摘要
抗微生物细菌的出现对全球健康的威胁日益严重，因此有必要开发创新的抗微生物药物。在这里我们报告了一系列基于CRISPR-Cas13a的抗菌核衣壳的开发，称为CapsidCas13a（s），它们能够对碳青霉烯抗性大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行序列特异性杀伤通过识别相应的抗药性基因。CapsidCas13a构建体是通过将编程的CRISPR-Cas13a包装到噬菌体衣壳中产生的，从而靶向抗药性耐药基因。与当目标基因位于质粒上时缺乏细菌杀灭能力的基于Cas9的抗菌剂相反，CapsidCas13a在识别目标基因时无论其位置如何，都表现出强大的细菌杀灭活性。此外，我们还证明了CapsidCas13a（s）可用于通过细菌的基因特异性清除来检测细菌基因，而无需采用核酸操作和光学可视化设备。我们的数据强调了CapsidCas13a（s）作为抗微生物耐药细菌的治疗剂和用于检测细菌基因的非化学试剂的潜力。
几十年来，致病性细菌中抗菌素耐药性的出现和扩散已成为全球公众日益关注的问题1。根据美国疾病预防控制中心（CDC）最近关于抗菌素耐药性的报告，美国每年发生280万以上的抗菌素耐药性感染，结果导致35,000多人死亡2。还预计，如果不制定新的抗菌策略，到2050年，抗药性（AMR）病原体每年将导致1000万例死亡3。实际上，AMR细菌的出现已导致了后抗生素时代，在该时代，许多当前可用的抗菌剂不再有效。部分原因是抗生素创新能力下降，因为在> 45年内还没有针对革兰氏阴性细菌的新型抗生素得到开发，并且只有有限数量的抗生素处于II期或III期临床试验中4。因此，迫切需要新的策略以开发替代的治疗方法来预防AMR细菌的感染。
为此，最近开发了各种基于核酸的抗菌剂，肽，噬菌体疗法，抗体，细菌素和抗毒力化合物5。其中，CRISPR（聚簇的规则间隔的短回文重复序列）-Cas3和Cas9编码的噬菌体提供了一种通过选择性杀死AMR细菌6来对抗此类威胁的手段。所述CRISPR-CAS3和CRISPR-Cas9基因组编辑构建体，将其设计为靶向AMR基因，通过它们打包成噬菌体递送到细菌7，8，9，10，11，以实现AMR基因特异性细菌杀死7，8，9，10，11，12，并防止AMR基因的传播 7。但是，由于质粒DNA的DNA切割不会导致细菌死亡，至少在没有其他混杂变量（例如毒素-抗毒素系统）的情况下，不会导致细菌死亡，因此该策略无法有效地靶向带有质粒传播的AMR基因的细菌 9。
CRISPR-Cas13a是CRISPR-CAS VI型2级系统，其特征是RNA引导的单链RNA（ssRNA）的切割活性13，14。Abudayyeh等人的2016年研究。证明CRISPR-Cas13a具有混杂的ssRNA裂解活性并由于细菌RNA的降解而限制宿主细菌的生长（参考文献14）。事实证明，这是针对噬菌体的防御系统15。当噬菌体感染细菌时，CRISPR-Cas13a会识别噬菌体基因组的转录本，这会导致细菌转录本的非特异性降解并阻止细菌细胞的生长，从而阻止感染的扩散。最近，我们确定了CRISPR-Cas13a系统的四种不同的亚型从六个11株纤毛种类16。其中CRISPR-Cas13a形式的Leptotrichia shahii（LshCas13a）对细菌的生长具有显着的抑制作用，与Abudayyeh等人的观察一致。14。我们在这里报告了通过将LshCas13a包装到噬菌体衣壳中成功开发序列特异性抗菌剂的情况，该噬菌体既可以用作抗AMR细菌感染的治疗剂，也可以用作检测细菌基因以进行诊断的非化学剂。
首先，我们通过使用在染色体或质粒上带有碳青霉烯抗性基因bla IMP-1的大肠杆菌，验证了CRISPR-Cas13a（LshCas13a）与CRISPR-Cas9相比的生长抑制能力。为此，我们构建了两个带有CRISPR-Cas13a或CRISPR-Cas9的质粒（pKLC21和pKLC54），该质粒带有靶向bla IMP-1的间隔子（优化了间隔序列，请参阅下文），并将它们分别引入大肠杆菌以测试它们对携带bla IMP-1的宿主细胞的生长抑制作用（图 1a）。正如预期的那样，针对bla IMP-1的LshCas13a相对于在染色体（从2.6×10 10到2.0×10 8 CFU / ml）和质粒（从2.3×10 10到8.7×10 ）携带bla IMP-1的细菌，细菌数量减少了两到三个数量级6 CFU / ml）。然而，相对于仅在染色体上携带bla IMP-1的细菌（从6.3×10 10到3.6×10 7 CFU / ml），CRISPR-Cas9的细菌数量减少了三个数量级，而在质粒上则没有。从2.8×10 10到2.2×10 10 CFU / ml），与其各自的非靶向对照相比（图 1b，c）。这些结果与以下事实相吻合：尽管CRISPR-Cas9通过双链DNA断裂导致细胞死亡，但CRISPR-Cas13a通过RNA的非特异性切割诱导细胞休眠（参考文献14）。但是，尚不清楚上述Cas13a引起的细胞数目减少是否是由于细胞死亡引起的。
一个 CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas9改造与靶向的示意图BLA IMP-1到BLA IMP-1 -表达大肠杆菌 STBL3。b 制备了从质粒（质体传播的bla IMP-1）和染色体（染色体传播的bla IMP-1）表达bla IMP-1的大肠杆菌 STBL3 ，并用CRISPR-Cas13a或CRISPR-Cas9进行了转化，均带有间隔子靶向bla IMP-1或没有垫片（非定位）。将得到的转化体接种在含有卡那霉素（Km）的LB平板上，以测试CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas9对序列特异性细菌的杀灭作用。Km用于维持质粒。c计算在实验b中获得的平板上的细菌数。统计显着性由两面Student's t检验确定。每个条形代表具有标准偏差的平均值（n = 3）。d测试CRISPR-Cas13a依赖性细胞生长抑制作用的实验示意图。脱水四环素（aTc）诱导的bla IMP-1-或rfp-表达质粒（pKLC56）与表达CRISPR-Cas13a的pKLC21质粒与靶向bla IMP-1或rfp的间隔子共转化到大肠杆菌 STBL3中。然后培养所得的转化体，并在指定的时间点在抗生素Km和Cm（用于维持质粒的Km和Cm）存在下进行aTc诱导。此后，每小时测量OD值。e绘制生长曲线。增长曲线的每一条线代表具有标准偏差的平均值。f计数活细胞的数目以计算由靶向bla IMP-1的 CRISPR-Cas13a 引起的细胞死亡比例。准备的细菌培养物将d稀释至1/100，然后加入aTc以诱导bla IMP-1。还添加了Km和Cm来维持CRISPR-Cas13a和aTc诱导的bla IMP-1质粒。此后，在指定的时间点对细菌培养物取样，并在新鲜的LB平板上计数存活细菌的数量。每个条形代表四个生物学重复的平均值和标准差。p值由双面学生t检验确定。源数据在源数据文件中可用。
为了确定Cas13a是否引起细胞死亡，我们按照Abudayyeh等人的方法构建了一个系统，在该系统中，从质粒转录的靶向红色荧光蛋白（RFP）的CRISPR-Cas13a抑制具有RFP的细菌的生长。14。我们通过将脱水四环素（aTc）诱导型RFP质粒（pKLC56- rfp）以及靶向RFP的LshCas13a（Cas13a_rfp）引入大肠杆菌，在使用LshCas13a的肉汤培养基中进行了实验（图 1d），其中与Abudayyeh等人使用的间隔序列相同。用于定位rfp（参考14）。我们观察到与非靶标对照和非诱导对照相比，LshCas13a在诱导靶rfp转录后受到类似的细胞生长限制（图 1e，左图和中图）。有趣的是，当使用bla IMP-1作为靶基因进行相同的实验时，细菌生长曲线在bla IMP-1转录诱导后停止上升（图 1e，右图），表明细胞生长可能由于细胞死亡或休眠。为了清楚地说明这一点，在培养过程中在有或没有aTc诱导bla的情况下，对携带bla IMP-1靶向间隔子的活细胞进行计数IMP-1转录。如图1f所示 ，在bla IMP-1转录诱导后的8小时内，活细胞的数量从5.5×10 6减少到8.8×10 3个数量级，减少了大约三个数量级。我们将这些结果解释为证明了CRISPR-Cas13a介导的宿主细胞序列特异性杀伤。然而，目前尚不清楚休眠15或对CRISPR-Cas13a具有抗性的活细胞的原因，但在对上述两个实验的32个随机选择的菌落进行测序后，我们没有在靶序列中发现任何突变（图 1b））。我们还观察到了bla IMP-1的诱导转录抑制了宿主细胞的生长（图 1e，右图），这可能归因于bla IMP-1过表达的适应性成本。众所周知的是碳青霉烯酶的累积损害了细菌的生长17，18。
在验证了CRISPR-Cas13a_ bla IMP-1构建体对bla IMP-1阳性细菌的杀菌活性之后，我们想到了可以通过将CRISPR-Cas13a系统加载到噬菌体中来合成AMR细菌特异性CapsidCas13a构建体的想法。衣壳。所述CRISPR-Cas13a_ BLA IMP-1装载到大肠杆菌噬菌体M13的衣壳，以产生EC-CapsidCas13a_ BLA IMP-1 （图 2A），其表现出对细菌的序列特异性杀伤活性携带BLA IMP-1基因在的EC-CapsidCas13a_ BLA IMP-1浓度依赖性（图 2b）。随后，我们证实了一系列CapsidCas13a构建体具有相同的序列特异性杀伤活性，这些构建体被编程为靶向不同基因型的碳青霉烯耐药基因（bla IMP-1，bla OXA-48，bla VIM-2，bla NDM-1和bla KPC-2）和大肠菌素抗性基因（mcr -1和mcr -2），所有这些目前在临床上都是一个问题（图 2c，补充图 1））。相反，在任何情况下，非靶向CapsidCas13a（具有非靶向间隔子）都不会杀死细菌，这表明该构建体对针对AMR细菌感染的基因定向抗菌治疗具有强大的特异性。
一个描述CapsidCas13a作用方式的图形概念模型，其中将bla IMP-1靶向CRISPR-Cas13a包装到大肠杆菌 M13噬菌体衣壳（EC-CapsidCas13a- bla IMP-1）中，以便在正常过程中递送到宿主细菌细胞中病毒感染。在存在靶基因（携带bla IMP-1的大肠杆菌）的情况下，CRISPR-Cas13a将被激活，随后的非序列特异性RNase活性将导致宿主细胞死亡。在没有靶基因的情况下（没有bla IMP-1的大肠杆菌），CRISPR-Cas13a不会被激活，也不会再有细胞死亡。b- d上的细菌菌苔与所生成的CapsidCas13a（一个或多个）点测定大肠杆菌 NEB5αF' 我q测试杀菌活性。斑点区域的清晰裂解区代表细菌的杀死。NEB5αF' 我q携带BLA IMP-1的表达载体和空载体（对照）感染的EC-CapsidCas13a-的十倍系列稀释液BLA IMP-1在L-阿拉伯糖的存在或不存在用于诱导BLA IMP-1的表达（b）; CapsidCas13a（s）被编程为靶向不同的碳青霉烯耐药基因（bla IMP-1，bla OXA-48，BLA VIM-2 ，BLA NDM-1 ，和BLA KPC-2 ）和粘菌素抗性基因（MCR-1和MCR-2 ）点上的一系列NEB5αF'的余q菌株表达每种抗性基因（Ç）; CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas13a杀菌活性的比较。非靶向和BLA NDM-1靶向CapsidCas13a和CapsidCas9，在十倍系列稀释液，点样在NEB5αF'的草坪我q有或没有表达BLA NDM-1在质粒或染色体（d）。所有测定重复三次。
为了CapsidCas13a的特性与先前报告的基于Cas9-抗菌剂比较，我们产生一个基于Cas9-EC-CapsidCas9_ BLA NDM-1构建体具有相同的协议，但在这种情况下CRISPR-Cas13a_ BLA NDM-1被替换CRISPR-Cas9_ BLA NDM-1和其杀菌的方式与EC-CapsidCas13a_相比BLA NDM-1。正如所料，EC-CapsidCas9_ BLA NDM-1只能杀死细菌与染色体靶基因，而EC-CapsidCas13a_ BLA NDM-1捕杀了携带任一所述染色体或质粒（图上的目标基因的细菌。 2D）。由于许多临床上重要的AMR的基因，包括在肠杆菌科细菌中发现耐碳青霉烯类基因在质粒上编码的19，20，CapsidCas13a预计是优于CapsidCas9在光的杀伤效率。此外，以往的研究表明，CRISPR-Cas9容易发生意外的基因突变，由于其DNA裂解活性21，22，23。相反，CapsidCas13a不是直接切割DNA，而是靶向细菌mRNA。因此，由于Cas13a的作用，细菌的意料不到的基因突变不太可能发生。尽管需要进行深入的研究，但至少如上所述，通过对32个Cas13a抗性菌落进行测序，我们没有在靶基因中发现任何突变。这些特性表明，与Cas9相比，Cas13a作为抗菌剂具有不同的潜力。
为了确定所述CapsidCas13a（多个）是否能选择性地杀死细菌AMR，的人造混合物的混合群中靶细菌大肠杆菌 NEB5αF' 我q表达质粒携带的碳青霉烯抗性基因BLA IMP-1中，粘菌素抗性基因MCR-2 ，或与没有抗性基因作为对照，与每个基因特异性EC-CapsidCas13a构建体的单剂量（即，EC-CapsidCas13a_处理BLA IMP-1靶向BLA IMP-1 ，和EC- CapsidCas13a_ mcr-2（用于定位mcr-2）。随后，确定每种细菌菌株的丰度。如图。 3，NEB5α的F细胞数量的“百分比我q（BLA IMP-1 ）和NEB5αF' 我q（MCR-2 ）显著从30.5％和35.0％分别细胞混合物时减少到3.5％和1.9％，用EC-CapsidCas13a_ bla IMP-1和EC-CapsidCas13a_ mcr-2治疗， 分别。同时，经非靶向间隔子对照的EC-CapsidCas13a处理后，细胞群体的丰度没有变化。CapsidCas13a的这些序列特异性杀伤活性证明了它们作为微生物控制剂的潜力，可以通过杀灭具有特定基因组含量的细菌来修饰或操纵细菌菌群而不影响不希望的细菌种群。除了展示CapsidCas13a的多功能性之外，我们还使用了圆顶蜜蜂幼虫感染模型研究了其体内治疗效果。EC-CapsidCas13a_的管理BLA IMP-1至螟感染的幼虫大肠杆菌 R10-61表达BLA IMP-1与未治疗（p = 0.0016）或带有非靶向间隔子的CapsidCas13a作为对照（p = 0.044）相比，PPAR的生存率明显提高（图 4）。该结果进一步增强了CapsidCas13a构建体用于治疗AMR细菌感染的治疗前景。
程序化的CapsidCas13a改变了细菌种群的组成。混合细胞群是通过混合制备大肠杆菌 'NEB5α˚F 我q与NEB5α的F相等数量（对照）“ 我q表达BLA IMP-1和MCR-2 ，分别。然后分别用bla IMP-1靶向，mcr-2靶向和非靶向CapsidCas13a 处理细胞混合物。请注意，每个靶向AMR基因的CapsidCas13a都会减少相应的靶细胞群。百分比代表三个生物学重复的平均值。源数据在源数据文件中可用。
使用马尼拉回廊（Galleria mellonella）感染模型检查EC-CapsidCas13a- bla IMP-1的治疗效果。EC-CapsidCas13a-施用BLA IMP-1（MOI 100）到蜡螟感染R10-61（的碳青霉烯抗性临床分离物的幼虫大肠杆菌携带BLA IMP-1显著改进的宿主存活）与对照组相比，EC-非靶向的CapsidCas13a（p = 0.044）和磷酸盐缓冲液（PBS; p = 0.0016）。两组感染R10-61并用EC-CapsidCas13a-nontargeting和PBS处理的组之间的p值为0.30。该p-值通过对数秩检验计算。结果表示为每组使用十只幼虫进行的三个独立实验的合计值。源数据在源数据文件中可用。
由于隐形细菌（携带AMR基因，但不能通过现有的抗生素敏感性试验确定）的流行率正在增加24，因此在临床环境中需要一种简便易用的此类菌株检测方法。为此，修改了CapsidCas13a构建体以检测细菌AMR基因。首先，EC-CapsidCas13a_的间隔序列BLA IMP-1靶向BLA IMP-1基因，以提高杀伤效率最优化。优化始于构建CRISPR-Cas13a表达质粒文库，其中121个间隔子序列靶向整个bla IMP-1的不同位置分别作为一个插入CRISPR阵列。然后，将所有质粒分别转化到表达bla IMP-1的大肠杆菌细胞中，并对所得转化体进行分析，以鉴定最有效的间隔区序列（补充图 2a）。对从转化子中提取的总质粒DNA进行深度测序后，对间隔子读数的计算发现，所有测试的间隔子序列至少在一定程度上可通过质粒的消耗率来介导靶标特异性细菌的杀灭。 DNA（补充图 2b）。通过归一化表达bla IMP-1的细胞的读取次数来计算耗竭率与非的血乳酸IMP-1 - -表达。其中，13个间隔序列的耗竭率大于99.0（补充图 2c）。具有最高消耗率99.7 的bla IMP-1 _563间隔序列GACTTTGGCCAAGCTTCTATATTTGCGT被选作最佳间隔序列，用于后续实验（补充图 2c，补充表 4）。然后，将载体M13噬菌体用溶原噬菌体Φ80用于与噬菌体诱导染色体岛（PICI）包装系统中使用的替换（补充图 3）25，26，在基因组操作上更加灵活。最后，卡那霉素（KM）抗性基因（的KanR）插入作为选择标记，以产生基于PICI-EC-CapsidCas13a :: KanR_的构建体BLA IMP-1和EC-CapsidCas13a :: KanR_nontargeting作为非靶向间隔控制（图。 5A）。
一个生成的基于PICI-EC-CapsidCas13a靶向的示意图BLA IMP-1 。丝裂霉素C的诱导促进了带有CRISPR-Cas13a系统和卡那霉素（Km）抗性基因的PICImid的包装进入辅助噬菌体Φ80的衣壳。b – d在LB琼脂平板上进行了基于PICI的EC-CapsidCas13a :: KanR - bla IMP-1（十倍系列稀释）对大肠杆菌 MC1061的杀菌活性测试（有或没有目标基因的表达）（b） ; 通过观察补充Km（c的 LB底琼脂平板上细菌的生长来判断试验结果。），或在无毒品的LB底部琼脂平板上观察细胞裂解（d）；注意前一种方法对携带靶基因的细菌的敏感性提高了约三个数量级。e – j基于PICI的EC-CapsidCas13a可用于检测各种碳青霉烯抗性基因（bla IMP-1，bla OXA-48和bla VIM-2），无论它们在质粒或染色体上的位置如何（e，f），而EC-CapsidCas9可以检测位于染色体上但不在质粒上的基因（g）; 基于PICI的EC-CapsidCas13a还可以有效检测毒素编码基因（h），区分位于同一质粒（i）上的不同基因，并且还可以用于已验证的临床分离株（j，左图）通过PCR（j，右图）。ķ SA-CapsidCas13a :: TetR- mecA基因产生通过封装mecA基因靶向CRISPR-Cas13a入衣壳金黄色葡萄球菌噬菌体80α展出mecA基因特异性的杀菌抗MRSA活性的，但不是金黄色葡萄球菌菌株中缺陷的mecA基因。所有测定重复三次。凝胶的未裁剪图像可在补充信息中找到。
接下来，我们通过将2 µL十倍系列稀释的EC-CapsidCas13a :: KanR_ bla IMP-1和EC-CapsidCas13a :: KanR_non定位到测试菌株的新鲜琼脂草坪上，测试了bla IMP-1的构建体检测效率在Luria-Bertani（LB）琼脂中添加或不添加Km的情况（图 5b）。为了提高效率，我们选择确定针对Km板上的抗Km细胞的细菌杀灭作用（图 5c），而不是评估针对无Km板上的原始细胞的细菌杀灭作用（图 5d）。当EC-CapsidCas13a :: KanR_ bla IMP-1携带Km抗性基因的细菌被应用于生长在含有Km的底部琼脂上的软琼脂细菌草坪上，被该衣壳感染的细胞获得了Km抗性，因此可以在Km存在下生长。然而，对于带有靶标AMR基因bla IMP-1的细菌细胞，由于CRISPR-Cas13a构建体的杀菌作用，没有可观察到的生长（图 5c）。与在无Km平板上直接观察细菌生长抑制作用相比，该方法的灵敏度要高出将近三个数量级（图 5d）。通过使用基于M13衣壳的EC-CapsidM13Cas13a :: KanR_ bla IMP-1构建体，我们进一步证实了该系统的效率（补充图。 4a–c）。随后的实验表明，可以预期地准确检测到位于质粒或染色体上的目标AMR目标基因（图 5e，f，补充图 4d，e），而CRISPR-Cas9构建体只能检测到该基因位于染色体上而不位于质粒上（图 5g）。靶向其他AMR基因bla OXA-48和bla VIM-2（图 5e，f），毒素基因stx 1和stx 2（图5h）以及两个基因（bla IMP）的CapsidCas13a构建体进一步证实了其检测能力。 -1和mcr-2）位于同一质粒上（图 5i），表明该方法可用于检测任何细菌基因，无论它们在细菌染色体或质粒上的位置如何。尽管灵敏度稍低，但甚至可以通过直接将CapsidCas13a点样到琼脂平板上擦拭的细菌上来检测目标基因，而不是使用软琼脂覆盖法（补充图 5）。
我们还尝试将CapsidCas13a构建体用于检测带有bla IMP-1或bla NDM-1的大肠杆菌的耐碳青霉烯类临床分离株。由于这些菌株对Km不敏感，因此用潮霉素（Hygro）抗性基因HygroR替换了EC-CapsidCas13a :: KanR的KanR，以生成EC-CapsidCas13a :: HygroR_ bla IMP-1和EC-CapsidCas13a的构建体： ：HygroR_ bla NDM-1。这两个CapsidCas13a的测试结果表明，带有bla IMP-1和bla NDM-1的大肠杆菌临床分离株精确检测到，与聚合酶链反应（PCR）分析的结果一致（图 5j，补充图 5d），表明CapsidCas13a（s）可用于检测细菌基因。关于CRISPR-Cas13a的应用潜力，我们以上证明的数据开辟了一个新领域，不仅可以将其开发为抗菌治疗剂，而且还可以开发为无需核酸操作的新型细菌鉴定系统。一旦CapsidCas13a建立。关于基于CRISPR-Cas13的核酸检测方法（称为SHERLOCK系统）的优美报道，该方法是通过核酸扩增技术和CRISPR-Cas13的结合开发的。这种方法可以在体外检测DNA或RNA的摩尔浓度，灵敏度27。相反，提出的使用CapsidCas13a构建体的检测系统无需进行DNA或RNA扩增，电泳设备或光学设备即可进行，因为只需要细菌培养板即可。此外，每升宿主细菌培养物可收获大于10 10 个 CapsidCas13a转导形成单位（TFU），只有2-3 µL 10 5单点检测需要每毫升溶液中含有1个构建体，以准确确定目标基因的存在与否。尽管这些功能彰显了CapsidCas13a在细菌基因检测方面的巨大潜力，但仍然存在局限性，至少：（1）必须为每种细菌种类和基因构建相应的CapsidCas13a，（2）测试结果的周转时间由于对结果的解释取决于细菌的生长，因此可能会很长。（3）当细菌无法培养或目标基因未转录时，不能使用该结果。
最后，除了展示CRISPR-Cas13a对革兰氏阴性菌的杀菌活性外，我们还尝试使用金黄色葡萄球菌来确认CRISPR-Cas13a对革兰氏阳性菌的附带活性。首先，一组大肠杆菌。产生带有CRISPR-Cas13a构建体且带有或不带有靶向S的间隔序列的金黄色葡萄球穿梭载体，即pKLC4 。金黄色葡萄球菌的rpsE基因。将该载体转化为金黄色葡萄球菌菌株RN4220表明具有适当间隔区序列的CRISPR-Cas13a的杀菌活性与大肠杆菌中的相似（补充图 6a）。然后，一个SA-CapsidCas13a_生产的mecA构建体可靶向耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）的耐甲氧西林的基因mecA，这是全球最普遍的AMR病原体之一28。我们优化了间隔序列（补充图 6B-E ）和CRISPR-Cas13a_ mecA基因 -carrying矢量（pKLC-SP_ mecA基因）结构以相同的方式进行了如上文对CRISPR-Cas13a_ BLA IMP-1 。CRISPR-Cas13a_的填充mecA基因到金黄色葡萄球菌噬菌体80α衣壳根据由乌韦达等人建立的方法进行。使用金黄色葡萄球菌致病岛（SaPI）系统29，30（补充图 7）。该包装系统同时对所得的SA-CapsidCas13a :: TetR_ mecA构建体赋予四环素（Tet）耐药性，因为SaPI带有Tet耐药基因，这使得可以通过抗MRSA的杀菌能力和MRSA检测能力进行测试定位 mecA。正如所预期的，当甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌菌株RN4220和MRSA USA300或 mecA基因敲除USA300（USA300-Δ mecA基因）感染了SA-CapsidCas13a_ mecA基因，只有USA300菌株携带的生长 mecA基因被显著抑制（图 5k，补充图 8），清楚地证明了CRISPR-Cas13a对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的序列特异性细菌杀伤能力。
在这项研究中，我们通过CRISPR-RNA（crRNA）识别靶标RNA来利用CRISPR-Cas13a的混杂RNA裂解能力，从而导致宿主细胞死亡，从而产生一种新型的序列特异性细菌抗微生物剂。为了将CRISPR-Cas13a递送至靶细菌，我们使用针对大肠杆菌的PICI包装系统和针对金黄色葡萄球菌的 SaPI包装系统将CRISPR-Cas13a包装到了载体噬菌体衣壳中。。由于合成的CapsidCas13a不携带噬菌体基因组，因此它属于核酸药物或基因药物的类别，而不是生物体的类别，从而易于作为治疗药物投入实际应用。虽然仍有许多问题要涉及实际应用，如噬菌体衣壳的宿主范围，Cas13a（裁判的催化方式来回答。14，15），噬菌体衣壳包装的效率以及有关基因重组的伦理问题等。我们的策略表明，CapsidCas13a抗菌剂有望在至少三个应用类别中开发：（1）作为针对任何细菌基因的有前途的抗菌治疗剂，包括AMR基因，或选择性地杀死靶向毒素的细菌，（2）作为一种简单而廉价的细菌基因检测系统，可用于细菌鉴定和有效的分子流行病学研究，而无需扩增核酸或光学器件，（3）作为通过靶向和消除特定细菌种群而不破坏其他无关细菌种群来操纵细菌菌群的工具。结论，
吉吉医科大学伦理委员会批准了无脊椎动物的使用伦理。
本研究中使用的细菌菌株列于补充表 1中。细菌菌株在LB培养基（BD Difco）中于37°C生长。除非另有说明，否则将适当的抗生素添加到生长培养基中，使其达到以下最终浓度：氨苄西林（Amp）为100 µg / mL，Km为30 µg / mL，氯霉素（Cm）为34 µg / mL，大肠菌素为4 µg / mL ，Hygro浓度为200 µg / mL。
张峰博士（Addgene质粒＃79152; http://n2t.net/addgene：79152 ; RRID：Addgene_79152）14提供了CRISPR-Cas13a表达载体（pC003），该载体在pACYC184上带有LshC2c2基因座。为了产生携带针对各种基因的CRISPR-Cas13a系统的高效载体系列，我们进行了载体操作。首先，使用LsCas13a clo-f和LsCas13a clo-r的引物对，从沙希氏菌菌株JCM16776（参考文献14）扩增cas13a-cas1-cas2基因座的DNA片段（补充表 3）。），并使用引物pC003 PCR-r和pC003 PCR-f扩增了pC003载体的另一个DNA片段。然后将两个DNA片段与In-Fusion HD克隆试剂盒（日本Takara Bio Inc.）连接以生成pKLC5，从而将pC003的cas13a-cas1-cas2基因座替换为JCM16776。接下来，cas1-cas2由于Cas1 / 2对于CRISPR-Cas13a的杀菌活性不是必需的，因此从pKLC5中除去了基因座。这是通过使用Cas1 Cas2 del SacI-f和Cas1 Cas2 del SacI-r的引物对pKLC5进行PCR，用SacI（日本Takara Bio Inc.）消化PCR片段并再次用高Ligation连接来实现的。2（日本东洋纺株式会社）生成pKLC5ΔCas1/ 2。此后，为了使pKLC5ΔCas1/ 2能够包装到M13噬菌体衣壳中，如下插入了f1起源和KanR：从pRC319扩增出f1起源和KanR，这是Timothy Lu的礼物（Addgene质粒＃ 61272; http://n2t.net/addgene：61272 ; RRID：Addgene_61272）9使用InF13 pRC319-f和InF13 pRC319-r的引物组，以及InF13 PCR SalI-f和InF13 PCR SmaI-r的另一个引物组，从pKLC5ΔCas1/ 2载体扩增载体部分。然后将所得的两个DNA片段与In-Fusion HD克隆试剂盒连接，以产生带有完整CRISPR-Cas13a系统的pKLC21，除了将克隆位点留空以插入任何合适的间隔子外。pKLC21携带M13噬菌体的f1来源，因此能够与M13噬菌体相互作用。最后，在pKLC21载体上构建了靶向碳青霉烯抗性基因bla IMP-1的CRISPR-Cas13a系统，方法如下：简单地说，33 mer寡核苷酸DNA（28 mer间隔子和5 mer用于插入Bsa）我切割了blaIMP-1_104-s和blaIMP-1_104-as的位点，对应于来自编号Im的bla IMP-1的核苷酸位置。104至否 合成132个样品，并在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），50 mM NaCl和1 mM EDTA）中退火。之后，用限制酶Bsa I-HF 处理pKLC21 ，凝胶纯化，随后使用Ligation high ver。连接到退火的寡核苷酸DNA。2，以获得pKLC21_ BLA IMP-1 _104。同样，针对其他对碳青霉烯耐药基因（bla NDM-1，bla KPC-2，bla OXA-48和bla VIM-2）的pKLC21载体，大肠杆菌素耐药基因（mcr-1和MCR -2），mecA基因，rpsE，和ERMC的金黄色葡萄球菌被生产。所述BLA IMP-1靶向覆盖的整个序列pKLC21载体文库BLA IMP-1还构建以相同的方式，由此121不同寡聚DNA覆盖整个对BLA IMP-1分别插入BSA pKLC21的I位点。补充表3中列出了所有使用的寡核苷酸DNA的序列 。除了pKLC21载体系列，金黄色葡萄球菌 – 大肠杆菌还构建了携带CRISPR-Cas13a的穿梭载体（pKLC3.0）。用于组件pKLC3.0，三个DNA片段，的KanR（APHA-3 ）和ORI的大肠杆菌，猫和P15A ORI 金黄色葡萄球菌，和cas13a从pHel3-FLAG扩增（参考文献31），pDB114（分别由Luciano Marraffini博士提供）10和pKLC21，使用以下引物组（补充表 3））：InF 3.0 KanR-f和InF 3.0 KanR-r；InF 3.0 SArep_CAT-f和InF 3.0 SArep_CAT-r; InF 3.0 p15A ori_Cas13-f和InF 3.0 p15A ori_Cas13-r。将所得的三个片段与融合高清克隆试剂盒连接以产生pKLC3.0。对于PICImid（带有PICI包装系统的质粒）的构建，克隆了岛EcCICFT073的包装所必需的 cos N和 rppA基因（参考资料25）。这些用InFpi araCosPPi NotI1-f和InFpi araCosPPi NotI1-r的引物组扩增。用NotI（日本Takara Bio Inc.）消化得到的片段，随后将其克隆到pKLC21的NotI位点中以产生PICImid pKLC31。构建CRISPR-Cas9表达载体，pYS29载体32被PstI消化。将含有CRISPR-Cas9的片段与pKLC21的PCR片段连接，该pKLC21的PCR片段使用引物对InF54 pKLC21 PCR-f和InF54 pKLC21 PCR-r扩增以产生pKLC54。对间隔序列BLA IMP-1插入pKLC54矢量的BSAI位点，得到pKLC54_ BLA IMP-1使用Ligation High版本_560。2.用于间隔区构建的寡DNA列在补充表 3中。
我们构建了载体pKLC-SP_ mecA，该载体带有CRISPR-Cas13a_ mecA序列，两侧是来自金黄色葡萄球菌SaPIbov2的bap（编码生物膜相关蛋白）的bap的两个同源重组区– 大肠杆菌载体pIMAY。的5'和3'区的两个PCR片段BAP上SaPIbov2首先从扩增金黄色葡萄球菌菌株RN4220-80α-Δ TER值 -SaPIbov2 :: tetM（参考文献29，33）。BAPup 7272-F和BAPup 8172-R引物用于bap 5'区的PCR扩增基因，而引物BAPdown 12224-F和BAPdown 13089-R用于扩增3'区。然后使用In-Fusion HD Cloning Kit产生pIMAY- bap Up / Down ，将与载体末端同源的具有15 bp侧翼序列的两个片段顺序整合到温度敏感质粒pIMAY中。同时，我们使用pKLC21_ mecA -5作为模板，以间隔物靶向mecA和没有间隔物靶向mecA的CRISPR-Cas13a系统（CRISPR-Cas13a_nontargeting）扩增CRISPR-Cas13a_ mecA。用LsC2c2 mecA5-F和LsC2c2 mecA5-R引物对进行PCR扩增以获得CRISPR-Cas13a_ mecA，LsC2c2 mecA5-F和LsC2c2 188-R获得CRISPR-Cas13a_nontargeting（对照）。最后，我们分别插入的5'和3'的区域之间的PCR产物BAP上pIMAY- BAP向上/向下与IN-FUSION HD克隆试剂盒，以产生pKLC-SP_ mecA基因和pKLC-SP_null（对照）。
我们构建了两个用于表达CRISPR-Cas13a系统靶基因的质粒系统：一个pSP72 aTc诱导型载体，其中用于靶基因表达的克隆位点在aTc的控制下；不包含来自M13噬菌体的f1复制起点的pKLC26。为了构建pSP72，首先使用TetReg SalI-f和TetReg BamHI-r引物从pC008载体中扩增aTc调控元件，并用限制酶SalI和BamHI消化扩增子。消化后，将片段插入带有pBR322来源的pSP72载体（美国Promega Corporation）的SalI–BamHI位点。由于用于表达靶基因的克隆位点（BamHI / EcoRI）受aTc诱导型启动子调控，因此将所得质粒称为pSP72 aTc诱导型载体。
pC008（具有Tet诱导RFP的pBR322）是张锋的礼物（Addgene质粒＃79157；http：//n2t.net/addgene：79157； RRID：Addgene_79157）14。通过克隆AMR基因（例如，bla IMP-1，bla NDM-1，bla KPC-2，bla OXA-48和bla VIM-2），产生了一组表达CRISPR-Cas13a靶基因的载体）在产生的质粒的BamHI / EcoRI位点上。通过用缺失f1原点和ARA启动子的方式修饰pBAD33来构建pKLC26。首先，用两个引物pBAD33 PCR XhoI-f和pBAD33 PCR XhoI-r扩增pBAD33载体，这些引物被设计为排除f1起源。用限制酶XhoI消化后，将片段与Ligation high ver。2产生pKLC23。然后，pKLC23载体和bla IMP-1天然启动子序列（GENEWIZ人工合成的GenBank ID：AB733642.1的1,716-1,168 bp）分别用两个引物对分别扩增，分别是pKLC23 PCR InFusion-f2和pKLC23 PCR InFusion-r2，InFusion-f和Intl1pro InFusion-r，分别。最终得到的两个片段与融合高清克隆试剂盒的结合最终产生了pKLC26载体，该载体带有bla IMP-1天然启动子来替代ARA启动子。
为了获得pKLC26_ BLA IMP-1为BLA IMP-1的表达，两个PCR扩增进行，使用的引物对InF18 pKLC26-f和InF18 pKLC26-R，和一个片段生成pKLC26的片段BLA IMP-1（GenBank登记ID：S71932），使用引物对InF18 IMP-1-f和InF18 IMP-1-r。将两个DNA片段，然后用IN-FUSION HD克隆试剂盒连接到产生pKLC26_ BLA IMP-1 。通过使用相同的方法，生成了用于表达以下AMR基因的一系列载体（补充表 2）：bla NDM-1（GenBank ID：FN396876），bla KPC-2（GenBank ID：AY034847），blaVIM-2（GenBank ID：AF191564），bla OXA-48（GenBank ID：AY236073），mcr -1（GenBank ID：KP347127），mcr -2（GenBank ID：LT598652），hygroR（该序列从TOPO HygroR亚克隆这是Tyler Jacks，Addgene质粒＃68445）和rfp（编码RFP，GenBank ID：KJ021042）的礼物。
得到pKLC26_ BLA IMP-1 _ MCR -2，两个PCR扩增进行时，生成pKLC26_的片段BLA IMP-1使用的引物对InF55 pKLC26IMP1-f和InF55 pKLC26IMP1-r和pKLC26_的片段MCR -2使用引物对InF55 pKLC26mcr2-f和InF55 pKLC26mcr2-r。然后将两个DNA片段与In-Fusion HD克隆试剂盒连接。我们使用CLSI推荐的磁盘扩散测试通过对相应抗生素的敏感性测试确认了克隆基因的表达。获得用于保湿的pKLC42为了在RecA启动子的控制下表达，使用引物对InF42 HygroR-f和InF42 HygroR-r进行PCR扩增，产生pKLC26_HygroR的片段。然后将PCR片段和合成的RecA启动子寡DNA（补充表 3）与In-Fusion HD克隆试剂盒连接。
pKLC53的构建如下进行。使用InF53 pKLC42 PCR-r和InF53 pKLC42 PCR-f引物从pKLC42扩增RecA启动子，并使用InF53 IMP-1 PCR-f和IF53引物从pKLC26_blaIMP-1扩增IMP-1表达序列。 InF53 IMP-1 PCR-r。然后将两个扩增子与In-Fusion HD克隆试剂盒连接以生成pKLC53。为了获得pKLC56_ BLA IMP-1为BLA IMP-1的Tet可诱导的启动子的控制下表达，两个PCR扩增进行时，生成pKLC26_的片段BLA IMP-1使用引物对InF56 pKLC26_IMP-1-f和InF56 pKLC26_IMP-1-r，以及使用引物对InF56 Tet-ind clo-f和InF56 Tet-ind clo-r的pSP72 aTc可诱导载体的片段。然后将两个DNA片段与In-Fusion HD克隆试剂盒连接。通过相同的方法，生成了aTc诱导型RFP载体和对照载体（补充表 2）。
首先，为了防止M13噬菌体基因组自组装，删除了辅助噬菌体M13KO7（美国New England Biolabs）的f1复制起点。这是通过使用M13KO7 PCR InFusion-f和M13KO7 PCR InFusion-r的引物对对M13KO7质粒进行PCR，然后将所得片段与另一个带有p15A起源和Cm抗性基因的PCR产物连接而获得的，该产物使用pBAD33从pBAD33扩增pBAD33 PCR InFusion-f和pBAD33 PCR InFusion-r的引物对。用In-Fusion HD克隆试剂盒进行连接，所得噬菌粒称为pKLC25。接下来，CRISPR-Cas13a加载的大肠杆菌 M13噬菌体衣壳靶向bla IMP-1（基于M13噬菌体的EC-CapsidM13Cas13a_ bla IMP-1如下产生）：将pKLC25载体转化到大肠杆菌 MC1061中以合成辅助噬菌体（噬菌体衣壳）。
在Cm平板上选择转化的细菌。随后，将大肠杆菌窝藏pKLC25用pKLC21携带CRISPR-Cas13a和M13的F1原点（即，pKLC21_转化BLA IMP-1矢量），和琼脂含有Cm和公里在LB选择。挑选在该双重抗生素选择板上生长的菌落，并在37℃下在含有Cm和Km的LB液体培养基中培养。然后将固定相的大肠杆菌培养物以8000× g离心 20分钟，然后将上清液通过0.22 µm过滤器。等体积的PEG缓冲液（5 mM Tris-HCl（pH 7.5），10％PEG 6000、1 M NaCl（58 g / L）和5 mM MgSO 4 ·7H 2将O（1.23g / L）加入到滤液中，充分混合，并在4℃下放置24小时。在此之后，混合物在12,000rpm离心× 克 10分钟，在4℃以沉淀基于噬菌体M13 EC-CapsidM13Cas13a_ BLA IMP-1 。为了提高其纯度，进行了重复离心。最终，加入SM缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.5），0.1 M NaCl，7 mM MgSO 4 ·7H 2 O和0.01％明胶），将沉淀重悬以产生M13噬菌体最终溶液。基于EC-CapsidM13Cas13a_ bla IMP-1。一系列针对bla NDM-1，bla KPC-2，bla基因的基于M13噬菌体的EC-CapsidM13Cas13a还使用相同的方法制备了VIM-2，bla OXA-48，mcr -1，mcr -2和rfp。
的大肠杆菌 JP12507（参考文献25），通过噬菌体lysogenizingΦ80成衍生的大肠杆菌 594菌株，用于基于PICI-EC-CapsidCas13a（S）的生成。为了防止在基于PICI的EC-CapsidCas13a生成过程中自动包装Φ80，删除了噬菌体DNA包装所需的cos N位点，从而创建了JP17091。通过使用JP17091和一系列PICImid pKLC31，如下产生了靶向各种基因的基于PICI的EC-CapsidCas13a :: KanR。首先，pKLC31_ bla IMP-1将其转化为JP17091，并将转化体在含Km的LB平板上培养。然后，分离几个菌落并在含Km的LB液体培养基中振荡并在37℃下进一步培养，同时加入丝裂霉素C以诱导噬菌体切除，并添加L-阿拉伯糖诱导rpp A（用于噬菌体DNA包装）。加入L-阿拉伯糖至终浓度为0.2％，当细菌培养物达到OD 600时使其达到终浓度2 µg / mL。为0.1。将培养物在30℃，80 rpm摇动下孵育过夜。孵育后，收获上清液并通过0.22 µm过滤器。然后加入等量的PEG缓冲液，充分混合后，将溶液在4°C放置至少1 h。然后，将溶液在12000×离心 克在4℃下10分钟，得到基于PICI-EC-CapsidCas13a :: KanR_的沉淀BLA IMP-1 。
为了除去残留的液体，将沉淀洗涤几次，最后重悬于SM缓冲液中以备将来使用。一系列基于PICI-EC-CapsidCas13a的::的KanR（多个）靶向的基因BLA NDM-1 ，BLA KPC-2 ，BLA VIM-2 ，BLA OXA-48，MCR -1，MCR -2和RFP被也可以使用相同的方法制备。通过使用质粒pKLC44生成携带hygroR而不是kanR的基于PICI的EC-CapsidCas13a :: HygroR，其中kanR被hygorR取代。我们使用In-Fusion HD克隆试剂盒，通过用SacI和XhoI切割pKLC31并将其与从pKLC26 HygroR扩增得到的hygroR与InF44 pKLC42-f和InF44 pKLC42-r的引物对结合，构建了pKLC44。我们生成的基于PICI-EC-CapsidCas9靶向BLA NDM-1（EC-CapsidCas9_ BLA NDM-1 ），使用JP17091应变和质粒pKLC27（携带CRISPR-Cas9_ BLA NDM-1 ，RPP A和包装站点COS N）。pKLC27的构建如下。从pCR319（Timothy Lu的礼物）9扩增了CRISPR-Cas9_ bla NDM-1 9使用引物一组InF27 pRC319-f和InF27 pRC319-r，并使用InF27 araCosPPi-f和InF27 araCosPPi-r引物从pBAD18 cos N rppA扩增包装位点cos N和 rppA。然后将两个扩增子与In-Fusion HD克隆试剂盒连接以生成pKLC27。通过使用两种限制性酶SbfI和BglII用CRISPR-Cas9替换pKLC31的CRISPR-Cas13a，生成了针对bla IMP-1的基于PICI的EC-CapsidCas9载体（EC-CapsidCas9_ bla IMP-1）。
基于SAPI-SA-CapsidCas13a_ mecA基因是使用SAPI包装系统产生的基本上11，30。首先，将携带靶向MRSA mecA的CRISPR-Cas13a_ mecA的金黄色葡萄球菌-大肠杆菌穿梭载体pKLC-SP_ mecA和对照载体pKLC-SP_null分别转化为金黄色葡萄球菌菌株RN4220-80α- ΔterS -SaPIbov2 ::: tetM 29，33通过电穿孔，使用具有以下参数的NEPA21电穿孔仪（日本Nepa Gene Co.，Ltd.）：穿孔脉冲（电压：1800 V，脉冲长度：2.5 ms，脉冲间隔：50 ms，脉冲数：1，极性：+）和传输脉冲（电压：100 V，脉冲长度：99 ms，脉冲间隔：50 ms，脉冲数：5，极性：±）。
然后在允许质粒复制（28°C）的温度下回收所得转化体1 h，然后铺板在补充有10 µg / mL Cm的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）板上。当转化子在Cm存在下于37°C（非容许温度）孵育时，质粒可以通过同源重组整合到染色体中。为了刺激滚动周期复制，然后将单个菌落（来自37°C平板）接种到胰蛋白酶大豆肉汤中，并在28°C下孵育，而无需选择抗生素。最后，将100μl 该培养物的10 -5稀释液涂在含1μg/ mL aTc的TSA上以选择不含质粒的细胞。通过PCR验证了两个CRISPR-Cas13a系统的插入。最后，丝裂霉素C化学诱导所得细胞以产生SA-CapsidCas13a_mecA基因和SA-CapsidCas13a_nontargeting（对照）通过使用该方法别处描述11。
的产生大肠杆菌菌株自身的染色体上表达的外源基因是通过使用ARA诱导Red重组系统中进行。首先，我们转化的大肠杆菌菌株NEB5-αF' 我q（新英格兰生物实验室，美国）和MC1061用质粒pKD46携带ARA诱导Red重组系统34。接下来，按照Tomoya Baba等人描述的方法，将所需基因，例如bla IMP-1，敲入上述菌株中。35。从pKLC26_ bla IMP-1扩增出包含bla IMP-1和Cm抗性基因（cat）的DNA片段。用pKLC26-f中的K12基因组和pKLC26 Cm-r中的K12基因组的引物对，使用ELEPO 21 将PCR产物电穿孔到上述大肠杆菌细胞中，并具有以下参数：成孔脉冲（电压：2000 V ，脉冲长度：2.5 ms，脉冲间隔：50 ms，脉冲数：1，极性：+）和传输脉冲（电压：150 V，脉冲长度：50 ms，脉冲间隔：50 ms，脉冲数：5和极性：±）。电穿孔后，加入1 mL SOC，搅拌下在37°C下培养1 h，然后铺展在含Cm的LB平板上，然后在37°C下孵育直至观察到菌落。通过Sanger测序证实了所得插入的序列。
所述pKLC21_ BLA IMP-1 _563（Cas13a和crRNA_ BLA IMP-1 _563表达质粒）和pKLC54_ BLA IMP-1 _560（Cas9和crRNA_ BLA IMP-1 _560表达质粒）靶向BLA IMP-1如上所述构建。将CRISPR-Cas表达质粒转化到大肠杆菌 STBL3（pKLC45）（作为对照）和STBL3（pKLC53）（bla IMP-1表达质粒）。然后将每个转化体铺在含有Km的LB平板上，并在30℃下孵育16小时。之后，收集平板上的菌落并用0.8％NaCl连续稀释，并对存活细胞数进行菌落计数。
将非靶向的pKLC21_ bla IMP- 1_563，pKLC21_ bla IMP- 1_RFP和pKLC21_ bla IMP- 1_RFP转化为大肠杆菌 STBL3（pKLC56）（作为对照），STBL3（pKLC56_ bla IMP-1）（aTc-诱导型bla IMP-1表达质粒）和STBL3（pKLC56_RFP）（aTc诱导型RFP表达质粒）。然后将每个转化体接种到含有Km和Cm的LB平板上，并在37℃下孵育16小时。将平板上的菌落转移至含有Km和Cm的LB培养基中，并在37℃下孵育10小时。确认细菌生长良好后，将每种培养物用LB培养基稀释100倍，并在剧烈振荡（400 rpm）下于30°C孵育1.5 h。然后，加入1 µg / mL aTc诱导bla IMP-1和rfp的表达，并在剧烈振荡下于30°C孵育1 h。之后，将抗生素（Km，Cm和Amp）添加到培养物中，并在剧烈振荡下于30°C孵育23 h。外径650 每小时进行一次监控。
将pKLC21_ bla IMP-1 _563转化到大肠杆菌 STBL3（pKLC56_ bla IMP-1），然后将细菌接种到含有Km和Cm的LB平板上，并在37°C下孵育16小时。将平板上的菌落转移至含有Km和Cm的LB培养基中，并在37℃下孵育10小时。用LB培养基将细菌培养物稀释100倍，然后加入1 µg / mL的aTc和抗生素Km和Cm，然后在30°C下孵育8 h。在测量OD之前，每1 h将细菌培养物剧烈振摇10 s。处理后0小时，1小时，2小时，4小时和8小时的时间收集细菌，并用0.8％NaCl连续稀释。将稀释的细菌点在没有抗生素的LB平板上，并计数存活细胞的数量。
三个对数期培养物的大肠杆菌菌株的过表达BLA IMP-1 ，MCR-2质粒和携带对照质粒，NEB5-αF' 我q（pKLC26_ BLA IMP-1 ），和NEB5-αF' 我q（pKLC26_ MCR-2 ）和NEB5-αF' 我q（pKLC26），在LB液体培养基中调节至OD 600为0.1，并用新鲜的LB培养基中稀释10倍。我们将每种稀释液300μl转移到一个试管中，混合均匀，然后将其分成四个试管，每个试管最大100μl。用基于M13的EC-CapsidCas13a_ bla处理了三支试管IMP-1，EC-CapsidCas13a_ mcr-2和EC-CapsidCas13a_nontargeting（对照），而第四管被视为未处理对照。EC-CapsidCa13a处理是通过将上述三个CapsidCas13a的MOI 100分别添加到其相应的试管中，充分混合，然后在37°C下轻轻摇动培养6小时来进行的。孵育后，用0.8％NaCl进行系列稀释，并对存活细胞数进行菌落计数。计数分别在含有Amp，粘菌素和无药物的琼脂平板上形成的菌落数，并计算细胞比。SA-CapsidCas13a_ mecA的序列特异性杀伤活性 通过使用Tet琼脂平板来确定“ Tet抗性”，因为在包装过程中产生的SA-CapsidCas13a携带着从SaPIbov2递送的Tet抗性决定簇。
将M13噬菌体/基于PICI的EC-CapsidCas13a用10 -4至10 -7的 SM缓冲液连续稀释。在此期间，过夜培养大肠杆菌菌株NEB5-αF' 我q或MC1061 1：100稀释用LB肉汤在37与搅拌下温育℃直至的OD 600获得〜0.1的。然后，将10μl每种稀释的M13噬菌体/基于PICI的EC-CapsidCas13a稀释液添加到100μl细菌悬浮液中，并将混合物在37℃下孵育30分钟。随后，将所有培养液铺在含有Cm或Km的LB平板上，并将平板在37°C下孵育过夜。计算在Km平板上而不在Cm上生长的菌落，以计算TFU / mL。
的大肠杆菌被确定菌株生长至OD 600〜0.5的。然后，将100 µl培养物与3 mL在50°C预热的熔融软琼脂（含0.5％琼脂糖的LB溶液）混合，倒入含有Km或Hygro的LB平板上。板在室温下固化。同时，将具有已知滴度的M13噬菌体/基于PICI的EC-CapsidCas13a调节至10 5 TFU / mL，并制备其十倍系列稀释液。最后，将2 µL M13噬菌体/ PICI型EC-CapsidCas13a的每种稀释液点样到固化的软琼脂上，并将板在37°C下孵育。如果在板上形成了菌斑，则结果被解释为阳性。
所述pKLC21_ BLA IMP-1（CRISPR-Cas13a_ BLA IMP-1的表达质粒）库靶向的整个区域BLA IMP-1被构造为上述的。等量的每一个的121 pKLC21_ BLA IMP-1携带针对不同位置间隔BLA IMP-1和pKLC21_nontargeting（作为对照）混合，并转化到大肠杆菌（E.coli） MC1061（pKLC26）和MC1061（pKLC26_ BLA IMP-1）。然后将每个转化体接种到含有Cm和Km的20个LB板上，并在37°C下孵育16小时。接下来，通过使用LB培养基收获每个转化体> 10,000个菌落，并使用QIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN）提取质粒。使用Nextera XT Library Prep Kit（Illumina）从质粒构建成对的测序文库。使用Illumina MiSeq平台（2×301 bp）和MiSeq试剂盒版本3（Illumina）进行测序。
从Ikiesa工厂（日本大阪）购买的M大小的G. mellonella幼虫用于存活分析，以评估基于PICI的EC-CapsidCas13a对大肠杆菌感染的治疗效果。收到后，通过将幼虫在黑暗的房间中放置24小时，使其适应实验室环境，然后再开始测定。实验排除了活动力弱，颜色暗，形状异常，与其他幼虫明显不同的幼虫。在该实验中使用了汉密尔顿注射器（701LT，汉密尔顿）和KF 731针头（汉密尔顿）。首先，对带有碳青霉烯抗性基因bla IMP-1的耐碳青霉烯的大肠杆菌 R10-61进行过夜培养将其用新鲜的LB培养基以1：1000稀释，并在搅拌下于37°C进一步温育以达到〜0.5的OD 600。然后将细菌用PBS洗涤两次，并在PBS中调节至〜1×10 7 CFU / mL 的密度。每组选择三十只乳白色的幼虫，并将5微升细菌悬液直接注入左前腿。一小时后，基于PICI 5微升含有的MOI 100的PBS EC-CapsidCas13a_ BLA IMP-1，仅将EC-CapsidCas13a_nontargeting或PBS注入已注入细菌溶液的同一部位。将幼虫转移到37°C的培养箱中，监测存活情况长达3天。对针刺激无反应或身体变形的幼虫被视为死亡。然后从三个独立实验的数据生成Kaplan-Meier生存曲线，并使用EZR（http://www.jichi.ac.jp/saitama-sct/SaitamaHP.files/statmedEN.html）进行对数秩检验进行分析。
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