摘要
我们调查了一氧化氮合酶（NOS）在爆炸暴露后介导小脑中血脑屏障（BBB）破坏和周围免疫细胞浸润中的作用。重复但不是单次爆炸暴露会引起小脑延迟发作BBB破坏（爆炸后72小时）。爆炸后施用的NOS抑制剂N（G）-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）阻断了BBB破坏并阻止了CD4 +T细胞浸润到小脑。L-NAME还阻止了胚细胞诱导的细胞间粘附分子1（ICAM-1）的增加，该分子在调节血脑免疫细胞的运输中起着至关重要的作用。在此急性/亚急性爆炸后间隔（最后一次爆炸后24-71小时）内阻断NOS介导的BBB功能障碍，也可以在30天后（L-NAME清除身体后很长一段时间）防止轮转任务上的感觉运动损伤。在患有爆炸相关TBI的退伍军人/军人成员的死后大脑中，我们发现了明显的Purkinje细胞树突状乔木结构异常，与暴露于爆炸后的小鼠的神经病理学结果相当。总体而言，这些结果表明，爆炸引发了NOS依赖的致病级联反应的延迟发作，随后可能会出现行为异常。
爆炸诱发的轻度创伤性脑损伤（mTBI）在“持久自由/伊拉克伊拉克自由/黎明行动”（OEF / OIF / OND）中服役的军事人员和退伍军人中普遍存在。在2000年至2018年之间，已经诊断出380,000多名OEF / OIF / OND退伍军人患有TBI，这被认为是这些战争的标志性伤害1。
在患有TBI的退伍军人中，痴呆症的风险增加了一倍以上，但是对这种增加的风险进行调节的机制仍然了解甚少2。神经血管功能障碍，包括血脑屏障（BBB）的破坏，可能是一个重要引发机制，MTBI套在运动致病级联导致慢性神经变性病理生理学3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19岁。BBB破坏已经在许多的鼓风MTBI的临床前模型中已经检查10，11，20，21，22，23，24，25。我们和其他人已经表明，爆炸暴露引起短暂的中断BBB 8，10，26，这表明爆炸也刺激短期神经血管修复过程中，随着更多的长期，共同发生，病理有损BBB完整性级联相互作用。在这方面，已证明爆炸是在最初的BBB开放恢复到正常水平后几天引发BBB延迟发作的8。。这种延迟性BBB dysintegrity发生在特定脑区域，是在海马和小脑突出8，10，27。
多项临床研究显示小脑容易爆炸MTBI的影响11，28，29，30，31，32。此外，生物物理模拟表明人小脑稻瘟病曝光一个特定漏洞33，34。爆炸引起的轻度脑外伤的临床前模型揭示小脑持续性白质损伤11，35，36。小脑经典欣赏其在感觉整合作用，这是由稻瘟病和其它形式的神经外伤的影响11，37，38，39，40，41。然而，人们越来越清楚的是，小脑也起着重要作用，在调节被显着影响到个人与高阶认知和行为功能的爆炸有关MTBI 30，42，43。小脑的翻译意义，以及它对爆炸诱导的mTBI的脆弱性，促使我们集中精力更好地理解小脑中BBB破坏的机制。
在这项研究中，我们试图确定小脑胚细胞诱发的BBB破坏是否是NOS依赖性的，并探讨延迟发作的BBB破坏和同时发生的白细胞浸润是否与小脑病理生理和感觉运动功能有关。
使用已建立的方法8，10，11，14，44，45，46，雄性C57BL / 6小鼠暴露于使用气动冲击管传送20.19磅（±0.29）的峰静压一个或三个鼓风超压器（BOP） ，5.86 ms（±0.065）的正相持续时间和0.038 psi * ms（±0.0016）的脉冲（图 1）。
完善的气动冲击管产生的爆炸超压可模拟高爆炸物所预期的弗里德兰德波形。红色迹线表示在包括该报告的整个实验中采样的24次爆炸的平均波形。黑色迹线显示了估计的弗里德兰德波形，该波形是在野外以8 m的距离引爆约21 kg TNT时的爆炸所期望的。误差线表示SEM。
在正常条件下，只有非常低的水平的血源性白蛋白交叉完整BBB进入CNS 47，48，49。我们以前曾报道过，重复（2X），但不是单次（1X）爆炸会导致全脑8的白蛋白通透性延迟（72 h）BBB通透性。对于本报告中的实验，我们使用了3X blast范式（每天一次，连续三天），因为它更好地与常用的临床前暴露方案相对应，并且与我们先前的翻译性mTBI发现11一致。图2中的结果 证实，在全脑中3X爆炸，而不是1X爆炸，显着增加了延迟发作的99m Tc-白蛋白BBB破坏（图 2）。; F （2,25） = 6.94；p ≤0.01）。我们先前已经表明，相同的3X暴露方案会导致急性BBB破坏，这与后来在小脑中出现的慢性神经元丢失密切相关11。因此，在本研究中，我们集中注意3X爆炸暴露对小脑BBB破坏的影响。
重复爆炸暴露可增加BBB对放射性标记白蛋白的渗透性。甲显著增加（** p ≤0.01）在脑/血清（uμl/克）的比99米在全脑，观察到的Tc-白蛋白在72小时重复MTBI后（3X鼓风; ñ = 12）相比，1X BLAST（Ñ = 12）和假对照小鼠（n = 12）。单向ANOVA 事后纽曼-科伊尔斯。值表示平均值±SEM，表示为每克脑组织的微升。通过将每个大脑的cpm除以相应血清中的每微升cpm，然后除以大脑的重量来计算脑/血清比率。
一氧化氮（NO）信令被已知调节BBB通透性50，51，52。为此，我们报道了一氧化氮合酶（NOS）的抑制作用减弱了单次和两次爆炸诱导的迟发性血脑屏障破坏8。为了解决3X blast诱导的小脑BBB破坏是否同样受NOS调控，我们在注射泛特异性NOS抑制剂N（G）的小鼠最后一次暴露后72小时，测量了血源性99m Tc-白蛋白的摄取-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）。我们发现3X blast显着增加了小脑的延迟发作BBB破坏（图 3a ; F （2,30） = 4.23; p ≤0.05），这是由显著L-NAME治疗（图改善。 图3a ; p ≤0.05）。与小脑相反，在这些特定实验条件下进行的3X爆炸并未增加BBB对排除后脑（即后中脑，桥脑，延髓和小脑）的前脑结构中血源性放射性标记白蛋白的通透性（图 3b；F （ 2，30 ） = 0.073; ns。）。
一氧化氮合酶抑制阻止爆炸诱导的小脑延迟发作的血脑屏障破坏。（一） 3X鼓风显著增加的脑/血清比率99米锝白蛋白在小脑（* p ≤0.05），这是显著由L-NAME给药减毒（10毫克/千克; IP在48，54和部71h最后一次爆炸发生后）（* p ≤0.05）。（b）重复mTBI后，前脑中99m Tc-白蛋白的脑/血清比率无差异（p > 0.05）。单向ANOVA 事后纽曼-科伊尔斯。值表示平均值±SEM。时间线描绘了mTBI暴露，L-NAME治疗范例和BBB通透性的测量。
上面的结果进一步支持了这样的想法，即小脑特别容易受到胚芽诱发的BBB功能障碍的影响，延迟发作的BBB破坏是（至少部分地）由NOS依赖性信号传导介导的。此外，有证据表明NOS的活性是T细胞浸润到CNS 53，54，与对应于血脑屏障破裂，并与我们观察到以下的鼓风延迟性BBB破坏相一致的时间窗口内发生8，55，56。这促使我们问：（i）blast是否会增加小脑中的免疫细胞浸润；（ii）是否以NOS依赖的方式发生；以及（iii）blast诱导的免疫细胞浸润是否遵循相同的大脑区域特异性模式（即小脑与前脑）作为BBB破坏。
为了测试这些问题，我们采用流式细胞术定量CD4 + T细胞（CD45 + / CD3 + / CD8 - ）和CD8 + T细胞（CD45 + / CD3 + / CD4 - ）浸润到小脑后72小时3X鼓风暴露（请参见方法，图 4和补充图1）。鼓风显著增加CD4 +渗入小脑（图 4A ; ˚F （2,24） = 5.56; p ≤0.01;散点图图 4C-E）。纽曼-科伊尔斯事后分析调整用于多重比较证实，L-NAME治疗阻断鼓风诱导的CD4 + T细胞浸润（鼓风+车辆相对于鼓风+ L-NAME，p ≤0.027），降低浸润至与假手术水平+ L-NAME控件。附加的先验计划比较赫尔默特分析进一步证实了CD4 + T细胞浸润到小脑是鼓风+赋形剂处理的组中比在鼓风+ L-NAME和假手术对照组（显著更大p ≤0.004）; 并且blast + L-NAME组在统计学上等效于shams（ns）。与小脑相反，爆炸暴露不会增加CD4 +T细胞浸入相同动物的前脑（图 4f；F （2,24） = 0.331，ns；散点图图 4h-j）。爆炸暴露不影响CD8 + T细胞向小脑（图 4b；F （2,24） = 0.16，ns）或前脑（图4g；F （2,24） = 0.69，ns）的浸润。 。我们还测量了外周单核细胞（CD11b +，CD45高）的浸润，在小脑中爆炸暴露均未显着影响其浸润（F （2,24） = 0.081，ns）或前脑（F （2,24） = 0.902，ns）。
反复爆炸后，一氧化氮的抑制作用减弱了小脑中CD4 + T细胞的浸润。（A）流式细胞术揭示，重复TBI显著增加CD4 +在小脑（**计数p ≤0.01），这是由显著L-NAME给药（*衰减p ≤0.05）。（b）重复TBI后小脑CD8 +计数无差异（p > 0.05）。（c） ms的小脑的散点图，（d） blast媒介物处理的小鼠，和（e） blast L-NAME处理的小鼠。（f） CD4 +没有差异重复mTBI后，在前脑中测量了CD 计数（p > 0.05）或（g） CD8 +计数（p > 0.05）。（H）散点图p阄前脑沙姆斯的，（ⅰ）鼓风+赋形剂处理的，和（j）的鼓风+ L-NAME处理的小鼠。单向ANOVA 事后纽曼-科伊尔斯。值表示平均值±SEM。
这些结果表明，反复爆炸暴露可诱发脑区域特异性，NOS依赖性CD4 + T细胞浸润，这与爆炸对小脑区与前脑区BBB完整性的影响有关。这些结果，加上报道称NOS信号传导调节的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达66，这是众所周知的穿过BBB发挥T细胞中转了关键作用57，58，提出的问题鼓风增大是否小脑ICAM-1的表达依赖于NOS。
脑内皮细胞表达的ICAM-1在介导T细胞浸入大脑中起着关键作用57。因此，我们调查了胚泡诱导的ICAM-1变化是否可以介导上述T细胞结果。Western印迹分析3X TBI后72小时显示在小脑在ICAM-1蛋白的表达一个显著差异（图 5 ; ˚F （2,15） = 7.66; p ≤0.01）。此外，爆炸后L-NAME给药显著衰减ICAM-1蛋白的表达（图 5A ; p ≤0.05）。VCAM-1是另一种参与T细胞束缚的内皮膜蛋白59。与ICAM-1的发现相反，冲击波并没有改变小脑VCAM-1的水平，也不受L-NAME治疗的影响。我们发现重复爆炸后VCAM-1蛋白表达无显着差异（图 5b；F （2,15） = 0.93；p > 0.05）。
反复爆炸显着增加小脑中ICAM-1的表达，但不增加VCAM-1的表达。（A）蛋白质印迹分析显示，在小脑该重复MTBI显著增加ICAM-1的表达在72小时（** p ≤0.01），而L-NAME显著减弱该效果（* p ≤0.05）。（b）重复mTBI后72 h，小脑VCAM-1表达未见显着差异（p > 0.05）。单向ANOVA 事后纽曼-科伊尔斯。值表示平均值±SEM。
ICAM-1表达的增加与在小脑中观察到的T细胞浸润相对应。补充这一发现并与功能性BBB保持一致。 由图2和图3可以看出，L-NAME与小细胞微血管上的内皮细胞标记物葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）60共定位于胚细胞诱导的ICAM-1减毒（补充图 4；F （2,9） = 10.93; p ≤0.01）。综上所述，这些数据表明重复性TBI以NOS依赖性方式增加小脑ICAM-1的表达，从而调节内皮T细胞进入CNS。
在暴露于重复性TBI的小鼠小脑中，L-NAME防止了BBB破坏（图 3a）和爆炸后72小时CD4 + T细胞浸润（图 4a）。为了测试这种在急性/亚急性爆炸后间隔期间的干预措施是否能防止感觉运动功能障碍，我们在30天后检查了轮转动物的性能。通过跌倒潜伏期来测量感觉运动表现（图 6）。Sham和3X爆炸小鼠在最后一次爆炸后48、54和71小时接受L-NAME或媒介物注射。我们首先证实，假对照组中L-NAME治疗没有明显影响（F （1,19） = 3.05，ns）。因此，将经媒介物和经L-NAME处理的毛发汇集起来，以与经3X冲击处理的经媒介物和经3X冲击处理的L-NAME处理过的动物进行比较。双向混合ANOVA（间内）重复测量揭示了显著总体假，BLAST-车辆之间和爆炸-L-NAME组差异，（˚F 2,34）（ = 3.31; p ≤0.045）。进一步事后配对比较试验证实，鼓风L-NAME处理的小鼠比高炉媒介物处理（执行显著更好p ≤0.02）和假手术对照组（p ≤0.03）。因为L-NAME改善了TBI暴露的小鼠的感觉运动功能，所以我们调查了L-NAME的处理是否影响了胚泡诱导的神经病理学程度。
L-NAME可改善暴露于重复爆炸的小鼠的感觉运动损伤。3X blast和sham小鼠接受L-NAME小鼠。在脱毛方面，L-NAME处理对性能无明显影响，因此被合并（假车辆n = 10，假L-NAME处理n = 11）。有一个整体显著差异（p 沙姆斯之间≤0.045），鼓风媒介物处理（Ñ = 14），和高炉L-NAME处理的（Ñ = 14）的小鼠。一个月前暴露于重复性mTBI的小鼠在轮转任务中表现出感觉运动功能受损（p ≤0.05）与假对照组（池鼠，给予L-NAME的小鼠）相比。事后分析表明高炉L-NAME处理的小鼠比高炉媒介物处理的小鼠（执行显著更好p ≤0.02）。两向ANOVA Helmert测试。值表示平均值±SEM。
使用本报告中使用的相同爆炸暴露方案，我们先前已经发现在与瞬时BBB破坏的解剖亚域一致的斑块域中发生大量的Purkinje细胞损失11。在此之后，我们检查了3倍爆炸暴露后L-NAME处理对浦肯野细胞乔木结构的影响。为实现此目的，我们对3X爆炸后30天获得的小脑进行了共聚焦显微镜检查，并对它们进行了EAAT4免疫染色。EAAT4是只在整个小脑的分子层ramify成熟浦肯野细胞体的质膜及其致密树突乔木表达神经元谷氨酸转运61，62。
仅包含二级荧光标记的抗体可验证并支持EAAT4（图 7a）和钙结合蛋白（图 7b）的形态学特异性（合并图 7c；放大图 7d）。在假对照小鼠中的EAAT4免疫染色揭示了正常出现的致密浦肯野细胞树突（图 7e）。在假对照小鼠中也观察到正常的浦肯野细胞形态，如小叶IX中的钙结合蛋白免疫染色（图7f）所证实的 （合并图 7g；放大图 7h）。爆炸3倍后一个月，EAAT4（图 7i）和钙结合蛋白（图 7j）减少在小叶IX中观察到免疫反应性（合并图 7k；放大图 7l）。这与我们先前关于持续的浦肯野细胞体病理学的报道保持一致，特别是在小叶IX 11中。值得注意的是，L-NAME的给药不能挽救小叶IX（合并的图 7o；放大的图 7p）中胚芽母细胞诱导的EAAT4降低（图 7m）或钙结合蛋白免疫反应性（图 7n）。
在暴露于重复爆炸冲击的小鼠中，观察到小脑浦肯野细胞上EAAT4表达降低。（a）显示Alexa 488的仅二级对照（无一级抗体）的代表性图像，（b） Alexa Cy3，（c）合并，（d）放大（40倍）。（e）显示3倍假手术和L-后1个月对照小鼠小脑小叶IX 的EAAT4（绿色），（f）钙结合蛋白（红色），（g）合并的代表性免疫荧光图像和（h）放大图像。 NAME管理。（i）显示EAAT4的代表性图像，（j）钙结合蛋白，（k）合并，以及（l）重复mTBI后一个月的图像放大。（m）显示在重复mTBI与L-NAME的一个月后，EAAT4的代表性图像，（n）钙结合蛋白，（o）合并的图像和（p）缩放图像。在甲显著降低（Q） EAAT4（* p ≤0.05），和（r）的钙结合蛋白（* p ≤0.05）在小鼠中的同时暴露于重复MTBI加上车辆（*小脑的小叶IX观察免疫荧光p ≤0.05） ，和重复MTBI加上L-NAME（* p ≤0.05）。单因素方差分析事后纽曼·基尔斯。值表示平均值±SEM。箭头突出显示EAAT4 + / calbindin + Purkinje细胞体。比例尺= 30 µm，20 µm（缩放）。
定量表明，重复爆炸MTBI显著降低EAAT4的表达（图 7Q ; ˚F （2,9） = 5.25; p ≤0.05），钙结合蛋白和（图 7R ; ˚F （2,9） = 6.93; p ≤0.05）。这些结果证实，重复性TBI会引起持续的小脑病理，这可能与持续的感觉运动障碍有关。尽管L-NAME可以防止胚细胞诱发的感觉运动功能障碍，但这种治疗方法无法阻止胚细胞诱发的小脑浦肯野小细胞神经病理学。这表明，在这些实验条件下，NOS抑制可能对重复性TBI后对持久性功能结局具有有益作用，而这在总浦肯野细胞损失中并未体现出来。尽管如此，这并不排除适当定时抑制NOS仍然有益的可能性，或至少延迟了小脑持续性神经病理学发展的可能性。
我们和其他人已经表明许多退伍军人功能和结构神经影像学异常与高炉相关MTBI 11，28，32，63，64，65，66，67，68。然而，目前几乎没有关于人类小脑中与胚泡相关的mTBI的神经病理学信息。为了初步了解爆炸暴露小鼠中小脑病理的可能翻译意义，我们检查了来自罕见的一组四只死后小脑，它们来自美国军人和退伍军人，具有爆炸相关的mTBI和两名相当的非TBI退伍军人对照。
对照组1是一名海军军官，没有已知的TBI，他因心脏骤停（可能是心肌梗塞）而在43岁时死亡。病史包括高血压，高胆固醇血症和慢性阻塞性肺疾病。没有明显的神经病理学异常，包括tauopathy或神经变性的证据。对照组2是一名男性退伍军人，死于心脏骤停，享年57岁。他没有TBI的终生史。但是，他报告说在4岁和7岁时摔倒楼梯并两次撞头，没有失去知觉或需要任何紧急护理或急诊室评估。医学/精神病学诊断包括头痛和“精神崩溃”的远程病史。TBI 1是一位死因不明的男性，享年31岁。他知道曾接触过高炸药，并且有PTSD病史，并报告了记忆力和注意力障碍，头痛，焦虑和抑郁。神经病理学发现为界面星形胶质瘢痕形成（IAS）和两个tau灶。TBI 2是一名46岁的男性海豹突击队队员，死于自弹枪伤。军事爆炸包括多种简易爆炸装置（IED）和其他爆炸物。接触运动史包括高中，大学，半职业足球和混合武术。医学/精神病史包括对PTSD，酒精使用障碍，听力下降和慢性疼痛的诊断。神经病理学检查结果为CTE（阶段1）和IAS。TBI 3是一名男性海豹突击队员，因溺水去世，享年35岁。军事爆炸爆炸包括多个爆炸装置和其他爆炸物。没有参与接触运动的历史。医学/精神病学诊断包括PTSD，酒精/物质使用障碍，慢性疼痛，偏执观念和躁狂发作。神经病理学发现为无tau病理的IAS。贸易壁垒4是一名男性退伍军人，因择期背部手术而死，享年46岁。该病例以前曾参与过blast mTBI的研究，并具有广泛的验前临床特征。军事爆炸暴露是由IED和其他爆炸物引起的> 50爆炸mTBI，其急性症状与mTBI的VA / DoD标准一致，没有接触运动或非爆炸TBI的历史。医学/精神病学诊断包括PTSD，饮酒障碍，偏头痛，慢性背痛，听力下降和耳鸣。神经病理学诊断包括CTE（第1阶段）和脑膜炎。
与小鼠神经病理学发现（图 8）以及我们在3X爆炸暴露的小鼠中的先前结果（在治疗后30天进行检查）11一致，在与爆炸相关的病例中，我们观察到小脑Purkinje细胞丢失的斑片区域（图 8）。 mTBI（红色钙结合蛋白染色）。伴随此，我们观察到了EAAT4 +分子层中的乔木丢失（绿色）。在某些情况下，这些乔木没有丢失（通过钙结合蛋白免疫染色证明），但仍显示出EAAT4的显着减少，EAAT4是在这些细胞中调节谷氨酸摄取和谷氨酸能信号传导的关键分子。总的来说，这些结果支持了我们和其他人在爆炸暴露的动物有报道神经病理学的平移意义11，14，69，70，并建议高度arborized浦肯野细胞，这是小脑的唯一输出的庞大网络， blast相关的mTBI可能会长期破坏它。
营养不良性EAAT4在胚细胞相关性mTBI的人小脑Purkinje细胞中的表达。EAAT4的共聚焦显微镜显示代表免疫荧光图像（绿色），和在退伍军人/军事Servicemember控制的小脑钙结合蛋白（红色），没有爆炸TBI（一 - ç和d - ˚F，控制1 - 2，在结果分别描述），以及与爆炸相关的mTBI （如结果所述，分别为g – i，j – l，m – o和p – r的 TBI 1–4）的退伍军人/军人小脑。比例尺= 50 µm。
我们已经发现重复的mTBI会导致小脑延迟发作的BBB破坏，并且比暴露于冲击波的小鼠的前脑结构明显更健壮。双相BBB破坏已经在神经外伤的其他啮齿动物模型中观察到71，72。BBB损伤的这种动态特性可能很重要，因为已经提出了潜在的BBB破坏作为创伤后TBI干预的目标8。在这份报告中，我们发现小脑比前脑更容易受到BBB功能障碍的影响。这一发现与我们先前的结果非常吻合，先前的结果表明小脑易受爆炸诱导的血脑屏障破坏8，随后的浦肯野细胞损失11，并且还与其他神经外伤动物模型开拓的发现，即显示小脑容易，即使发起侮辱在大脑的其他地方集中伤保持40，41。
以前认为CNS和外周免疫系统在功能上是相互独立的。基于研究的结果，最近对该观点进行了重要的修改，这些研究证明了周围和中枢神经系统73中免疫细胞之间的主动相互作用。在这项研究中，小脑中观察到CD4 + T细胞浸润。白细胞浸润被认为是BBB功能障碍的功能替代物，在更严重的TBI 74损伤后的中枢神经系统中已观察到。最近有报道爆炸可以诱导CCL2 +单核细胞穿过BBB 9。本文的结果证明CD4 + 反复爆炸诱导的mTBI后，T细胞浸润小脑。
越来越多的证据表明，神经外伤可以激发周围的免疫细胞渗入大脑56。虽然有肉眼组织学证据表明，白细胞爆震后进入CNS 75，76，对免疫细胞浸润脑爆炸的影响，迄今已收到有限的关注，并出现了关于潜在机制或功能性后果的任何信息。白细胞（尤其是T细胞）渗透到大脑的一种机制涉及ICAM-1表达的变化57。我们发现，ICAT-1的表达在mTBI爆炸后在小脑中均增加，并通过NOS抑制而降低。在暴露于炎性细胞因子的人内皮细胞中也观察到了ICAM-1的表达增加77。另外，NOS信号传导调节ICAM-1表达和功能53。过度炎症会通过NOS依赖性机制引起微血管通透性过高78。然而，有趣的是，抑制组成型NOS信号会促进白细胞粘附79。爆炸暴露的小鼠表现出过量的NOS信号传导80和NOS依赖性BBB功能障碍8。该报告中的数据为与BBB功能障碍相关的延迟白细胞浸润的NOS依赖性机制提供了新的思路。
与我们先前关于延迟发作的血脑屏障破坏的研究8保持一致，这些结果进一步说明了急性/亚急性损伤后间隔对塑造长期预后的潜在意义。尽管L-NAME和它的活性抑制NOS代谢物L-NG-硝基精氨酸（LNOARG）具有20分钟的量级上半衰期短至22小时，分别81，我们发现，L-NAME治疗从48-71小时爆炸后预防上次爆炸后30天测试的感觉运动功能受损。
在其他临床前脑损伤模型已经被观察到在NOS信令变化82，83，并在疾病进展后TBI牵连84，85。目前正在进行一项使用吸入一氧化氮的临床试验，作为改善TBI预后的一种手段（NCT03260569 Clinicaltrails.gov）。外周NO给药，损伤后这种治疗的时机以及其他因素之间的潜在关系使得很难在本报告的发现之间得出精确的对应关系，尽管如此，在临床上的这种努力为NO /提供了额外的支持。 NOS信号通路是进一步治疗mTBI的相关目标。还显示出NOS抑制可改善感觉运动功能38并减少神经元细胞死亡86在TBI的临床前模型中。我们的结果表明，急性/亚急性NOS抑制作用不会阻断小脑神经病理学的全部范围。这种特定的干预措施可能只会延迟爆炸性mTBI的后遗症。尽管如此，调节NOS功能的长期策略仍可能提供额外的神经保护作用。或至少进一步延迟了mTBI相关神经创伤的发作和进展。
目前，爆炸后暴露于死后人类小脑的信息很少，这主要是因为从这种情况下可获得的组织极为罕见。在具有爆炸相关TBI历史的四个退伍军人和军人的小脑中，我们发现了营养不良的Purkinje细胞乔木形态和EAAT4表达的丧失，这加强了我们和其他人在动物模型中观察到的神经病理学发现的潜在翻译意义。 blast mTBI。
小脑对mTBI的易感性尚不清楚。这可能是由于许多相互作用的因素引起的，这些因素包括：（i）由于神经元数量过多（成年人大脑总860亿个神经元中的690亿处于小脑，所以代谢需求很高）；（ⅱ）不同微血管结构，和（iii）它的解剖位置相对于所述颅骨87，88，89。在考虑这些因素时，BBB破坏和/或免疫细胞浸润仍可能代表相互作用的病理过程，这些过程驱动持续的小脑功能障碍和神经病理。
退伍军人轻度TBI表现出异常小脑功能30，31，90，91。小脑中的BBB功能障碍可能导致与NOS信号传导相关的慢性低度炎症运动，最终可能导致长期的神经变性。总体而言，我们的研究结果表明，NOS在介导小脑对轻度冲击波损伤的小脑反应中起着重要作用，并建议适当时机阻止NO信号传导会延迟病理生理进程。这些复杂的相互作用不仅在介导延迟性BBB功能障碍中起重要作用，而且在mTBI神经退行性进展中也可能起关键作用。
研究了8-12周龄的雄性C57BL / 6（n = 148）小鼠（杰克逊实验室）。小鼠可以随意获得食物，水，并被集体饲养。将动物随机分为假，药物或TBI组。所有研究均由退伍军人事务普吉特海湾卫生保健系统的机构动物护理和使用委员会批准。根据美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行实验，并按照ARRIVE指南进行报告。
实验前，使小鼠适应动物设施至少一周。对于爆炸暴露，首先用5％异氟烷麻醉动物，然后用2％异氟烷（1 L / min氧气）进行维持。小鼠安装在激波管约束装具与他们的腹侧体表面向在气动冲击管中的迎面而来的冲击波如前所述10，11，44。将假手术对照动物安装在约束带中，并在与暴露于爆炸的小鼠相同的时间下麻醉。爆炸暴露后存活的小鼠（146/148）均表现出正常的行走，在立足点附近被尾巴抬高时，视觉引导的抓握响应，并在暴露后1小时内进行修饰行为。
按照确定的步骤50，用99m Tc（GE Healthcare，Piscataway，NJ）标记白蛋白（Sigma，St。Louis ）。用HCl将240mg / ml酒石酸亚锡和1mg / ml白蛋白的混合物调节至pH 3.0。将一毫摩尔的99m Tc-NaOH 4加入该混合物中，并孵育20分钟。将99m Tc-白蛋白在G-10 Sephadex（GE Healthcare）柱上纯化，加入0.1 ml磷酸盐缓冲液（0.25 M）。在等体积的1％牛血清白蛋白（BSA）和三氯乙酸（30％）中，纯化的99m Tc-白蛋白峰中的放射性可沉淀90％以上的酸。5×10 6 cpm /纯化的99m鼠标在包含1％BSA的乳酸林格氏溶液的最终体积（0.2 ml /小鼠）中制备Tc-白蛋白级分。
按照确定的程序50，在最后的冲击/假处理后72小时，用氨基甲酸乙酯（4 g / kg; 0.2 ml;腹膜内）麻醉小鼠。暴露颈静脉，并注射99m Tc-白蛋白（5×10 6每分钟计数（cpm））在0.2 ml含1％BSA的乳酸林格氏液中处理10分钟。从降腹主动脉的切口收集血液。然后通过打开胸腔，夹紧降主动脉，切断两条颈静脉并在不到1分钟的时间内通过心脏左心室灌注20 ml乳酸林格氏液，将大脑的血管腔洗净。冲洗后，取出大脑。解剖小脑和前脑结构（除后中脑，脑桥，延髓和小脑外的其余大脑区域）并分别称重。冲洗后可见血液的大脑被排除在分析之外（n = 2）。通过在3200× g下将颈动脉血离心10分钟获得血清在4°C下。在伽玛计数器中测定血清和脑区域中99m Tc放射性水平。通过将脑区域的cpm除以脑区域的重量得出cpm / g，计算出脑组织的放射性。通过将血清中的cpm除以计数产生cpm /微升的血清微升来计算血清放射性。然后将脑组织放射性除以相应的血清放射性，并以微升/克脑组织为单位给出结果。
对于本报告中的所有研究，L-NAME处理均表明小鼠接受了3次腹膜内注射N（G）-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME； Sigma； 10 mg / kg； 100 µl 7％NaHCO 3 ; ip）在最后一次爆炸后的48、54和71小时。对于这些实验，假肢接受了相同的L-NAME注射以及它们各自的冲击群。我们基于L-NAME 81的血浆半衰期采用了这种3X剂量范例。车辆对照接受了3次100 µl的7％NaHCO 3注射。
使用旋转仪（San Diego Instruments，San Diego，CA）来测量运动协调和平衡。使用了五个试验，每个试验具有不同的旋转速度（8、16、24、32和40 rpm）。对于每个试验，杆在120 s内加速至最终速度，在最终速度下再保持30 s，最后在30 s内降至0 rpm。使用2分钟的间隔时间。记录每个试验的旋转脚架下落的潜伏期。
使用先前建立的方法8，将大脑在4°C的PBS中4％的低聚甲醛中固定10个99m Tc-白蛋白半衰期（〜60 h）。将半切片在PBS中的30％蔗糖中于4°C平衡24 h，然后包埋在OCT（Tissue-Tek，Torrance，CA）中。用50 mM柠檬酸钠（pH 9.0）进行抗原修复，然后在80°C加热30分钟。如先前所述进行免疫染色14。漂浮的组织切片用一滴Prolong Gold Antifade Reagent盖上盖玻片。使用了以下抗体：兔多克隆抗EAAT4（Abcam，Cambridge，MA; 1：1,000），小鼠单克隆钙结合蛋白（Abcam; 1：1,000），兔多克隆抗GLUT1（Millipore，Billerica，MA; 1：500） ，以及山羊多克隆抗ICAM-1（Novus Biologics，Centennial，CO; 1：1,000）。将标记有Alexa 488和Cy3的相应二抗应用2 h（Jackson Immunoresearch，West Grove，PA； 1：1,000）。用Leica TCS SP5 II显微镜进行共聚焦显微镜检查。使用Leica Application Suite采集显微图像，并使用图像调整进行处理，图像调整仅限于线性对比度，亮度调整在每个实验中均同样应用于经过喷砂处理和假处理的动物的数据。
在上次爆炸后72小时或经过时间匹配的假手术后，用氨基甲酸乙酯（4 g / kg； 0.2 ml；腹膜内）麻醉小鼠，并用冰冷的PBS进行心内灌注。提取大脑并将其解剖成小脑和前脑。在PBS中的冰上捣碎大脑区域。将匀浆在4 o C下以300× g离心5分钟。将药丸重悬于酶解缓冲液（Tumor Dissociation kit，Miltenyi Biotec，Auburn，CA）中，用22号针头研磨，并在37 o C 摇动。然后将消化的脑悬液通过70μmSmartStrainer，并用5 ml HBSS / FBS / EDTA彻底冲洗。将收集的悬浮液以300× g离心。将药丸重悬于5 ml 40％Percoll（GE Healthcare，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）中，并在25 ° C下以400× g离心20分钟。吸出髓磷脂层（上）和Percoll上清液，并将其洗涤用5 ml HBSS / FBS / EDTA离心，并在25 ° C下以300× g离心10分钟。吸出上清液，将沉淀重悬于100μlPBS中，并转移至1.5 ml离心管中。
合并每种细胞悬液的等分试样以用作染色的对照。保留池中的一等分试样作为未染色对照。一秒钟在55°C下热处理10分钟。将所有细胞悬浮液（包括池和加热的等分试样）（但未染色的对照）与等体积的活性染料（Ghost Dye510，Tonbo Biosciences，圣地亚哥，加利福尼亚）在PBS中按1：500稀释孵育30分钟在4°C下。通过添加5体积HBSS / FBS / EDTA终止标记，并以300× g离心5分钟。将细胞重悬在冰上的HBSS / FBS / EDTA中，其中含有5μg/ ml小鼠Fc阻断剂（ThermoFisher Grand Island，NY）在冰上重悬15分钟，然后用一组荧光团偶联的一抗染色（补充表 1））。将细胞与抗体在冰上孵育30分钟，覆盖，然后洗涤并重悬于PBS中的250μl1％多聚甲醛中，并保存在4°C直至分析。使用FACSDiva 8.0（美国加利福尼亚州圣何塞，BD Biosciences，BD Biosciences）在LSRFortessa SORP上采集数据，并使用FlowJo（美国加利福尼亚州圣卡洛斯，Tree Star）进行数据分析。使用标准化的门控策略来浸润T细胞（补充图 1）。使用荧光减一（FMO）对照来确定抗体阳性，并通过添加1滴UltraComp eBeads（ThermoFisher Invitrogen）进行补偿对照。
使用先前建立的方法8，将大脑在液氮中速冻并保存在-80°C。在具有蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Thermo; Rockford，IL 1：100）的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液中对解剖的组织进行超声处理，并以12,000× g的速度离心15分钟，收集上清液，并用二辛可宁酸（BCA）分析确定蛋白质。通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（20 µg总蛋白/泳道）上于还原条件下分离蛋白裂解物，转移至硝酸纤维素膜，并用山羊多克隆抗ICAM-1（Novus Biologics，1：1,000）进行探测），兔单克隆抗VCAM-1（Abcam，1：2000）和兔单克隆β-肌动蛋白（Cell signalling，Danvers，MA; 1：10,000）作为加载对照。用抗山羊和抗兔辣根过氧化物酶偶联的二抗（Jackson ImmunoResearch； 1：5,000）探测印迹，并通过增强的化学发光法（GE Healthcare，Piscataway，NJ）观察。免疫反应蛋白条带的光密度使用Image-Quant定量，并扣除背景，并标准化至上样对照（β-肌动蛋白）。完整的免疫印迹可见补充图。 2（ICAM-1）和补充图 3（VCAM-1）。
根据批准的华盛顿大学和统一服务大学机构审查委员会（IRB）程序进行所有脑标本的收集和病例特征信息，以允许使用身份不明的组织样品。从爆炸暴露的退伍军人的尸体解剖和年龄，性别匹配，未暴露的对照中获取组织样品。使用市售的试剂盒（Opal Manual IHC Kit，Akoya Bioscience）对脑切片进行染色。在4°C下过夜应用以下抗体：兔多克隆抗EAAT4（Abcam; 1：1,000）和小鼠单克隆calbindin（Millipore; 1：1,000）。在AR6缓冲液中进行热介导的抗原修复。将染色的载玻片用ProLong Diamond防褪色固定剂（ThermoFisher）固定。如上所述进行共聚焦显微镜检查。
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