摘要
淋病奈瑟菌是淋病的病原体，是一种人类唯一的病原体，其不断增长的抗生素耐药性引起了全世界的关注。淋球菌表达的抗生素抗药性的上升趋势突出表明，需要找到当前淋病治疗的替代方法，例如疫苗开发或新型疗法。淋球菌OmpA蛋白由于在淋病奈瑟菌中的保守性和稳定表达而被预先鉴定为潜在的疫苗候选者。但是，尚不清楚可能调节OmpA水平并因此潜在疫苗效力的因素。较早的工作表明ompA是MisR / MisS调节剂的一部分，表明它是MisR激活的基因。在本文中，我们证实了ompA的 MisR / MisS调控，并报道了MisR反应调节剂可以结合ompA翻译起始密码子的上游。此外，我们描述了对ompA转录的MisR激活至关重要的ompA启动子上游DNA序列的贡献。我们的结果提供了一个框架，用于通过已知对实验感染过程中的淋球菌存活至关重要的调节系统来理解淋球菌ompA的转录。
严格的人类病原体淋球菌（吴）是淋病的病原体，这是在美国的第二个最常见的性传播感染，每年导致全球估计有8700万个感染1，2。从历史上看，Ng对每种用于淋病治疗的抗生素3都有临床抵抗力。令人担忧的是，广泛耐药伍菌株已在全球报告说，具有耐阿奇霉素和/或头孢曲松，这是目前在双抗生素疗法中使用在美国和其他地方的4，5，6，7，8。目前由 Ng菌株表达的抗生素耐药性危机以及工业界为开发新的抗微生物药物而减少的努力，重新激发了人们对开发淋病疫苗的兴趣 9。在这方面，已经提出了几种表面暴露的，保守的和稳定产生的 Ng抗原作为候选疫苗。包括在该列表是23 kDa的外膜蛋白的OmpA称为是在其它革兰氏阴性细菌类似的OmpA 9，10。
的OmpA样蛋白已被视为疫苗针对11，12，13，14，15。例如，纯化的OmpA的小鼠的粘膜免疫引起针对多重耐药鲍曼不动杆菌16的保护性免疫。Ng OmpA最初是通过计算机筛选FA1090基因组数据库的潜在表面暴露的蛋白质而发现的，这些蛋白质可能是Ng疫苗的疫苗抗原10。由于吴 OmpA的存在，并且通过所有检测的保守伍菌株且不受相变或抗原变异的影响，是免疫系统识别的理想靶标。相关地，从血清NG-感染患者识别的OmpA表示天然人感染期间它的表达10，17。发现OmpA有助于候选疫苗的进一步发现是，它促进Ng对人宫颈和子宫内膜细胞的粘附和侵袭，对吞噬作用的抵抗以及在雌性小鼠下生殖道的实验性感染中的生存10。综上所述，这些研究表明OmpA是一种致病因子，可作为疫苗的一部分用于保护处于危险中的人免受淋病。
值得注意的是，的ompA被证明是之中的约17％伍基因妇女症状，天然宫颈感染期间差异表达的相比，伍在化学上确定的肉汤中生长（株NCCP11945）18。因此，理解机制伍的转录调控ompA的表达可能有助于预先了解有关的OmpA的作用吴发病过程中感染和疫苗提前开发力度。在这方面，从对其他细菌的研究中有证据表明类似ompA的基因受转录控制系统的控制。例如，ompA已经报道由HFQ和小RNA如云母和SSR1在调节大肠杆菌和志贺氏菌19，20，21。然而，伍的ompA不会出现由HFQ或任何预测来调节伍的sRNA 18，22。然而，用于转录调控证据伍的ompA由结果显示来自两个独立的转录谱的研究，其中包括的ompA为可以由该MISR /未命中感官双组分调控系统（TCS）被激活的基因23，24。MisR / MisS与其他细菌25拥有的CpxR / CpxA相似，由MisR反应调节剂和负责MisR磷酸化的MisS感觉组氨酸激酶（MisS）组成。尽管激活MisR / MisS的环境信号仍然未知，但据报道，该TCS对实验性感染雌性小鼠下生殖道的Ng存活至关重要24。因此，我们试图定义对ompA的MisR调节的机制，并在此提供该Ng毒力基因的MisR激活的模型。
我们以前的工作和其他人定义的吴鉴定MISR /小姐调节子的ompA由MISR被转录激活23，24。为了证实这些发现，我们通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检查了野生型（WT）菌株FA19，其同基因misR- null突变体（JK100）和互补菌株（JK101）中的ompA转录本和蛋白质水平分析。结果证实，当存在MisR时，ompA表达升高（图1），OmpA水平也升高 （补充图 S1）。确保对ompA的调节由于MisR的丧失不仅限于FA19遗传背景，我们还检查了其他Ng菌株（例如FA1090，MS11和HO41）的misR :: kan突变体中的ompA转录水平。qRT-PCR分析的结果表明，与各自的亲本菌株相比，MisR阴性突变体的ompA转录水平也降低了（图 1b）。
MisR是表达ompA所必需的。（a）在生长的对数中期，FA19，misR- null（JK100）和互补菌株（JK101）中的ompA转录本的qRT-PCR分析。（b）菌株FA1090，MS11和HO41及其各自的misR- null突变体中的ompA转录物的qRT-PCR分析。误差棒代表与3次独立实验的平均值的标准偏差。使用16S rRNA表达计算归一化表达率（NER）。结果的统计显着性由学生t检验确定，* P <0.05，** P <0.001。
在的TCS，传感器激酶的功能不仅可以感知环境应力线索也磷酸其同源监管机构，以提高后者的活动26，27。为了确定ompA表达的MisR调节是否需要MisS感觉激酶，我们检查了MisS阴性菌株JK102中的ompA表达。qRT-PCR分析的结果表明，由于MisS的丢失，ompA转录水平显着降低（补充图 S2），这可以通过与反式表达的WT misS基因互补来逆转。因此，MisR和MisS都参与了ompA表达的激活。
接下来，我们确定ompA的 MisR调节是否直接。为此，使用体外磷酸化的MisR（MisR〜P）和ompA翻译起始密码子上游的400 bp DNA序列（包含推定的启动子元件）进行了电泳迁移率迁移分析（EMSA）。结果表明，MisR〜P可以与靶DNA结合（图 2和补充图 3）。作为对照，我们确定了另一种淋球菌转录调节蛋白MpeR是否可以结合所检查的ompA启动子。MpeR的调控区与MisR / MisS 28调控的基因有部分重叠，但不调控ompA。我们证实MpeR不结合ompA目标DNA，这表明ompA与MisR 之间的相互作用是特异性的（补充图 S4）。
MisR以特定方式与ompA启动子结合。显示的是竞争性EMSA，表明与ompA启动子的MisR结合特异性。泳道1，单独使用放射性标记的探针（5 ng）；泳道2，放射性标记的探针加上MisR〜P（1.5 µg）；泳道3–7，放射性标记的探针加上浓度增加的未标记的ompA探针（特异性）；8-11泳道，放射性标记的探针加上浓度增加的未标记rnpB探针（非特异性）。
为了确保MisR〜P与靶DNA的结合是特异性的，我们使用未标记的特异性（ompA）和非特异性（rnpB）探针进行了竞争性EMSA ；rnpB不受MisR 23管制。重要的是，只有特定的未标记探针才能与标记的ompA探针竞争MisR结合（图 2），表明这种结合是特异性的。
确认MisR与上游ompA DNA 结合后，我们试图鉴定对调节ompA表达重要的ompA启动子和MisR结合位点。因此，我们首先通过使用从菌株FA19和JK100（FA19 misR :: kan分离的总RNA）进行引物延伸（PE）分析来识别转录起始位点（TSS），从而定位了ompA启动子。）。PE测定规程从FA19 RNA产生一个单峰，当用RNaseA处理此类RNA或使用来自JK100的RNA时，该峰不存在。用FA19 RNA获得的PE产物位于ATG起始密码子上游约23 bp，假定的sigma 70启动子元件-10序列的下游约11 bp（图3a，上图 ）。有趣的是，推定的ompA启动子的预测的-10和-35六聚体的分离是次优的13个核苷酸，这表明ompA转录需要转录因子（例如MisR）。
通过引物延伸来映射ompA启动子中的转录起始位点。（a）荧光（HEX）标记的FA19，RNase处理的FA19和misR- null（JK100）的引物延伸产物的电泳图和相应的序列阶梯。梯形图下方显示的核苷酸对应于ompA的启动子区域。使用Applied Biosystems GeneMapper软件版本4.0（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4440915#/4440915）分析引物延伸产物。（b）ompA的顺序具有预测的MisR结合位点的启动子区域。红色框表示使用PRODORIC在线工具预测的MisR结合位点。-10，-35和Shine-Dalgarno启动子元件以及转录起始位点（TSS）用文字表示并加下划线。ATG ompA起始密码子以紫色突出显示。MisR结合位点共有序列IUPAC代码：KWWWTGTAAAARGNNWH，其中K = G / T，W = A / T，R = A / G，H = A / T / C，N =任何核苷酸。TruncΔS1中突变的S1位点内的核苷酸序列以斜体显示。
接下来，我们分析了假定的ompA启动子区域（如图3b所示 ），以了解MisR调控的机制。最初，我们使用DNaseI保护来识别MisR结合位点，但结果尚不确定（数据未显示）。因此，我们结合了生物信息学和遗传学研究来鉴定可能参与ompA的 MisR调控的DNA序列。对于生物信息学分析，PRODORIC在线工具29用于使用先前发表的Ng识别ompA起始密码子上游的潜在MisR结合位点MisR结合共有序列IUPAC代码：KWWWTGTAAAARGNNWH，其中K = G / T，W = A / T，R = A / G，H = A / T / C，N =任何核苷酸23。该分析表明存在两个潜在的MisR结合位点，以下将其称为S1和S2（图 3b）。为了确定两个推定的MISR结合位点的重要性，我们检查的ompA在WT和表达MISR ::根使用背景菌株的ompA - lacZ的翻译融合那的由S1和S2（全长融合，[FL]）或只是S1（截断融合[Trunc]）（图 4a）。有了这些ompA :: lacZ与野生型FA19相比，我们发现misR- null菌株（JK100）中的FL融合蛋白表达降低，这表明MisR与包含ompA启动子的区域的相互作用对于WT 表达ompA至关重要。 4b）。重要的是，在WT和misR :: kan背景下，与FL融合相比，Trunc融合物中仅S1位点的存在导致表达显着降低（图 4b）。
MisR 对ompA的监管。（a）描述了ompA- lacZ融合构建体的组织。框S1-S2表示预测的MisR结合位点的大概位置。-10和-35六聚体被标出。（b）misR突变对ompA表达的调节作用。在FA19和misR null（JK100）背景下，含有ompA-lacZ融合蛋白（FL和Trunc）的报告株的细胞提取物中，每毫克总蛋白的特定β-半乳糖苷酶活性。（c）MisR结合位点的破坏对ompA表达的影响。在FA19背景下，含有ompA-lacZ融合蛋白（FL和Trunc）和MisR结合位点融合蛋白（FLΔS2，FLΔS1和TruncΔS1）的报告株的细胞提取物中，每毫克总蛋白的特定β-半乳糖苷酶活性。结果是三个独立实验的平均值。通过ANOVA确定统计学显着性，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。
为了进一步评估S1和S2对ompA表达的MisR控制的贡献，我们在野生型FA19菌株中构建了另外的ompA-lacZ融合蛋白，每个位置都有突变（图 4a）。因此，我们删除了整个S2位点（14 bp）以创建FLΔS2。假设S1位点与推定的-10启动子元件重叠，我们去除了8 bp的结合位点（5'-GTACGGTT-3'），并插入了8 bp的非共有序列（5'-ACCTTCAC-3'）， FLΔS1和TruncΔS1; 在S1位点改变的序列区域以斜体显示在图 3b中。该融合构建体允许丢失S1结合位点，同时保持-10元件和TSS的完整性。使用这些融合菌株，我们注意到当从FL融合物中去除S2位点时，ompA表达（图 4c）。相比之下，S1位点的破坏使ompA启动子的表达降低程度较小（约50％）（图 4c）。此外，尽管与包含S1和S2的FL融合物相比，Trunc或TruncΔS1融合物之间的ompA-lacZ表达没有显着差异。因此，尽管两个假定的MisR结合位点都可能有助于调节ompA表达，结果表明S2在与MisR的相互作用中起更主要的作用。为了验证该假设，我们使用被破坏的S1或S2位点DNA作为放射性标记的FL探针的未标记竞争者，进行了竞争性EMSA。正如预期的那样，未标记的FL探针与放射性标记的FL探针（图 5和补充图 5）竞争，尽管FLΔS1探针的竞争程度较小。与lacZ融合数据一致，FLΔS2探针未与FL探针竞争。因此，我们得出结论，S2位点对于Ng中的ompA表达的完全MisR激活是必需的，但还不够。
主要MisR结合位点的映射。竞争性EMSA证明了MisR与启动子区域中特定位点的优先结合。泳道1和9，单独使用放射性标记的探针（5 ng）；泳道2，放射性标记的探针加上MisR〜P（1.5 µg）；3-4道，放射性标记的探针加上未标记的FL竞争探针；泳道5–6放射性标记的探针加上未标记的FLΔS2竞争探针；泳道7–8放射性标记的探针加上未标记的FLΔS1竞争探针。
这项工作是由以前的意见，共同建议中的能力二者的OmpA和MISR /错过重要的作用刺激了吴雌性小鼠的实验下生殖道感染中生存10，24。由于ompA的表达在两个不同的研究发现是MISR调节子的部分23，24，我们试图定义的MISR / MISS调节机制基础ompA的表达。本文提出的结果表明MisR控制ompA的直接作用。我们建议，虽然S1和S2假定的MisR结合位点（图 3b）都参与了MisR的激活。ompA表达在后者中起着更为主要的作用。S2位点紧邻−35六聚体上游的位置表明，结合的MisR有助于RNAP募集至启动子，该启动子在ompA转录的-10和−35六聚体之间具有次优间隔。然而，我们不能轻视下游S1位点的作用，因为即使存在S2 ，在WT菌株FA19中对其的破坏也显着降低了ompA表达（图 4c）。
总之，这是第一个表征Ng o mpA基因调控的报道，该基因编码候选疫苗抗原。我们建议MisR / MisS直接增强ompA表达。综上所述，MisR / MisS和OmpA的内在联系可以用于疫苗或化学疗法的开发目的。
表1中列出了Ng菌株FA19及其同基因突变菌株，以及所使用的质粒和它们的大肠杆菌宿主 。本研究中使用的寡核苷酸引物列于补充表 S1中。常规将大肠杆菌菌株在Luria-Bertani（LB）琼脂上或含有50μg/ mL卡那霉素，100μg/ mL氨苄青霉素或100μg/ mL氯霉素的LB肉汤（Difco，Sparks，MD）中常规培养。淋病球菌在含有凯洛格氏补充剂I和II的淋菌球菌（琼脂糖）琼脂（Difco，Sparks，MD）上于37°C和5.0％（v / v）CO 2 30下生长。通过在预热的含有凯洛格氏补充剂I和II和0.043％（w / v）碳酸氢钠的GCB肉汤中接种平板生长的细胞，来开始淋球菌的液体培养，并使其在37°C下摇动生长。淋球菌的液体培养物最终浓度为10 mM MgCl 2。
使用红霉素抗性盒10如下所述地构建FA19 ompA :: ermC突变体（菌株CH10）。CH10被转化WT FA19与来自基因组DNA从由纯化的PCR产物构造伍 FA1090 的ompA :: ERMC突变体构建先前10和慷慨安Jerse（统一服务大学，贝塞斯达，MD）捐赠。如前所述进行平板转化，并在含有1μg/ mL红霉素的GCB琼脂上选择转化体31。通过使用引物HFLF2和HFLR2的PCR确认ermC盒的插入，并通过测序由基因组DNA制成的PCR产物进行验证。如前所述，使用非极性aphA-3卡那霉素盒使misR基因失活，可以构建FA1090，HO41和MS11菌株中的misR :: kan突变体23。损失MISR通过PCR和测序使用引物misRkanup和misRkandown。
Ng菌株CH10如下补充。在FA1090 的ompA :: ERMC C”，整个的ompA基因及其天然启动子被插入到基因间区域中NGO0077和NGO0078之间的染色体10，32。使用引物PNG0077和PNG0078扩增互补的编码区，以确保补体在正确的基因座中重组。使用10μg/ mL的氯霉素在GCB琼脂上选择CH10的转化体，并通过PCR和测序进行验证。
为了测量靶基因的表达，在对数中期或对数后期收获淋球菌，并将沉淀保存在-70°C。按照制造商的说明（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）通过Trizol提取纯化RNA，然后进行无Turbo DNA纯化（Ambion，Austin，TX）处理。使用QuantiTect逆转录酶试剂盒（Qiagen，芬洛，荷兰）生成cDNA。我们通过检查本文中使用的每个引物对的引物效率，引物特异性（融解温度）和线性动态范围，验证了我们的qRT-PCR方法。有关我们的验证结果的更多信息，请参见补充图 S6。对于qRT-PCR分析，使用16 S rRNA作为管家参考基因计算每个靶基因的标准化表达33。作为另外的内部对照，使用recA作为参考基因确认了显着性（数据未显示）。所有qRT-PCR均进行了三次重复的技术和生物学实验。
用引物His-OmpAF和His-OmpAR扩增了ompA的编码序列。用BamHI和XhoI消化PCR产物，然后克隆到已经用相同酶消化的pET-15b中，得到pCH1。纯化质粒并转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。使用杂交纯化方法生产His-OmpA融合蛋白，先按照制造商的规程（Millipore Sigma，Burlington，MA）对蛋白质进行变性以使其首先溶解并在洗脱之前将其在柱上进行复性。融合蛋白使用亚硝酸三乙酸镍（Ni +2-NTA）列。用含有100和200 mM咪唑的缓冲液洗脱His-OmpA。的级分进行透析以除去使用10mM PBS（137mM的氯化钠，2.7mM的氯化钾，10mM的咪唑的Na 2 HPO 4， 2mM的KH 2 PO 4）和浓缩。加入二硫苏糖醇（DTT）和甘油的终浓度分别为1 mM和10％（v / v）。通过考马斯蓝的SDS-PAGE电泳染色证实了重组OmpA的纯度。使用对应于OmpA蛋白（Cys-NGHTDNTGSDAVNNP）氨基酸145-159的小肽，生成了兔多克隆抗OmpA抗体（Pacific Immunology，Ramona，CA）。针对从FA19和ompA纯化的全细胞裂解液测试了抗体的特异性 突变菌株以及纯化的His-OmpA蛋白。
通过在10,000 rpm下离心2分钟，将在肉汤中生长至晚期对数生长期的Gonococci沉淀，并在2X SDS上染染料（100 mM Tris-HCl，pH 6.8，4％[wt / vol] SDS）中制备全细胞裂解液，0.2％[wt / vol]溴酚蓝，20％甘油，200 mM二硫苏糖醇[DTT]）。蛋白质水平通过使用NanoDrop分光光度计和BCA蛋白质测定法进行归一化。通过在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行的考马斯染色来确认当量上样。在1X TST缓冲液（0.01 M Trizma碱，0.150 M NaCl，0.05％[vol / vol] Tween 20）中的5％（wt / vol）脱脂奶粉中封闭印迹，并在4用抗OmpA O / N的一抗探测使用1：1000稀释液，温度为°C。然后将印迹用1X TST洗涤，然后与偶联至AP的二抗孵育并用NBT / BCIP显影。
使用引物pOmpA2F和pOmpAR通过PCR从FA19基因组DNA扩增出包含推定的ompA启动子区域的DNA探针（图 3b）。对于放射性标记的探针时，所指示的PCR产物用[γ 32 P] -dATP使用T4多核苷酸激酶（New England Biolabs公司，Ipswitch公司，MA）。将标记的DNA片段（5 ng）与1.5μgMpeR和MisR一起孵育，该MpeR和MisR已在30μl反应缓冲液中于室温下用乙酰磷酸盐磷酸化34。对于MisR竞争测定，使用RnpB1F和RnpB1R引物（非特异性rnpB）将未标记的ompA探针或未标记的PCR产物（5 ng）在添加放射性标记的探针之前，将其与蛋白质孵育15分钟。样品在4°C的6％天然聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后进行放射自显影。
所述的ompA TSS用在自动化毛细管电泳仪5'-荧光标记HEX引物和分析，鉴定通过引物延伸，如前所述35与修改。FA19和JK100成长为OD 600取1.0 mL培养液，将1 mL培养物重悬于200μlRNAlater溶液（Ambion，Austin，TX）中。通过使用RNeasy Plus Minikit（Qiagen，芬洛，荷兰）分离总RNA，使用无Turbo DNA的试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）去除基因组DNA污染，并进一步浓缩DNase I消化的总RNA样品。与Qiagen RNeasy MiniElute Cleanup Kit（Qiagen，芬洛，荷兰）一起使用。使用程序90°C 3分钟，53°C（Tm）1小时和25°C 10分钟的程序在热循环仪中将27 µg总RNA与30皮摩尔的引物Hex-Om-IT-R退火。 。然后，按照公司规程，使用SuperScript II逆转录酶系统（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚）将其在42°C下延长1 h。将2 µl引物延伸反应与7.5 µl Hi-Di甲酰胺和0混合。5μlGeneScan 600 LIZ大小标准品（马萨诸塞州沃尔瑟姆的Applied Biosystems），并使用运行默认基因分型模块的3730毛细管DNA分析仪（马萨诸塞州沃尔瑟姆的Applied Biosystems）进行检测。HEX标记的cDNA引物延伸产物的长度和丰度（峰以下的高度和面积）通过使用Applied Biosystems GeneMapper软件版本4.0（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4440915#/4440915）。
为了将核苷酸碱基准确地分配给在引物延伸反应中检测到的峰，通过使用Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems，Waltham，MA）产生了序列阶梯。简而言之，使用引物OmLacFL和Om-It-R2通过PCR产生DNA模板。根据制造商的说明，用200 fmol的模板DNA和2 pmol的Hex-Om-IT-R（模板链）进行测序反应。将四种双脱氧反应混合物各自在水中稀释5倍，然后将2μl上样到3730 DNA分析仪（Applied Biosystems，Waltham，MA）上。测序反应的电泳图与使用GeneMapper 4.0（Applied Biosystems，Waltham，MA）在引物延伸中产生的电泳图水平对齐。
ompA-lacZ翻译融合使用pLES94系统36生成。简而言之，使用引物OmLac21，OmLac1和OmLacRev扩增了ompA的推定启动子区域，并用于生成ompA与pLES94中截短的无启动子lacZ基因的翻译融合。通过热休克将构建体转化为One Shot TOP10具有化学活性的大肠杆菌细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA），并在含有100μg/ mL氨苄青霉素和40μg/ mL X-Gal（5-Bromo）的LB琼脂上选择转化体-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷）。确认质粒，纯化，并转化入野生型菌株FA19，以产生菌株FA19 :: P FL 和FA19 :: P Trunc。在含有1μg/ mL氯霉素的GCB琼脂上选择淋球菌转化体，并通过PCR进一步验证。
为了构建破坏的位点融合体，分别使用引物S2disF / R和S1disF / R删除（ΔS2）或更改（ΔS1）可疑的结合位点。从含有破坏的PCR产物中扩增全长启动子，并将其克隆到pLES94中。将所得质粒转化到FA19中以产生菌株FA19 :: PFLΔS2，FA19 :: PFLΔS1，FA19 :: PTruncΔS1。MISR -null菌株通过删除构建MISR在WT融合菌株。通过测序确认所有菌株。
将含有lacZ翻译融合蛋白的Ng菌株在含有1μg/ mL氯霉素的GCB琼脂平板上培养过夜。刮下细胞，用磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）洗涤一次，然后重悬于裂解缓冲液（0.25 mM Tris [pH 8.0]）中。然后通过三个冻融循环将细胞破碎。通过在4°C下以15,000× g离心10分钟去除细胞碎片。如先前所述进行β-半乳糖苷酶测定37。
所有数据均表示为具有标准偏差（SD）的平均值。所有定量数据之间的统计显着性通过学生t检验或单因素方差分析进行分析，然后采用Tukey的事后检验进行诚实的显着差异分析。显着性设定为P <0.05。
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