组织块； FFPE中分离的DNA）方面非常通用，但伴随着更长的周转时间，增加的成本和生物信息学挑战。
最近的长期阅读测序技术，如牛津纳米孔技术（ONT）测序，已被证明对阐明人类基因组10的结构变异有极大帮助。此外，实时测序功能为临床应用提供了丰富的机会。但是，一个纳米孔流通池的测序通量（2–5x基因组覆盖率； R9.4）不足以阐明基因组11的完整结构变异（SV）格局。ONT最近发布了一种基于Cas9的协议，用于富集特定基因组区域，该协议利用了感兴趣区域（ROI）的上游（5'）和下游（3'）侧翼序列，切除了后者并进行了靶向测序12。两个出版物已经利用这种方法来研究甲基化和结构变异12，以及基因组重复13。通过这种技术，目标覆盖率分别达到了165x和254x，为测序SV（例如融合基因）提供了独特的工具。但是，此方法需要了解ROI的两个侧翼序列，这再次将其应用限制为仅检测已知的融合基因伴侣组合。
我们在这里开发FUDGE（从基因富集进行融合检测）作为融合基因鉴定策略，以进行融合基因的靶向富集，并通过使用长读实时ONT测序在没有先验知识的情况下鉴定未知的融合伴侣和精确的断点。此外，我们创建并实施了互补的生物信息学工具NanoFG，以从长期读取的纳米孔测序数据中检测融合基因。使用这种方法，我们在48小时内实现了68倍的平均断点覆盖率-平均665倍的富集-并鉴定了来自各种癌症类型（例如AML，尤因肉瘤，结肠癌）的融合基因伴侣。此外，我们提供了低输入量DNA样品（10 ng）以及样品和靶标多路复用的策略，以最大程度地降低测定成本。最后，
我们开发了FUDGE来专门富集仅已知一个基因伴侣而未知另一个融合基因伴侣和/或断点的融合基因。为此，如前所述12将从新鲜冷冻样品中分离的基因组DNA进行了去磷酸化处理，并在可疑断点区域侧翼的crRNA被用于将Cas9靶向特定的基因组位点，从而在该基因组位点产生双链DNA断裂（图2）。 1a）。Cas9蛋白主要与切口的PAM远端结合，因此掩盖了磷酸化的这一端，同时使磷酸化的DNA暴露于切口的PAM近端（图 1b））。在dA尾部之后，这种磷酸化的DNA产生了一个独特的接触点，该接触点可用于退火ONT特异性测序接头-仅限于该区域。为了实现方向性，crRNA以链导向的方式设计，可特异性地指导crRNA序列上游或下游的读取-有效地测序到可疑的5'或3'融合伴侣中（图 1b，方法和补充图 1）。）。之后，将富集的文库在一个ONT流通池（R9.4）上测序。为了从低覆盖率纳米孔测序数据中可靠地检测融合基因，我们开发了一种生物信息学工具NanoFG，该工具可报告融合伙伴，确切的断点位置，断点序列和引物以进行验证（图 1c）。）。
将基因组DNA样品去磷酸化，并通过Cas9引入crRNA指导的靶标特异性双链切割。b磷酸化位点通过双链断裂暴露；但是，Cas9仍然与切口的PAM远侧结合，并阻止该侧DNA的磷酸化。DNA末端为dA尾，衔接子仅连接到PAM序列近端的磷酸化DNA末端。序列方向由适配器决定，朝向未知序列。C将目标文库加载到一个ONT流通池（R9.4）上并进行测序。NanoFG使用纳米孔测序数据运行，提取融合跨度的读数，检测融合基因，并提供精确的融合基因配置，断点位置，断点序列和融合跨度引物序列。
为了测试融合基因检测测定法产生足够的富集并在所需方向上引导读数的能力，我们将FUDGE应用于来自男性健康供体的基因组DNA。作为原理证明，我们以链特异性方式为一组循环融合伴侣基因（BRAF，EWSR1和SS18）设计了crRNA 。我们进行了两个单独的文库制备（PP1和PP2），并针对每个文库的三个基因组位点分别靶向了两个不同的外显子（图 2a和补充数据 1）。作为阳性对照，我们靶向两个基因组位点（C9orf72和FMR1），我们之前对其进行了靶向测序，并使用了两个位于ROI两侧的crRNA，每个均靶向两条不同链中的一条（图 2a和补充数据 1）。样品处理后，将PP1和PP2的库合并并在单个流通池中测序。测序导致1.665 Gbs的通过量，相当于0.5x的平均基因组覆盖率（补充数据 1）。对于仅靶向基因组一条链的基因座，平均有89％的读段以预期的5'或3'方向测序（图 2b–d和补充图 2a–e）。PP1和PP2切割点的覆盖率分别为115x和102x（BRAF）（图 2b），142x和101x（EWSR1）（图 2c），117x和118x（SS18）（图 2d），57x和104x（C9orf72）（图 2e），11x和44x（FMR1）（图 2f） ， 分别。平均读取长度为9.9 kb（图 2g和补充数据 1），平均有116个读取跨越了最常见的融合断裂点位置（图 2b–d和补充数据 1），证明了该检测方法可用于检测融合基因，与断点位置无关。
一个 Cas9引入削减crRNA池PP1和PP2针对不同的基因组区域。方框和数字代表外显子。剪切位置用剪刀表示，PAM序列（橙色）表示crRNA设计的方向，箭头表示预期的测序方向。b – f覆盖图显示了多个基因组位点的目标覆盖率。虚线（绿色）指示crRNA定向的Cas9切割位置，箭头指示从特定crRNA设计创建的读取的方向性。红色区域突出显示每个基因最常见的断点位置。g测序运行的读取长度分布。虚线表示平均读取长度。源数据作为源数据文件提供。
为了测试FUDGE是否能识别与目标基因或断点位置无关的融合基因，我们将该技术应用于三个融合阳性癌细胞系中，先前已确定了融合构型。尤因肉瘤细胞系A4573（参考文献14）和CHP-100（参考文献15）带有EWSR1-FLI1融合基因，滑膜肉瘤HS-SYII细胞株含有SS18-SSX1融合蛋白16。我们针对每个样品定位三个基因座（BRAF外显子10，EWS R1外显子7，SS18外显子9），并在一个流通池中对每个样品进行测序（补充数据 1）。这产生了0.24x（A4573），0.15x（CHP-100）和0.015x（HS-SYII）的平均基因组覆盖率（图 3a）。由于实现了方向性，我们观察到目标覆盖率（切到断点）急剧增加到81x（A4573），66x（CHP-100）和11x（HS-SYII）（图 3a和补充图 1）。这与342x（A4573），443x（CHP-100）和735x（HS-SYII）的总体目标富集度有关（图 3b–e）。
a三个细胞系A4573，CHP-100 和b的全基因组平均覆盖度和b富集，靶基因（切割至断点），BP跨度（断点跨度）和融合跨度（跨融合结）。 HS-SYII。c两个融合伴侣EWSR1（靶向）和FLI1的细胞系A4573的覆盖图。d两个融合伴侣EWSR1（靶向）和FLI1的细胞系CHP-100的覆盖图。e两个融合伙伴SS18（靶向）和SSX1的细胞系HS-SYII的覆盖图。虚线（绿色）指示crRNA定向的Cas9切割位置，虚线（红色）指示断点位置。箭头指示从特定crRNA设计创建的读取的方向性。源数据作为源数据文件提供。
为了轻松地从纳米孔数据中识别融合跨度读物，我们开发了NanoFG 17。NanoFG是对NanoSV 10的修正，可从纳米孔测序数据中调用融合基因，并报告每种基因融合的确切断点位置，断点序列和跨断点引物（图 1）。断点的读取范围为69（A4573），62（CHP）和6（HS-SYII），分别与290x，417x和406x富集相关。NanoFG鉴定了两个EWSR1-FLI1融合基因，分别具有28个（A4573）（图 3a，c）和18（CHP-100）（图 3a，d）融合跨度读段，这涉及118x和20x的融合特异性富集。分别为121x（图 3b）。两个尤因氏肉瘤细胞系具有相同的融合基因，但是具有不同的断点位置（补充图 3A）。这些差异很容易被NanoFG检测到，并强调了这种检测方法的灵活性，无需知道确切的断点位置即可鉴定融合。为了揭示为什么NanoFG无法识别SS18-SSX1融合基因，我们在IGV浏览器18中手动研究了候选基因座。HS-SYII细胞系的测序导致极少的通量，目标覆盖率（11x）（图 3a）和较低的断点跨度读取（6）。结果，仅产生一个融合跨度的读数，该读数低于针对NanoFG的融合支持性读取设置的过滤截止值（要求最少两个融合支持性读取）。将NanoFG的设置调整为一个支持读段时，称为SS18-SSX1融合（图 3a，e），但是，如果未知融合状态以排除假阳性，则降低融合支持读的阈值需要手动验证。 （补充图 3B）。尽管HS-SYII细胞系的通量很低，该测定仍能产生68倍的融合特异性折叠富集（图 3b）。）。这显示了FUDGE从低覆盖率纳米孔测序数据中识别融合基因的能力，而不论融合伴侣或断点位置如何。
为了验证FUDGE可以从肿瘤材料中识别融合基因，并且无需事先知道断点的位置，我们将测定法应用于六种不同来源，已知融合状态的肿瘤样品。我们测试了从尤因肉瘤（ES1），横纹肌肉瘤（RH），慢性粒细胞白血病（CML），伯基特氏淋巴瘤（BL），费城染色体阳性B淋巴细胞急性白血病（B-ALL）（ALL1）分离的DNA ）和B-ALL（ALL2）。横纹肌肉瘤的特征是FOXO1的第二个内含子（104 kb）断裂，然后融合到PAX3或PAX7（参考文献19）。由于FOXO1内的潜在断点区域较大，因此我们选择了针对PAX3和取而代之的是PAX7基因，以尽量减少必需的crRNA数量。在这里，最常见的断点区域分别跨越18 kb和32 kb。因此，我们设计了连续的crRNA，以跨越两个基因的潜在断点区域（补充数据 1）。CML和ALL1带有断点位置未知的BCR-ABL1融合基因。的BCR基因港口3个复发断点簇，跨越外显子12和外显子15（主要群集）之间6.6 kb的，外显子1和外显子2（次要群集）之间71 kb的，和外显子19和外显子20之间的1.3kb的（微簇）。为了全面涵盖所有可能的断点，我们针对全部三个簇共11个crRNA（补充数据 1））。我们在单个流通池上对每个肿瘤样品进行了测序，并按预期确定了EWSR1-FLI1融合蛋白（ES1、8个读数）（补充数据 1和补充图 3A和4A），PAX3-FOXO1融合蛋白（RH，32个读数） ）（图 4a，d），主集群内的BCR-ABL1融合（CML，22个读数）（图 4b，d），MYC和IGH基因座之间的易位（BL，3个读数）（图。 4d和补充图 4B），次要簇内的BCR-ABL1融合（ALL1,27次读取）（图 4d和补充图4C）和CRLF2-P2RY8重排（ALL2，185次读取）（图 4c，d）。目标富集度为498x（ES1），930x（RH1），611x（CML），347x（BL），679（ALL1）和3492（ALL2），而跨越点的富集度为406x（ES1），838x（ RH1），598x（CML），81x（BL），633x（ALL1）和3601x（ALL2）（图 4e）。由此，实现了270x（ES1），258x（RH1），188x（CML），61x（BL），197x（ALL1）和3382x（ALL2）的融合特异性富集（图 4e）。此外，我们确定了两个额外的融合事件，一个互作式的FOXO1-PAX3（RH2）融合，其中有RH样品和DRICH1-BCR的八个融合支持读数（CML2）与CML样本的三个支持融合的读段融合。由于这些事件是意想不到的发现，因此我们通过断点PCR对其进行了验证（补充图 5A，B）。我们还对DRICH1-BCR融合体进行了Sanger验证，因为该事件先前尚未在文献中报道（补充图 5C）。重要的是要注意，NanoFG是专门设计用于检测两个涉及的融合伴侣中具有断点的融合基因的。作为IGH / MYC易位（IGH -breakpoint近似2.5kb的上游IGHM和）CRLF2-P2RY8重排（CRLF2-CRLF2上游大约3.5 kb的断点）不符合此标准，NanoFG没有报告这些标准，因此更适合使用NanoSV。对于预期在带注释的基因之外的区域（包括启动子，UTR和外显子/内含子区域）发生融合事件的情况，NanoSV报告的变异调用文件（vcf）的手动分析是NanoFG流程的第一步（方法）是必需的。在此，可以提取有关确切断点位置，支持读取次数等的信息。
a两个融合伴侣PAX3（靶向）和FOXO1的RH肿瘤样品的覆盖图。PAX3的目标是三个连续的指导，以跨越18 kb可能的断点区域。b两个融合伴侣BCR（靶向）和ABL1的CML肿瘤样品的覆盖图。BCR的目标是通过十一个顺序指南来跨越可能的断点区域。c ALL2肿瘤样品在CRLF2（靶向）和P2RY8（靶向）之间缺失的覆盖图。d平均覆盖率和e肿瘤样品ES1，RH，CML，BL，ALL1和ALL2在基因组上的平均富集，靶标（切到断点），BP跨度（断点跨度）和融合跨度（跨融合结点） 。虚线（绿色）指示crRNA定向的Cas9切割位置，虚线（红色）指示断点位置。箭头指示从特定crRNA设计创建的读取的方向性。源数据作为源数据文件提供。
总而言之，这证明了FUDGE能够从患者样品中检测已知和相互融合的基因以及基因组重排，而与肿瘤类型无关。
为了确认FUDGE在没有融合伴侣或融合状态的事先知识的情况下识别了融合基因，我们以盲法测试了两个肿瘤样品（B1和B2）。对于B1样品，诊断工作通过分离FISH 鉴定出了KMT2A融合蛋白；但是，在此处描述的实验之前，融合伴侣无法识别，并且未知。该KMT2A基因是AML和ALL和表演两大断点集群频繁的融合伙伴4，而我们设计crRNAs两个（补充资料 1）。B2样本是从可能包含BCR-ABL1，IGH / MYC或BCR-ABL1的六个肿瘤样本（四个ALL，一个BL，一个Burkitt's-ALL）中随机选择的。CRLF2-P2RY8重排。因此，我们针对具有两个crRNA的B1样品和具有14 crRNA的B2样品（补充数据1）进行了靶向，并对 两个样品分别在一个流通池中进行了测序。NanoFG 在B1中鉴定出KMT2A-MLLT6融合体（图 5a），在B2中鉴定出BCR-ABL1融合体（图 5b），分别具有29个融合跨度和27个融合跨度读物（图 5c）。总体而言，我们观察到了938x（B1）和313x（B2）的跨断点富集以及143x（B1）和148x（B2）的跨融合富集（图 5d）。这证明了FUDGE从肿瘤材料中识别未知融合事件的能力。
a两个融合伴侣KMT2A（靶向）和MLLT6的B1肿瘤样本的覆盖图。b两个融合伴侣BCR（靶向）和ABL1的B2肿瘤样品的覆盖图。BCR的目标是通过十一个顺序指南来跨越可能的断点区域。虚线（绿色）指示crRNA定向的Cas9切割位置，虚线（红色）指示断点位置。箭头指示从特定crRNA设计创建的读取的方向性。c平均覆盖率和d样本B1和B2在基因组上的平均富集，靶标（从切割到断裂点），BP跨越（断裂点跨越）和融合跨越（跨越融合结）。e进行时间序列实验，以鉴定融合跨度读段（％）和f融合跨度读段（n = 2）所需的测序时间。源数据作为源数据文件提供。
此外，我们进行了对所有八个测序肿瘤样品的回顾性时程实验，以确定必要的测序时间来检测熔跨越读取（图 5 E，F）。平均而言，在测序的前12小时内产生了70％的融合跨度读数，在测序的前24小时内产生了90％的融合跨度读数（图 5e）。对于所有样品，除了BL中的IGH / MYC重排外，花费不到三个小时的时间即可确定两个融合跨度的读数（图 5f）。这突显了我们的研究方法的速度，并表明如果测序在24小时后停止，则可以获得大部分融合跨度的读数。
可用肿瘤物质的量通常是基因组分析的限制因素。为了解决这个问题，我们测试了我们的管道是否与全基因组扩增（WGA）材料兼容。WGA产生的DNA片段长度相当长（最多100 kb）20，因此可能是一种合适的方法，可以以足够的长度产生足够的DNA用于靶向纳米孔测序。因此，我们对两个结肠癌样品（C1和C2）的WGA-DNA进行了测序，已知它们带有BRAF融合蛋白（分别为AGAP3-BRAF和TRIM24-BRAF）21，肉瘤样品带有SS18-SSX1融合（S1）和未知融合状态的PDX肉瘤样品（S2）。我们用9个crRNA靶向S2样品，靶向最常见的复发性肉瘤融合伴侣EWSR1，PAX3，PAX7和SS18。对于所有样品，我们对10 ng起始原料进行WGA，并对1μgWGA-DNA进行富集实验。基因组覆盖率（图 6a）和读取长度与以前的实验（补充数据1）相当 。最初，NanoFG无法检测到 AGAP3-BRAF融合，但是，将阈值降低至一个支持融合的读数可识别出融合基因（图 6a–c）。该TRIM24-BRAFNanoFG用11个融合跨度的读段（图6a，b，d）调用了融合 。对于S1和S2样品，NanoFG和IGV中的手动检查均无法检测到目标融合基因。值得注意的是，WGA引入了伴随的结构变异，导致大量的融合基因预测（补充图 5D）和IGV中手动检查的困难。但是，我们显示两个读数的融合支持阈值对于正常样品和WGA样品而言是一个合理的截止值，因为与一个支持读数相比，预测的融合数急剧减少，但与更高的融合支持相比则保持相对稳定（补充图 5D）。此外，在我们的测定中，未通过crRNA靶向的NanoFG鉴定的融合基因很可能是假阳性。我们利用NanoFG提供的确切断点位置和跨非扩增肿瘤DNA的断点跨度PCR （例如，在一个GAP3-BRAF中）成功验证了两个BRAF融合基因，该融合基因由单个融合跨度读数检测到（补充图 5E）。此外，对于BRAF融合，断点连接位置相距6.5 kb（图 6c，d和补充图 3）。），突出了我们分析的公正性能。这表明FUDGE可以成功地应用于WGA材料，而NanoFG仍可以准确地识别出结构变异的确切基因组断裂点。但是，需要两个融合基因的先验知识。
在整个基因组中，针对整个基因组扩增的肿瘤材料C1和C2 的平均覆盖度和b富集，靶点（切割至断点），BP跨度（跨断点）和融合跨度（跨融合结）。c两个融合伴侣AGAP3和BRAF（靶向）的全基因组扩增肿瘤材料C1的覆盖图。d两个融合伴侣TRIM24和BRAF的全基因组扩增肿瘤材料C2的覆盖图（定位）。虚线（绿色）指示crRNA定向的Cas9切割位置，虚线（红色）指示断点位置。箭头指示从特定crRNA设计创建的读取的方向性。源数据作为源数据文件提供。
并行识别和降低成本是诊断方法的关键。因此，我们测试了在一个测序运行中多路复用样品的可行性。我们从具有不同融合伴侣（MLLT1，MLLT2，MLLT3和MLLT4）的四个KMT2A融合阳性细胞系（ALLPO，KOPN8，ML2和Monomac-1）获得了DNA 。我们使用了两个靶向两个断点簇的crRNA（补充表 1），并为每个样品产生了独立的文库（图 7a）。）。将目标文库以无条形码的方式进行预测序合并，并在单个流通池上运行。这种多路复用方法导致基因组覆盖率为0.57x，平均读取长度为9.2 kb（补充数据 1）。NanoFG确定了四个不同的融合伴侣（补充图 6A）和6个不同的断点位置（图 7b）。有趣的是，两个KMT2A融合（MLLT2和MLLT3）似乎是相互的（补充图 6A，B）。KMT2A内的断点跨度为6 kb，我们确定了相互融合的断点与位置无关（图 7c））。我们利用了跨断点引物并测试了所有样品中所有融合基因的发生（图 7a）。这种方法很容易对每个融合的起源样本进行卷积，因此验证了这种复用方法（补充图 7A）。值得注意的是，Monomac-1细胞系（KMT2A-MLLT3）也显示出KMT2A-MLLT1融合的阳性结果。这可以追溯到培养的细胞系中的污染，突出了该测定法检测亚克隆事件的敏感性。我们从Monomac-1细胞系中分离了新鲜的DNA，实际上只能验证预期的融合基因KMT2A-MLLT3（补充图 7B）。）。此外，从覆盖图中，我们观察到MLLT4融合伴侣内有26个读数（补充图 6A），而任何NanoFG检测到的融合均无法解释。在IGV浏览器中进行手动调查后，我们确定了一种融合物KMT2A-MLLT4，该融合物具有更复杂的重排，而NanoFG并未对此进行调用（补充图 7C）。在这种情况下，删除了KMT2A的一个30 bp的小区域，然后反转185 bp，并最终融合到MLLT4。我们再次设计了跨断点引物，此外，对扩增子进行了Sanger测序并验证了复杂重排的发生和结构（补充图。 7C）。结果，仅使用一个纳米孔流通池，我们从四个样品中鉴定出七个融合基因，目标集中富集度达349x，平均产生18个融合跨度读数（图 7d）。这显示了我们的方法能够通过简单的PCR测定法对具有不同融合基因和断点位置的样品进行多路复用，并精确定位原始样品的能力。
复用方法的示意图。制备样品并分别进行Cas9富集，并进行均等的预测序。文库池在单个ONT流通池上测序，并用NanoFG检测到融合基因，并设计了融合特异性断点引物。对原始样品进行断点PCR，以鉴定每个融合基因的来源样品。b KMT2A的覆盖图（针对性）。虚线（绿色）指示crRNA定向的Cas9切割位置，虚线（红色）指示断点位置。箭头指示从特定crRNA设计创建的读取的方向性。c KMT2A中的断点位置基因用于不同的鉴定融合基因。外显子8和12之间的断裂簇和相互融合的基因以相同的颜色突出显示。d通过融合结富集。源数据作为源数据文件提供。
融合基因是各种癌症类型22的诊断，预后和治疗机会的关键决定因素。但是，通过诊断方法检测融合基因仅限于高度重复的融合基因构型。我们在这里开发了FUDGE，这是一种通过基因富集与纳米孔测序相结合的融合检测方法，可在48小时内快速检测独立于伴侣和融合蛋白的位置。
基因组断点的快速鉴定提供了利用断点连接作为最小残留疾病（MRD）追踪23的生物标记的机会。融合基因检测的常见诊断方法可以分为基于DNA或RNA的方法（表 1）。由于将断裂点限制在外显子-外显子连接处，因此在RNA水平上检测融合基因可能不太复杂。但是，RNA分子的稳定性较差，总体丰度受表达水平的影响。优选基于DNA的方法，例如靶向NGS分析或WGS，因为它们可以识别所有融合基因事件，包括启动子融合以及确切的基因组断裂点。但是，较长的周转时间阻碍了这些检测，而WGS可能导致假阳性率高。
借助FUDGE，我们可以提供快速，无偏见的融合基因检测。我们成功地从基因组DNA中鉴定出了与癌症类型或融合基因构型和/或断点位置无关的融合基因。我们针对八个实体和血液肿瘤标本中的十个复发性融合伴侣，确定了22种独特的融合基因构型，突出了融合基因生物学的复杂性。在一个案例中，通过诊断工作，FISH分离将KMT2A鉴定为融合伙伴。但是，融合伙伴是无法检测到的。我们将FUDGE应用于样本并确定MLLT6在两天内成为融合合作伙伴（前提是crRNA已设计并在内部完成）。此外，FUDGE还无需额外的努力即可检测出相互融合事件。在两个BRAF融合阳性样品的情况下，断点位置彼此之间的距离> 6 kb。诸如qPCR之类的常规方法不足以跨越可能的断点位置的较大区域。我们对协议进行了整合，以设计顺序指南，从而提供了跨越可能的断点位置的较大区域的机会。对于BCR-ABL1融合，我们跨越了一个大于80 kb的区域，突出了FUDGE的多功能性。
通过我们的测定，可以在48小时内进行融合检测。融合基因的快速鉴定对于其中融合基因是特异病征性如尤文肉瘤或滑膜肉瘤肿瘤类型必不可少22，24。因此，早期检测可以及早确定诊断并开始治疗。此外，特定融合基因构型的出现可能是预后的决定因素25。FUDGE在48小时内鉴定了所有融合基因构型，从而可以立即进行诊断和治疗。此外，我们证明了70％的融合支持读码是在测序的前12小时产生的，并且三个小时的测序足以识别两个融合跨读码，从而为减少紧急情况下的检测时间提供了机会不到一天。到现在为止，我们将测定的重点放在十种不同的复发融合基因上。但是，可以将测定法扩展到任何感兴趣的基因。此外，快速检测确切的基因组断点位置打开了大门，可立即从液体活检中识别患者特异性靶标以追踪循环肿瘤DNA（ctDNA）中的融合分子，并通过监测最小的残留疾病来评估治疗反应。
这种方法的局限性是需要非片段化DNA。将FUDGE crRNA协议应用于FFPE材料（病理过程的当前标准），由于降解的FFPE DNA的读取长度短，很可能无法全面鉴定融合基因。将设计策略调整为以短间隔定期间隔crRNA可能会解决此问题；然而，这种方法将大大增加每个融合基因的测定成本。此外，肿瘤内异质性和肿瘤纯度可能会影响我们测定的检测下限，并且在DNA利用率较低的情况下使用WGA可能有助于准确识别断点位置，但前提是必须先了解两个融合基因伴侣。我们设置了至少两个跨接读段的临界值，以可靠地检测到融合基因，而无需进一步验证。通常，我们观察到低通量测序运行和/或更远的远端断点事件的靶标覆盖率降低（补充图。 8），表明可以通过将指南放置在更靠近断点的位置来获得更高的断点覆盖率。值得注意的是，这些实验中使用的测序DNA样品均未专门分离用于长读测序。因此，优化分离方法并因此优化DNA分子的长度和/或采用平铺方法将对检测这些更远端的事件产生积极影响。在这里，仅检测到两个融合，每个融合跨度读一次，需要通过断点PCR手动验证融合基因。但是，通过整合多crRNA方法和ONT加大努力以提高测序通量，预计FUDGE的性能将得到改善。另外，后者将允许更高的能力来复用样品，从而进一步降低了测定的成本。
我们当前的多路复用方法，包括样品池和通过断点PCR进行回顾性多路分解，可降低成本，但会延长测定时间，并增加样品处理的复杂性。使用较低通量的流通池（例如ONT Flongle），可以分别运行单个样品，而无需合并和解复用PCR，从而简化了工作流程并大大降低了测定成本。
总之，从低覆盖率纳米孔测序中，FUDGE可以识别融合基因，而与融合伴侣或断点位置无关。FUDGE通过在快速，准确的测定中复用靶点，克服了当前诊断测定的各种限制，可用于在48小时内检测融合基因。该测定法在临床中的应用可以允许快速的基因融合检测，从而允许适当的治疗开始和针对基于血液的最小残留疾病追踪的特定遗传靶标的鉴定。
将尤文氏肉瘤细胞系（A4573，CHP-100）和滑膜肉瘤细胞系（HS-SYII）在5％CO 2中于37°C的湿润气氛中于Dulbecco改良培养基（DMEM）（Thermo Fisher）中补充10 ％胎牛血清（FBS）和抗生素（100 U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素）。没有支原体。用Lonza MycoAlert系统确定污染。细胞系是从柏林Charité的Anton Henssen合作获得的。
将所有细胞系ALL-PO和KOPN8以及AML细胞系ML2和Monomac-1在RPMI-1640培养基（Invitrogen）中悬浮培养，并补充10％或20％的牛犊血清（FCS）和抗生素。细胞系得自PMC Utrecht的Ronald Stam。
健康的捐献者（PP）提供了书面知情同意书。ES1和RH患者已根据德国小儿肿瘤和血液病学会（GPOH）的德国试验方案进行了注册和治疗。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》和《良好临床实践》进行的，并获得了所有患者或其监护人的知情同意。柏林慈善大学的机构审查委员会批准了患者标本的收集和使用。样本，临床数据已由柏林慈善医院存档并提供。
C1和C2先前的序列为21，由荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心外科系Ijzermans教授提供。
B1是博士教授的礼物。CM Zwaan，伊拉斯姆斯医学中心-鹿特丹索菲亚儿童医院，荷兰/马克西玛公主小儿肿瘤中心，荷兰乌得勒支。患者，他/她的父母或法定监护人给予知情同意，所有操作均按照赫尔辛基的声明进行，伊拉斯姆斯MC-索菲亚儿童医院批准了该实验。
CML，BL，ALL1，ALL2和B2来自荷兰乌得勒支公主玛西玛（PrincessMáxima）小儿肿瘤中心的诊断样本档案。由于这项工作被认为属于诊断服务改进范围之内，因此它不需要欧盟临床试验指令（2001/20 / EC）中所述的特定研究伦理委员会批准。
按照制造商的说明，使用基于柱的NucleoSpin®组织DNA提取试剂盒（Macherey-Nagel），从培养的细胞（A4573，CHP-100和HS-SYII）和组织（ES1和RH）中提取基因组DNA。使用4200 TapeStation系统（安捷伦）执行样品质量控制，并使用Qubit 3.0荧光计（Thermo Fisher）测量DNA含量。
通过使用基于柱的Qiagen DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒（Qiagen），从ALL细胞系（ALLPO和KOPN8），AML细胞系（ML2和Monomac-1）和AML患者（B1）中分离基因组DNA。制造商的说明和DNA含量用Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher）测量。
可以手动提取基因组DNA，也可以使用QIAcube自动化样品处理器提取，其中CML，BL和ALL2使用AllPrep DNA / RNA微型试剂盒，而ALL1和B2使用QIAamp血液微型试剂盒。
对于全基因组扩增（WGA），使用repli-g mini试剂盒（Qiagen）根据制造商的规程扩增10 ng起始材料。
每个潜在的基因融合体都构成了使用该富集技术靶向的已知融合伴侣，并在随后的测序之后鉴定了（未知）伴侣。取决于已知文献，将已知的靶融合伴侣指定为5'或3'融合伴侣。此外，从文献搜索中提取了最常见的断点位置，并且将最远端的断点位置标记为目标区域的极端边界。如果未知的融合伴侣是5'伴侣，则将crRNAs设计为基因负链上存在的序列（5'-> 3'）直到PAM序列。如果未知的融合伴侣是3'伴侣，则将crRNA设计为基因的正链上存在的序列（5'-> 3'），直到PAM序列为止（补充图 1）。）。使用Integrated DNA Technologies（IDT）定制gRNA设计工具设计定制Alt-R®crRNA，并选择具有最大目标上得分和最低目标外得分（IDT）的选择。
Cas9富集改编自ONT Cas9富集协议12。简而言之，大约1μg基因组DNA或WGA-DNA（补充数据 1）在37°C下用小牛肠道磷酸酶（NEB）和CutSmart Buffer（NEB）脱磷酸10分钟，然后在80°C灭活2分钟。crRNAs重悬在TE pH7.5中至100μM。为了同时靶向多个基因座，将crRNA等摩尔合并至100μM。通过将100 uM等摩尔混合的crRNA池与100μMtracrRNA（IDT）和双链体缓冲液（IDT）混合，在95°C下孵育5分钟，然后冷却至室温，来制备核糖核蛋白复合物（RNP）。将10μMRNP与62μMHiFiCas9（IDT）和1x CutSMart缓冲液（NEB）混合，并在室温下孵育15分钟以产生Cas9 RNP。将去磷酸化的DNA样品和Cas9 RNP与10 mM dATP和Taq聚合酶（NEB）在37°C混合15分钟，在72°C混合5分钟，以促进基因组DNA的切割和dA尾巴处理。通过将连接缓冲液（SQK-LSK109，ONT），Next Quick T4 DNA连接酶（NEB）和适配器混合物（SQK-LSK109，ONT）混合来制备衔接子连接混合物。将混合物小心地加到处理过的DNA样品上，不要涡旋，并在室温下孵育25分钟。洗涤DNA，并通过添加TE pH8.0和0.3x体积的AMPure XP珠子（Agencourt）与珠子结合，然后在室温下孵育10分钟。通过用长片段缓冲液（SQK-LSK109，ONT）洗涤与珠子结合的溶液两次，将3 kb以下的片段洗掉。用洗脱缓冲液（SQK-LSK109，ONT）从珠子中释放出丰富的文库。用Qubit Fluorometer 3.0（Thermo Fisher）测量富集的文库浓度。将混合物小心地加到处理过的DNA样品上，不要涡旋，并在室温下孵育25分钟。洗涤DNA，并通过添加TE pH8.0和0.3x体积的AMPure XP珠子（Agencourt）与珠子结合，然后在室温下孵育10分钟。通过用长片段缓冲液（SQK-LSK109，ONT）洗涤与珠子结合的溶液两次，将3 kb以下的片段洗掉。用洗脱缓冲液（SQK-LSK109，ONT）从珠子中释放出丰富的文库。用Qubit Fluorometer 3.0（Thermo Fisher）测量富集的文库浓度。将混合物小心地加到处理过的DNA样品上，不要涡旋，并在室温下孵育25分钟。洗涤DNA，并通过添加TE pH8.0和0.3x体积的AMPure XP珠子（Agencourt）与珠子结合，然后在室温下孵育10分钟。通过用长片段缓冲液（SQK-LSK109，ONT）洗涤与珠子结合的溶液两次，将3 kb以下的片段洗掉。用洗脱缓冲液（SQK-LSK109，ONT）从珠子中释放出丰富的文库。用Qubit Fluorometer 3.0（Thermo Fisher）测量富集的文库浓度。通过用长片段缓冲液（SQK-LSK109，ONT）洗涤与珠子结合的溶液两次，将3 kb以下的片段洗掉。用洗脱缓冲液（SQK-LSK109，ONT）从珠子中释放出丰富的文库。用Qubit Fluorometer 3.0（Thermo Fisher）测量富集的文库浓度。通过用长片段缓冲液（SQK-LSK109，ONT）洗涤与珠子结合的溶液两次，将3 kb以下的片段洗掉。用洗脱缓冲液（SQK-LSK109，ONT）从珠子中释放出丰富的文库。用Qubit Fluorometer 3.0（Thermo Fisher）测量富集的文库浓度。
根据制造商的方案，将一个肿瘤样品中的文库加载到一个流通池（R 9.4，ONT）上。测序在GridION X5仪器（ONT）上进行，碱基检出由Guppy（ONT）执行。
可以在https://github.com/SdeBlank/NanoFG上找到NanoFG 。
通过使用参数为“ -x map-ont -a”的minimap2（v。2.6）26将读段映射到人类参考基因组版本GRCHh37 。将生成的SAM文件压缩为bam格式，并使用samtools（v。1.7）进行索引27。接下来，从bam文件中检测到结构变化。用户可以选择具有默认参数的NanoSV（v。1.2.4）10：'min_mapq = 12，depth_support = False，mapq_flag = 48'，cluster_distance = 100，ci_flag = 300'或Sniffles（v.1.0.9）28使用默认参数：-s 2 -n -1 --genotype来检测SV。在这里，我们将NanoSV用于所有实验（多路复用除外）。对于样品C1和HS-SYII，由于跨融合的读取次数较少，因此将其他参数：'cluster_count = 1'用于NanoSV。对于多路复用实验，支持融合的读段比例低于NanoSV中的等位基因频率截止值。因此，默认的Sniffles设置用于检测6个融合。默认情况下，将删除所有未通过内置NanoSV或Sniffles过滤器的SV。另外，所有插入也将从VCF中删除。
NanoFG通过ENSEMBL数据库29中的基因注释了SV的两端，从而选择了可能形成融合基因的候选SV 。如果SV的两端位于不同的基因中，则将其标记为可能的融合。接下来，使用samtools（v。1.7）27提取所有支持候选SV的读物。
为了重新映射和准确检测SV，使用LAST 30（921）使用默认设置重新映射每个候选融合基因提取的所有读数，以提高映射准确性。然后，使用NanoSV精确定义重新映射的融合候选中的断点。NanoSV参数'cluster_count = 2，depth_support = False'，cluster_distance = 100，ci_flag = 300'用于检测所有当前融合。对于C1和HS-SYII，将'cluster_count = 1'用作NanoSV的参数。
为了检查和标记融合，收集了ENSEMBL数据库的其他信息以产生融合基因的确切组成。仅保留能够在同一条链上产生连续转录本的融合体，并向样品中添加其他标记，以进一步表明报告的融合体是否重要或ENSEMBL数据库中的某些信息不完整。
所有收集到的ENSEMBL基因信息都用于提供检测到的融合蛋白的概况。这包括涉及的基因，包含断点的外显子或内含子，融合的确切位置，融合支持读段的数目，两个融合基因的CDS长度以及最终融合的CDS长度。检测到的融合也以VCF格式报告，以供进一步分析。概述中支持融合的阅读次数可能与vcf中报告的阅读次数有所不同，这是因为NanoFG将多次支持NanoSV断点的阅读检测为单个支持阅读。为了更好地了解检测到的融合，NanoFG还提供了PDF格式的可视化概述。除了有关基因，标志的信息之外，
NanoFG使用引物3（参考文献自动设计用于融合基因的引物验证31）使用默认设置，旨在为200-400碱基对产物。表 2包含用于验证断点的所有引物序列。
使用单个线程，在+ -25000纳米孔读数上，NanoFG的运行时间约为20分钟。可以在GitHub（https://github.com/SdeBlank/NanoFG）上找到包括测试集的详细说明。
为了检测基于测序持续时间的融合基因检测的差异，将所有fastq合并，并根据测序时间对所有读数进行分类。最早的时间被视为测序运行的开始，随后基于1、2、3、4、5、6、12、18、24、30、36、42和48小时后的bin选择读数。第一次阅读已测序。然后，使用每个样本的默认设置分别在每个fastq上分别运行NanoFG。使用这种方法，可以确定已对至少2个融合读码进行测序的时间点，以定义每个样品产生两个跨融合读码所需的最小测序持续时间。
为了选择用于检测融合基因的最小数量的支持读物，我们在多个样本（CHP-100，ES1，C1-WGA和C2-WGA）上运行了NanoFG，其中最少一个支持读物。此后，对报道的至少有1、2、3、4和5+个支持读数的融合数进行计数。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
通过EBI和CRG（https://ega-archive.org）托管的欧洲基因组-现象学档案馆（EGA）的受控访问，可以获得来自纳米孔测序的低覆盖WGS二进制比对图（BAM）文件。编号EGAS00001003964。数据访问请求将由UMCU遗传学部数据访问委员会（EGAC00001000432）进行评估，并在完成材料转让协议并由UMCU的医学伦理委员会授权后进行转移，以确保符合涉及人类行为的荷兰医学研究。图1和2的基础源数据。 提供2 – 7作为源数据文件。可以在以下位置找到用于基因组构建GRCh37的ENSEMBL数据库https://grch37.ensembl.org/index.html。根据合理要求，作者可以提供任何其他相关数据。本文提供了源数据。
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