摘要
过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）是一种转录因子，可被激动剂批准用于治疗2型糖尿病，但在体内也抑制致癌作用和细胞增殖。Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（KRAS）基因中的激活突变通过促进负反馈环（包括细胞外信号调节激酶1/2（ERK1 / 2）和有丝分裂原激活的激酶激酶1/2（MEK1 ））减轻了这些有益作用。 / 2）依赖性的PPARγ失活。为了克服这种抑制机制，我们寻找了PPARγ的新型翻译后调控因子。磷酸肌醇磷酸酶肌管蛋白相关蛋白7（MTMR7）被鉴定为PPARγ的胞质相互作用伴侣。合成肽的设计类似于MTMR7的调节卷曲螺旋（CC）结构域，并在人类癌细胞系和C57BL6 / J小鼠中研究了其活性。MTMR7与PPARγ形成复合物，并通过抑制PPARγ的ERK1 / 2依赖性磷酸化而增加其转录活性。由于CC结构域中的LXXLL基序，MTMR7-CC肽在体外和体内模拟PPARγ激活。分子动力学模拟和对接预测，肽与PPARγ的类固醇受体共激活因子1（SRC1）结合位点相互作用。因此，MTMR7是PPARγ的正调节剂，其通过合成肽的模仿克服了在癌细胞中活跃的抑制机制，这可能导致针对PPARγ的临床研究失败。
核转录因子PPARγ已被确定为2型糖尿病的靶标已有多年。除了它的降脂和胰岛素敏化性质，在恶性和炎性人类疾病PPARγ节目益处的药理活性1，2，3，和RAS-ERK1的抑制/在（预）临床模型中观察到2信令4，5，6。正是后者的特征使核受体成为胃肠道肿瘤中有希望的靶标，其在RAS-ERK1 / 2信号级联反应中具有频繁的激活突变，例如在大肠癌（CRC）7中。在这种情况下，RAS中的突变基因是晚期疾病有效治疗的主要障碍8，需要抑制RAS-ERK1 / 2信号传导的新药物靶标9。但是，严重的不良反应限制了PPARγ-配体在代谢疾病中的长期单一治疗10。尽管如此，与化疗或生物疗法的组合可以提供针对癌症的新策略6，11，12个临床试验研究使用PPARγ激动剂的尚未未能表现出足够的功效13，14。
其原因一是临床前和临床研究之间的这种差异可能依赖于由RAS-ERK1 / 2信号级联PPARγ的复杂的监管，这还没有考虑到任何的提及试验前：我们15，16和及其他17 [ 18]证明，RAS的下游效应子抑制PPARγ，例如通过ERK1 / 2依赖性磷酸化以及通过MEK1进行核输出和胞质隔离。除了这种调节机制外，第一代PPARγ激动剂的脱靶副作用甚至导致肿瘤和血管细胞的增殖速率增加，因为它们涉及RAS的PPARγ受体独立（“非基因组”）激活19和磷酸肌醇3激酶（PI3K）20信号，特别是在较高剂量时。
因此，我们假设由于存在活性RAS级联的情况下其胞质隔离，导致PPARγ的核转录活性降低，从而促进了其靶向到目前为止未知的胞质效应子。因此，揭开PPARγ的新型效应子或调节剂可能是克服这一障碍的一种有前途的方法，特别是涉及具有RAS基因激活突变的肿瘤，该突变主要对PPARγ激活无反应。
在这种情况下，我们确定了76 kDa的肌微管蛋白相关蛋白7（MTMR7），它是脂质磷酸酶的肌微管蛋白（MTM）家族的成员，是PPARγ的新型相互作用伴侣。MTMS由N-末端plextrin同源性（PH），中央蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），SET-相互作用（SID）和C端卷曲螺旋（CC）结构域的21，22。经由催化结构域介导该家族的催化活性成员与无酶活性的成员之间的同型和异二聚化，例如MTMR6 / 7/8与MTMR9，其介导的酶活性增加23。对于鼠MTMR7，已描述了缺少该结构域的截短的54 kDa同工型24。然后，活性酶使磷脂酰肌醇-3-单磷酸酯（PI（3）P）和-3,5-双磷酸酯（PI（3,5）P 2）磷酸化。MTM是膜结合的并且定位于内体，除了MTMR7，其以游离肌醇-1，3-二磷酸（Ins（1，3）P 2）为底物以可溶形式存在于细胞质24中。
除了先前报道的MTMR7在脑，肌肉，肝脏和肾脏中的表达24，我们在胃肠道中检测到MTMR7 25。相对于其他MTMS，表征为“生存磷酸酶” 21，22，我们表明，MTMR7减少CRC细胞在体外的增殖，即使在激活的突变的存在KRAS和活性胰岛素信号，由于抑制两RAS-ERK1的/ 2和PI3K-AKT-mTOR信令25。
在本研究中，我们描述了一种新型的PPARγ调控机制，该机制通过与MTMR7的相互作用增强其转录活性。此外，我们通过设计和修饰类似于该结构域的肽，提供了对MTMR7响应外部刺激的亚细胞分布的新见解，并确定了MTMR7的CC结构域，作为体内外PPARγ的潜在新型药理激活剂。
在癌细胞与RAS-ERK1 / 2信号的组成型活化，PPARγ可以从细胞核转移到胞质溶胶由先前描述的MEK1依赖性输出机制易位15，26。但是，胞质PPARγ的功能尚不清楚。为了鉴定可能充当胞质PPARγ调节剂或效应子的新型结合配偶体，在非整倍体人类CRC细胞系SW480中进行了基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）蛋白相互作用筛选，该细胞株已突变了等位基因。在KRASG12V基因27和大量的核外PPARγ。SW480细胞在无去垢剂的情况下被低渗裂解破坏，该过程可提取胞浆蛋白。然后用PPARγ抗体（Ab）或对照IgG进行共免疫沉淀（CoIP），然后通过银染检测沉淀的条带。PPARγAb共沉淀54 kDa带内的肽，并通过MALDI-MS测序将其识别为对应于人MTMR7（图1a；表S1）。大多数肽覆盖了酶的内部和C端部分，包括催化磷酸酶，SID和CC结构域。
使用 PPARγAb（＃7196）或IgG（微珠对照）对SW480细胞的胞质裂解物进行共免疫沉淀（CoIP），然后通过银染检测沉淀的条带。通过PPARγ抗体沉淀出的54 kDa带的MALDI-MS测序包含来自人MTMR7（表肽S1）。M =标记。b分别使用IP和IB的PPARγ（泳道4：＃7196）或MTMR7（泳道1：＃121222；泳道3：＃51145）Abs检测HCT116细胞胞质裂解物中内源蛋白的CoIP。显示了代表性的凝胶和定量分析。与胶珠对照相比，凝胶中条带的OD绝对值显示为-倍±SE（n = 3次重复）。P =输入。C异位蛋白的CoIP。将HEK293T细胞与GFP-PPARγ和MTMR7（FL）表达质粒瞬时共转染24小时。分别使用PPARγ（＃7196）或MTMR7（＃121222）Abs对胞质裂解物进行CoIP。显示了代表性的凝胶。P =输入。d，e邻近结扎测定（PLA）。将HEK293T细胞与未标记的PPARγ和GFP-MTMR7 FL（d）或未标记的MTMR7 FL和GFP-PPARγ（e）表达质粒共转染24 h。使用PPARγ（＃2435）（d），MTMR7（＃121222）（e）和GFP Abs。显示了代表性图像。比例尺= 20 µm。颜色图例：红色=PPARγ/ MTMR7复合物；绿色= GFP；蓝色=原子核（DAPI）; 原始放大倍数×630。
为了检测内源性MTMR7和PPARγ之间的胞质复合物，我们求助于HCT116，这是一种人类KRASG13D突变的CRC细胞系，其表达大量的全长（FL）MTMR7（76 kDa）蛋白25。进行正常循环的HCT116细胞的亚细胞分级分离（SCF），并用MTMR7或PPARγAb结合或未结合的珠子对细胞质裂解液进行免疫沉淀。用MTMR7 Ab进行免疫印迹（IB）（图1b）。MTMR7 Abs指向酶的C端区域，并拉下与FL蛋白相对应的76 kDa条带。
对于异位蛋白的检测，我们采用了具有少量内源性FL MTMR7（76 kDa）蛋白25的 HEK293T细胞。用编码GFP-PPARγ和MTMR7（FL）蛋白的表达质粒瞬时共转染细胞24小时。SCF后，使用MTMR7或PPARγ-Ab共轭珠进行胞质裂解物的CoIP。IB对MTMR7的检测到80 kDa的条带，代表MTMR7下拉后的GFP-PPARγ（图1c上图）。对于用PPARγAb共轭珠进行的CoIP，MTMR7 Ab检测到76 kDa过表达的条带（图1c下图）。为了证实这种相互作用的发现，用GFP-MTMR7（FL）转染24 h后，在HEK293T细胞中进行了邻近结扎测定（PLA）（图1d）或GFP-PPARγ（图1e）表达质粒。此后，对细胞进行免疫荧光成像，并将MTMR7和PPARγ蛋白共定位为粉红色点。这些数据表明MTMR7与PPARγ形成复合物。
为了询问MTMR7和PPARγ的亚细胞分布，对表达高水平内源性MTMR7蛋白的正常循环HCT116细胞进行了免疫荧光显微镜检查（图2a）25。在这种情况下，可以检测到主要的胞浆定位（p = 0.057核“ N”与胞浆“ C”，Mann–Whitney试验，n = 4个重复）。此外，我们 通过免疫组织化学（IHC）评估了来自CRC患者（n = 67例）的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本的MTMR7表达和亚细胞定位。在这些患者中，有41位（61％）MTMR7染色呈阳性。在这些MTMR7阳性病例中，有19例（46％）检测到了核染色（图。2b）。
MTMR7 的本地化。使用MTMR7 Ab（＃121222）在表达内源性MTMR7蛋白的HCT116细胞中进行免疫荧光显微镜检查。左：代表性图像。右：核（“ N”）和细胞质（“ C”）荧光强度（FI）的定量显示了MTMR7的主要细胞质定位。与对照组相比，数据为FI±SE的 两倍（p = 0.057 N vs. C，Mann-Whitney检验，n = 4次重复）。比例尺= 10 µm。颜色图例：红色= MTMR7，绿色=肌动蛋白（phalloidin），蓝色=核（DAPI）；原始放大倍数×630。b MTMR7在人CRC患者组织中的定位（n = 67例）。使用MTMR7 Ab（＃121222）的免疫组织化学（IHC）显示了一部分MTMR7核染色阳性的患者（上图），而主要在其他病例的胞浆中可检测到（下图）。显示了代表性的图像；原始倍率×200。ç PPARγ的减少核定位与MTMR7的增加细胞内的定位有关。在匹配的人类CRC患者的组织标本上用MTMR7（＃121222）和PPARγ（＃7196）Abs进行IHC染色。左：显示了具有（上两个面板）或没有（下两个面板）核MTMR7和PPARγ染色的病例的代表性图像；代表性核用箭头标记。右：定量分析表明，PPARγ + 核数目减少与MTMR7减少有关+ 核（p = 0.04，Fisher精确检验，n = 67例）。PPARγ核染色的减少定义为阳性核<30％。
对于25个样品，观察到了PPARγ的另外染色，其中16个（64％）显示出PPARγ的阳性核染色（图2c）。核PPARγ染色与MTMR7的核定位有关（p = 0.04，Fisher精确检验，n = 67位患者）。
为了进一步研究MTMR7的刺激依赖性核易位，在表达高内源性MTMR7 FL蛋白的HCT116细胞中进行了免疫荧光显微镜检查。将细胞剥夺血清16小时，然后与PPARγ激动剂罗格列酮（rosi）（1μM，R1），表皮生长因子（EGF）（50 ng / ml）或胎牛血清（FCS）（20％v / v）1小时（图3a，b）。用FCS或rosi刺激后，检测到核荧光强度（FI）增加（FCS p = 0.0173，R1 p = 0.0431），而在饥饿的细胞中存在主要的细胞质定位趋势（p = 0.11） （N对C，双向方差分析，Sidak的多重比较测试，n = 3个重复）。因此，内源性MTMR7响应于血清或PPARγ激活而从胞质溶胶转移至细胞核。
一个免疫荧光显微镜。将HCT116细胞剥夺血清16小时（“饥饿”），然后用血清（20％v / v FCS），EGF（50 ng / ml）或rosi（1μM）刺激1 h，然后进行固定和染色内源性MTMR7（Ab：＃121222）。来自核和胞质区室的FI信号被归一化为整个FI。数据为FI±SE的 两倍（相对于C，* p <0.05 N，双向ANOVA，Sidak的多重比较测试，n = 3次重复）。虽然饥饿细胞中内源性MTMR7的分布没有差异，但血清，EGF或rosi刺激1 h会增加核MTMR7 FI。b来自（a）使用针对MTMR7（红色，a），肌动蛋白（phalloidin）（绿色，b），细胞核（DAPI）（蓝色，c）的Abs。比例尺= 20 µm。原始放大倍率：×630。c响应生长因子和PPARγ激动剂，内源性MTMR7易位到细胞核中。将HEK293T细胞去除血清16小时，然后与溶媒对照（VC; DMSO），rosi（R; 1μM）或20％（v / v）FCS孵育1 h。此后，对细胞进行MTR7（Ab：＃150458）的SCF和IB。代表性的凝胶和定量分析。显示了来自凝胶条带的平均OD值±SE（* p <0.05 N vs. C，双向ANOVA，Sidak多重比较测试，n = 3次重复）。C =细胞质；N =核。dMTMR7易位到患者衍生的类器官（PDO）中。将六名不同CRC患者的细胞系在含有VC或1 µM rosi（R1）的培养基中培养48小时。左图：进行了针对MTMR7的IHC（Ab：＃9406043），并且6个PDO品系中有4个在基线显示了阳性MTMR7染色，这在罗氏刺激下会增加。在激活KRAS突变的3个PDO系中的2个中，rosi刺激后MTMR7染色强度增加。每个PDO都有其患者ID标记。的KRAS -mutation类型以上的代表图像给出。右图： roso刺激后MTDO7 +核的百分比在具有激活密码子12和13的KRAS突变的PDO系中更高（p = 0.016 KRAS活性高/低，双向方差分析，Holm-Sidak多重比较检验，n = 6例）。刺激前和刺激后对以相同颜色编码。
但是，这种方法并不FL和MTMR7的小亚型区分24，25。因此，我们研究了具有低内源性MTMR7 FL蛋白的HEK293T细胞的亚细胞定位。使细胞饥饿16小时，然后用血清或PPARγ激动剂刺激，然后用针对MTMR7的SCF和IB刺激（图3c）。与20％（v / v）FCS或rosi（1μM，R1）孵育后，内源的，截短的MTMR7亚型（54 kDa）积累在核部分中（N vs.C ：FCS p = 0.0440，R1 p = 0.0008 ；双向ANOVA，Sidak的多重比较测试，n = 3个重复）。本研究中使用的所有抗体均识别MTMR7 FL蛋白的C末端区域（表S2），表明两种同工型都依赖于刺激。
为了表征原位MTMR7的亚细胞定位，我们培养了4位携带激活KRAS突变的患者和2位野生型（WT）KRAS的患者的类器官（PDO）。将PDO在含有1 µM rosi或溶媒对照（VC，DMSO）的培养基中孵育48小时（图3d）：在基线上，6个PDO中的4个显示阳性MTMR7染色，其中3个具有激活的KRAS密码子12或13个突变。值得注意的是，经rosi刺激的PDO显示出核MTMR7的增加。与具有KRAS WT PDO系或具有A146T突变的系相比，在具有密码子12或13 的激活KRAS突变的PDO系中，这种作用更为明显（p = 0.016高KRAS活性与低KRAS活性，双向方差分析，Holm-Sidak多重比较检验，n = 6例）。因此，PPARγ激动剂在患者来源的癌症干细胞中促进MTMR7在体外和离体的核积累。
为了评估MTMR7是否改变PPARγ的转录活性，我们使用萤光素酶质粒在基础启动子前结合了PPARγ响应增强子（PPRE）进行了记者基因检测。用空载体（EV）或MTMR7（FL）表达质粒转染HCT116，SW480和HEK293T细胞，然后用rosi（0.1–10μM）刺激48 h（图4a–c）。MTMR7过表达增加的基础（HCT116和SW480：p <0.0001）和配体依赖性（HCT116和SW480：p <0.0001; HEK293T：1μM：p = 0.0295，10μM：p = 0.0425）的报告基因活性与EV对照相比（重复：HCT116：n = 12; SW480：n = 6; HEK293T：n = 12; 双向方差分析，Sidak的多重比较测试，EV与MTMR7）。
a – c MTMR7促进PPARγ依赖的报告基因表达。将HCT116（a），SW480（b）和HEK293T（c）细胞分别用空载体（EV）或MTMR7 FL表达质粒与PPARγ-报告质粒（PPRE-luc）一起转染24小时，然后再用罗西（Rosi）刺激。 0–1 µM），再持续24小时。测量了总细胞裂解物中的萤光素酶活性，将其标准化为蛋白质含量，并计算为相对于对照的*倍±SE（* 与MTMR7的p p <0.05 EV，双向ANOVA Sidak多重比较测试；重复：HCT116 n = 12； SW480 n = 6； HEK293T n = 12）。d下调MTMR7 mRNA与PPARγ靶基因表达降低有关。通过使用cBioPortal数据库提供的结肠直肠腺癌（TCGA，Nature 2012）数据进行的癌基因组学计算机分析发现，在分析的182例CRC患者中，有38例≥1 SD。这种下调与PPARγ靶基因的“每千碱基对的百万碱基对读图”（RPKM）计数减少有关。数据是提供者所披露的均值±SD和显着性（* p <0.05高vs.低MTMR7 mRNA）。ËMTMR7降低PPARγ1丝氨酸82/84的抑制性磷酸化。将HEK293T细胞用MTMR7（FL）转染6 h，然后剥夺血清16 h，随后用溶媒（VC，DMSO），rosi（1μM，R1）或20％（v / v）FCS刺激60分钟，然后是SCF。进行未磷酸化和磷酸化的PPARγ的IB。数据是与EV对照相比的绝对OD值，计算为-倍±SE（p = 0.1 EV vs. MTRM7，Mann-Whitney测试，n = 3次重复）。F，MTMR7取消了ROSI介导的ERK1 / 2激活。将HCT116细胞用MTMR7 FL质粒转染6 h，然后血清剥夺16 h，并用rosi（10 µM）刺激指定的时间（min）。在MTMR7存在下，总细胞裂解物上的IB检测到减少的ERK1 / 2磷酸化。数据为标准化为HSP90的绝对OD值，计算为-倍±SE（p = 0.0449，Kruskal–Wallis试验，亚组分析：10分钟，p = 0.0392 EV对MTMR7，Dunn多重比较试验；n = 3次重复）。
为了探索这些结果是否与增加的PPARγ-靶基因表达相关，使用了癌症基因组学的cBioportal数据库进行了计算机分析28。TCGA Nature 2012提供的CRC数据集中MTMR7 mRNA表达的平均值≤1SD与大量PPARγ靶基因的表达降低呈正相关（图4d）。Pancancer Atlas提供的数据集（未显示）再现了这一发现。
为了阐明在MTMR7存在下观察到的PPARγ活性增加的潜在机制，我们使用了丝氨酸82/84处的真正ERK1 / 2磷酸化位点的特异性抗体，进行了SCF和IB磷酸化的PPARγ。为此，HEK293T细胞分别用EV或MTMR7（FL）转染，并分别用溶媒对照（VC），20％（v / v）FCS或1μMrosi（R1）处理24小时（图4e）。MTMR7过表达后，可检测到核磷酸化（即灭活）的PPARγ数量减少的趋势。因此，MTMR7似乎通过减少其通过RAS-MEK1 / 2-ERK1 / 2途径16的抑制性磷酸化而间接增加PPARγ活性。
由于至少一些脱靶ROSI（以及相关格列酮）的副作用可通过MEK1 / 2-ERK1的异常活化所介导的/ 2信令29，30中，我们调查MTMR7过表达对ROSI介导的ERK1效果/ 2磷酸化。为此，将HCT116细胞用EV或MTMR7（FL）瞬时转染，去除血清16小时，然后与10 µM rosi孵育，其浓度高于其IC 50并显示出能刺激ERK1 / 2 30。MTMR7的过表达消除了这种作用，导致磷酸化的ERK1 / 2减少（p = 0.0449，Kruskal–Wallis试验），特别是在罗西刺激10分钟后（p = 0.0392 EV对MTMR7，邓恩的多重比较测试）（n = 3个重复）（图4f）。对于SW480细胞显示了相似的结果（补充图1A）。
催化活性MTM的主要调控机制是通过C末端卷曲螺旋（CC）域31与伴侣MTM和效应蛋白形成同型或异型二聚体。因此，我们假设MTMR7的CC结构域是负责与PPARγ相互作用的蛋白质区域。为了验证这一想法，我们设计了一种合成肽来替代MTMR7 FL蛋白。没有MTMR7的CC域或任何其他MTM的晶体结构。然而，金等。确定并表征了MTMR2 32的CC域。对MTMR7，MTMR2，MTMR6，MTMR8和MTMR9的氨基酸（aa）序列进行多重比对分析，我们在MTMR7的C端发现了30个氨基酸的延伸（图5 a1）。
使用NCOILS 1.0版（ExPASy;补充图1B），该富含亮氨酸的区域显示出较高的卷曲形成能力。因此，我们将该区域用作MTMR7-CC模拟肽（PEP）设计的基础。由EMBOSS提供的Pepwheel预测选定的序列以形成两亲性α-螺旋（补充图1C）。此外，还设计了一种修饰肽（MP），该肽由乱序的相同氨基酸残基组成，但包含核受体33（包括PPARγ）的规范LXXLL共激活基元（图5 a2）。两种肽在N端均被肉豆蔻酰化，在C端被酰胺化，以增强对细胞的吸收并最小化蛋白水解。
为了确定所述肽对PPARγ的转录活性的影响，将HEK293T细胞用PPRE-荧光素酶报道质粒转染24小时。此后，在存在或不存在rosi（1和10μM）的情况下，用媒介物对照（VC），MP或PEP（均为1 µM）进行处理。至于MTMR7 FL蛋白的过表达，两种肽的处理都会增加PPARγ的转录活性（图5b，* p <0.05，相对于VC，双向ANOVA，Holm-Sidak的多重比较测试，n = 7个重复）。在HCT116（n = 3）和SW480（n = 5）重复 样品中观察到了类似的效果（* p <0.05 vs. VC，一样品t测试）。治疗ROSI的浓度高于其IC 50（> 1μM）减少PPARγ的活性，推测是由于MEK1 / 2-ERK1 /PPARγ2-途径和随后的磷酸化和失活的“非基因组”活化16。值得注意的是，将细胞暴露于MP和PEP可以逆转这种效应：在两种肽均存在的情况下，即使在用10μMrosi处理后，仍可检测到PPARγ活性增加（图5b，* p <0.05 vs. VC，双向ANOVA） ，Holm–Sidak的多重比较测试，重复进行：HEK293T：n = 7，HCT116：n = 3，SW480：n = 5）。为了解决这个体外功效是否可以转化为体内情况的问题，将C57BL6 / J小鼠（pCEA-SV40-Tag）34用MP，PEP（均为30 mg / kg * d）或腹膜内注射（每周四次）进行媒介控制（VC）。RT-qPCRs（表S2）检测的示例性PPARγ靶基因上从远端结肠（图衍生的快速冷冻整个组织样品中提取的总RNA进行图5c）。在用任一肽处理的动物中，P21 （Cip1 / Waf1 ）和Cd36 mRNA均增加（VC：n = 4小鼠，MP：n = 8小鼠，PEP：n = 8小鼠，* p 与VC相比，<0.05，Mann-Whitney检验）。这种效应是伴随着体重增长（VC与PEP：p = 0.0112;与VC MP：p = 0.1，Mann-Whitney检验）和脾脏重量（VC与PEP：p = 0.0182;与VC MP：p = 0.0639，Mann-Whitney检验）（图5d）。两者合计，MTMR7-CC模拟肽在体外和体内激活PPARγ。
a，1：MTMR7、2、6、8和9的卷曲螺旋（CC）域的氨基酸（aa）序列的比对。七肽重复序列用字母a–g表示，与MTMR2的亮氨酸位于d位置。异二聚化所需的MTMR2残基标记为绿色32。该图是使用ESPript（http://espript.ibcp.fr）绘制的。a，2：MTMR7包含30 aa序列的MTMR7，具有高线圈形成能力。N末端被肉豆蔻酰化修饰，C末端被酰胺化。设计一个由乱序相同氨基酸序列组成但具有PPARγ共激活因子LXXLL基序的修饰肽作为对照。bMTMR7-CC肽促进PPARγ的转录活性。将HEK293T，HCT116和SW480细胞用PPARγ-荧光素酶报道质粒（PPRE-luc）转染24小时，然后与1μM模仿MTMR7（PEP）的卷曲螺旋（CC）结构域的肽和修饰的肽（MP）一起孵育），其中的r-螺旋结构混乱，但存在或不存在rosi（1＆10μM）的情况下，保留的LXXLL共激活基序持续24小时。与媒介物对照相比，标准化为蛋白质含量的荧光素酶活性计算为％±SE（* p <0.05，相对于VC，HEK293T：双向ANOVA，Holm–Sidak的多重比较测试，n = 7次重复； HCT116：1个样本t测试，n = 3次重复，SW480：一样本t检验；n = 5个重复）。c PEP和MP在体内激活PPARγ靶基因。C57BL6 / J小鼠（pCEA-SV40-Tag）分别通过腹膜内注射分别用MP，PEP（均为30 mg / kg * d，每周4次）或溶媒对照（VC，DMSO）治疗14天。对从远端结肠的速冻全组织样品中提取的RNA进行RT-qPCR检测PPARγ靶基因。MP和PEP处理可增加P21 （Cip1 / Waf1 ）和Cd36 mRNA的表达。CT值归一化为B2m，计算为-SE ±倍，并与对照进行比较（* p <0.05 vs. VC，Mann-Whitney检验，VC：n = 4，MP：n = 8，PEP：n =每组8只小鼠）。d PEP和MP增加脾脏重量并诱导体重增加，从而模仿罗西型表型60：pCEA-SV40-Tag小鼠的治疗如上所述。治疗14天后测量体重和脾脏重量。数据是与对照组相比的平均值±标准误差（ 相对于VC，* p <0.05，Mann-Whitney检验，VC：n = 4，MP：n = 8，PEP：n =每组8只小鼠）。
为了更好地理解模拟肽介导的PPARγ激活的潜在分子机制，采用了一种计算方法来生成肽/PPARγ复合物的合理模型。两种肽（PEP和MP）进行了预测由web服务器预测蛋白质以形成α螺旋二级结构35和阿加迪尔36（补充图2，3）。因此，它们都被建模为α-螺旋，但是末端的肉豆蔻酰化和酰胺帽被省略。
然后，我们使用三个不同的Web服务器在PPARγ的配体结合域（LBD）的12个螺旋束上识别推定的肽结合位点（图6a）。该分析得出了三个相互作用的候选区域（图6b）。Web服务器meta-PPISP 37预测PPARγ的激动剂结合口袋周围的残基最可能是蛋白质38上的相互作用位点（图6b），主要由螺旋2ʹ和3的残基以及它们之间的环39形成。。盘绕线圈（CC）预测器Waggawagga 40和DeepCoil 41，仅预测螺旋10/11是PPARγ上螺旋线圈相互作用的可能位点。螺旋10介导PPARγ和RXRα之间的异二聚化，并与RXRα的螺旋10形成卷曲螺旋（图6c）。所述品脱网络服务器42产生的PPARγ几个晶体结构，并与LXXLL基序的窝藏辅激活物或辅阻遏物相关蛋白43，44，45，46。后者已经在由PPARγ的螺旋3、4、5和12形成的共活化剂相互作用位点39处以α-螺旋构型共结晶（图6b）。
PPARγ 的卡通表示，带有编号的螺旋。PDB代码：1fm9 45。b，cPPARγ的表面表示。可能的相互作用部位以红色显示。由网络服务器meta-PPISP（http://pipe.scs.fsu.edu/meta-ppisp.html，参考资料：http：//pipe.scs.fsu.edu/meta-ppisp.html）预测，由3和2′螺旋残基形成的激动剂结合位点可能是相互作用的位点。37）。网络服务器PINTS（http://www.russelllab.org/cgi-bin/tools/pints.pl，参考资料42）预测了共激活因子相互作用的位点，包括来自螺旋3、4、5和12的残基。Helix 10/11（异二聚化位点）是通过螺旋线圈预测Web服务器DeepCoil（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/deepcoil，参考。41）和Waggawagga（https://waggawagga.motorprotein.de，参考40）。预测的相互作用位点与PPARγ的晶体结构与激动剂，共激活肽及其卷曲螺旋相互作用伴侣RXRα形成了良好的对应关系。d – f对PEP（d），MP（e）和SRC1肽（f，PDB代码：1fm9）与coactivator交互站点。PPARγ的卡通表示是白色，螺旋以黑色编号，与肽相互作用的残基以绿色显示为棒状，并以绿色标记为白色。PEP的LXXXL基序以及SRC1和MP的LXXLL基序的亮氨酸显示为黄色棒状并标记为黄色，SRC1和肽表示为蓝色卡通。对于PEP和MP肽，用AMBER18 67计算相互作用来自120 ns的MD模拟。对于SRC1，根据1fm9结构计算相互作用。在这两种情况下，最大原子间接触距离均设置为5Å（不包括氢），并且在所分析的50,000个帧中，有80％以上需要存在相互作用。显示了每个模拟的最后一帧中的结构。
由于异源二聚化和共激活因子结合位点已经被实验证明是α-螺旋肽和蛋白质区域的结合位点，因此与激动剂结合位点相比，它们更可能是相互作用位点。对接是通过使用不同方法的两个不同的Web服务器执行的：Web服务器GalaxyPepDock 47仅将MP与规范的LXXLL主题停靠在辅助激活子绑定位点上。PEP还以其LXXXL或LXXL主题专门停靠到该站点。使用的第二个工具是Web服务器ClusPro 48。ClusPro对接产生了复合物，其中肽对接至PPARγ上不同的位点，包括螺旋10/11和共激活因子相互作用位点的附近。
为了评估哪种复合物可能是最有利的，对两个网络服务器上的23种复合物进行了全原子分子动力学（MD）模拟，然后计算了结合自由能，将MP和PEP绑定到核的不同位置受体。肽与异二聚位点或共激活因子相互作用位点结合。自由能计算的结果表明，与异二聚化位点相比，共激活剂相互作用位点是更有利的结合位点（表S3）。）。计算了每种肽与PPARγ之间最有能量优势的复合物，以及与SRC1中经典的共激活肽的PPARγ的相互作用。如在MD模拟的最后一帧中所见，PEP以其N末端LXXXL基序结合到共激活因子相互作用位点（图6d），而MP和SRC1分别以其规范LXXLL基序结合到相互作用位点（图6d）。6e，f）。将计算的相互作用与Nolte等人描述的相互作用进行比较。如图39所示，MP的结合模式似乎与SRC1相似，涉及螺旋3、4和12（表S4）上的残基，包括螺旋3上的K301和螺旋12上的E471（图6e）。）。已经描述了这两个残基形成带电荷的钳，其被认为将SRC1上的共活化剂基序以正确的取向定位在共活化剂相互作用位点39上。
在120 ns MD模拟的80％以上，未发现PEP与螺旋12上的残基相互作用，因此，不太可能利用带电的夹具进行定位（图6d）。如对SRC1 39的描述，LXXLL / LXXXL基序中第五位的亮氨酸通过插入螺旋3、4和5之间的疏水缝隙中，参与了大多数相互作用。对于这两种肽，该亮氨酸经计算可与该裂隙内的F306相互作用，这是SRC1未显示的相互作用残基。
补充图4显示了MD模拟最后一帧中PPARγ与PEP或MP的完整配合物的结构。在共激活剂相互作用位点之外，它们的构象不同。发现PEP在螺旋2′和3附近的激动剂结合口袋的入口上以稳定的螺旋形式悬垂其C末端，而其N末端仍未结构化并且没有形成稳定的相互作用。MP的N端保持接近螺旋7和11，而其C端接近螺旋1。
总之，对肽/PPARγ复合物结构的计算机模拟预测表明了类似共激活因子的结合模式，这可能解释了肽刺激PPARγ转录活性的能力。
在本研究中，我们描述了MTMR7在人CRC中的新作用，将其鉴定为PPARγ的结合伴侣和正调节剂。PPARγ的转录活性受到配体结合，翻译后修饰和亚细胞定位的调控49。在此描述的MTMR7-PPARγ相互作用复杂报价由条块PPARγ调控的新型模式和PPARγ激动剂的亲与抗肿瘤效果的可能的解释50，51，52。以前，我们将MTMR7表征为ERK1 / 2和AKT / mTOR信号转导的抑制剂25，从而充当受体酪氨酸激酶的下游两个互连和补偿性致癌途径（例如EGF受体）和RAS的双重堵塞53，54。MTMR7可以通过抑制RAS-ERK1 / 2级联，其通过ERK1 /否则唤起PPARγ的失活从而执行PPARγ的经典核函数2介导的磷酸化和MEK1在胞质溶胶PPARγ/ 2依赖性封存16，在那里它进行交互抑制PPARγ活性的分子包括Caveolin-1 26和热激蛋白55。
在目前的研究中，我们提供的证据表明MTMR7也由PPARγ激动剂罗格列酮降低ERK1 / 2的快速“非基因组激活” 56，57。通过这种机制（已证明是由质膜中的EGF或G蛋白偶联受体（例如GPR40）介导的），MTMR7可以防止此类PPARγ配体对细胞增殖和器官损伤的不利副作用49，50，51，52。这一发现是特别重要的在使用PPARγ激动剂在胃肠道恶性肿瘤的治疗负临床试验中过多的光14，58：由于MTMR7的丢失是CRC中的常见事件，是由包括胰岛素或类胰岛素生长因子的刺激25引起的，因此在抗增殖疗法中靶向PPARγ时，MTMR7的表达状态可能是一个预测参数。
此外，我们提供了有关MTMR7亚细胞分布的新见解。虽然通常myotubularins被认为是细胞质蛋白21，22，我们所收集的数据表明在响应胞质溶胶和细胞核之间MTMR7梭到RAS的刺激信号级联或PPARγ激动剂（在此示例性对ROSI）。在小鼠24中，表达了MTMR7的全长（FL）76kDa和截短的54kDa亚型。后者缺少C末端螺旋线圈（CC）域，因此可能无法与其他MTM寡聚24。通过MALDI-MS在SW480细胞中鉴定的肽还表明人CRC细胞中存在MTMR7的54 kDa亚型，与PPARγ形成复合物。使用针对MTMR7的C末端结构域的四种不同Abs进行的蛋白质印迹分析，以及先前发表的来自几种人CRC细胞系25的外显子选择性RT-PCR，证实存在截短的<54 kDa MTMR7（补充图5）。因此，我们可以得出结论，已鉴定的同工型在N末端被截短，该末端包含负责膜缔合的PH结构域。因此，这种截短可能使MTMR7及其结合伴侣PPARγ（参见图7中的模型）一起穿入核中，以增强核受体的转录活性。
MTMR7被鉴定为一种新型的PPARγ相互作用体，可提高体内和体外的PPARγ活性。我们提出了一种在胞质溶胶中的全长（FL）同工型（76 kDa），可能具有一个N端PH结构域以结合到血浆和/或细胞内膜（例如内体），以及一个移动的截短同工型（54 kDa），大概由MTMR7的C端部分组成，该部分带有盘绕线圈（CC）结构域，该结构域也存在于细胞核中。a在静止细胞中，MTMR7与内体（或其他水泡结构）结合，而ERK1 / 2和MEK1 / 2则存在于细胞质中，而PPARγ则位于细胞核中。b在用EGF（或血清）刺激后，激酶易位到细胞核中，ERK1 / 2使Ser84上的PPARγ磷酸化，而MEK1 / 2将PPARγ输出到细胞质中，这两个事件导致PPARγ失活。我们建议MTMR7抵消两种激酶的抑制作用：（1）MTMR7 FL停留在细胞质中和/或通过其PH结构域附着在膜上，并通过未知的机制抑制MEK1 / 2依赖的ERK1 / 2活化，大概是如其他MTM所示，涉及PIP代谢和EGFR流量改变。该事件消除了上述激酶对PPARγ的翻译后失活（在b中），导致PPARγ的转录活性增加。（2）截短的MTMR7易位至细胞核，通过其螺旋线圈（CC）结构域直接与PPARγ结合，并充当具有类似于SRC1的LXXLL样基序的核受体共激活因子。由此，恢复了PPARγ对靶基因启动子的转录活性（例如，P21 CIP1 / WAF1， ea）。Ç PPARγ配体（由ROSI例举）结合于PPARγ并增强在细胞核中其转录活性。此外，rosi触发质膜受体（例如EGFR，GPR40）和下游激酶（b中）的“非基因组”反式激活。至于EGF /血清（b）），MTMR7抵消了依赖于Rosi的MEK / ERK的“非基因组”激活，并促进了PPARγ在细胞核中的转录活性以及其作为SRC1样共激活因子的作用方式。
观察到的MTMR7-CC模拟肽的功效进一步支持了这种作用方式，类似于磷酸酶的卷曲螺旋（CC）结构域，该结构域能够在体内和体外激活PPARγ：值得注意的是，它诱导了PPARγ的转录。 PPARγ目的基因以及体重增加，归因于噻唑烷二酮类PPARγ激动剂的公知的不利影响（例如罗格列酮）49，59，60。
利用不同的Web服务器进行结合位点预测和对接，并结合MD模拟，指出PPARγ的共激活因子相互作用位点是最可能的肽结合位点，类似于真正的共激活因子SRC1，将亮氨酸插入LXXLL基序的位置5进入螺旋3、4、5和12 38之间的疏水裂缝中。与任何其他候选位点（如异二聚化界面或激动剂结合口袋）相比，覆盖该相互作用位点的复合物更稳定且在能量上更有利。MP和PEP与残基相互作用，而Nolte等人也报道了SRC1。39。因此，MP利用E471和K301之间的带电钳并与螺旋12上的几个残基相互作用。还发现这两种肽均与F306相互作用，这暗示LXXLL / XXXL基序可能进一步伸入裂隙并有助于肽与共激活因子相互作用位点的稳定结合。值得注意的是，肽段的延伸从其最初的螺旋构象开始展开，而其他部分，尤其是与共激活因子结合位点结合的部分，在整个MD模拟中均保持螺旋状。该肽区的稳定螺旋形成与SRC1中LXXLL母题行为的报道一致，认为该母子以其载脂蛋白形式无结构，但在与共激活子结合位点61结合后形成短的两亲性α螺旋，62。
尽管计算方法有利于共激活剂相互作用位点并导致看似合理的相互作用预测，但该模型对PPARγ/ PEP复合物的一个重要缺点是PEP不包含被认为对此必要的规范LXXLL基序过去62种类似coactivator的互动方式。MP提供了比PEP更有利的结合自由能这一事实支持了所有这三种亮氨酸的重要性。用肽和SRC1对重组PPARγ-LBD蛋白进行无细胞竞争测定对于通过实验确认我们的计算机预测是必要的。
初步发现表明，这些肽不能取代PPARγ-LBD中的罗西，因此不太可能充当真正的激动剂。相反，rosi增加了CRC细胞中MTMR7 /PPARγ复合物的形成和MTMR7蛋白的表达（未显示）。这些观察结果可能表明，与MTMR9一样，配体激活的PPARγ可以稳定MTMR7蛋白，反之亦然，MTMR7可能通过SRC1共激活位点导致PPARγ的准变构激活。但是，未来将需要进行深入的核磁共振（NMR）或共结晶研究以通过实验证明计算机模型的预测。
综上所述，我们的研究基于（i）抑制ERK1 / 2信号传导和（ii）与MTMR7的CC结构域直接相互作用，确定了一种新型的PPARγ正调控剂。表征肽的药理特性的进一步研究将是必要的，以允许进一步开发这种新型PPARγ活化剂用于未来的临床应用。
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