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MYC充当自然杀伤细胞介导的淋巴恶性肿瘤免疫监视的开关

二维码

发表时间：2020-06-11 16:14作者：武汉新启迪生物Xinqidibio来源：www.qidibio.com

MYC充当自然杀伤细胞介导的淋巴恶性肿瘤免疫监视的开关

摘要

该MYC基因驱动器T和B淋巴组织的恶性肿瘤，包括伯基特淋巴瘤（BL）和急性淋巴细胞白血病（ALL）。这里，我们证明在自然杀伤（NK）细胞数的减少全身SRα-tTA的/四环素-O-MYC ON小鼠轴承MYC驱动T-淋巴瘤。残余MNK细胞的脾脏MYC ON在终端NK效应分化途径T-淋巴瘤轴承小鼠表现出扰动。淋巴瘤内源性MYC通过转录抑制STAT1 / 2阻止NK成熟和I型干扰素（IFN）的分泌。用I型IFN治疗带有T淋巴瘤的小鼠，可以通过挽救NK细胞成熟来提高存活率。成熟NK细胞的过继转移足以延迟T淋巴瘤的生长和MYC灭活后的复发。在MYC驱动的BL患者中，STAT1和STAT2的低表达与缺乏活化的NK细胞显着相关，并预示不良的临床结果。因此，我们的研究为开发基于NK细胞的疗法以在将来有效治疗MYC驱动的淋巴瘤提供了理论依据。

介绍

癌基因依赖是其中癌症变得依赖于致癌基因对增殖和存活的单个'驾驶现象1，2。驾驶员的抑制形成的基础癌基因靶向治疗1，2，3。因此，人类恶性肿瘤在于它们成瘾癌基因包括潜在脆弱性MYC，RAS和BCR-ABL1 4，5。靶向治疗一直是最成功的针对BCR-ABL1（费城/植+）诱导的白血病6，7。要开发针对MYC驱动的癌症的靶向疗法，了解MYC如何调节细胞自主和非自主过程（包括宿主免疫）至关重要。癌基因成瘾被认为是细胞自主性和免疫独立性8。最近的研究表明，MYC和其它癌基因单独或共同调节在多种肿瘤类型的肿瘤微环境和宿主免疫反应9，10，11，12，13，14，15，16。

我们通过四环素（tet）系统调节的癌症转基因小鼠模型研究MYC驱动的肿瘤发生过程中宿主免疫的作用的易处理方法。这些模型使我们能够通过了解癌症内在和外在的宿主免疫相关的机制如何MYC失活引发肿瘤消退1，10，15。CD4 + T细胞似乎对于MYC失活后持续的癌症消退至关重要10。然而，在这些模型中，原发性MYC诱导的肿瘤发生过程中免疫格局的变化仍有待描述。

我们旨在描述由原发性的MYC驱动的淋巴瘤发生而引起的总体免疫学变化，以鉴定可以开发为针对MYC驱动的淋巴瘤的免疫疗法的抗肿瘤免疫亚群。我们假设MYC直接干扰淋巴瘤发生部位的宿主免疫，从而逃避免疫监视。因此，我们使用大规模流式细胞仪（CyTOF），检查了MYC激活后以及在易于发展为MYC驱动的T细胞淋巴母细胞的SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠中原位失活MYC后宿主免疫成分的特定变化淋巴瘤1。

我们观察到MYC抑制淋巴瘤微环境中自然杀伤（NK）细胞的成熟。我们发现，NK细胞通过延缓MYC驱动的T淋巴瘤的生长和复发而具有关键的抗肿瘤发生作用，因此在淋巴瘤形成过程中被MYC抑制。我们显示了淋巴瘤内在性MYC抑制NK细胞介导的免疫监视的直接信号传导机制。我们的结果为开发和结合基于NK细胞的疗法与MYC抑制剂治疗MYC驱动的淋巴瘤提供了理论依据。

结果

MYC驱动的淋巴瘤表现出脾脏结构破坏

我们检查了由SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠1中明显的MYC驱动的T淋巴瘤形成引起的脾脏总体变化。值得注意的是，SRα限制了人类MYC（hMYC）转基因在SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠中的T细胞谱系的过度表达，从而引起了全身性弥散性T淋巴瘤1。携带淋巴瘤的小鼠显示出脾脏生发中心破坏，而MYC失活部分拯救了脾脏结构（补充图 1）。因此，我们推测MYC在T淋巴瘤中的过度表达可能会重塑脾脏免疫状况。

致癌性MYC干扰脾脏免疫亚群的频率

hMYC转基因在T淋巴细胞中的可诱导调控，使我们能够阐明淋巴瘤内源性MYC在原发性淋巴瘤发生过程中如何影响正常免疫细胞。使用CyTOF 17，我们描述了在原发性MYC诱导的SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠淋巴瘤发生过程中，淋巴器官的整体免疫学变化。

检查来自在（MYC ON）和（MYC OFF，96 h）灭活MYC之前，来自明显的SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠的脾脏样品的免疫亚群；并与年龄和品系匹配的正常脾脏（正常）进行比较。

与T淋巴瘤的表型一致，MYC ON队列中T淋巴细胞亚群的分布发生了变化，与正常小鼠相比，未成熟CD4 + CD8 +双阳性（DP）CD3 + T淋巴母细胞的百分比增加。MYC失活导致大部分DP T淋巴母细胞消除，脾脏T亚群恢复正常分布，表明MYC成瘾，如前所述1（图 1a–c，补充图 2a，b）。MYC ON小鼠中的T 淋巴母细胞是TCRαβ +，因此导致TCRγδ +的百分比降低T细胞（补充图 2c，d）。

接下来，我们检查了MYC ON 和MYC OFF小鼠中的其他非恶性免疫区室，并将其与正常小鼠进行了比较。在MYC ON小鼠中NK（CD3 - NKp46 +），NKT（CD3 + NKp46 +）和B细胞（CD19 +）的百分比显着降低，并在MYC OFF小鼠中恢复至正常水平（图 1d，e，补充图2e-g和3a，b）通过调节MYC不会改变包括树突状细胞（DCs）和中性粒细胞在内的其他免疫区室的相对比例（补充图 2b）。 3c–f）。

T淋巴瘤的免疫变化与脾肿大无关

淋巴瘤的发生通常与脾细胞增多有关。为了排除NK和B细胞明显减少的原因是因为它们被T淋巴母细胞被动地超过，我们测量了CyTOF评估的脾脏样本中免疫亚群的绝对细胞数。我们观察到淋巴瘤脾细胞的细胞数显着增加（图 1f）。如预期的那样，与正常小鼠和MYC OFF小鼠相比，MYC ON小鼠的CD3 + pan T，TCRαβ + CD3 + T和未成熟DP CD3 + T淋巴母细胞的绝对计数增加（图 1g，补充图 4a，b）。以淋巴瘤为特征，TCRαβ + CD3 + T淋巴母细胞的繁殖伴随着MYC ON小鼠CD3 + TCRγδ + T淋巴细胞数量的明显减少（补充图 4c）。

致癌的MYC显着降低了CD3 - NKp46 + NK和CD3 + NKp46 + NKT细胞的数量，而MYC失活则逆转了这种效应（图 1h，补充图 4d）。尽管减少了B淋巴细胞的频率，但与正常小鼠和MYC OFF小鼠相比，在MYC驱动的淋巴瘤中B细胞的数量没有改变（图 1i）。MYC驱动淋巴瘤显著增加DC和嗜中性粒细胞（补充图的数字 4E，F），证实这些子集的先前充分表征亲致瘤性功能在淋巴瘤中18，19，20。

NK细胞在MYC驱动的T淋巴瘤中被特异性抑制

我们的目标是确定可开发作为对MYC驱动的淋巴瘤治疗抗肿瘤免疫亚群21，22。由于NK细胞作为针对基于MYC的淋巴瘤的潜在基于细胞的免疫疗法具有吸引力，因此我们继续特别关注MYC如何在淋巴瘤发生过程中改变NK亚群。我们通过常规流式细胞术检测MYC灭活前后的NK组成来确认CyTOF结果（补充图 5）。接下来，使用计算方法从大量基因表达数据中估算免疫组成（CIBERSORT 23），我们从正常SRα-tTAMYC ON计算了CyTOF匹配脾脏中NK组成的变化。（淋巴瘤）和SRα-tTAMYC OFF（回归淋巴瘤）小鼠。与CyTOF一致，与正常小鼠和MYC OFF小鼠相比，CIBERSORT证明MYC ON小鼠中NK细胞的相对比例减少（补充图 6）。因此，使用三个不同的平台，我们证明了MYC因果关系可逆地减少了淋巴瘤形成过程中脾NK细胞介导的免疫监视（图 1k）。

MYC驱动的淋巴瘤形成过程中的NK细胞抑制是系统性的

我们检查了NK抑制是否发生在T淋巴细胞（包括血液和骨髓）浸润的其他淋巴组织中。与正常和MYC灭活（MYC OFF）小鼠相比，明显的淋巴瘤小鼠（MYC ON）的循环NK百分比，每μl血液数量和NKp46的MFI显着降低（图 2a–e）。就像在血液中观察到的那样，与正常和MYC OFF小鼠相比，在淋巴瘤小鼠（MYC ON）的骨髓中CD3 - NKp46 + NK细胞被显着抑制（补充图 7e，f）。

淋巴瘤发生过程中的NK细胞抑制是MYC依赖性的

为了证明NK抑制对MYC的依赖性，我们比较了具有残留母细胞的MYC OFF小鼠与具有相似母细胞百分比的淋巴瘤小鼠（MYC ON）脾脏和循环NK细胞的百分比和表面NKp46表达（图 2f，i）。在剩余的淋巴母细胞的存在MYC OFF小鼠可灭活前归因于任一初始高疾病负担MYC MYC灭活后，或T-淋巴母细胞的偏微分24。MYC失活会增加NK百分比（图 2g，j）和表面NKp46（图 2h，k）），即使存在残留的淋巴母细胞。因此，我们推断NK抑制是MYC依赖性的，并且不会仅仅由于在MYC灭活后因淋巴母细胞清除而腾空的空间而发生。

NK成熟在MYC驱动的T淋巴瘤形成过程中被阻止

我们调查了MYC诱导的淋巴瘤形成过程中NK细胞减少是否由于细胞死亡增加而发生。出乎意料的是，与正常和MYC OFF组相比，我们观察到了携带淋巴瘤的MYC ON小鼠中NK细胞死亡的减少（补充图 8）。因此，我们得出结论，在淋巴瘤形成过程中对NK亚群的抑制不是由淋巴瘤固有MYC诱导的NK细胞凋亡增加引起的。

从骨髓的NK细胞的消失MYC ON小鼠表明MYC驱动淋巴瘤有可能会通过在骨髓阻断早期NK细胞发育成熟废除NK细胞周边的补充25，26，27，28。因此，我们比较总NK的数目（林- CD122 +），NK细胞前体细胞（NKP，林- CD122 + NKp46的- CD49b - ），更分化的未成熟的NK（油墨，林- CD122 + NKp46的+ CD49b -），和成熟的NK（MNK，林- CD122 + NKp46的+ CD49b +）细胞在正常的骨髓SRα-TTA-MYC ON（淋巴瘤），和SRα-TTA-MYC OFF（倒退淋巴瘤）小鼠。我们观察到，与正常组和MYC OFF组相比，MYC ON小鼠的骨髓中总NK，NKP，iNK和mNK细胞数量减少（图 3a–d），这使我们推测MYC驱动的淋巴瘤形成可诱导小鼠在骨髓NKP阶段之前阻断NK的早期发育。检查lin - CD122 +的相对分布骨髓内的NK细胞，我们观察到MYC ON小鼠中的mNK百分比低于正常和MYC OFF中存在的mNK细胞的稳态频率，这也反映在脾脏中（图 3e–g）。这些发现表明，骨髓中早期NK发育的阻滞导致mNK细胞的供应减少，而这些mNK细胞可以出口到包括脾脏在内的周围器官。

MNK细胞在脾经历进一步分化以产生功能性NK效应在4级线性分化途径：CD27 -细胞CD11b -，CD27 +细胞CD11b -，CD27 +细胞CD11b +和CD27 -细胞CD11b + 29，30。因此，我们检查了MYC ON小鼠中残留的mNK细胞是否在终末NK分化阶段表现出干扰。有趣的是，我们在的至少频率观察到显著减少成熟CD27 -细胞CD11b -与正常小鼠和MYC OFF小鼠相比，MYC ON小鼠的终末分化CD27 - CD11b + mNK分数伴随着最高分数的增加（图 3h，i）。因此，我们得出结论，在MYC驱动的T淋巴瘤发生过程中，功能性NK效应子亚群的稳态频率明显受损。我们推测，MYC ON小鼠中终末分化的CD27 - CD11b + mNK组分频率的增加，除了由于早期NK发育受阻所致的数量减少外，还可能意味着NK细胞功能的丧失。图 3j 显示在MYC驱动的淋巴瘤形成过程中，在早期（骨髓）和晚期（脾脏）NK成熟中发生的变化。

令人惊讶地，我们观察到增加了CD27的频率-细胞CD11b -和CD27 +细胞CD11b - ，和降低的CD27的频率+细胞CD11b +和CD27 -细胞CD11b +相比于在文献中所示种群的对照小鼠29。我们发现这是C57BL / 6J 29和FVB / N菌株之间的菌株介导差异的结果（SRα-tTA/ Tet-O-MYC小鼠的背景（补充图 9））。

为了观察观察到的MYC灭活后NK成熟度的变化是否不是强力霉素治疗的结果，如先前所述31，将FVB / N小鼠用与灭活MYC表达所需剂量相同的强力霉素治疗。通过流式细胞术测量骨髓和脾脏中的NK细胞。在任何早期NK亚组（补充图10a-h）或脾mNK细胞上CD27和CD11b的表达（补充图 10i，j），用强力霉素治疗和未治疗的对照小鼠之间均未见明显变化。因此，SRα-tTA/ Tet-O-MYC小鼠中MYC调节后NK稳态的变化是MYC表达变化的结果，而不是强力霉素所致。

若要调查观察到的MYC对NK成熟的抑制是否仅限于离散的淋巴组织微环境，我们检查了MYC ON小鼠肝脏和肺中NK细胞的成熟。我们观察到MYC ON小鼠肝和肺中T淋巴细胞的浸润伴随着总lin - CD122 + NK细胞百分比的降低，以及lin - CD122 + NK组分中mNK细胞频率的降低（补充图 11和12a– d），与正常小鼠相比。我们还观察到在MYC ON中mNK细胞分化为功能性效应物的扰动与健康小鼠相比，小鼠（补充图 12e，f）。因此，NK细胞的成熟在表现出T淋巴细胞的浸润的淋巴组织和非淋巴组织中都受到干扰。这些发现加强了我们的假设，即在MYC驱动的淋巴瘤形成过程中观察到的NK监测变化可能直接由淋巴母细胞中的MYC表达诱导。

MYC抑制I型干扰素可能会阻止NK监测

接下来，我们通过分析正常，SRα-tTAMYC ON（淋巴瘤）和SRα-tTAMYC OFF（回归）的大量脾细胞的转录组谱，研究了MYC介导的原发性T和B淋巴瘤形成过程中抑制NK监视的分子机制。淋巴瘤）小鼠（GSE106078）。我们观察到MYC OFF脾脏的表达谱与正常脾脏紧密聚集，从而证实MYC诱导的转录变化在失活后很大程度上可逆（图 4a）。）。基因集富集分析（GSEA）显示，与正常人和正常人相比，MYC ON小鼠的JAKs（Janus激酶）-STAT1 / 2（信号转导和转录激活因子1/2）-I型IFN（干扰素）途径被显着抑制。MYC OFF小鼠（图 4b–d）。

图4：在MYC驱动的淋巴瘤形成过程中，抑制I型IFN信号介导的细胞逃避了NK监测。

值得注意的是，MYC灭活后STAT1 / 2的激活类似于抗病毒免疫应答，与产生I型干扰素和随后激活NK细胞介导的免疫监视有关32。STAT1 / 2-I型IFN信号传导已经显示出NK细胞的影响成熟和功能33，34，35，36，37，38，39。相比正常对应，缺陷小鼠中I型IFN受体（IFNαR1/ 2 - / - ）显示较低的显著脾MNK小区频率33，36，NKP阶段35之前在骨髓中早期NK成熟的阻滞，并以CD27和CD11b 36的变化为标志，改变了NK效应分化途径中mNK亚群的频率。因此，我们推测在MYC ON小鼠中降低的NK监测可能表型上缺乏I型IFN信号级联成分的小鼠。

与MYC驱动的淋巴瘤形成过程中的NK抑制相一致，与正常小鼠和MYC OFF小鼠相比，我们观察到了许多STAT1 / 2-Type I IFN调控的基因的转录抑制，这些基因对MYC ON小鼠中NK介导的免疫监视具有特异性（补充图。 13）。这表明I型IFN标记与脾NK细胞成熟中观察到的变化之间存在联系。

接下来，我们比较的转录物水平STAT1，STAT2和在正常B细胞（其他的I型IFN信号传导组分MYC LOW），预先从淋巴瘤B细胞Eμ-MYC小鼠（MYC HIGH），和公开的B细胞淋巴瘤从Eμ- MYC小鼠（MYC HIGH），是MYC驱动的B淋巴瘤（GSE51011 40）的小鼠模型。在逐步B细胞转化过程中，MYC的顺序增加伴随着STAT1 / 2-I型IFN信号的转录抑制（补充图 14）。因此，抑制STAT1 / 2-I型IFN信号传导是T和B-MYC驱动的淋巴瘤的标志。

I型IFN信号介导MYC驱动的NK细胞抑制

我们研究I型IFNα的短期（3天）管理是否SRα-MYC的tTA 对小鼠轴承显性的T淋巴瘤可以拯救MYC介导的NK抑制作用。与同胎仔匹配的媒介物治疗的淋巴瘤小鼠（PBS）相比，IFNα治疗的小鼠中CD3 - NKp46 + NK细胞的百分比和数量显着增加（图 4e）。值得注意的是，在对照组和经IFNα处理的组之间，WBC，CD3 + T细胞和DP未成熟T细胞的数量保持不变（补充图 15），表明I型IFN特异性地调节NK细胞的稳态。长期将IFNα施用至MYC ON显着的T淋巴瘤小鼠与经载体（PBS）处理的荷瘤小鼠相比，改善了总生存（OS）（图 4f）。

为了解决在施用IFNα期间消耗NK细胞是否会影响OS，我们用抗NK1.1 NK细胞消耗抗体或IgG2a对照抗体与重组IFNα结合处理了明显的T淋巴瘤SRα-tTAMYC ON小鼠。我们观察到，与未耗尽NK细胞的对照相比，耗尽NK细胞可缩短OS时间（图 4g）。因此，我们得出结论，I型IFN的抗肿瘤作用至少部分取决于NK细胞。这些发现证实了我们先前的观察结果，即I型干扰素不是直接作用于T淋巴细胞，而是直接作用于宿主免疫细胞，从而发挥其抗肿瘤作用。

最后，我们通过在MYC灭活时用IFNAR1阻断剂或对照抗体处理明显的T淋巴瘤MYC ON小鼠，并通过检查脾脏NK成熟来询问在MYC灭活期间恢复NK组分稳态频率时I型IFN信号传导的要求4天后。我们观察到总脾脏lin - CD122 + NK细胞的数量以及IFNAR1阻断抗体治疗组和对照组之间lin - CD122 +子集内NKP，iNK和mNK组分的相对频率没有差异（补充图。 16）。然而，在检查脾脏mNK亚群的频率时，我们观察到在MYC灭活过程中阻断IFNAR1后，CD27 + CD11b +效应细胞的频率显着降低（图 4h，i）。这表明，尽管在NK成熟的后期阶段产生功能性NK效应子需要I型IFN信号传导，但对于MYC灭活后的早期NK成熟和恢复正常NK数量而言，这是必不可少的。我们得出的结论是，MYC驱动的淋巴瘤发生可能通过抑制STAT1 / 2信号级联反应和I型IFN产生而破坏NK细胞稳态的正常免疫过程。

致癌MYC抑制肿瘤细胞产生I型干扰素

接下来，我们调查了MYC驱动的B和T淋巴瘤细胞系中MYC的体外调节是否差异调节STAT1 / 2-I型IFN信号传导。由于伯基特氏淋巴瘤（BL）是一种典型的人类MYC相关淋巴瘤，因此我们在表达MYC调控的EBV转化的人B细胞系中（MYC ON）和（MYC OFF）MYC失活之前，通过Phospho-CyTOF测量了信号传导变化。由Tet系统（P493-6）模仿BL 41。我们证实MYC在P493-6细胞中可诱导表达（图 5a）。在通过JAK和STAT运行的免疫调节细胞因子信号通路中，MYC失活在P493-6细胞中增加的表达和STAT1的活化相比，MYC ON P493-6细胞（图 5B-d ，补充图 17， 18和19A）。MY493失活后，在P493-6细胞中诱导了STAT2的结合伴侣STAT2的转录（图 5d，补充图 19b）。实际上，在P493-6细胞中MYC失活后，I型IFNα2的转录水平显着升高（MYC OFF，图 5e）。MYC灭活前后P493-6细胞的细胞因子分析表明，与MYC ON细胞相比，MYC OFF细胞中IFNα的分泌明显上调（图 5f，补充图 20）。

MYC失活后，源自SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠的T淋巴瘤系中的肿瘤固有信号变化（补充图 21）与在人类BL样模型中观察到的MYC失活导致STAT1激活的变化相似。 / 2-I型IFN信号传导（补充图 22和 23）。我们的发现表明，淋巴瘤内源性MYC抑制STAT1 / 2-I型IFN信号传导。从而阻断了肿瘤微环境中NK细胞的成熟。

MYC转录抑制STAT1 / 2-I型IFN信号转导

我们测试了MYC是否在转录上抑制STAT1 / 2-I型IFN信号级联。虽然作为一个反式激活众所周知，MYC可以抑制通过螯合反式激活包括MIZ1和SP1 / SP3的基因转录42，43，44，和结合在基因启动子引发剂（INR）的元件。例如，MYC灭活释放从肿瘤抑制基因如结合位点MYC-MAX异二聚体CDKN2B和CDKN1B，从而促进这些基因的MIZ1介导的转录激活42，43，44。

与先前的研究表明MYC在转录上抑制STAT1 45相一致，我们发现MYC与P493-6人BL和小鼠MYC驱动的T淋巴瘤中的STAT1启动子结合（补充图 24）。为了描述MYC介导的I型IFN信号转录抑制的分子机制，我们比较了MYC驱动的淋巴瘤细胞系过表达MYC或无法隔离MIZ1（MYC V394D）的MYC突变体中STAT1，STAT2和IFNα2的水平，或相应的空向量（EV）。尽管MYC在P493-6细胞中的过量表达抑制了STAT1 / 2和IFNα2的产生（图 5g–k，补充图 25）。），MYC V394D突变体在四环素控制的MYC（Tet-MYC）灭活之前和之后均显着拯救了STAT1 / 2-Type I IFN信号传导的激活。我们的结果表明，MYC通过隔离转录激活因子（例如MIZ1）来部分抑制STAT1 / 2-Type I IFN信号传导。在MYC驱动的T淋巴细胞中，我们观察到MYC介导的I型IFN信号级联的抑制独立于MIZ1（补充图 26和27），表明其他MYC结合伴侣如SP1 / 3 40可能参与其中。。

MYC 高人类淋巴瘤抑制STAT1 / 2和NK监测

我们检查了MYC驱动的人类淋巴瘤患者，发现其抑制STAT1 / 2信号转导和NK细胞介导的免疫监视的证据。首先，我们分析了经常表现出MYC过度活化的人类淋巴瘤，例如Burkitt淋巴瘤（BL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL，GSE4475 46）。我们观察到在BL和DLBCL患者中STAT1和STAT2转录本与MYC转录本成反比（图 6a，b）。值得注意的是，由MYC易位47驱动的BL 显示出最高的MYC水平和最低的STAT1和STAT2水平。这表明在BL中MYC的自然成瘾可能导致STAT1 / 2-I型IFN信号转导的抑制。

图6：MYC 高人类淋巴瘤表现出降低的STAT1 / 2和NK细胞介导的免疫监视。

接下来，我们分析了根据STAT1和STAT2的中位表达将BL患者分为四组是否可以预测临床预后。我们观察到STAT1和STAT2含量最低的患者的临床预后最差（图 6c）。此外，根据CIBERSORT估计，大多数STAT1和STAT2含量最低的BL患者（85％，6/7）没有激活的NK细胞（图 6d）。我们发现，BL患者中较高水平的活化NK细胞与明显有利的临床结局和延长的生存期相关（图 6e）。因此，STAT1和STAT2的低表达与BL患者的NK细胞抑制和较差的总体生存率相吻合。

最后，使用在体表达数据CIBERSORT，我们比较了NK细胞在从MYC的血液中分离的单核细胞所估计的分数高的T淋巴瘤患者（GSE62156）48，49和健康个体23。值得注意的是，相比于健康个体（图MYC水平在T-淋巴瘤患者显著更高 6F因为染色体易位可潜在激活MYC的）48，49，50，51，52，53，54。我们观察到STAT1和STAT2水平的显着抑制（图 6g，h），与正常人相比，T淋巴瘤患者的总NK细胞和活化的NK细胞亚群减少（图 6i-1）。总的来说，我们的发现表明，在人类和小鼠MYC驱动的淋巴瘤中，NK抑制是一个常见的范例，部分原因是MYC癌基因直接抑制了STAT1 / 2-I型IFN信号转导级联。

NK细胞可作为对抗MYC驱动淋巴瘤的潜在疗法

我们的发现表明，NK监测的颠覆对于MYC驱动的淋巴瘤的形成至关重要。因此，我们调查了NK细胞是否可以通过在MYC驱动的淋巴瘤起始和MYC失活后复发中询问NK细胞的需求和充足性而发展为针对MYC驱动的淋巴瘤的免疫疗法。

为了检查在转基因MYC驱动T-淋巴瘤小鼠阻断淋巴瘤生长NK细胞的要求，我们贫4周龄NK细胞SRα-TTA-MYC ON到明显的淋巴瘤发展之前小鼠在8-12周，并比较这些与对照组小鼠。我们观察到100％的NK耗竭小鼠死于侵袭性淋巴瘤并伴有脾肿大，而对照小鼠表现出疾病严重程度的异质性模式，其中只有50％的脾脏肿大（补充图 28a，c）。无病生存期（DFS）的比较表明，与NK耗竭组相比，对照组的生存期略有延长（尽管无统计学意义（补充图 28a））。我们预测增加样本量以使每组包含更多的小鼠可能会导致两组之间DFS的统计显着变化。值得注意的是，当测量发病率作为脾肿大的函数时，我们观察到对照小鼠的存活概率有统计学上的显着增加，这表明疾病严重程度较高（补充图 28b）。因此，我们得出结论，NK细胞对于阻断MYC驱动的淋巴瘤的形成很重要。

我们进一步证实了在通过注入静脉内荧光素酶标记减缓T-淋巴瘤生长NK细胞的要求MYC ON衍生自T-淋巴母细胞SRα-tTA的/ TET-O-MYC小鼠（补充图 21）与接收方（NOD SCID）或不包含（NOD SCIDIL-2Rγ -/-，NSG）NK和其他先天性淋巴样细胞。在NOD SCID移植受者中，小鼠的淋巴瘤发作（NSG第5 天，NOD SCID第18天）和中位发病率（NSG第10 天，NOD SCID第20天）明显延迟（图 7a，b）。T淋巴瘤最终移植到存在NK细胞的NOD SCID小鼠的骨髓中（图 7a）。我们推断，尽管NK监视最初会阻止MYC驱动的淋巴瘤发生，但持续的MYC表达最终会抑制NK细胞建立淋巴瘤，如在原代SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠中看到的那样。

T淋巴瘤在有NK监测的部位（如骨髓）的植入（图 7a，注射后第18天的BLI图像）表明，NK细胞介导的同种异体排斥是NOD SCID小鼠延迟淋巴瘤植入的不太可能的解释。但是，为了排除这一点，我们在（d-3）T细胞淋巴瘤移植（d0）的三天前，将从健康正常FVB / N小鼠（补充图29）获得的同基因成熟NK细胞（CD3 - NKp46 +）移植到NSG小鼠中。）。与接受媒介物的移植受者相比，我们观察到接受同种NK细胞的移植受者的T淋巴瘤开始明显延迟（图。 7c，d）。因此，仅NK细胞就足以减慢MYC驱动的淋巴瘤的生长。值得注意的是，尽管接受NK细胞的移植受者的淋巴瘤起始时间有所延迟，但系统性淋巴瘤最终仍与我们先前的发现一致，后者一旦建立，MYC驱动的淋巴瘤会促进NK细胞抑制。

MYC驱动淋巴瘤复发与免疫缺陷宿主（100％的外显率交MYC灭活NSG相比于免疫感受态宿主）其中MYC灭活维持淋巴瘤消退10，55。我们调查了NK细胞是否足以延迟MYC灭活后的淋巴瘤复发。与正常对照相比，正常小鼠的同基因NK细胞（CD3 - NKp46 +）在MYC失活时过继转移到携带T淋巴瘤的NSG受体中时，延迟了淋巴瘤的复发和OS的延长（图7e-g）。。因此，仅NK细胞的过继转移就足以维持MYC失活后的淋巴瘤消退。

总体而言，我们的结果表明NK细胞在MYC驱动的淋巴瘤中具有重要的抗肿瘤发生作用，因此使基于NK细胞的免疫疗法成为针对此类恶性肿瘤的有吸引力的治疗策略。

讨论区

在原发性肿瘤发生过程中对免疫亚群中的干扰进行定位对于鉴定癌症免疫疗法至关重要。通过CyTOF，我们描绘了MYC灭活前后MYC驱动的T淋巴瘤的免疫特征。我们确定了MYC直接抑制NK监视的机制。NK细胞的MYC依赖性抑制是高度特异性的其它抗肿瘤发生免疫子集没有在数通过改变MYC调制（图 1，附图 2 - 4）。我们的结果与最近的报道一致，其中MYC已显示可促进腺癌11中 NK细胞的排斥。

我们发现，带有明显MYC驱动的T淋巴瘤的小鼠抑制了骨髓中早期NK细胞的发育（图 3a-e）。我们表明，这种在NK成熟中的早期发育停滞转化为外周，可能是由于mNK细胞向包括脾脏，肝脏和肺脏在内的器官输出减少所致（图 3f和补充图 11a和12a–d）。我们表明，MNK细胞中的MYC ON小鼠表现出改变的效应NK细胞的分化途径的子集的频率29，30，提示在MYC驱动的淋巴瘤中NK功能可能受损。我们发现，MYC失活可显着逆转在MYC ON小鼠中观察到的NK发育早期和晚期的缺陷（图 3h）。因此，我们推断MYC驱动的淋巴瘤可通过阻断NK细胞成熟来逃避NK监测，而抑制MYC对于逆转这种发育障碍并引发针对“ MYC成瘾”的肿瘤的NK细胞介导的反应至关重要。阻滞在NK成熟已被证明是免疫逃逸的癌症的重要机构27，28。我们证明，在淋巴母细胞中MYC的过度表达会在淋巴瘤微环境中NK发育中阻止这种停滞。

我们表明，MYC驱动淋巴瘤通过转录阻抑STAT1 / 2-I型IFN信号逃避NK监视（图 5克-K ，补充图 24 - 27），用于NK细胞成熟所需的33，34，35，36，37，38，39。MYC 高淋巴母细胞显示I型IFN产生受到抑制（图 5e，f，补充图 20和22）），这反过来会扰乱淋巴瘤微环境中的NK成熟。我们发现MYC驱动的人类淋巴瘤与同时抑制STAT1 / 2和NK排斥有关（图 6）。

尽管我们观察到MYC过表达改变了B / T淋巴母细胞I型IFN的分泌，但我们并未排除其他免疫细胞（包括树突状细胞）的IFN分泌可能受到干扰的可能性。值得注意的是，我们观察到MYC ON小鼠中IL15和IL15R的减少（补充图 13）。IL15是NK成熟所必需的，并且主要由DC通过I型IFN激活后分泌出来，56提示MYC转化的淋巴细胞失去IFN类型分泌可能影响DC成熟57，因此减少DC分泌IL15并阻止NK成熟。与先前的研究一致，该研究表明MYC驱动的B淋巴瘤的DC数量增加且DC成熟受到阻碍如图18所示，我们显示在 MYC ON小鼠中DC数目显着增加（补充图 4e）。DC的表型和功能变化的后果及其对MYC诱导的淋巴瘤形成过程中IL15和NK成熟的影响仍有待探索。

I型IFN治疗恢复了携带淋巴瘤的小鼠的脾脏中NK细胞的产生（图 4e）。IFN治疗与NK耗竭相结合缩短了MYC ON小鼠的发病时间（图 4g）。因此，MYC抑制STAT1 / 2-I型IFN的级联反应并阻断NK监测（补充图 30）。除了它们作为抗病毒剂使用，I型干扰素诱导癌细胞的抗增殖作用37，58。我们的研究解释了为什么MYC驱动的B淋巴瘤系对I型IFN治疗敏感59，并说明了I型IFN治疗在淋巴瘤中的新功能。

我们观察到，MYC失活时阻断IFNAR1会损害CD27 + CD11b + NK效应子的产生，而不会抑制脾脏中mNK细胞的补充（图 4h，补充图 16）。尽管有IFNAR1阻滞，MYC OFF小鼠mNK细胞体内稳态水平的恢复可能是由独立于I型IFN信号通路的激活所解释的，该通路可以在MYC灭活后诱导NK成熟。

现有的研究表明，特定NK受体-配体相互作用由NK细胞介导的肿瘤的识别和可以阻止MYC驱动淋巴瘤60，61。在MYC ON淋巴瘤小鼠中，NKG2D（KLRK1）的转录水平降低，而在MYC OFF小鼠中，NKG2D的转录水平恢复至正常水平（补充图 13），表明MYC驱动的淋巴母细胞对NKG2DL的抑制作用。因此，MYC介导的NK监视抑制的多种机制可能在淋巴瘤形成过程中起作用。

我们的结果对癌症免疫治疗具有重要意义62。我们观察到过继转移的NK细胞显着延迟了MYC驱动的淋巴瘤的发生，并导致MYC失活后持续的淋巴瘤消退（图 7），这表明MYC驱动的淋巴瘤可能对基于NK细胞的疗法特别敏感。用于淋巴瘤的大多数常规化学疗法是免疫抑制的。旨在恢复免疫应答的疗法可能对MYC驱动的淋巴瘤特别有效。我们的研究结果强调识别MYC抑制剂的重要性63和这些与NK细胞疗法组合64，65，66以获得最大的治疗效果。我们建议，与其他人一样，我们将研究针对MYC的潜在治疗候选药物，考虑NK细胞介导的免疫监视在定义治疗方式中的作用至关重要。并确定NK细胞的特性，时间和剂量以获得最大的治疗益处。

方法

细胞系和细胞培养

条件性MYC驱动的小鼠T细胞淋巴瘤细胞系（补充图 21）来自SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠。通过用0.02μg/ ml强力霉素（Sigma-Aldrich，T7660）处理细胞培养4、8、24和48小时，可以在SRα-tTA/ tet-O-MYC T淋巴瘤细胞中抑制c-MYC 。BL样的人P493-6细胞由宾夕法尼亚大学Chi Van Dang提供。对于P493-6细胞中的c-MYC失活，有条件的pmyc-tet构建体用0.1μg/ ml强力霉素（Sigma-Aldrich，T7660）抑制24小时。确认细胞株对支原体污染呈阴性，并保存在Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI，Invitrogen）中，含有含有10％胎牛血清，100 IU / ml青霉素，100μg/ ml链霉素和50μM2-巯基乙醇的GlutaMAX。在37°C的5％CO 2湿润培养箱中。

动物

所有程序均已获得斯坦福大学实验动物管理行政小组（APLAC）的批准，并按照机构和国家/地区指南进行。在研究中使用了以下小鼠品系：FVB / N（雄性，8-12周），SRα-tTA/ Tet-O-MYC小鼠（雄性，8-12周），NOD SCID（雄性，4-8）周），NOD SCIDIL2Rγ -/-（雄性，4-8周），FVB / N（雄性，4-8周）和C57BL6J（雄性，4-8周）。在斯坦福大学饲养和饲养动物，并保持在18-23°C，40-60％的湿度以及12小时光照/ 12小时黑暗周期。

小鼠免疫细胞的分离与加工

我们使用了幼小雄性小鼠（8至12周龄）。使用了以下小鼠品系：SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠和相应的FVB / N野生型品系。该SRα-的tTA / TET-O-MYC男性在约2-3个月大时发展为T细胞淋巴瘤。根据T细胞淋巴瘤发展的可见症状鉴定患病小鼠；即体重减轻和食欲不振，皮毛褶皱，呼吸急促和运动困难，并在出现这些症状中的一种或多种后24小时内死亡。将发展为T细胞淋巴瘤的雄性同窝仔数的一半接受强力霉素治疗以灭活MYC。对于经受MYC灭活的T细胞淋巴瘤小鼠，腹膜内给予一剂起始剂量的强力霉素，此后，小鼠在其饮用水中连续接受强力霉素4天。将每个笼子里的白血病同窝仔随机平均分为MYC ON / HIGH（未处理）或MYC OFF / LOW（强力霉素治疗）组。从三只小鼠的脾脏，血液和骨髓中分离出SRα-tTA/ tet-O-MYC（MYC ON / HIGH），SRα-tTA/ tet-O-MYC +强力霉素（MYC OFF / LOW）和正常健康（FVB / N）对照。对小鼠实施安乐死后，通过心脏穿刺抽血，并直接进行红细胞溶解。骨髓可通过用PBS冲洗股骨和胫骨腔，或将两端均切开的骨头以1600× g离心 3分钟而获得。用19 1/2将脾脏和骨髓匀浆G针，并通过70 µm过滤器过滤。使用RBC裂解缓冲液（BD PharmLyse，BD Biosciences）或ACK裂解缓冲液（Gibco）去除脾脏，血液和骨髓中的红细胞后，冷冻保存洗涤后的细胞，用于CyTOF或流式细胞仪。为了处理肝和肺细胞，先通过右心室向小鼠灌注PBS，然后再向左心室和下腔静脉灌注PBS，向小鼠灌注PBS。将切开的肝和肺切成小块，并在HBSS中用Ca ++和Mg ++消化（温和），使用温和的MACS Octo Dissociator（MACS Miltenyi）含有2 mg / ml胶原酶IV（Worthington）和0.2 mg / ml DNase I（Roche）。细胞悬液通过70 µm细胞过滤器过滤，并用ACK裂解缓冲液（ThermoFisher）处理。处理后立即将细胞用于流式细胞仪。在进行动物实验时不致盲。

大规模细胞计数（CyTOF免疫分型）

该测定在斯坦福大学的人类免疫监测中心进行。将小鼠脾细胞在温暖的培养基中融化，洗涤两次，重悬于CyFACS缓冲液（补充有2％BSA，2 mM EDTA和0.1％叠氮化钠的PBS）中。然后通过Visell计数活细胞。将细胞以每孔100万个活细胞的量添加到V型微量滴定板中，并通过沉淀和重悬于新鲜CyFACS缓冲液中洗涤一次。用50μl以下抗体-聚合物缀合物混合物在细胞上在冰上染色60分钟（补充表 1）。所有抗体均为来自Fluidigm的定制金属结合物（补充表 1）。将细胞洗涤两次。通过沉淀并用500 µl FACS缓冲液重悬。将细胞重悬于含有1.7 µg / ml活死细胞（DOTA-马来酰亚胺（Macrocyclics）含有天然丰度铟）的100 µl PBS缓冲液中。通过沉淀将细胞洗涤两次，并用500 µl CyFACS缓冲液重悬。将细胞重悬于100μl2％PFA的PBS溶液中，并于4°C放置过夜。第二天，将细胞沉淀并通过重悬在新鲜PBS中洗涤。将细胞重悬于100 µl eBiosciences透化缓冲液（在PBS中1x）中，置于冰上45分钟，然后用500 µl CyFACS缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于100 µl含铱的DNA嵌入剂中（在PBS中以1：2000稀释； DVS Sciences），并在室温下孵育20分钟。将细胞在CyFACS缓冲液中洗涤一次，然后在500 µl Milli-Q水中加三次。在注射到CyTOF（Fluidigm）中之前，在含有0.1x EQ归一化珠（Fluidigm）的Milli-Q水中将细胞稀释至〜800,000细胞/ ml的浓度。使用FlowJo v10进行数据分析，方法是先对基于铱与Ce140（珠子）的完整细胞进行选通，然后对来自嵌入剂的两个铱同位素进行选通，然后根据Ir191对细胞长度对单峰进行选通，然后对活细胞（铟-LiveDead负种群）进行选通，然后是特定于细胞子集的门控（补充图 31）。使用FlowJo X 10.0.7r2和viSNE（Cytobank Inc.）分析数据。

磷酸CyTOF

将收获的细胞悬浮在16％PFA中，并在室温下孵育10分钟。用CyFACS缓冲液（含0.1％BSA和0.05％叠氮化钠的1x CyPBS；在Milli-Q水中制成）洗涤后，通过在室温下将细胞与表面染色抗体混合物（补充表2）一起孵育来进行表面染色。温度30分钟。然后在进行细胞内染色之前，用CyFACS缓冲液洗涤细胞并使其通透。然后将细胞与细胞内抗体混合物孵育（补充表 2）在室温下放置30分钟。用CyPBS洗涤后，将细胞与Ir-嵌入剂溶液在冰上温育20分钟。然后将样品用Milli-Q水洗涤，并使用标准仪器设置程序在CyTOF仪器上进行采集。使用FlowJo X 10.0.7r2分析数据。

流式细胞仪

补充表3中列出了所有用于流式细胞仪测量的抗体。在使用前滴定所有抗体以确定用于最佳染色指数的稀释度。根据表面染色的标准程序进行多色流式细胞术染色，并用大鼠抗小鼠CD16 / 32 Fc阻断剂（BD Pharmingen）阻断细胞。用碘化丙啶（PI，Sigma-Aldrich）或LIVE / DEAD可固定近红外死细胞染色试剂盒（ThermoFisher）对细胞染色，以清除死细胞。在FACSCalibur或5激光LSRII（Becton Dickinson）上分析标记的细胞。使用Ultracomp eBeads补偿珠（Invitrogen）和ArC胺反应补偿珠套件（ThermoFisher）进行补偿。使用FlowJo X 10.0.7r2分析数据。补充图31提供了门控策略。

绝对免疫细胞计数的计算

在分别对脾脏，血液和骨髓的单细胞悬浮液进行CyTOF或流式细胞仪检测之前，使用Vicell对活细胞进行计数。使用当天通过CyTOF和流式细胞仪计算的免疫种群百分比，计算出不同免疫亚群的绝对存活细胞数。

RNA测序

正常（FVB / N，n = 3），SRα-tTAMYC ON（n = 3）和SRα-tTAMYC OFF（n = 3）小鼠的脾脏单细胞悬液的一部分用于CyTOF产生RNA 。RNA测序是在北京基因组研究所（BGI）使用BGISEQ-500仪器进行的。实验管道如下所述。

对于文库制备，使用寡（dT）磁珠选择带有polyA尾巴的mRNA，或将rRNA与DNA探针杂交并消化DNA / RNA杂合链，然后进行DNase I反应以去除DNA探针。获得目标RNA后，将其片段化并通过N6随机引物反转录为双链cDNA（dscDNA）。dscDNA在5'端用磷酸盐端修复，在3'端用粘性“ A”端修复。将在3'末端具有粘性“ T”的衔接子连接至dscDNA。使用两种特异性引物扩增连接产物。然后使PCR产物变性，并通过夹板寡核苷酸和DNA连接酶使单链DNA环化。然后对准备好的文库进行测序。

一级测序数据（原始读数）经过质量控制（QC）。QC后，将原始读数过滤为干净读数，然后再与参考序列进行比对。一旦比对通过QC，我们便进行了下游分析，包括基因表达和基于基因表达的深度分析（PCA /相关性/筛选差异表达基因）。使用适配器对数据进行筛选读取，具有> 10％未知碱基的读取和低质量读取。Bowtie 2用于将纯净读段映射到参考基因，而HISAT用于将读段映射到参考基因组（mm8）。RSEM用于使用期望最大化（EM）算法来计算最大似然丰度估计。FPKM方法用于计算单个基因的表达水平。基因表达Omnibus（GSE106078）。

西伯索

人类CIBERSORT 使用人类免疫亚群中基因表达的LM22参考矩阵在https://cibersort.stanford.edu/上进行（19）。在正常脾免疫组合物的CIBERSORT（FVB / N），SRα-tTA的MYC ON和SRα-tTA的MYC OFF小鼠中，使用ImmGen产生的基准矩阵（https://www.immgen.org/，GSE15907）。在与CyTOF匹配的正常样品（n = 3），SRα-tTAMYC ON（n = 3）和SRα-tTAMYC OFF（n = 3）样品上进行CIBERSORT 。

T淋巴瘤的移植和生物发光成像

用萤光素酶标记源自雄性SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠的MYC上瘾的T细胞淋巴瘤细胞系（补充图 21）。然后将3×10 6荧光素酶标记的T细胞淋巴瘤细胞静脉注射到两组免疫缺陷的宿主中：NOD SCID（杰克逊实验室）和NOD-SCIDIL-2Rγ -/-（NSG）。使用的男性移植受者年龄在4至5周之间。使用体内IVIS 100生物发光/光学成像系统（Xenogen），每周两次通过移植受体的生物发光成像（BLI）追踪白血病的植入和进展。D在测量发光信号之前，以每只小鼠2.5分钟的剂量腹膜内注射溶于PBS的-荧光素（Promega）15分钟。用3％异氟烷诱导全身麻醉，并在手术过程中继续通过鼻锥引入2％异氟烷进行麻醉。在进行动物实验时不致盲。使用Living Image软件（Perkin Elmer）分析生物发光成像数据。斯坦福大学实验动物护理管理小组（APLAC）批准了所有小鼠实验，并按照机构和国家/地区指南进行了实验。

NK细胞过继转移到带有T淋巴瘤的小鼠中

将3×10 6个荧光素酶标记的T细胞淋巴瘤细胞静脉注射到4-8周龄的NSG小鼠中（n = 19）。通过BLI验证T细胞淋巴瘤植入后，所有小鼠均接受强力霉素治疗以灭活MYC。通过磁激活细胞分选术（MACS，NK细胞分离试剂盒II，Miltenyi Biotech），对19只小鼠中的10只进行了从4-8周龄FVB / N小鼠脾脏分离的NK细胞的过继转移。进行流式细胞术以确认分离的NK细胞的纯度。每只小鼠将1×10 6 MACS纯化的NK细胞注射入带有T细胞淋巴瘤消退的NSG移植受者中（强力霉素，MYC OFF）。

I型IFN治疗，NK耗竭和IFNAR1阻滞

向患有明显淋巴瘤的SRα-tTA/ tet-O-MYC小鼠腹膜内施用20,000U的I型IFNα（R＆D系统），持续3天。在第3天，收集来自处理过的小鼠的脾脏，并进行流式细胞术以进行NK和T细胞分析。PBS处理的小鼠用作对照。如“免疫细胞绝对计数的计算”部分所述获得绝对细胞计数。为了长期施用I型IFNα，每三天腹膜内用20,000UIFNα或PBS治疗小鼠。每隔六天腹膜内注射100 µg抗NK1.1（克隆PK136，BioXCell）或IgG2a对照（克隆C1.18.4，BioXCell）以消减NK细胞。腹膜内给予2.5 mg抗IFNAR1（克隆MAR1-6A3，Leinco）或IgG1对照（克隆HKSP，Leinco）腹膜内给药以阻断SRα中的IFNAR1将带有明显淋巴瘤的-tTA / tet-O-MYC小鼠与小鼠同时用强力霉素进行MYC灭活。4天后，收集脾脏并进行流式细胞术以进行NK和T细胞分析。

免疫印迹

在补充有1％蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”（Pierce）的CelLytic缓冲液（Sigma）中裂解细胞。随后通过NuPAGE（Invitrogen）4–12％Bis-Tris梯度凝胶或4–12％预制XT-Criterion梯度凝胶（Biorad，Hercules，CA）通过电泳分离蛋白质样品，然后转移至PVDF膜（固定；密理博（Millipore）。之后，将印迹在TBST中的5％牛奶中封闭，并在4°C下与一抗孵育过夜（补充表 4）。）。与一抗孵育后，将印迹用0.1％TBST洗涤3次，每次10分钟，然后与与碱性磷酸酶（AP）偶联的二抗（山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体，ThermoFisher Scientific）孵育5 ％的牛奶在TBST中在室温下放置一个小时。如上重复洗涤，并使用Novex™AP化学发光底物（CDP-Star™）（ThermoFisher Scientific）观察印迹。使用Image Lab 5.1软件在胶片上或在Biorad Chemodoc MP Imaging系统上显影印迹。

逆转录病毒的生产和转导

逆转录病毒构建体的转染（补充表 5）使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和Opti-MEM介质（Invitrogen）进行）。将含有质粒pHIT60（gag-pol）和pHIT123（嗜热包膜）（由GP Nolan提供）的Phoenix细胞与逆转录病毒构建体共转染后，产生了用于细胞感染的逆转录病毒上清液。将细胞在含10％FBS，100 IU / ml青霉素，100μg/ ml链霉素，25 mM HEPES，pH 7.2、1 mM丙酮酸钠和0.1 mM非必需氨基酸的GlutaMAX的高葡萄糖DMEM（Invitrogen）中培养细胞。16小时后，用含10mM丁酸钠的生长培养基代替无血清培养基。温育8小时后，将培养基改回不含丁酸钠的生长培养基。24小时后，我们收集了病毒上清液，将其通过0.45-μm过滤器，并在2000×下离心两次。克为在32℃上50微克/毫升RetroNectin的涂覆的非组织培养处理的六孔板90分钟。通过以600× g离心30分钟转导Pre-B细胞（每孔2×10 6 –3×10 6个细胞），并在转移到培养瓶中之前，在37°C下用5％CO 2维持过夜。所有的逆转录病毒工作均在BSL2实验室中进行，该实验室配备了指定的通风柜，用于病毒生产和转导。

慢病毒的产生和转导

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和Opti-MEM培养基（Invitrogen）进行慢病毒（补充表 5）转染。我们通过用质粒psPAX2（gag-pol; Didier Trono，Addgene 12260）和pMD2.G（VSV-G包膜; Didier Trono，Addgene 12259）共转染HEK 293FT细胞来产生慢病毒上清液感染鼠细胞。如上所述，在具有GlutaMAX的高葡萄糖DMEM（Invitrogen）中培养细胞。根据制造商的建议，用Lenti-X™浓缩器（Clontech）浓缩培养上清液。将浓缩的病毒与细胞一起孵育50 µg / ml经RetroNectin包被的非组织培养物处理的6孔板。所有慢病毒工作均在BSL2实验室中进行，该实验室配备了指定的通风橱以进行病毒生产和转导。

定量RT-PCR

根据标准PCR条件和ABI7900HT实时PCR系统（Applied Biosystems），使用Invitrogen的SYBRGreenER混合物进行实时定量PCR。定量RT-PCR的引物在补充表 6中。

免疫组织化学

将得自实验小鼠的脾和胸腺浸入20 ml福尔马林（VWR）中24 h，然后转移至PBS中。使用标准程序在Tissue-TEK VIP处理器（Miles Scientific）上进行石蜡包埋，将4μm切片安装在Apex上佳的幻灯片上（Leica Microsystems），并在Ventana BenchMark自动IHC染色机上染色。免疫组织化学切片用固定介质固定，应用抗褪色剂（Pro-Long Gold； Invitrogen），盖玻片密封，然后在25°C的Zeiss Axiovert 200 M倒置共聚焦显微镜上用IP计40 Plan Neofluor物镜采集图像Lab 4.0软件（Scanalytics）。

芯片测序分析

原始ChIP测序文件是从Gene Expression Omnibus（GEO，GSE44672，GSE36354，补充图22）下载的。Galaxy软件（https://usegalaxy.org/）中的FASTQ Groomer 用于生成文件，这些文件被映射到RefSeq数据库中的小鼠基因（mm9）。在集成基因组查看器（IGV_2.3.72）中可视化了从Galaxy处理得到的bigWig文件。

统计和可重复性

CyTOF，流式细胞术和CIBERSORT结果以箱形图显示，并使用两尾Mann-Whitney U检验（不假定正态分布）和Graphpad Prism软件进行任意两组之间的比较。对于所有箱形图，中心位于中位数，最小值和最大值由晶须指示，该框表示介于25％和75％之间的数据。所有剩余数据均以平均值±sd表示。在使用Graphpad Prism软件计算每组的方差之后，使用两尾Student t检验对两个样本组之间的平均值进行比较。对于涉及将细胞移植到小鼠中的实验，使用R / Hmisc软件包中的“ cpower”函数计算每组中的最小小鼠数（http://www.r-project.org）。Kaplan-Meier方法用于估计总生存期和无复发生存期。对于所有存活率分析，使用对数秩检验来比较移植的小鼠或人类患者的组。R软件包“生存”版本2.35–8用于生存分析。所有p值都是两尾的。显着性水平设定为p <0.05。p值：ns =不重要；所有重要的p值都在原稿中指出。

对于涉及原发性T淋巴瘤小鼠的实验，通过为每个实验从至少三个独立的繁殖对中抽取小鼠来确保结果的可重复性。通过使用多种方法来确保获得相同的结果，可以确保实验的成功复制。例如，在FVB / N，MYC ON和MYC OFF上执行CyTOF，CIBERSORT和流式细胞仪不管使用哪种方法，小鼠都可以确保NK细胞稳态的变化是可重现的。对于这些实验中的每一个，我们都使用匹配和独立的样品以确保可重复性。所有的体外实验均使用至少两个不同的生物学重复样本进行，这些重复样本取自独立的批次/细胞代。对于qPCR研究，每个生物学重复均作为三个技术重复运行以解决处理错误。对于免疫印迹，显示了两个生物学重复的代表。为了进一步确保严谨性，在提供相同读数的两种不同实验方法之间进行了结果的交叉比较。例如，通过免疫印迹验证了磷酸化CyTOF的变化。使用RNA测序或GEO提供的可公开获得的微阵列数据进一步验证了某些实验的qPCR结果。对于体内和体外研究，所有复制尝试均成功。在T淋巴瘤和B淋巴瘤中均进行了公开数据的荟萃分析，以进一步加强我们的研究，显示NK细胞在B淋巴瘤和T淋巴瘤中均具有抗肿瘤作用。