摘要
蛋白酶体抑制剂已在多发性骨髓瘤（MM）的治疗中提供了重大进展。因此，人们对开发针对泛素蛋白酶体途径内的E3连接酶，去泛素酶和/或泛素受体的策略的兴趣日益增加，目的是实现更高的特异性和减少的副作用。先前的研究表明E3连接酶HUWE1在调节c-MYC（一种经常在MM中失调的癌基因）中的作用。在这里，我们调查了MM中的HUWE1。我们发现与正常细胞相比，MM中HUWE1的表达升高。小分子介导的HUWE1抑制作用导致MM细胞系的生长停滞，而没有显着影响正常骨髓细胞的生长，提示了良好的治疗指数。使用HUWE1敲低模型的研究显示了相似的生长抑制。HUWE1表达与MM骨髓细胞中MYC表达正相关，相应地，HUWE1的基因敲低和生化抑制降低了MM细胞系MYC表达。HUWE1底物的蛋白质组学鉴定揭示了HUWE1与MM细胞的代谢过程密切相关。在不存在HUWE1的情况下，细胞内谷氨酰胺水平降低，可能导致MYC降解。最后，HUWE1耗竭与来那度胺联合在体外和体内模型中均产生协同抗MM活性。综上所述，我们的数据证明了HUWE1在MM细胞生长中的重要作用，并为针对MM中HUWE1的治疗策略提供了临床前理由。HUWE1的基因敲低和生化抑制降低了MM细胞系中MYC的表达。HUWE1底物的蛋白质组学鉴定揭示了HUWE1与MM细胞的代谢过程密切相关。在不存在HUWE1的情况下，细胞内谷氨酰胺水平降低，可能导致MYC降解。最后，HUWE1耗竭与来那度胺联合在体外和体内模型中均产生协同抗MM活性。综上所述，我们的数据证明了HUWE1在MM细胞生长中的重要作用，并为针对MM中HUWE1的治疗策略提供了临床前理由。HUWE1的基因敲低和生化抑制降低了MM细胞系中MYC的表达。HUWE1底物的蛋白质组学鉴定揭示了HUWE1与MM细胞的代谢过程密切相关。在不存在HUWE1的情况下，细胞内谷氨酰胺水平降低，可能导致MYC降解。最后，HUWE1耗竭与来那度胺联合在体外和体内模型中均产生协同抗MM活性。综上所述，我们的数据证明了HUWE1在MM细胞生长中的重要作用，并为针对MM中HUWE1的治疗策略提供了临床前理由。在不存在HUWE1的情况下，细胞内谷氨酰胺水平降低，可能导致MYC降解。最后，HUWE1耗竭与来那度胺联合在体外和体内模型中均产生协同抗MM活性。综上所述，我们的数据证明了HUWE1在MM细胞生长中的重要作用，并为针对MM中HUWE1的治疗策略提供了临床前理由。在不存在HUWE1的情况下，细胞内谷氨酰胺水平降低，可能导致MYC降解。最后，HUWE1耗竭与来那度胺联合在体外和体内模型中均产生协同抗MM活性。综上所述，我们的数据证明了HUWE1在MM细胞生长中的重要作用，并为针对MM中HUWE1的治疗策略提供了临床前理由。
多发性骨髓瘤（MM）是一种血液肿瘤，其特征在于骨髓（BM）中恶性浆细胞的克隆增殖。蛋白酶体抑制剂（PIs）破坏泛素蛋白酶体系统（UPS）的使用已提供了重要的治疗进展，并突出了该途径在MM中的重要性[ 1 ]。硼替佐米，第一在类PI，既是前线和复发MM治疗的一种广泛使用的组分，而第二代的PI，卡非佐米和伊克昔佐米，被批准用于治疗复发和难治性MM [ 1，2 ]。尽管他们成功，获得性耐药性和剂量限制性副作用限制了它们的临床效用[ 3，4，5，6]，并且越来越有兴趣将UPS的其他组件作为目标。
UPS通过错误折叠的蛋白质和控制许多关键细胞过程的调节蛋白质的靶向破坏，在蛋白质稳态中发挥着核心作用。通过泛素化过程招募蛋白质进行降解，泛素化是涉及三种酶的酶促级联反应。E1酶激活泛素并将其连接到E2酶；然后，E3连接酶介导泛素向靶蛋白的转移，从而提供底物特异性。一组称为去泛素化酶（DUBs）的蛋白酶也可以逆转这一过程。UPS酶的改变的调节已与转化和肿瘤发生有关[ 7，8]。E3连接酶和DUB特别是理想的治疗候选药物，因为它们能够直接靶向异常信号通路。这方面的一个主要例子是免疫调节药物（IMiD）通过与cereblon（Cullin-4 E3连接酶复合物的底物受体）结合而诱导的转录因子IKZF1和IKZF3降解[ 9 ]。临床前研究已经强调了一些其他DUB的和E3连接酶的是本良好的治疗靶标在MM [ 10，11，12，13 ]。
HUWE1是一个大型（482 kDa）HECT域E3连接酶，参与关键蛋白的调控，例如c-MYC（MYC），p53和MCL-1（参考文献[ 14 ]）。HUWE1的失调经常被与肿瘤发生有关，并在HUWE1突变最近已经在MM患者[确定14，15 ]。根据细胞情况，HUWE1既是癌基因又是肿瘤抑制因子。关于HUWE1在调节癌基因c-MYC（MYC）中的作用的报道相互矛盾。在一个模型中，HUWE1通过K48连接的泛素化调节MYC的稳定性，敲除HUWE1导致MYC增加并驱动肿瘤进展[ 16]。相反地，在其它肿瘤类型HUWE1通过K63连接的遍在蛋白化和HUWE1沉默或抑制阻止MYC信号激活MYC的转录和减少肿瘤细胞的增殖[ 17，18 ]。这些矛盾的观察结果表明，HUWE1可能在MYC调控中发挥细胞类型和背景依赖性的作用。MYC的病理性激活是B-细胞恶性肿瘤，包括MM [的共同特征19，20 ]。HUWE1的高表达已被证明与MYC驱动的淋巴瘤特别相关[ 21 ]，但是HUWE1在调节MM中的作用方面尚不清楚。
在这项研究中，我们显示与健康浆细胞相比，HUWE1在MM中高表达。使用小分子抑制剂和功能丧失方法，我们证明了HUWE1在促进体内和体外模型中MM生长方面的重要作用。我们进一步证明HUWE1耗竭诱导细胞系模型和患者来源的MM细胞中的MYC降解。
通过使用UPS主题定义的MM细胞系微阵列分析，我们以前鉴定了许多与UPS相关的基因，包括HUWE1，与正常的CD138 +浆细胞相比，MM中的表达增加了（补充图1a，b）[ 22 ]。对三个独立基因表达数据集的进一步分析显示，通过一系列浆细胞疾病，HUWE1的表达逐渐增加（图1a–c）。同样，对健康供体（n = 3），MGUS（n = 3）和MM（n = 25）证明，与正常对照组相比，MM浆细胞中HUWE1的表达显着增加（p = 0.014;图1d，e）。此外，使用CoMMpass研究的数据分析MM患者的HUWE1基因表达和总体生存率，发现与较低表达水平的患者相比，表达较高水平HUWE1的患者总体生存率显着降低（log-rank p = 0.025;图。1f）。
HUWE1在以下人群的CD138 +细胞中的表达：（a）正常供体（n = 16），意义不明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS; n = 22），闷热的MM（SMM; n = 24）和新诊断的MM患者（n = 72） ）; 已发布的数据集GSE6477，（b）正常供体（n = 22），MGUS（n = 44）和SMM（n = 14）；已发布的数据集GSE5900，以及（c）MGUS（n = 7），MM（n = 39）和浆细胞白血病（PCL；n = 6）患者；已发布数据集GSE2113。d在健康供体骨髓，MGUS和MM患者中CD138和HUWE1双重染色的代表性免疫组织化学（IHC）图像。HUWE1红色染色，CD138深棕色/黑色染色，蓝色复染（原始放大倍数×10和×20）。e来自健康供体（n = 3），MGUS（n = 3）和MM（n = 25）的核HUWE1 DAB染色强度。f相对于HUWE1表达（CoMMpass数据集IA14版本）的5年总体存活率的Kaplan-Meier曲线；≥33个百分位数n = 244（检查了178个），≤33个百分位数n = 488（检查了378个）; 被审查的案件由垂直刻度线表示。G上图：MM细胞系中的HUWE1表达；下图-MM细胞系中的HUWE1活性（HUWE1自体泛素化用作催化活性的读数）。h密度测定法分析MM细胞系中HUWE1的表达和活性；Ñ = 3 一个，b，c ^，ê ANOVA进行统计学分析的一种方式; * p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001。
除了此处显示的HUWE1表达失调外，最近在小部分MM患者（5.7％）中发现了HUWE1的突变[ 15 ]。这些主要是分布在编码序列上的错义突变，并且与t（11; 14）亚组显着相关。在MM患者报告突变的比例（7％）在HUWE1的二聚化区域，其基于之前的研究都可能导致增加的活性被发现23，24 ]，然而，大多数突变的作用还没有待定。通过分析公开可用的MM细胞系数据（www.keatslab.org）我们通过Sanger测序鉴定了具有HUWE1突变的细胞系，随后在5个MM细胞系（U266，XG-1，XG-2，KMS-27和H1112）中确认了HUWE1突变（补充图1c）。根据MM患者的数据，HUWE1突变主要在t（11; 14）易位的细胞系中发现，并且以相似的方式分布（补充图1c-d）。比较了突变细胞系中HUWE1蛋白的表达与野生型（WT）HUWE1（JJN3，MM.1S，ANBL-6，KMS-18，OPM-2）的5种MM细胞系中的表达。在H1112细胞系中HUWE1蛋白表达明显降低（p 与HUWE1野生型细胞系相比，它带有一个剪接位点突变（= 0.002）。但是，UbiQapture-Q分析表明，在包括H1112在内的所有细胞系中，HUVE1催化活性均通过自体泛素化活性进行了测量（图1g，h）。
为了确定HUWE1在MM中是否具有任何功能意义，我们首先分析了HUWE1的小分子抑制或shRNA敲低对MM细胞系生长和存活的影响。HUWE1抑制剂BI8622和BI8626先前已经鉴定和表征[ 16，25 ]。HUWE1自体泛素化的抑制证实了抑制剂的靶向活性（补充图2a）。两种抑制剂都以浓度依赖的方式降低了一组MM细胞系的活力，包括对地塞米松（MM.1R）和硼替佐米（ANBL6-BR）耐药的细胞系（图2a）。此外，将细胞系与MM患者来源的BMSC共培养时，未观察到敏感性的显着变化（图2b）。; 补充图2b）。与IC的单个治疗50剂量BI8622 / BI8626的显著减少的MM细胞系的增殖在96小时（图2C ;补充图2C），和细胞周期分布的分析表明在S（细胞的积累p ≤0.044 ）和G2 / M（p ≤0.048），在G1（相关联降低p ≤0.0024;图2D）。重要的是，HUWE1的抑制对正常BM单核细胞的生存能力（补充图2c）或集落形成能力（图2e，f）没有显着影响，提示了良好的治疗指标。
MM细胞系对BI8622（左图）和BI8626（右图）的 24小时剂量反应。b单独培养或与骨髓基质细胞（BMSC）共培养24 h时，JJN3细胞对BI8622的剂量反应。c在14μMBI8622或BI8626存在下培养的JJN3细胞的生长曲线；DMSO处理的细胞用作载体对照。d在15μMBI8622或BI8626存在下培养24 h的JJN3细胞的细胞周期分布。e在15 µM BI8622或BI8626存在下，在基于半固体甲基纤维素的培养基中培养14天的健康供体的单核细胞的典型菌落生长；DMSO处理的细胞用作载体对照。F14天后对菌落进行定量。克表达多西环素可诱导的shRNA靶向HUWE1或非靶向对照JJN3细胞（NTC）的shRNA用1μg/ ml的多西环素（DOX）处理。在dox处理后72小时，通过Western印迹分析HUWE1的表达。h表达强力霉素诱导的shRNA或NTC shRNA的JJN3细胞的生长曲线; dox处理后72 h，以3×10 5 / ml 接种细胞，并在96 h内监测生长。i单独培养或与HS-5基质细胞共培养的表达NTC shRNA或shHUWE1-3的JJN3细胞的生长曲线。j＆k表达NTC shRNA或shHUWE1-3的JJN3细胞72 h的细胞周期分布（j）或dox治疗后1周（k）。Ñ ≥3对所有实验; 配对t检验用于统计学分析；* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001。
对于shRNA研究，用强力霉素诱导型慢病毒转导JJN3细胞，该慢病毒编码三种不同的靶向HUWE1的shRNA构建体。用非靶向对照（NTC）shRNA转导的细胞用作对照。选择嘌呤霉素后，以3×10 5细胞/ ml 的密度接种细胞，并在96小时内评估增殖。加入强力霉素后，所有shRNA序列均会降低HUWE1的表达（图2g），从而导致增殖降低（图2h）。使用构建体shHUWE1-3（p = 0.008）对增殖的影响最大，该shRNA用于后续实验。与HUWE1抑制剂一样，当HUWE1敲低细胞与BMSC共培养时，增殖的减少得以维持（图。2i）。在强力霉素诱导后72小时的细胞周期分布分析表明，S期细胞大量积聚（p = 0.003），G1降低（p = 0.019），并且在治疗后1周保持了这种效应。这与Choe等人的发现是一致的。他们报道了HUWE1耗尽细胞的S期停滞[ 26 ]。虽然HUWE1的抑制和敲低都有效地阻止了MM细胞系的增殖，但是几乎没有相关的caspase诱导的凋亡激活（补充图2d-e），表明HUWE1耗竭的作用主要是细胞抑制作用。
Qi等。先前报道HUWE1在MYC驱动的B细胞淋巴瘤中与MYC表达平行[ 21 ]。在这里，我们显示了MM BM trephines中HUWE1的核染色与MYC的核染色呈正相关（r = 0.49；p = 0.03；图3a，b）。此外，我们证明了在敲低细胞中MYC表达与HUWE1表达相对降低（图3c）。相应地，除XG-1 HUWE1突变细胞系外，BI8622和BI8626对HUWE1的抑制作用导致整个HUWE1野生型和突变细胞系以及患者来源的MM细胞中MYC表达降低。在没有HUWE1的情况下，MYC mRNA水平不会改变（补充图3a-b）），表明MYC在翻译后受HUWE1调控。泛素化试验表明，当抑制HUWE1时，MYC的K63减少和K48连接的多泛素化的增加（图3e；补充图3c），表明在没有HUWE1的情况下，MYC是蛋白酶体降解的目标。通过证明通过添加蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以在HUWE1抑制剂处理的细胞中挽救MYC蛋白表达，从而进一步证实了这一点（图3f）。
来自MM患者三环的代表性IHC：苏木精和曙红（左上方），CD138（右上方），HUWE1（左下方）和MYC（右下方）。b MM患者三环中核HUWE1和核MYC DAB染色的相关性（n = 20）；使用QuPath定量染色强度。相关系数和统计分析使用皮尔森检验确定。c用1μg/ ml强力霉素（dox）处理24、48和72小时后，表达shHUWE1-3的JJN3细胞中HUWE1和MYC蛋白表达。d在15μMBI8622或BI8626存在下培养24 h的一组HUWE1野生型（WT）细胞系，HUWE1突变细胞系和MM患者样品中，MYC蛋白表达；DMSO处理的细胞用作载体对照（VC）。È MYC泛素化以下HUWE1抑制。印迹的左侧显示了在15μMBI8622或BI8626（输入）存在下培养的MM.1S细胞中MYC的表达；印迹的右侧显示了使用UBIQAPTURE-Q泛素亲和力矩阵从输入裂解物中富集的泛素化MYC。在15μMBI8622或BI8626±3 h脉冲与20 nM硼替佐米一起培养6 h的MM.1S细胞中，f MYC表达。
为了进一步阐明HUWE1在MM中的功能，我们使用了Snapshot蛋白质组学来鉴定HUWE1的底物。该技术使用蛋白质微阵列作为底物平台检测全细胞裂解物中的泛素化反应。将微阵列与来自NTC或HUWE1敲低细胞的细胞裂解液一起孵育，并检测泛素链。从21,065个蛋白质中获得数据，其中2223个蛋白质 在泛素化方面显示出显着变化（p <0.05）（图4a；补充表1）。在积极的变化中号 -值表示推定HUWE1底物，而负中号-值代表泛素增加的蛋白质。在没有HUWE1的情况下，总共有1516个蛋白的泛素化统计降低。尽管某些较小的变化可能会在分析中表示噪音，但并未采用M值的下限，因为这些值也可以指示泛素化的轻微但高度可重复的修饰，例如链缩短或延长。HUWE1假定底物的基因本体论和独创性途径分析显示，代谢过程具有很强的富集性（图4b，c；补充图4a-c）。MM细胞在许多代谢途径中均显示出改变[ 27]，并且在没有HUWE1的情况下，来自糖酵解，谷氨酰胺分解和脂肪酸代谢等途径的蛋白质表现出修饰的泛素化（补充表2）。
a将蛋白质阵列与表达NTC或shHUWE1的JJN3细胞的细胞裂解液一起孵育，并使用串联泛素结合实体（TUBE）检测泛泛素链。该图表示在没有HUWE1的情况下蛋白质泛素化的显着变化（n = 2314），正值表示推定的底物；M值衡量变化的幅度。b假定的HUWE1底物丰富的顶级基因本体过程（生物过程）。c通过Ingenuity Pathway分析确定的推定的HUWE1底物富集的顶级网络。d用媒介物对照或15μMBI8622或BI8626培养的JJN3细胞的细胞内谷氨酰胺浓度；表示为车辆控制的百分比（n = 3）。e表达NTC shRNA或shHUWE1-3±1μg/ ml强力霉素（DOX）的JJN3细胞的细胞内谷氨酰胺浓度；表示为对照的百分比（n = 3）。使用配对t检验确定统计学显着性。* p ≤0.05，*** p ≤0.001。
由于已经证明谷氨酰胺的消耗会诱导MM特异性的MYC降解[ 28 ]，与我们对HUWE1抑制或敲低的发现相似，我们研究了谷氨酰胺丢失对MM细胞系对HUWE1抑制剂敏感性的影响。与以前的发现相比，我们显示了在没有L-谷氨酰胺的情况下培养的细胞MYC表达下降（补充图5a），并证明了这些细胞对HUWE1抑制的敏感性降低（补充图5b））。在耗尽HUWE1的细胞中未检测到主要谷氨酰胺转运蛋白（SLC1A5，SLC38A1和SLC38A2）的泛素化状态发生变化，但是，在与谷氨酰胺代谢有关的许多转运蛋白，酶和电化学梯度中，泛素化均发生了改变（补充表2）。我们证明在细胞内谷氨酰胺水平在MM细胞系中降低显著的抑制或HUWE1结果的敲低（p ≤0.012;图4D，E），这表明在谷氨酰胺有助于在不存在HUWE1的减小以MYC退化; 未来的研究旨在剖析这种现象背后的机理。
蛋白酶体抑制剂和IMiDs是MM治疗的关键组成部分。HUWE1抑制剂与卡非佐米的组合增强了任何一种药物的抗增殖作用，并且组合指数（CI）分析显示了一些协同的抗MM活性（图5a；补充图6a）。在所有测试剂量下，HUWE1抑制剂与IMiD来那度胺联合均可类似地增强任一药物的抗增殖作用，并与BI8622和BI8626均显示出强大的协同活性（图5b；补充图6b）。）。相应地，敲除HUWE1的JJN3细胞对来那度胺的敏感度明显高于其对照对应物，而对卡非佐米的敏感度没有变化（图5c，d）。HUWE1耗竭和来那度胺之间强协同作用的机制可能部分是由它们对MYC的联合作用介导的（图5e，f）。
将 MM.1S细胞用BI8622（7.5或15μM）或BI8626（7.5或15μM）加卡非佐米（2.5和5 nM）处理24小时，并分析其生存力。b MM.1S细胞用BI8622（7.5或15μM）或BI8626（7.5或15μM）加来那度胺（1或10μM）处理72小时，并分析存活率。a和b显示组合指数（CI）值，其中CI <1表示协同作用，1表示累加效果，> 1表示拮抗作用（n = 3）。c表达强力霉素诱导的shHUWE1-3或NTC shRNA的JJN3细胞对卡非佐米的剂量反应; dox处理后72 h，以3×10 5 / ml 接种细胞，用carfilzomib处理，并在24 h后分析存活力（n = 3）。d表达强力霉素诱导的shHUWE1-3或NTC shRNA的JJN3细胞对来那度胺的剂量反应; dox处理后72 h，将细胞以3×10 5 / ml 接种，并用来那度胺处理，再过72 h（n = 3）后进行活力分析。使用配对t检验确定统计学显着性。* p ≤0.05，*** p ≤0.001。È与BI8622或BI8626单独（15μM），来那度胺单独（10μM）处理的细胞中MM.1S MYC蛋白的表达，或二者的组合。F 在单独用强力霉素（1μg/ ml），单独来那度胺（10μM）或两者组合处理的表达强力霉素诱导的shHUWE1-3的JJN3细胞中，MYC蛋白表达。
当前可用的HUWE1抑制剂BI8622和BI8626的药代动力学特性不利于体内研究[ 16 ]，因此我们使用诱导型shRNA敲除JJN3细胞验证了HUWE1耗竭的体内效应。我们先前已经证明，JJN3细胞可在NSG小鼠中产生侵袭性的短期骨髓瘤模型，并且在注射肿瘤细胞后3周小鼠表现出发病迹象[ 29]]。将JJN3 NTC或JJN3 shHUWE1-3细胞注射入NSG小鼠中，并在注射肿瘤细胞后7天向饮用水中加入强力霉素，然后用来那度胺或溶媒处理小鼠，并继续监测2周。通过生物发光成像（p = 0.03）和肿瘤细胞百分率（p = 0.0006；图6a，b，d，e）测定，多西环素的添加在治疗后第13天显着消除了肿瘤的生长。类似的效果被视为单剂来那度胺（p ≤0.006;图6A，C-E ）。此外，与任一单独治疗相比，HUWE1基因敲低和来那度胺的组合显着降低了肿瘤负担（p = 0.03；图。6e）。CD138 / HUWE1和CD138 / MYC的免疫组织化学分析在体内验证了HUWE1的敲低，并证明在用强力霉素，来那度胺或两者组合治疗后的13天，MYC表达降低和肿瘤负荷降低（图6f）。
a通过生物发光成像（BLI）评估的肿瘤负荷的代表性图像：显示的是注射了用强力霉素处理的表达NTC shRNA或shHUWE1-3的JJN3细胞的小鼠的末期图像（治疗后13天；注射后21天） （1 mg / ml）和媒介对照或强力霉素和来那度胺（100 mg / kg）。b在强力霉素治疗后间隔13天，对注射了表达NTC shRNA或shHUWE1-3的JJN3细胞的小鼠的肿瘤负荷进行定量（通过BLI测量的总通量）。c在强力霉素加赋形剂或来那度胺治疗后间隔13天，对注射了表达NTC shRNA的JJN3细胞的小鼠的肿瘤负荷进行定量（通过BLI测量的总通量）。d晚期肿瘤负荷表示为通过BLI测量的总通量的倍数变化。e晚期肿瘤负荷表示为来自股骨骨髓潮红的人类白细胞抗原（HLA）阳性细胞的百分比。f每个治疗组股骨远端切片的代表性IHC图像用CD138 / HUWE1或CD138 / MYC双重染色（原始放大倍数×10）。n = 8只小鼠/组；数据表示为平均值±SEM；使用单向方差分析确定统计学显着性；* p ≤0.05，** p ≤0.01，*** p ≤0.001，**** p ≤0.0001。
HUWE1是一个大HECT结构域E3连接酶的宽范围的蛋白底物的催化泛素化，在许多细胞过程，包括细胞增殖，细胞凋亡，复制和DNA损伤反应[调控牵连它26，30，31，32 ] 。因此，HUWE1的失调与肿瘤发生有关就不足为奇了。HUWE1是否具有促肿瘤或抑癌活性是一个有争议的问题，似乎取决于细胞类型。HUWE1的过表达已在许多癌症中被发现，一项研究报告说HUWE1在9种肿瘤类型中的7种表达增加[ 33]。相应地，我们发现与健康浆细胞相比，HUWE1在恶性肿瘤中增加。HUWE1还可以通过突变在MM中失调[ 15 ]。我们鉴定了表达HUWE1突变的MM细胞系，其分布与患者中鉴定的突变相当。HUWE1突变体和野生型细胞系中的HUWE1表达和活性均相似。根据外显子组聚合协会（ExAC）收集的数据，HUWE1预计不能耐受功能丧失突变（pLI评分= 1）。在HUWE1突变发生在中等频率在癌症中[ 15 ]，但通常与X染色体连锁精神发育迟滞相关联，其中它们可以导致改变的或增强的活性[ 24，34]。HUWE1突变与患者和细胞系中的t（11; 14）的关联表明，它们在该亚组中可能具有功能意义，值得进一步研究。连同我们的观察结果和ExAC预测，很可能突变主要导致MM的功能改变，而不是完全丧失活性。HUWE1已经产生兴趣作为潜在的治疗靶标中的一些恶性肿瘤[的16，20，31，35，36，37]。在这项研究中，我们表明HUWE1的小分子抑制或敲低有效地降低了MM细胞的增殖，而不会影响健康的BM单核细胞的生存能力。重要的是，即使当细胞在BMSCs存在下生长时，也观察到增殖减少，这促进了MM细胞的生长和存活。此外，在积极的MM体内模型中，HUWE1的敲除显着降低了肿瘤负担，从而证实了其作为MM治疗靶点的潜力。由PI或IMiD组成的联合疗法构成了MM治疗方案的基础[ 38]。在这里，我们证明了HUWE1敲低或抑制与这两种类型的药物的协同活性。尤其是，HUWE1抑制和IMiD来那度胺的组合在体外和体内均导致肿瘤生长显着降低。考虑到在MM和其他恶性肿瘤中靶向HUWE1的潜力，目前正在努力产生具有改善的理化性质的HUWE1抑制剂。
MYC是HUWE1研究最广泛的底物之一，在MM中经常失调。通过HUWE1 MYC的调节是依赖于上下文，用证据支持K48-和K63连接的多泛素化既导致MYC的降解或激活，分别[ 17，39 ]。以前的研究调查HUWE1和MYC之间的关系已经证实HUWE1所需的正常B细胞稳态[ 40，41 ]，并通过其上MYC [效应调节B细胞成熟41 ]。此外，HUWE1的高表达已与MYC驱动的B细胞淋巴瘤特异性相关[ 20]。在这项研究中，我们探讨了HUWE1和MYC在MM（终末分化B细胞恶性肿瘤）中的关系。我们发现MM中的MYC和HUWE1蛋白表达之间呈正相关，并证明HUWE1耗竭导致K63泛素化降低并促进MYC的蛋白酶体降解。这与先前的报道HUWE1的MYC的K63泛素化[ 18 ]和证明HUWE1缺陷的鼠B细胞中MYC的表达减少一致[ 41 ]。相反，在结直肠癌模型中，HUWE1的抑制作用不会影响MYC的稳态水平，表明HUWE1对MYC的组织特异性调控[ 16]。结合先前的研究，我们的发现表明HUWE1对MYC的调节在正常B细胞和恶性B细胞的调节和存活中特别重要。
采用了泛素特异的蛋白质组学方法来揭示MM中HUWE1功能的基础机制。该分析鉴定出大量假定的HUWE1底物。与此相一致，结构的研究已经确定在HUWE1的构象灵活性，被预测为允许基板[的宽光谱的泛素化23，42 ]。具有不同的E3此外，HUWE1，与其它家族HECT E3连接酶常见的，可以合作来催化泛素化，从而进一步扩大靶底物[数量43，44，45]。出人意料的是，这些蛋白质的基因本体论和网络分析均显示出代谢过程的丰富性。迄今为止，仅有一项研究报道了HUWE1通过糖酵解酶己糖激酶2的K63连接泛素化在调节癌细胞代谢中的作用[ 35 ]。我们确定了许多其他代谢酶和转运蛋白作为HUWE1的潜在底物，这表明，在MM中，HUWE1可能对肿瘤代谢表现出更广泛的作用。改变的代谢有助于发病机理，获得性耐药性和免疫逃避中MM [ 46，47，48 ]。与正常浆细胞相比，MM细胞对糖酵解和谷氨酰胺分解的依赖性更高[ 27]。有趣的是，已证明抑制谷氨酰胺分解可诱导MM细胞特异性MYC降解[ 28 ]，这反映了HUWE1抑制作用。在缺少HUWE1的情况下，细胞内谷氨酰胺水平的降低表明，当HUWE1耗尽时，谷氨酰胺水平可能在MYC调节中起作用。但是，还需要其他研究来描述HUWE1在调节MM细胞代谢中的作用，特别是与MYC驱动的代谢途径有关。
总而言之，越来越多的证据表明HUWE1在肿瘤发病机制中的背景依赖性作用。我们的研究表明，在MM中，与其他B细胞类型一样，HUWE1在细胞增殖和MYC表达调节中起着至关重要的作用。此外，HUWE1的下调增强了标准护理疗法（尤其是来那度胺）的抗肿瘤活性，突显了在MM中靶向治疗HUWE1的希望。
HS-5、293T，MM.1S和ANBL-6细胞购自ATCC和OPM-2，U266细胞和JJN3细胞购自DSMZ。XG-1和XG-2细胞是法国INSERM的Catherine Pellat-Deceunynck博士的礼物。H1112和KMS-27细胞是亚利桑那州梅奥诊所的Leif Bergsagel教授的礼物。所有细胞系均根据提供者的说明进行维护。IL-6（2 ng / ml）补充了ANBL6.WT（野生型），ANBL6.BR（抗硼替佐米），XG-1和XG-2。在5 nM硼替佐米存在下培养ANBL6.BR细胞。常规测试细胞的支原体，并使用短串联重复序列分析（STR）进行鉴定，由Eurofins细胞系鉴定服务（Ebersberg，德国）进行。
MM患者的骨髓穿刺物和三叶草在道德上获得了北爱尔兰生物银行的批准（批准号NIB12-0061），并根据赫尔辛基宣言获得了知情同意。人BM单核细胞和玻片购自Stem Cell Technologies（英国剑桥）作为正常对照。CD138表达是浆细胞和MM细胞的标志。根据制造商的说明，使用AutoMACS系统（Miltenyi Biotech，德国）从原始样品中富集CD138 +细胞。
如先前所述[ 22 ]，从BM抽吸物中分离出MM BMSC 。MM细胞系或MM患者-BMSCs / HS-5基质细胞系单独或以1：5（BMSC / MM）的比例一起培养48小时，并根据制造商的CyQUANT细胞增殖测定法测量细胞增殖指示（Thermo Fisher）。
在15μMBI8622或BI8626存在下，在Methocult H4034 Optimum培养基（StemCell Technologies）中培养来自正常供体的单核细胞。2周后，使用光学显微镜对菌落计数。
从25例MM患者，3例不确定意义的单发性丙种球蛋白病（MGUS）患者和3例健康受试者中获得了骨髓白喉。将从每个FFPET嵌段上切下的连续系列切片切成多聚赖氨酸玻片，在二甲苯中脱蜡，然后通过分级酒精重新水化。使用微波炉在10 mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中进行热诱导的表位修复，并用0.3％H2O2的甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶活性。以下抗体用于IHC – CD138（MCA2459T，英国哈特福德郡，Bio-Rad），HUWE1（HPA002548，英国默克，费特姆），MYC（ab32072，Abcam，英国剑桥）和通用抗小鼠/抗-兔子（Vector实验室，英国彼得伯勒）。免疫反应性用ImmPACT DAB过氧化物酶底物（Vector Laboratories）观察，细胞核用苏木精复染。49 ]。
使用293T细胞，瞬时生产了编码SMARTvector诱导型人HUWE1 shRNA（Dharmacon，Chicago IL，美国）的病毒载体。转染后24 h，刷新培养基，培养基交换后24 h，收获培养上清液，过滤（0.45μm），补充聚丙烯，用于转导MM细胞系，或保存在-80°C下供以后使用。转导后进行FACS分析，以选择用1 µg / ml强力霉素（Merck）处理后表达TurboRFP报告基因的细胞。shRNA序列如下所示。用表达NTC shRNA的载体感染的细胞用作对照。
H1-ATCGAAAGAACGCAATGCT
H2-TTCGGCACAAATCTACTTC
H3 – TGGACGAATGCCTAGCTGG
细胞生存力和细胞凋亡，使用的CellTiter-GLO评估®和Caspase-GLO测定，分别为（Promega公司，英国南安普敦）。根据制造商的说明，使用CyQUANT（Thermo Fisher）评估增殖。根据制造商的说明，使用谷氨酰胺测定试剂盒（Abcam）测量细胞内谷氨酰胺浓度。
收获细胞，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，并使用碘化丙啶染色或EDU掺入分析细胞周期。对于碘化丙啶，将细胞固定在70％的乙醇中，然后用含有0.25 mg / ml RNase的50μg/ ml碘化丙啶溶液进行染色。对于EDU掺入，将细胞固定在2％甲醛中，并通过随后加入70％乙醇使其渗透。然后在检测EdU取代的DNA（EdU-DNA）之前，在含有0.05％Triton X-100的PBS中洗涤细胞。按照Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒（制造商的说明）（Thermo Fisher）进行EdU-DNA的检测。随后将大块DNA用DAPI染色。
如前所述使用抗HUWE1（ab70161，Abcam），c-MYC（ab32072，Abcam），GAPDH（ab181602，Abcam）和泛素（sc-8017，Santa Cruz，Heidelberg，Germany）的抗体和二抗进行免疫印迹反鼠标和反兔子（英国剑桥郡DAKO）。使用UbiQapture-Q（Enzo Life Sciences，Exeter，UK）分离泛素化的蛋白质，以结合单赖氨酸和聚泛素化的蛋白质，而与赖氨酸链连接或串联泛素结合实体（TUBE）抗体无关，这些抗体对K48或K63结合具有特异性（ UM607和UM604，生命传感器，美国马尔文），根据制造商的说明。保留一定比例（25μg）的总细胞裂解物以用作输入对照，并将250μg的剩余裂解物与适当的亲和基质结合以捕获泛素化的蛋白质。随后通过免疫印迹分析输入对照和从基质洗脱的蛋白质。使用WesternBright可视化印迹™ ECL辣根过氧化物酶底物（英国，Advansta），扫描到G：BOX凝胶doc系统（英国，剑桥，Syngene）中，并使用GeneTools分析。
用NTC shRNA或靶向HUWE1的shRNA转导JJN3细胞，并在转导后48小时选择0.5 µg / ml嘌呤霉素。选择后，收获细胞并在温和的细胞裂解缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 7.5、150 mM NaCl，1％NP-40、1％脱氧胆酸钠，10％甘油，1 mM PMSF）中裂解。将新鲜的裂解物运送到AVMBiomed（宾夕法尼亚州Pottstown），立即用于快照蛋白质组学（UMAP）中，以鉴定遍及约20,000种蛋白质的泛素化底物。简而言之，将HuProt蛋白微阵列与NTC细胞和HUWE1敲低细胞的裂解液在室温下平行孵育90分钟，然后将生物素标记的TUBE（Biotin TUBES2，Boston Biochem）用于检测整个阵列中的泛素链通过使用Alexa647共轭链霉亲和素进行可视化处理。用GenePix 4100A扫描仪（分子设备）扫描微阵列，并使用GenePix Pro（v7）软件对图像进行网格化和定量。利用中值强度（特征和局部背景），并计算信噪比。然后将值相对于每个阵列中的生物学对照标准化。重复特征（代表相同的蛋白质）通过平均值和标准偏差进行汇总。将这些值在阵列之间比较（WT HUWE1减去NTC），然后通过打印头和位置对Loess进行变换，以消除技术错误源，从而最终得出变化幅度的最终估计值（然后将值相对于每个阵列中的生物学对照标准化。重复特征（代表相同的蛋白质）通过平均值和标准偏差进行汇总。将这些值在阵列之间比较（WT HUWE1减去NTC），然后通过打印头和位置对Loess进行变换，以消除技术错误源，从而最终得出变化幅度的最终估计值（然后将值相对于每个阵列中的生物学对照标准化。重复特征（代表相同的蛋白质）通过平均值和标准偏差进行汇总。将这些值在阵列之间比较（WT HUWE1减去NTC），然后通过打印头和位置对Loess进行变换，以消除技术错误源，从而最终得出变化幅度的最终估计值（M值）。使用T检验（配对，有2个尾部）评估每个估计值的统计显着性（在M = 0的零假设下）。
所有动物实验均已严格遵守1986年《动物（科学程序）法》，并得到了谢菲尔德大学动物伦理委员会和英国内政部（PPL 70/8799）的批准。所有小鼠均分组饲养在单独的通风笼中，时间为12 h光/暗周期，并随意获得食物和水。 使用G * Power软件前瞻性地计算了小鼠数量（n = 8 /组）。结束阶段和体内分析是盲目的。
雌性7-9周龄的NOD SCID伽玛（NSG，NOD.Cg- PRKDC SCID 的II2rg tm1Wjl / SZJ）小鼠（Charles River实验室）随机分组并用10个静脉注射6表达shRNA的NTC人JJN3细胞（Ñ = 16）或shHUWE1-3（n = 16）通过尾静脉。1周后，给所有小鼠饮用水中的强力霉素（1mg / ml，在1％蔗糖中），然后用来那度胺（100mg / kg，5次/周）或溶媒（1％甲基纤维素）处理。使用IVIS Lumina II（Caliper Life Sciences）通过生物发光成像每周监测肿瘤负荷。治疗2周后处死所有小鼠。从左股骨冲洗出BM，并使用FACSCalibur（BD Biosciences）通过流式细胞术评估人白细胞抗原（HLA）阳性细胞，以测量肿瘤负荷。如上所述，将右股骨固定在10％福尔马林中，脱钙，包埋在石蜡中，并用CD138 / HUWE1或CD138 / MYC对3 µm纵切面进行双重染色。
在GraphPad Prisim 8中进行统计分析。使用单向方差分析或Student's t检验评估组之间的差异。相关系数通过皮尔森检验进行评估；对数秩检验用于生存分析。如图中的图例所示，数据表示为至少三个生物学重复的平均值±SD。
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