摘要
角膜伤口愈合对于维持角膜完整性和透明性至关重要，并且涉及一系列取决于上皮细胞增殖的生理过程。但是，控制角膜上皮细胞增殖的分子机制了解甚少。在这里，我们显示Sestrin2，一种应力诱导蛋白，在伤口愈合过程中在角膜上皮中被下调，并且在Sestrin2缺陷型小鼠中上皮基底细胞的增殖得到增强。我们还显示，YAP，河马信号通路的主要下游效应器，调节角膜上皮伤口修复过程中的细胞增殖，并且Sestrin2抑制其活性。此外，Sestrin2缺陷型角膜上皮中活性氧水平的增加促进了YAP的核定位和去磷酸化，激活了它以增强角膜上皮细胞的增殖。这些结果表明，Sestrin2是YAP的负调节剂，它调节基底上皮细胞的增殖能力，并可能作为角膜上皮损伤的潜在治疗靶标。
角膜上皮是角膜的最外层。它可以保护眼睛免受环境伤害，是保持角膜透明性所必需的。角膜上皮由几层浅层鳞状细胞，多层翼细胞和单层基底细胞组成，所有这些都在整个生命中通过角膜上皮干细胞（CESCs）1再生。角膜上皮创伤愈合的修复过程中，引起的各种损伤，涉及三个细胞事件：基底细胞增殖，从周围的上皮到伤口部位的细胞迁移和细胞分化成分层的层1，2，3。这些细胞事件取决于外在和内在信号传导途径之间的复杂相互作用。
Sestrins（Sesns）是一个高度保守的，压力诱导型蛋白质家族。Sesn1，Sesn2和Sesn3在哺乳动物中发现。Sesn2已作为应激反应基因4进行了最广泛的研究。已知通过其抗氧化活性抑制活性氧（ROS）的产生，并提供对多种有害刺激的细胞保护作用，例如由氧化应激，遗传毒性应激，内质网（ER）应激和低氧5引起的刺激。最近的研究已经表明，SESN2通过抑制经由AMP活化蛋白激酶的活化（AMPK）雷帕霉素配合物1（mTORC1的）信令的哺乳动物靶标负调节细胞增殖6，7。mTOR的，丝氨酸/苏氨酸激酶，调节关键的细胞功能，包括生长，增殖和代谢8，9。mTOR激酶以两种大复合物形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTORC1的磷酸化和活化S6K，其继而磷酸化核糖体蛋白S6 10，11。在角膜，mTOR信号是已知参与在瘢痕形成，新血管形成，炎症和12，13，14，15。但是，尚不清楚Sesn2是否调节角膜上皮细胞的增殖。
河马信号通路参与器官大小，组织再生，和干细胞的自我更新的调节16，17，18。在哺乳动物中，Hippo途径由一个核心激酶级联组成，该级联由哺乳动物Ste20样激酶1/2（MST1 / 2）和大型肿瘤抑制因子1/2（LATS1 / 2）和转录共激活因子组成。两个关键下游的转录辅激活物，是相关蛋白（YAP）中并用PDZ结合基序（TAZ）的转录共活化剂，诱导参与细胞增殖，存活基因的表达，和迁移19，20，21。当上游信号激活河马信号通路时，MST1 / 2被磷酸化并激活LATS1 / 2。激活LATS1 / 2磷酸化的转录共活化剂在YAP Ser127，积聚在细胞质中，并且因此从细胞核排除22，23，24，25，26。河马信号通路的失活诱导YAP的去磷酸化及其转位进入细胞核，以促进TEAD结合和基因转录的激活25。最近的研究表明，YAP在角膜基底上皮细胞中表达，并在维持其增殖中起重要作用27。但是，YAP调节角膜伤口愈合的潜在机制仍然未知。
在这项研究中，我们表明在体外和体内角膜伤口愈合过程中，Sesn2缺乏促进角膜上皮细胞的增殖。我们还显示，YAP在缺乏Sesn2的角膜上皮细胞中被激活，从而导致ROS水平升高。这些结果表明Sesn2抑制YAP活性，并负调节角膜上皮细胞增殖。
人角膜上皮（hCET）细胞由Kaoru Araki-Sasaki（大阪大学，日本大阪）提供。将细胞于37°C在补充了5％胎牛血清（Corning），1x青霉素/链霉素（WELGENE，1的青霉素/ F-12（1：1; Corning，NY，USA）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/ F-12）中培养。韩国庆山），500 ng / ml氢化可的松（美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich）和30 ng / ml霍乱毒素（Sigma-Aldrich）。对于Sesn2和/或YAP抑制的hCET细胞，如前所述5产生了表达Sesn2 shRNA，YAP shRNA或野生型Sesn2的慢病毒，并转染到hCET细胞中。该SESN2 shRNA和野生型SESN2慢病毒质粒由Andrei V. Budanov（爱尔兰都柏林三一学院）提供，YAP shRNA慢病毒质粒（＃42540）获自Addgene（美国马萨诸塞州剑桥）。
Seono Rhee博士（韩国延世大学，韩国）友善提供了具有CL57BL / 6背景的Sesn2 -/-小鼠。八周大的Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠接受Zoletil（Virbac，法国Carros，法国）和Rompun（Bayer，韩国首尔，韩国）全身麻醉。使用直径为2或2.5 mm的无菌一次性活检穿孔器（日本，东京），在角膜中央上皮产生了圆形缺损。用荧光素对角膜上皮缺损进行染色，对于2 mm缺损在0和24 h拍照，对于2.5 mm缺损在0、24、48、72和96 h拍照。
对于体外伤口愈合测定，将Ibidi培养插入物（Ibidi GmbH，慕尼黑，德国）放在6孔板的孔底部。将hCET细胞接种到每个孔中，并孵育24小时。此后，移除伊比迪培养插入物以产生伤口。在0、12和24小时对细胞照相。通过确定伤口面积的百分比来测量伤口愈合。
为了进行免疫染色，将盖玻片上生长的细胞固定在4％多聚甲醛中，并用0.1％Triton X-100透化。将固定的细胞和角膜切片与含有1％牛血清白蛋白（BSA）和5％正常山羊血清的封闭溶液一起孵育1 h，并在4°C下与抗pS6和抗Yap抗体孵育过夜。此后，将细胞用PBS冲洗，在室温下与二抗（Alexa Fluor 488）孵育1小时，并用Hoechst 33342复染。使用带有AxioCam相机（Zeiss，耶拿，德国）的荧光显微镜采集图像。
为了进行蛋白质印迹，在裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 7.4），150 mM氯化钠，5 mM EDTA，1×Triton X-100、10％甘油，10 mM焦磷酸钠，10 mMβ-甘油磷酸酯，1 mM原钒酸钠，1x蛋白酶抑制剂，10 mM氟化钠和1 mM苯基甲基磺酰氟。使用二辛可宁酸测定法（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）测定总细胞提取物中蛋白质的浓度。此后，将等量的蛋白质通过10％SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后用5％脱脂奶粉或5％BSA的TBS和0.02％Tween-20溶液封闭1小时。将膜与最佳浓度的一抗在4°C下孵育过夜。第二天，将膜用TBST洗涤3次，每次5分钟，并在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1.5小时。使用增强的化学发光检测试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）观察免疫反应带。使用了以下抗体：磷酸-YAP（细胞信号，目录4911），YAP（细胞信号，目录14074），Sestrin2（由密歇根大学的Jun Hee Lee提供），磷酸-S6（细胞信号，目录4。 2211）和S6（圣克鲁斯，目录74459）。
为了进行体内增殖分析，将Sesn2 + / +和Sesn2 -/-小鼠受伤，并腹膜内注射5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）（100 mg / kg）。注射48小时后收集小鼠眼睛并固定。将角膜切片在1 M HCl中于37°C孵育30分钟，并在0.5 mM硼酸盐缓冲液中洗涤，然后与抗BrdU抗体孵育。细胞增殖通过免疫染色BrdU（Abcam，英国剑桥）进行评估。细胞核用Hoechst 33342染色。
为了进行体外增殖分析，使hCET细胞在培养基的盖玻片上生长，并加入1 µM 5-乙基-2'-脱氧尿苷（EdU）。与EdU孵育6小时后，将+细胞用PBS洗涤3次，固定在4％PFA中，并在200 µl Click-iT反应混合物中孵育（Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒； Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚，美国）30分钟。通过确定每个细胞中EdU掺入的量来测量细胞增殖。
为了进行荧光素酶测定，将表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的hCET细胞接种在24孔板中。用YAP报道基因8xGTIIC-lux（Addgene，Cambridge，USA）和内部对照pRL-TK转染细胞。转染24小时后收获细胞，并使用双重荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega，Wisconsin，USA）进行分析。
氧化敏感的荧光染料二氢乙啶（DHE）用于评估细胞内ROS水平。将来自Sesn2 + / +和Sesn2 -/-小鼠的受伤的角膜切片在PBS中洗涤，并在10μMDHE中孵育30分钟。然后，在获取图像之前，将角膜切片用PBS清洗并固定在载玻片上。
使用荧光激活细胞分选术（FACS）进行细胞周期分析。从6孔板中收获表达对照shRNA或Sesn2 shRNA的hCET细胞，并在20％的70％乙醇中固定过夜。在800 rcf下离心3分钟后，将沉淀重悬于PBS中，并在黑暗条件下用细胞周期溶液（Tali®Cell Cycle kit； Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）染色30分钟。使用流式细胞仪（NovoCyte，ACEA Biosciences，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）分析细胞周期概况。
为了确定YAP是否易位到用NAC或DMSO处理的Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮细胞核中，用抗YAP抗体对小鼠角膜切片进行了免疫染色。将从至少两个实验中获得的值取平均值，并表示为平均值±标准差（SD）。Hoechst 33258用于核染色。使用带有AxioCam相机（Zeiss，耶拿，德国）的荧光显微镜获取荧光图像。对于每个核，使用ZEN软件（Zeiss）测量抗YAP二抗的荧光强度。检查至少45个角膜上皮细胞。
为了研究Sesn2在角膜伤口愈合中的功能，首先将Sesn2 + / +和Sesn2 --/-小鼠的角膜裸露上皮，并通过荧光素染色监测角膜伤口愈合4天。Sesn2 -/-小鼠的角膜伤口区域在96小时内几乎完全愈合，而Sesn2 + / +小鼠的角膜伤口区域仍未愈合（图1a）。在Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠中确定伤口面积的百分比。结果显示，Sesn2 -/-小鼠的伤口闭合速度明显快于Sesn2+ / +小鼠（图1b）。角膜上皮裂解物的蛋白质印迹分析显示，与正常Sesn2 + / +小鼠的角膜相比，受损角膜中的Sesn2蛋白表达降低（图1c）。这些结果表明Sesn2可以抑制角膜上皮伤口愈合。为了解决这种可能性，将用表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的慢病毒转导的hCET细胞接种到伤口检测室中，并在伤口24小时后进行监测。在12和24小时，表达Sesn2 shRNA 的hCET细胞的伤口闭合率显着高于表达对照shRNA 的hCET细胞（图1d，e）。另外，当野生型SESN2在SESN2缺陷hCET细胞中重新表达，伤口闭合被推迟（补充图S1）。综上所述，这些结果表明Sesn2缺乏症增强了角膜上皮伤口的愈合。
a用2.5 mm冲头在损伤后0、24、48、72和96 h 对Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠进行荧光素染色的角膜的代表性照片。荧光素染色的区域代表角膜上皮伤口区域。到96小时，Sesn2 -/-小鼠的角膜伤口区域已愈合，而Sesn2 + / +小鼠的角膜伤口区域仍保持开放。b Sesn2 -/-和+ / +小鼠的角膜伤口区域的定量分析。来自Sesn2 -/-和Sesn2 + / +的总共12眼小鼠用于测量上皮伤口面积大小。Sesn2 -/-小鼠的伤口面积明显小于Sesn2 + / +小鼠。c损伤后48小时将Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠的角膜组织裂解，并用Sesn2和肌动蛋白抗体进行Western印迹。d表达Sesn2 shRNA和对照shRNA 的hCET细胞的体外伤口愈合试验。表达Sesn2的 hCET细胞将shRNA或对照shRNA接种在伤口室的两侧，并使其附着12小时。移开腔室，并立即在0、12和24小时拍摄伤口区域。虚线表示测定开始时的伤口边界。e在0、12 和24 h 定量分析表达Sesn2 shRNA和对照shRNA 的hCET细胞的伤口区域。表达Sesn2 shRNA的hCET细胞的伤口闭合率显着高于表达对照shRNA的hCET细胞。误差棒代表三个独立实验的平均值±SD。两尾学生t检验（** p <0.01，*** p <0.001）。比例尺，300 µm。
为了确定Sesn2是否在角膜伤口愈合过程中调节上皮细胞的增殖能力，我们向Sesn2 + / +和Sesn2 --/-小鼠注射了溴脱氧尿苷（BrdU）和机械诱导的角膜上皮伤口。通过使用抗BrdU抗体在受伤48小时后进行免疫染色来鉴定掺入BrdU的细胞。在角膜上皮的中央和周边区域均检测到BrdU阳性细胞（图2a）。此外，Sesn2 -/-小鼠角膜中BrdU阳性细胞的数量显着高于Sesn2 + / +小鼠角膜中的BrdU阳性细胞数（图2a，b）。另外，与表达对照shRNA的培养物相比，在表达Sesn2 shRNA的培养物中EdU阳性细胞的数目显着增加（图2c，d）。为了进一步证实Sesn2对hCET细胞增殖潜能的影响，分析了表达对照shRNA或Sesn2 shRNA 的hCET细胞在细胞周期不同阶段的分布。在S / G2期中，表达Sesn2 shRNA的hCET细胞的比例高于表达对照shRNA的hCET细胞的比例（图2e）。这些结果表明，Sesn2缺乏症可以通过调节细胞周期的S / G2期促进角膜上皮细胞的增殖。
损伤后，将 BrdU注射入Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠中，处死小鼠48小时。使用抗BrdU抗体（绿色）对角膜切片染色。赫斯特染料被用作复染（蓝色）。在角膜上皮层的中央和周边区域观察到BrdU阳性细胞，并主要在Sesn2 -/-小鼠中检测到。虚线表示基底膜。b损伤后Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠角膜上皮中BrdU阳性细胞的定量分析。c表达hCET细胞的EdU掺入试验Sesn2 shRNA或对照shRNA。将细胞与10 µM EdU孵育4小时。d EdU阳性细胞百分比。EdU阳性Sesn2缺陷型hCET细胞的数量明显增加。e在不同细胞周期阶段的细胞分布。缺乏Sesn2的hCET细胞在细胞周期S期和G2期的比例高于对照细胞。误差棒代表三个独立实验的平均值±SD。两尾学生t检验（** p <0.01）。比例尺，（a）中为50 µm ；（c）中为100 µm 。
接下来，我们试图确定Sesn2是否在角膜上皮伤口愈合中调节mTOR信号传导活性。用抗磷酸化S6核糖体蛋白的抗体（mTORC1活性的标志物）对来自Sesn2 + / +和Sesn2 -//小鼠的受伤角膜切片进行免疫染色。在角膜上皮的基底细胞中检测到了磷酸化S6蛋白（图3a）。在Sesn2 -/-小鼠的中央和周边角膜区域中，磷酸化S6蛋白的表达高于在Sesn2 + / +小鼠的这些区域中的表达。此外，蛋白质印迹显示pS6表达在表达Sesn2的hCET细胞中增加与表达对照shRNA的细胞相比，shRNA（图3b）。为了评估mTOR信号传导是否能促进Sesn2缺陷型角膜的伤口愈合，对Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮进行了机械剥脱，并用雷帕霉素（mTORC1的抑制剂）或DMSO处理。在雷帕霉素治疗的Sesn2 -/-小鼠中伤口闭合被延迟，而在损伤后24小时，在DMSO治疗的Sesn2 -/-小鼠中伤口区域完全愈合（图3c）。定量伤口面积百分比。雷帕霉素治疗的Sesn2 -/-角膜上皮伤口闭合率与用DMSO处理的小鼠相比，小鼠明显延迟（图3d）。我们还观察到了雷帕霉素治疗的Sesn2 + / +小鼠的伤口闭合延迟（补充图S2a，b），尽管Sesn2 -/-小鼠的伤口闭合率降低的百分比明显高于Sesn2 + / +小鼠。此外，使用经雷帕霉素或DMSO处理的Sesn2缺陷型hCET细胞进行的体外伤口试验得出的结果与小鼠相似（图3e，f）。然而，在用雷帕霉素和DMSO处理的表达对照shRNA的hCET细胞之间未观察到伤口面积百分比的显着差异（补充图S2c，d）。该发现表明雷帕霉素以Sesn2依赖性方式影响角膜上皮伤口愈合。为了测试雷帕霉素对角膜上皮细胞增殖的影响，我们用雷帕霉素和DMSO 处理了表达Sesn2 shRNA的hCET细胞，并进行了EdU掺入试验。雷帕霉素治疗显着减少了EdU阳性细胞的数量（图3g，h）。综上所述，这些结果表明Sesn2缺乏激活了mTOR信号传导并促进了角膜上皮细胞的增殖。因此，mTOR信号传导可促进角膜伤口愈合，并受Sesn2负调控。
a使用抗磷酸化S6抗体对Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠受伤的角膜切片进行免疫染色。与Sesn2 + / +小鼠的角膜上皮相比，Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮中的磷酸化S6表达增加。虚线表示基底膜。b用磷酸化S6，S6，Sesn2和肌动蛋白抗体对表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的hCET细胞进行蛋白质印迹。c Sesn2中的体内角膜上皮伤口愈合-/-受伤后的小鼠使用2毫米冲头。损伤后，用100 nM雷帕霉素或DMSO治疗每个角膜。在24小时时，雷帕霉素治疗的Sesn2 -/-小鼠的伤口区域保持开放，而DMSO治疗的Sesn2 -/-小鼠的伤口区域已愈合。d定量分析雷帕霉素和DMSO处理的Sesn2 -//小鼠的伤口面积。与用DMSO治疗的Sesn2 -/-小鼠相比，雷帕霉素治疗的Sesn2 -/-小鼠的伤口闭合明显延迟。e用100 nM雷帕霉素或DMSO处理的表达Sesn2 shRNA 的hCET细胞的体外伤口愈合试验。F伤口面积的定量分析显示，与DMSO处理的细胞相比，雷帕霉素处理的细胞的伤口闭合速率明显延迟。g用雷帕霉素或DMSO处理的Sesn2缺陷型hCET细胞的EdU掺入分析。h与DMSO处理的培养物相比，雷帕霉素处理的培养物中EdU阳性细胞数量减少。误差棒代表三个独立实验的平均值±SD。两尾学生t检验（* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001）。比例尺，50 µm in（a，g）；（e）中为300 µm 。
由于已知AMPK和mTORC1可以调节YAP活性，因此Sesn2可以潜在地调节Hippo信号通路。为了研究Sesn2的损失是否影响角膜上皮细胞中的YAP活性，我们分析了YAP蛋白在正常和受损Sesn2 + / +和Sesn2 --/-小鼠角膜中的表达。用抗YAP抗体免疫染色显示，YAP蛋白在角膜上皮的基底层中表达（图4a）。在正常角膜中，YAP蛋白主要在中央区域的基底上皮细胞的细胞质中检测到，而其蛋白在外周区域的上皮细胞的细胞质和细胞核中表达。有趣的是，Sesn2受伤的角膜+ / +小鼠在中央区域的基底上皮细胞中显示出YAP蛋白的核定位增加（图4a，箭头），而在周围区域的上皮细胞中则没有。在受伤的Sesn2 -/-小鼠角膜中，在中心区域表现出YAP核定位的基底上皮细胞数量增加。荧光强度分析证实了这一发现，表明在Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮细胞中检测到的核YAP 比在Sesn2 + / +小鼠的上皮细胞中被检测到的频率更高（图4b）。）。另外，在表达Sesn2 shRNA的培养物中，显示出YAP主要核定位的细胞数量高于表达对照shRNA的细胞数量（图4c）。YAP蛋白在易位入细胞核后在127位丝氨酸上被去磷酸化，随后被激活。为了确定Sesn2是否负调控YAP激活，使用抗磷酸-YAP（丝氨酸127）抗体对表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的慢病毒转导的hCET细胞进行免疫印迹。如预期的那样，磷酸化YAP蛋白在表达Sesn2 shRNA的培养物中的表达低于在表达对照shRNA的培养物中的表达（图4d）。此外，在缺乏Sesn2的hCET细胞中野生型Sesn2的重新表达导致磷酸化YAP蛋白水平的增加（补充图S3a）。此外，与表达对照shRNA的细胞相比，在表达Sesn2 shRNA 的培养细胞中YAP的GTIIC报告子活性增加了（图4e）。这些结果表明，Sesn2缺乏症会增加YAP活性。
a使用抗YAP抗体对Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠的受伤和正常角膜切片进行免疫染色。YAP在周围和中央角膜上皮的基底层中表达。白色箭头表示显示YAP核定位的细胞。b来自Sesn2 -/-和Sesn2 + / +小鼠的中央角膜上皮细胞中核YAP的荧光强度。c Sesn2缺乏症增加了YAP核定位。使用抗YAP抗体对表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的hCET细胞进行免疫染色。赫斯特染料被用作复染。dSesn2缺乏症增加了YAP活性。用抗磷酸化-YAP，YAP和肌动蛋白的抗体对表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的hCET细胞进行蛋白质印迹。È表达hCET细胞SESN2 shRNA或对照shRNA与GTIIC力士记者转染。如材料和方法部分中所述测量每个样品中的萤光素酶活性。f使用2 mm打孔器对损伤后Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮伤口愈合进行定量分析。受伤后用20 µM verteporfin或DMSO处理每个角膜。DMSO处理的角膜的伤口面积明显小于Verteporfin处理的角膜。G定量分析表达YAP shRNA或对照shRNA 的Sesn2缺陷hCET细胞的体外伤口愈合情况。与表达对照shRNA的hCET细胞相比，表达YAP shRNA的hCET细胞的伤口闭合显着延迟。ħ的EdU掺入表达SESN2缺陷hCET细胞的测定法YAP shRNA或对照shRNA。i EdU阳性细胞百分比。YAP缺乏会降低角膜上皮细胞的增殖。将表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的hCET细胞用0.5 mM AICAR或DMSO处理，并用磷酸YAP，YAP，磷酸S6，S6和肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹。ķ从细胞裂解物的Western印迹分析SESN2 shRNA的表达与雷帕霉素或DMSO处理hCET细胞。雷帕霉素治疗不影响磷酸化-Yap表达。误差棒代表三个或四个独立实验的平均值±SD。两尾学生t检验（* p <0.05，** p <0.01）。比例尺，50 µm in（c，h）；（a）为100 µm 。
为了进一步研究是否需要YAP来治疗Sesn2缺乏症介导的角膜伤口愈合，用verteporfin （一种阻断YAP和TEAD之间相互作用并抑制YAP功能的卟啉化合物）处理了Sesn2 -//小鼠中机械剥夺的角膜上皮28，或者DMSO。与使用DMSO处理的角膜相比，用Verteporfin处理的角膜的角膜上皮伤口闭合速率明显延迟（图4f，补充图S3b）。我们使用表达YAP shRNA或对照shRNA的慢病毒转导的Sesn2缺陷型hCET细胞进行了体外伤口测定，并观察到表达YAP的培养物中伤口闭合延迟shRNA（补充图S3c）。24小时后，在表达对照shRNA的培养物中伤口区域完全愈合。定量伤口面积的百分比，结果表明YAP缺乏降低了伤口闭合的速率（图4g）。接下来，我们测试了YAP是否能促进角膜上皮细胞的增殖。与表达对照shRNA的Sesn2缺陷型hCET细胞相比，表达YAP shRNA的Sesn2缺陷型hCET细胞中EdU阳性细胞的数量明显减少（图4h，i）。这些结果表明，在Sesn2缺乏介导的角膜伤口愈合中，需要YAP来调节hCET细胞的增殖。
为了确定AMPK是否调节YAP活性，我们用5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸（AICAR），AMPK激活剂或DMSO 处理了表达Sesn2 shRNA或对照shRNA的hCET细胞。Western印迹分析表明，与表达Sesn2 shRNA的DMSO处理的培养物相比，经AICAR处理的表达Sesn2 shRNA的培养细胞中磷酸化S6蛋白的表达降低（图4j）。但是，在表达Sesn2 shRNA的AICAR处理和DMSO处理的hCET细胞之间，磷酸化YAP蛋白的表达没有差异。此外，雷帕霉素处理不影响表达Sesn2的 hCET细胞中的YAP活性shRNA，而在这些细胞中磷酸化S6蛋白的表达则降低（图4k）。这些结果表明，Sensn2通过不依赖AMPK和mTORC1的机制调节YAP激活。
先前已经报道过，Sesn2抑制ROS的产生。为了确定在缺乏Sesn2的角膜中ROS的产生是否增加，我们用DHE染色细胞以特异性检测Sesn2 + / +和Sesn2 -/-小鼠受损角膜中的ROS水平。Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮细胞中DHE的荧光强度高于Sesn2 + / +小鼠的角膜上皮细胞，表明在Sesn2缺陷型角膜中ROS水平升高（图5a）。接下来，我们治疗了Sesn2受伤的角膜-/-N-乙酰半胱氨酸（NAC）（ROS的抑制剂）的小鼠，以评估ROS是否促进角膜伤口愈合。与24小时后DMSO处理的角膜相比，NAC处理的角膜的伤口闭合延迟（图5b，c）。此外，用NAC处理可抑制表达Sesn2 shRNA的hCET细胞的伤口闭合，而DMSO处理的细胞在24 h后可完全愈合（图5d，e）。这些数据表明ROS促进角膜伤口愈合。为了研究ROS是否调节YAP活性，Sensn2受损的角膜上皮细胞-/-将小鼠用NAC或DMSO处理，并用抗YAP抗体进行免疫染色进行分析。YAP蛋白主要在DMSO处理的角膜上皮细胞的细胞核中检测到，而在NAC处理的细胞的细胞质中表达（图6a）。NAC处理的角膜上皮细胞的核YAP荧光强度显着低于DMSO处理的细胞（图6b）。这些结果表明ROS产生诱导YAP核积累。为了确定ROS是否调节YAP活性，我们用H 2 O 2处理了hCET细胞，并使用抗磷酸化YAP抗体进行了蛋白质印迹。H 2 O 2与对照相比，治疗降低了YAP磷酸化（图6c）。用H 2 O 2和NAC 处理的hCET细胞中的磷酸化YAP蛋白的表达水平高于仅用H 2 O 2处理的hCET细胞中的表达水平（图6d）。综上，这些结果表明，Sesn2缺乏症会增加ROS的产生并激活角膜上皮细胞中的YAP。
一个由DHE ROS的检测染色从受伤的角膜部分SESN2 - / -和SESN2 + / +小鼠。Sesn2 -/-小鼠角膜中的DHE荧光强度显着高于Sesn2 + / +小鼠角膜中的DHE荧光强度。b使用2 mm冲头损伤后Sesn2 -/-小鼠的体内角膜上皮伤口愈合。受伤后用2 mM NAC或DMSO治疗每个角膜。c定量分析用NAC或DMSO处理的Sesn2 -/-小鼠的角膜伤口区域。ROS的抑制抑制角膜伤口愈合。d表达用2 mM NAC或DMSO处理的Sesn2 shRNA 的hCET细胞的体外伤口愈合试验。e NAC处理的hCET细胞的伤口闭合比DMSO处理的细胞延迟。误差棒代表三个独立实验的平均值±SD。两尾学生t检验（** p <0.01）。比例尺，（a）中为50 µm ；300微米（d）。
a使用抗YAP抗体对来自用2 mM NAC或DMSO处理的Sesn2 -/-小鼠的角膜切片进行免疫染色。NAC治疗可降低YAP核定位。b NAC或DMSO处理的角膜上皮细胞中核YAP的荧光强度。NAC处理的角膜上皮细胞的核YAP荧光强度显着低于DMSO处理的细胞。c用H 2 O 2处理可增加YAP活性。用0.1或0.2 mM H 2 O 2处理hCET细胞2 h。用磷酸化-YAP，YAP和肌动蛋白抗体对细胞裂解液进行蛋白质印迹分析。d用NAC处理抑制了YAP活性。用0.2 mM H 2 O 2或2 mM NAC 处理hCET细胞，并用磷酸YAP，YAP和肌动蛋白抗体进行Western印迹。误差棒代表三个独立实验的平均值±SD。两尾学生t检验（*** p <0.001）。比例尺，50 µm。
角膜伤口愈合对于维持角膜透明性和正常视力至关重要。角膜上皮细胞增殖是角膜伤口愈合中的关键事件。但是，角膜上皮细胞增殖的分子机制尚不清楚。在这里，我们确定Sesn2为角膜伤口愈合过程中基底上皮细胞增殖的负调节剂。我们还揭示了一种新的未报道的机制，其中Sesn2以AMPK独立的方式抑制YAP活性。
以前的研究已经证明，SESN2抑制人体癌细胞，成纤维细胞和上皮细胞的增殖6，29，30。在本文中，我们发现Sesn2在角膜伤口愈合过程中在上皮细胞中被下调，并且Sesn2 -/-小鼠的角膜伤口愈合比Sesn2 + / +小鼠快。此外，角膜上皮细胞中Sesn2缺乏会促进其增殖。SESN2抑制mTORC1的途径，促进细胞生长和增殖31，32，33。SESN2直接与AMPK，其磷酸化结节性硬化症复合物2（TSC2）和猛禽和抑制mTORC1的信号传导途径相互作用6，34，35。我们显示磷酸化的S6在体内和体外Sesn2缺陷角膜上皮细胞中被上调。Sesn2的重新表达降低了S6蛋白的磷酸化（补充图S3a）。我们还发现雷帕霉素对mTORC1活性的抑制延迟了Sesn + / +和Sesn2 -//-小鼠角膜上皮的伤口闭合。这些结果表明，Sensn2通过抑制角膜伤口愈合中的mTORC1信号传导途径，作为增殖的负调节剂。
YAP起着上皮细胞增殖中起重要作用36，37，38，39。一旦在丝氨酸127位点的去磷酸化，YAP被易位到核中，并随后被激活，以促进与增殖相关基因的转录23，40。我们的结果表明，在角膜伤口愈合过程中，YAP核定位在基底上皮细胞中增加，并且在Sesn2 -/-小鼠中，这些细胞的数量增加的程度更大。用verteporfin（一种YAP抑制剂）治疗可导致Sesn2 -/-小鼠角膜上皮伤口愈合延迟。而且，YAP组合式抑制Sesn2缺陷hCET细胞的增殖。这些结果表明YAP激活是调节Sesn2细胞增殖所必需的。最近的研究表明AMPK 41使YAP失活。该结果表明Sesn2可能通过AMPK调节YAP活性。但是，当使用AMPK激活剂AICAR和mTORC1抑制剂雷帕霉素处理Sesn2缺陷型hCET细胞时，YAP活性不会受到影响，尽管这些细胞中的mTORC1活性降低了。Sesn2可以通过其抗氧化活性抑制ROS的产生42。我们观察到Sesn2 -/-小鼠的角膜上皮中的ROS水平高于Sesn2 + / +小鼠在角膜伤口愈合期间。作为信号分子，ROS涉及多种内在和外在的信号传导途径刺激细胞增殖的43，44。先前的研究表明，ROS对EGF刺激的角膜上皮细胞增殖和伤口愈合必不可少45。我们的结果表明，ROS可以激活YAP以促进增殖。H 2 O 2处理后磷酸化YAP蛋白表达降低诱导产生ROS。但是，用NAC处理可以挽救磷酸化YAP蛋白的表达。此外，NAP处理的角膜上皮细胞中YAP的核定位随伤口闭合延迟而降低。氧化应激可以调节YAP活性46。H 2 O 2刺激诱导TRAF2与MST1结合，导致MST1激活47。MST1 / 2也被激活和促进细胞死亡响应于氧化应激48，49。但是，YAP与FOXO1形成复合物并激活FOXO1介导的抗氧化剂基因的转录，从而降低氧化应激。此过程暗示了YAP在ROS清除中的功能性作用50。有趣的是，最近的一项研究表明，用H 2 O 2 51处理的神经祖细胞中YAP蛋白的表达增加和细胞增殖。另一项研究还报道了细胞内ROS升高会增加YAP蛋白表达并降低YAP磷酸化，但不会影响MST1 / 2或LATS1 52。因此，我们推测ROS介导YAP激活独立于经典的Hippo途径在缺乏Sesn2的角膜上皮细胞中，尽管确切的机制尚不清楚。总之，我们的发现表明，Sesn2的下调通过角膜伤口愈合中ROS的产生诱导YAP激活，而mTORC1信号的激活则由AMPK介导。
有趣的是，YAP的核定位主要限于在伤口愈合过程中经历上皮再形成的中心区域。相反，mTORC1信号在中央和周边区域均被激活。这些结果表明，Sesn2的下调导致YAP和mTORC1信号转导的协同激活，从而促进角膜伤口的上皮再生。最近的一项研究表明，YAP在中央区域和周围区域的基底上皮细胞的细胞质和细胞核中的表达与上皮祖细胞在维持角膜上皮祖细胞中起着至关重要的作用27。角膜上皮祖细胞的增殖潜力对于完整的伤口修复至关重要1。虽然调节YAP活性在角膜上皮祖细胞中的确切机制需要进一步研究，但我们的发现揭示了Sesn2依赖性角膜上皮细胞增殖的新机制，涉及YAP和mTOR信号通路之间的功能性串扰，并暗示Sesn2可以作为伤口愈合中重新上皮化的潜在治疗靶点。
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