在同源重组过程中，Rad51在单链DNA上形成核蛋白丝，以促进DNA链交换。该细丝与双链DNA（dsDNA）结合，寻找同源性，并促进互补链的转移，从而产生新的异源双链体。链交换通过两个不同的三链中间体C1和C2进行。C1包含完整的供体dsDNA，而C2包含新形成的异源双链DNA。在这里，我们显示了Rad51的位点I中保守的DNA结合基序，环1（L1）和环2（L2）在此过程中发挥了不同的作用。L1参与C1络合物的形成，而L2介导C1-C2过渡，产生异源双链体。另一个DNA结合基序，位点II，充当最初Rad51细丝形成以及供体dsDNA掺入的DNA进入位置。

同源重组在两个减数分裂产生遗传多样性和有丝分裂细胞周期期间保持的基因组信息的完整性1，2。同源重组的中心步骤是同源DNA分子之间的DNA链交换反应。此反应是在单链DNA（ssDNA）的DNA双链断裂或超过在模板损伤位点的复制叉的通道后产生的ssDNA的间隙通过核酸酶和解旋酶的协同作用而产生的区域发起3，4，5，6。与ssDNA结合后，RecA家族蛋白会询问完整的双链DNA（dsDNA）是否具有同源性。一旦发现同源性，ssDNA就会侵入dsDNA并取代供体的非互补链，从而形成新的异源双链体。链入侵允许断裂的ssDNA的3'端充当引发修复DNA合成的引物，从而通过从供体中复制丢失的遗传信息来恢复它们。最后，将所得重组中间体是由几个酶促方法解决7，8，9。

RecA家族重组酶（以下称为重组酶）是进化上保守的ATPase，可在重组过程中催化链交换。重组酶包括在RecA的细菌，拉达古细菌，和的Rad51和DMC1在真核生物10，11，12，13。重组酶启动子以依赖于ATP的方式在ssDNA上组装，形成右旋螺旋核蛋白丝，称为突触前丝。这个高阶结构包括参与同源性搜索和随后的DNA链交换反应的催化核心10，14。一旦供体的非互补链被释放，重组酶丝就会包裹在新产生的异源双链DNA周围，这通常被称为突触后丝。

研究最广泛的重组酶是大肠杆菌 RecA 。在突触前的细丝中，RecA每个单体结合三个核苷酸，并且ssDNA的长度被拉伸为B型dsDNA的1.5倍。奇怪的是，拉伸不是均匀的，而是发生在相邻的RecA单体之间，从而导致三联体间间隙的形成。绑定到RecA的三元组始终保留B形式的构象15。

各单体的RecA建议将具有两个不同的DNA结合位点，位点I和位点II，参与链交换反应14，16。认为位点I结合ssDNA形成突触前丝，而认为位点II介导捕获供体dsDNA和同源性搜索。因此，可行的方案是，一旦经由位点II，供体的dsDNA的互补链突触前长丝感官同源性并入位点我以形成与入侵的ssDNA一个新的异源双链体中的灯丝8，17，18，19。

位点I，其周围的突触前长丝的内部进行定向，包含两个保守柔性环，L1和L2 20，21，22，23，24。Chen等通过解析RecA突触前丝的晶体结构。结果显示ssDNA沿位置I的中心轴由L1和L2保留，其核苷酸暴露于内部空腔15。L1中的Met-164和L2中的Ile-199的两个疏水氨基酸残基突出进入三重态间隙，从而稳定了细长的ssDNA。相比之下，在dsDNA结合到位点I的突触后丝中，Let中的Met-164插入互补链的三联体间隙中，而Ile-199则与初始ssDNA 15保持堆叠相互作用。

位点II沿着突触前丝与位点I紧密平行。有人提议，突触前长丝使得触点瞬时和非序列特异性地与经由位点II的传入的dsDNA以形成新生三股关节突触14，16。如果发现足够的同源性，则将供体dsDNA的互补链转移至突触前丝的受体ssDNA，导致异源双链体形成。RecA的Arg-243和Lys-245对II位功能25至关重要。

大肠杆菌 RecA中DNA结合位点的结构特征在重组酶中高度保守。因此，由真核重组酶驱动的链交换的基本过程很可能与由RecA驱动的那些过程非常相似。确实，低温电子显微镜（cryo-EM）研究表明，人类RAD51（HsRAD51）-ssDNA和HsRAD51-dsDNA复合物的近原子分辨结构分别与突触前和突触后复合物非常相似。等效的RecA结构26。作者提出，L2中的Val-273（对应于RecA的Ile-199）插入到ssDNA的三联体间隙中，从而稳定了不对称的ssDNA延伸。Val-273还插入dsDNA的三联体间隙中，表明L2在DNA链交换反应过程中稳定了异源双链DNA产物。此外，L1中的Arg-235插入三联体间隙并与dsDNA的一条链的磷酸酯主链相互作用。有趣的是，RecA缺少对应于Arg-235的氨基酸，这意味着Arg-235可能发挥了区分真核重组酶驱动的链交换反应和原核重组酶RecA驱动的链交换反应的作用。

通过开发实时监控分析，我们最近发现，裂变酵母裂殖酵母（SmRad51）的Rad51驱动的链交换反应通过两个不同的三链中间体，复合物1（C1）和复合物2（C2）进行27。因此，反应包括三个步骤：形成C1，从C1过渡到C2，以及从C2释放非互补供体链。C1和C2中间体具有不同的结构特征。供体dsDNA在C1中保留了原始碱基对，而在C2中，初始ssDNA与供体dsDNA的互补链缠绕在一起。因此，C1和C2分别分别对应于副交感神经和枢纽关节，Radding基团最初提出这些蛋白是RecA驱动的DNA链交换反应的中间体28。所述SWI5-SFR1络合物，高度保守的Rad51 / DMC1活化剂29，30，强烈刺激第二（C1-C2过渡）和第三（C2到最终产品形成）步骤的DNA链交换的27。

在这项研究中，为详细阐明真核重组酶中DNA结合位点I和II的分子作用，我们使用各种方法，包括基于荧光共振能量转移（FRET）的实时链交换，对SpRad51的三个DNA结合突变体进行了表征。吸附法，我们以前开发的27，31。我们发现，一个L1突变体在C1的形成中是有缺陷的，而一个L2突变体则消除了产生异源双链体的C1-C2过渡。这些结果表明，L1和L2在导致异源双链体形成的DNA链交换反应中起着核心但独特的催化作用。此外，我们的发现表明，位点II不仅可以将dsDNA，而且还可以将ssDNA传递到催化位点I，即使以前认为位点II在供体dsDNA捕获和同源性搜索中起主要作用。因此，我们的数据为真核重组酶驱动的链交换反应背后的常见分子机制提供了一些新见解。

三种DNA结合位点突变体的设计

Rad51具有两个DNA结合位点，即位点I和位点II（图   1a）。站点I由两个环路L1和L2组成；站点II位于L2的C端。我们基于氨基酸序列保守性产生了三个突变体。Rad51-L1突变体在L1上有一个单一突变，即Arg-257至Ala（R257A）；这对应于HsRad51中的Arg-235，有人提出它直接参与dsDNA的结合26。Rad51-L2突变体在L2中有一个单一突变，即Val-295突变为Ala（V295A），对应于HsRad51中的Val-273和RecA中的Ile-199。该残基已提出要插入到单链DNA和双链DNA的-三重态间的间隙，以稳定入侵链和异源双链DNA产物，分别15，26。最后，位点II的突变体Rad51-S2含有两个突变，分别为Arg-324至Ala和Lys-334至Ala（R324A和K334A）；这些残基分别对应于精氨酸-243和Lys-245，在的RecA的位点II 15，25。由于已经提出这两个碱性氨基酸残基在DNA结合中起着同等重要的作用，因此我们在S2突变体中将它们两个同时替换为Ala。显示了这些残基在SpRad51 的突触前（图   1b）和突触后（图   1c）丝中的位置。为了在体外分析这些Rad51突变体，使用大肠杆菌过表达系统将它们纯化至同质（补充图   1a）。）。这三个突变体显示出与野生型Rad51相当的圆二色性（CD）分布图和热稳定性，表明这些突变体的整体结构没有明显的损伤（补充图   1b，c）。另外，通过共免疫沉淀测定法判断，这三个突变体能够与野生型Rad51相似地结合Swi5-Sfr1辅助因子（补充图   1d）。

一个的域结构粟酒裂殖酵母的Rad51。DNA结合位点I包含两个环L1和L2。站点II位于L2的C端。显示了这些区域的氨基酸比对。Sp：裂殖酵母；Sc：酿酒酵母；Saccharomyces cerevisiae。主持人：智人。L1中具有R257A突变，L2中具有V295A突变，Site II中具有R324A K334A突变的Rad51突变体分别称为Rad51-L1，Rad51-L2和Rad51-S2。b通过使用HsRad51-ssDNA细丝结构（PDBID：5H1B）进行同源建模构建的SpRad51-ssDNA细丝模型。初始ssDNA显示为红色。L1和L2回路分别为绿色和青色。L1回路中的R257以橙色显示。L2回路中的V295以黄色显示。位置II中的R324和K334以品红色显示。c通过使用HsRad51-dsDNA细丝结构（PDBID：5H1C）进行同源性建模构建的SpRad51-dsDNA细丝模型。初始ssDNA，L1环，L2环，L1环中的R257，L2环中的V295以及位点ll中的R324和K334与图1b中的颜色相同   。初始ssDNA的互补链为蓝色。d使用长DNA底物的DNA三链交换测定。（左上）测定原理图。（左下）三链交换测定的凝胶图像。使用野生型Rad51（WT），Rad51-L1（L1），Rad51-L2（L2）或Rad51-S2（S2）（各5 µM）和Swi5-Sfr1（0.1、0.5和2.5 µM）分析。（右）带切口的圆形dsDNA（NC，最终反应产物之一）和接头分子（反应中间体）的定量产率。野生型和突变型Rad51蛋白的三硝基苯基ATP的e K D值。WT，0.646±0.032；Rad51-L1，0.729±0.031；Rad51-L2，0.448±0.030; Rad51-S2，0.627±0.12。野生型和突变型Rad51蛋白水解ATP的f k cat值。蓝色条，仅Rad51。红色条，Rad51和Swi5-Sfr1。数据（d – f）表示为平均值±sd（n  = 3个独立实验）。源数据作为源数据文件提供。

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Rad51 DNA结合位点突变体在体外DNA链交换中存在严重缺陷

我们首先检查了这些突变的Rad51蛋白的体外DNA链交换活性。为了这个目的，我们采用了使用传统的三链交换测定φ X174病毒环状ssDNA（cssDNA）和阿帕 LI-线性双链DNA（ldsDNA）作为底物（图   1D）。cssDNA和ldsDNA之间的配对产生DNA接头分子（JM）作为中间体，并且在5.4kb长度的突触底物上进行DNA链交换会产生带缺口的圆形双链体（NC）和线性ssDNA。当含有野生型Rad51的反应物补充有Swi5-Sfr1时，可以观察到JM和NC的稳定产生。与之形成鲜明对比的是，当使用突变型Rad51蛋白时，几乎无法检测到这些DNA物种，表明所有三个突变型的链交换活性均大大降低。

Rad51突变体的ATP结合和水解

由于ATP结合和水解对于Rad51驱动的DNA链交换非常重要，因此我们首先检查了Rad51突变体的这些活性（图   1e，f和补充表   1）。L1和S2突变体三硝基苯基ATP（TNP-ATP）（ATP的荧光类似物）的解离常数（K D）与野生型Rad51（图1e）相当   ，表明ATP正常结合。L2突变体的K D值略低于野生型Rad51 的K D值，表明对ATP的亲和力稍高。在省略辅因子（即Swi5-Sfr1和DNA）的大多数条件下，观察到L1突变体的ATPase活性降低（图1f）。 ）。在仅补充了ssDNA的反应中，L2突变体也显示出ATP水解的减少。在没有辅因子和仅存在dsDNA的情况下，S2突变体的ATP酶活性也略有降低。尽管存在这些明显的缺陷，但所有三个突变体在ssDNA，dsDNA和Swi5-Sfr1的存在下（即在链交换测定中使用的条件下）均显示出野生型的ATP水解水平，表明链几乎完全丧失这些突变体的交换活性（图   1d）不能用ATP结合或水解缺陷来解释。

基于FRET的DNA链交换活性实时分析

为了确定在这些Rad51突变体中DNA链交换反应的哪一步是有缺陷的，我们进行了基于FRET的实时测定，以监测DNA链配对和置换27（图   2）。）。在配对试验中，Rad51突触前丝在荧光素标记的ssDNA（83 nt）上形成，然后与若丹明标记的dsDNA（40 bp）混合。一旦突触前细丝与dsDNA相互作用，就会形成包含三链DNA的反应中间体（C1），然后将其加工成另一个中间体（C2）。C1-C2过渡之后是dsDNA未标记链的置换，最终形成异源双链体。在形成C1（两个中间体中的第一个）后，荧光素的荧光发射降低，因为若丹明通过FRET抑制了发射（图   2a）。）。相比之下，Rad51细丝中的ssDNA在DNA置换分析中未标记。取而代之的是，同源供体dsDNA的一条链的5'-末端用荧光素标记，而其互补链的3'-末端用罗丹明标记。一旦突触前丝与同源dsDNA相互作用，就形成了C1中间体并将其加工成C2中间体，然后从供体dsDNA上替换了荧光素标记的ssDNA。在添加突触前链之前，dsDNA上的两种染料都可以进行FRET。从C2中间体发生DNA置换后，荧光素从若丹明中释放出来，从而增加了荧光发射（图   2b）。）。重要的是，Rad51不会影响任何一种测定27中若丹明的荧光素的荧光发射或荧光素的FRET效率。

一个Rad51介导的DNA链配对反应的基于FRET的实时测定。（上）配对反应的示意图。黄色圆圈代表Rad51单体。绿色和棕色的星星分别代表荧光素和若丹明。（下）DNA链配对反应的时间过程。包含荧光素标记的突触前细丝（83 nt）的反应，该细丝由野生型Rad51，Rad51-L1（L1），Rad51-L2（L2）或Rad51-S2（S2）（各为1.5 µM）组成，带有/不带有Swi5-Sfr1通过添加供体dsDNA（40 bp）开始（0.15 µM）（时间= 0），该DNA在突触前丝的互补链末端用罗丹明标记。在493nm激发后在525nm监测荧光发射。野生型Rad51; 浅蓝色，野生型Rad51，带有Swi5-Sfr1；红色，Rad51-L1；绿色，带Swi5-Sfr1的Rad51-L1；紫色，Rad51-L2；黄色，带Swi5-Sfr1的Rad51-L2；黑色，Rad51-S2; 橙色，带Swi5-Sfr1的Rad51-S2；深蓝。b Rad51介导的DNA链置换反应的基于FRET的实时测定。（上）置换反应的示意图。（下）置换反应的时间过程。反应条件与（a）相同，除了供体dsDNA的两端被荧光素和罗丹明标记。C上图显示了三步反应的示意图。在反应式中，[A]，[B]，[C1]和[C2]分别对应于突触前丝，供体dsDNA，C1中间体和C2中间体的浓度。[D]和[E]分别对应于链交换反应的两个产物，异源双链DNA和释放的ssDNA。下图显示了来自基于DynaFit的拟合程序的DNA链配对的速率常数，该程序应用于（a）中获得的数据。数据表示为平均值±sd（n  = 3个独立实验）。另请参阅补充表   2。源数据作为源数据文件提供。

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与我们先前的研究27一致，在配对分析中，野生型Rad51在40分钟内将约20％的底物转化为中间体（图   2a）。Swi5-Sfr1将Rad51活性提高了约2倍。在DNA置换分析中，野生型Rad51在40分钟内将10％的底物转化为最终产物（图   2b）。Swi5-Sfr1将野生型Rad51蛋白的置换活性提高了约4倍。为了分析链交换的反应动力学，我们使用DynaFit软件ver.2模拟了野生型Rad51的配对反应。4.08.016 32并获得其反应常数（图   2c和补充表   2）。DNA链配对测定的实验数据和使用DynaFit通过仿真获得的理论曲线之间的残差表明非常吻合（补充图   2）。这些结果证实，由Rad51介导的DNA链交换反应服从顺序的三步反应模型，涉及两个不同的三链中间体C1和C2，并且Swi5-Sfr1刺激C1-C2过渡和最终的DNA置换步骤。在时间相关信号中显示出相位变化的反应曲线与此概念一致。

L1环的突变消除了Rad51的配对和置换活动

即使在Swi5-Sfr1存在的情况下，L1突变体也没有表现出配对或置换活性（图   2a，b）。因此，我们无法计算这些反应的动力学值。该结果表明R257A突变完全消除了Rad51的DNA链交换活性。

L2回路的突变阻碍C1进程

Rad51-L2环状突变体在配对试验的最初50 s内显示出与野生型Rad51非常相似的曲线。然而，在这一点之后，配对的进程显示出明显的下降（图   2a）。此外，Rad51-L2没有表现出任何置换活性（图   2b）。Swi5-Sfr1复合物刺激了Rad51-L2的配对和置换活性，但到40分钟时，只有约40％的中间体转化为最终产物（尽管在配对测定中约30％的底物形成了中间体，仅〜在置换试验中，有12％的底物产生了最终产物。相比之下，野生型Rad51能够将约95％的中间体转化为最终产物（在配对分析中，约43％的底物形成中间体，而在置换分析中，约41％的中间体产生了最终产物）。这些结果表明，Rad51-L2可以形成反应中间体，但不能有效地将这些中间体加工成最终产物。

为了分析由Rad51-L2驱动的链交换的反应动力学，我们还模拟了Rad51-L2的配对反应（图   2c和补充表   2）。对于野生型Rad51，Rad51-L2的实验数据与通过仿真获得的理论曲线之间的残差表明非常吻合（补充图   2）。两者ķ 1和ķ -1突变的值比野生型的Rad51的〜2.4倍高，导致类似ķ 1（ķ 1每ķ -1）值。这表明，尽管在野生型Rad51和Rad51-L2反应中C1的量是可比较的，但是在Rad51-L2介导的反应中C1的形成和破坏比野生型Rad51介导的反应更频繁地发生。相比之下，尽管该突变体的K 2（k 2 / k -2）值比野生型Rad51高约5倍，但k 2和k -2Rad51-L2的值分别比野生型Rad51小36倍和165倍。这些结果清楚地表明，在Rad51-L2突变体中，C1-C2过渡的动力降低了。第三步太慢，无法确定反应速率常数k 3和k -3。

Swi5-Sfr1 通过野生型Rad51催化提高了反应的K 2和K 3（k 3 / k -3）值，主要是通过k -2降低约2.5倍，k升高约2.5倍。如图3所示，k -3下降约5.3倍（补充表   2），如先前报道27。尽管Swi5-Sfr1也增加了k 2和k -2如果将Rad51-L2反应的R2值（分别约为10倍和21倍），仍分别比野生型Rad51的低约4.1倍和约3.0倍（图   2c）。Swi5-Sfr1 将由Rad51-L2催化的反应的k 3和k -3增加到与野生型Rad51相似的值。

综上所述，这些发现表明Rad51-L2能够熟练C1的形成，尽管保留了与Swi5-Sfr1的功能相互作用，但在处理C1-C2的过渡过程中却存在严重的缺陷。

位点II的突变消除了C1的形成

配对分析表明，Rad51-S2反应的进行比野生型Rad51反应的进行得慢得多，并且Swi5-Sfr1并未明显刺激Rad51-S2的配对活性（图   2a）。另外，Rad51-S2即使在Swi5-Sfr1存在下也没有表现出任何置换活性（图   2b）。尽管反应进行得非常缓慢，但实验数据和通过仿真获得的理论曲线之间的残差表明非常适合Rad51-S2（补充图   2）。与野生型Rad51相比，k 1和k -1即使在存在Swi5-Sfr1的情况下，Rad51-S2反应的值极低（分别低约180倍和约108倍）（分别低约171倍和约240倍）（图2c和图2c）。   补充表   2）。结果，由Rad51-S2驱动的链交换反应的进程太慢，无法确定后续步骤（k 2，k -2，k 3和k -3）的反应速率常数。因此，我们得出结论，Rad51-S2在C1形成中有缺陷。

C1中间体在L2回路突变体中积累

根据图2所示的结果   ，我们预测C1中间体会在Rad51-L2介导的链交换反应中积累。为了直接测试这一点，我们进行了配对启动的流产DNA链交换测定（图   3a）27。在此分析中，在配对开始后5、10或20分钟将EDTA加入配对反应中，以螯合Mg 2+导致核苷酸耗竭，并因此使Rad51从DNA解离，进而导致链交换中间体崩溃。如果中间体塌陷为底物，则会观察到荧光发射的增加，如果C1中间体积聚，因为它们无法转化为C2中间体，就会发生这种情况。相反，如果中间体分解成产物，则荧光发射基本上不会改变，如果C2中间体（和反应产物）比C1丰富，则会发生荧光发射。结果表明，在所有时间点添加EDTA后，荧光发射均增加，表明C1中间体已在所有测试的反应中积累（图   3b-e）。

配对启动的流产DNA链交换测定的示意图。将EDTA加入正在进行的配对反应中以螯合Mg 2+，从而导致Rad51从中间体中解离。如果将C1中间体转化为底物，则荧光发射增加，但是如果将C2中间体转化为产物，则荧光发射基本不会改变。b – e配对启动的流产测定的时间过程：b野生型Rad51；c具有Swi5-Sfr1的野生型Rad51；d Rad51-L2; 和e带Swi5-Sfr1的Rad51-L2。链配对反应开始后，如箭头所示，在5分钟（蓝色），10分钟（红色）或20分钟（绿色）中将EDTA加入到反应混合物中。f C1中间体的累积时间（输入的百分比）。野生型Rad51; 带Swi5-Sfr1的蓝色野生型Rad51；红色，Rad51-L2；绿色和带Swi5-Sfr1的Rad51-L2; 紫色。数据表示为平均值±sd（n  = 3个独立实验）。源数据作为源数据文件提供。

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为了估计转化为底物的C1中间体的量，我们通过从添加EDTA后的200 s的强度中减去添加EDTA之前的强度来计算荧光的变化（图   3f）。在与野生型Rad51蛋白的反应中，加入EDTA后，约50％的反应中间体转化为底物。Swi5-Sfr1复合物减少了C1的量，这与Swi5-Sfr1刺激C1-C2过渡的观点一致，从而减少了在添加EDTA时可塌陷成底物的C1的量。在反应开始后20分钟，Rad51-L2积累的C1中间体比野生型Rad51多2倍（图   3d，f）。尽管包含Swi5-Sfr1导致C1降低了约2倍，但这仍小于野生型Rad51与Swi5-Sfr1结合时观察到的约4倍的降低（图   3e，f）。这些结果表明Rad51-L2在形成含有从头异源双链DNA的C2中间体方面存在缺陷。

Rad51-L2缺乏从头异源双链DNA的形成

更直接地监控在C2异源双链DNA的形成，我们适于我们的链交换法使得单链DNA含有2-氨基嘌呤（2AP），腺嘌呤的荧光类似物的碱基对与胸腺嘧啶33，34，35，36，37，38，39。2AP的荧光发射在2AP胸腺嘧啶碱基对的形成，这应仅发生在形成中间C2的，反映由链交换异源双链体形成降低40，41（图   4A）。

图1是使用含有2AP的ssDNA的DNA链交换反应的示意图。b使用野生型Rad51进行DNA链配对反应的时间过程。（左）Rad51与含有2AP的ssDNA和具有同源（蓝色）或异源（红色）序列的dsDNA的配对反应。（中心）Rad51 + Swi5-Sfr1与含有2AP的ssDNA和dsDNA具有同源（蓝色）或异源（红色）序列的配对反应。（右）使用野生型Rad51，荧光素标记的ssDNA和若丹明标记的dsDNA（具有同源（蓝色）或异源（红色）序列）进行基于FRET的DNA链配对反应的时间过程。C使用Rad51-L2突变体的DNA链配对反应的时间过程。（左）Rad51-L2与含有2AP的ssDNA和具有同源（蓝色）或异源（红色）序列的dsDNA的配对反应。（中心）Rad51-L2 + Swi5-Sfr1与含有2AP的ssDNA和具有同源（蓝色）或异源（红色）序列的dsDNA的配对反应。（右）使用Rad51-L2，荧光素标记的ssDNA和若丹明标记的dsDNA的FRET基DNA链配对反应的时程，该序列具有同源（蓝色）或异源（红色）序列。d配对反应开始后25分钟2AP的荧光强度变化，由（b）。与同源dsDNA和完全异源dsDNA的反应结果分别显示为蓝色和红色条形。数据表示为平均值±sd（n  = 3个独立实验）。源数据作为源数据文件提供。

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将野生型Rad51，含2AP的ssDNA和与ssDNA同源的dsDNA合并后，约8％的底物被转化为产物（图   4b，ho）。Swi5-Sfr1刺激了约2倍的反应，与我们先前的报道一致27。相反，当dsDNA与ssDNA异源时，发射的变化可忽略不计（约10％的同源dsDNA反应）（图   4b，他）。

重要的是要注意，图2中描述的基于FRET的配对分析   本身无法检测到C2的形成。这是因为足以形成FRET的C1的形成并不依赖于突触前丝和dsDNA之间的同源性（图   4b）。相比之下，包含2-AP的测定法只能检测C2的形成，因为仅在可形成异源双链DNA的条件下（即，使用同源底物时）观察到底物的减少（图   4b）。一致的是，含有同源底物和野生型的Rad51（有或没有SWI5-SFR1）的2-AP反应呈准线性曲线，而相比之下，在等效基于FRET的测定配对看到的曲线（图   4b中）。两者合计，我们得出结论，该测定法确实可以检测同源底物之间的从头异源双链DNA的形成。

在2-AP分析中使用Rad51-L2时，底物的变化比野生型Rad51蛋白的底物变化小约2.9倍（图   4c）。尽管Swi5-Sfr1复合物刺激了Rad51-L2反应，但产物的量比含有野生型Rad51的同等反应量低约1.7倍（图   4d）。两者合计，这一发现进一步表明，Rad51-L2在将C1中间体转化为C2中间体方面特别有缺陷，其中C2中间体含有由链交换反应形成的从头异源双链DNA。

Rad51突变蛋白形成的突触前丝的特性

由于L1和S2突变体在DNA配对中具有明显的缺陷（图   2a），因此我们认为这些突变体可能形成异常的突触前丝。相比之下，如果L2突变体的缺陷仅限于C1-C2过渡，则它应能够形成与野生型相当的突触前丝。因此，我们使用荧光各向异性测试了Rad51突变体的稳态ssDNA结合活性。与这些期望一致，L1和S2突变体在ssDNA结合活性中表现出轻度缺陷，其K D   值略高（分别为1.8和2.5倍），而L2突变体的ssDNA结合活性与野生型相当。 Rad51（图   5a和补充表   3）。一致地，通过电泳迁移率变动分析（EMSA；蛋白质-ssDNA复合物被共价交联以保留不稳定的结构，在电泳之前）分析ssDNA结合，表明L2突变体显示出与野生型Rad51类似的迁移率迁移，而L1和野生型Rad51和S2突变体表现出略微降低的迁移率变化（补充图   3a）。

一个是通过测量荧光各向异性观察到野生型和突变体的Rad51蛋白质突触前的长丝形成。将Rad51蛋白滴定到含有ssDNA（3 µM核苷酸）的反应混合物中。野生型Rad51; 蓝色，Rad51-L1；红色，e，Rad51-L2；绿色，Rad51-S2；紫色。bRad51和ssDNA之间缔合的动力学。如“方法”中所述，在开始测量荧光各向异性之后60 s，将野生型或突变型Rad51蛋白注入包含TAMRA标记的ssDNA的比色杯中。（左）野生型Rad51（蓝色），Rad51-L1（红色），Rad51-L2（绿色）和Rad51-S2（紫色）（每个0.4 µM）在TAMRA标记的ssDNA（1.2 µM）上的缔合动力学。（中）野生型Rad51和Rad51-L1（每个0.8 µM）在TAMRA标记的ssDNA（2.4 µM）上的缔合动力学。（右）TAMRA标记的ssDNA（4.5 µM）上的野生型Rad51和Rad51-S2（1.5 µM）缔合动力学。c从补充图4中的解离分析计算得出的ssDNA的DNA结合突变体的解离速率常数   。d突触前丝的伸长。（上）示意图描述了使用FRET观察突触前丝的伸长。黄色球代表Rad51单体。绿色和红色的球分别代表荧光素和若丹明。（左下）荧光素和若丹明的发射光谱，被11个核苷酸隔开，在493 nm处激发。在ATP存在下，将野生型Rad51（3 µM）和Swi5-Sfr1（0.3 µM）与双标记的ssDNA（3 µM，核苷酸）混合。（右下）从此处和补充图5所示的发射光谱中计算出存在ATP或AMP-PNP时的FRET效率（E FRET）   。橙色虚线表示与B型DNA相比，两个荧光团之间的距离。* p通过两尾学生t检验 得出 = 1.53×10 -4和** p = 8.64×10 -6。数据（a，c，d）表示为平均值±sd（n  = 3个独立实验， 只有d的 DNA的n = 12 ）。源数据作为源数据文件提供。

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为了进一步表征这些Rad51突变体的ssDNA结合活性，我们实时分析了与ssDNA的关联（图   5b）。当蛋白质浓度为0.4 µM时，L1和S2突变体不会引起与野生型蛋白质相同程度的各向异性变化。相反，含有L2突变体的反应具有与野生型Rad51相同的各向异性。因此，L2突变体具有正常的ssDNA结合活性，而L1和S2突变体与ssDNA的结合严重不足，这与稳态结合测定的结果一致（图   5a）。）。当以比标准条件高两倍的浓度添加ssDNA和Rad51-L1时，L1突变体显示出与野生型蛋白质相似的缔合动力学，表明L1突变体具有接近正常的ssDNA缔合潜力（图。   5B）。另一方面，当以比标准条件高三倍的浓度添加ssDNA和Rad51-S2时，各向异性的总增加量与野生型Rad51相似，但增加速度要慢得多，这表明Rad51 -S2与ssDNA相关联是严重缺陷的（图   5b）。在这些实验条件下，对于野生型Rad51和突变体，Swi5-Sfr1对ssDNA结合的影响很小（补充图   3b）。

接下来，为了检查由突变体形成的突触前丝的解离，我们将包含Rad51-ssDNA丝的缔合试验的反应混合物稀释（1:40）到反应缓冲液中，不添加任何蛋白质或DNA，并实时监测丝的解离。通过一阶衰变模型计算这些突变体对ssDNA 的解离速率常数（k off）（图   5c，补充图   4，补充表   4）。野生型Rad51 的k off值为0.0116（s -1）。0.04 µM和0.2 µM Swi5-Sfr1的存在降低了k off由值〜4.3-和〜9倍，分别表示SWI5-SFR1通过防止的Rad51的从单链DNA，一致的解离与以前的报告稳定的Rad51灯丝42，43。在不存在Swi5-Sfr1的情况下，由L2突变体形成的细丝显示出与野生型Rad51相似的k off值，而L1和S2突变体具有略高的k off值（图   5c）。Swi5-Sfr1的添加显着减少了k off这三个突变体的最大数值，尽管L2突变体的数值较小。这些结果表明，由L1和S2突变体形成的细丝被Swi5-Sfr1有效地稳定了。Rad51-L2细丝稳定性的明显降低可能是无关紧要的，因为它形成的C1中间体的数量与野生型Rad51相似（图   2）。显然，这些结果表明，S2突变体对ssDNA的低亲和力不是由与ssDNA的快速解离引起的，而是由与ssDNA的缓慢缔合引起的，表明位点II参与了ssDNA的捕获。

Rad51突触前丝伸长仅在L2突变体中有轻度缺陷

的单链DNA在突触前长丝的活性形式比B型DNA延长约1.5× 26，44，45。为了确定此处检查的突变Rad51蛋白是否形成了细长的突触前细丝，我们利用了另一种基于FRET的检测方法（图   5d）。在该测定中，内部用荧光素和罗丹明标记的73-mer ssDNA（由11个核苷酸分隔）用作突触前丝形成的底物。Rad51与ssDNA的结合有望使ssDNA线性化，有效增加荧光素与若丹明之间的距离，从而降低FRET效率（E FRET）。一致地，当双重标记的ssDNA与野生型Rad51混合时，E FRET降低了约50％（图   5d和补充表   5），相当于B型DNA长度的1.45倍。所述ê FRET值在SWI5-SFR1（1.58×B型DNA）的存在下进一步降低。此结果与表示SWI5-SFR1伸长突触前长丝并保持它处于激活状态之前的报道一致46，47。当从反应中省略ATP时，该伸长率大大受损（补充图   5a）。不可水解的ATP类似物AMP-PNP也诱导了类似的伸长（1.58×B型DNA）（图   5d，补充图   5a，b和补充表） 5）。这些结果表明，无需随后水解的ATP结合就足以使Rad51细丝伸长。L1和S2突变体形成了与野生型Rad51相当的细长细丝，并对Swi5-Sfr1表现出相似的响应（图   5d，补充图   5a，b和补充表   5）。在没有Swi5-Sfr1的情况下，Rad51-L2突变体在细丝伸长方面显示出轻微缺陷（1.40x B型DNA与野生型1.45x相比），但在活化剂存在下未观察到缺陷。

这些ssDNA结合实验共同表明，尽管L1和S2突变体在ssDNA缔合中存在一些缺陷，但一旦由两个Rad51突变体形成细丝，它们就不会表现出任何明显的缺陷。在没有Swi5-Sfr1的情况下，L2突变体在ssDNA结合方面没有明显缺陷，而在ssDNA延伸方面仅存在少量缺陷。因此，我们推测，负责破坏Rad51-L2的DNA链交换的缺陷主要表现在突触阶段期间和/或之后。

L1环或II位点的突变严重破坏了dsDNA的结合

Rad51与dsDNA的结合在同源搜索中至关重要。因此，我们使用荧光各向异性分析了突变体的dsDNA结合活性（图   6a和补充表   3）。dsDNA的野生型Rad51 的K D为2.79 µM，比ssDNA的相应值大约7.3倍。与野生型Rad51相比，L2突变体的K D值略有增加，而L1和S2突变体具有如此低的dsDNA结合活性，以致我们无法计算K D。他们的价值观。重要的是，L1突变体显示dsDNA结合几乎完全丧失，而S2突变体保留了dsDNA结合的一些潜力。有趣的是，通过EMSA对dsDNA结合的分析表明，除了L1和S2突变体之外，L2突变体还表现出比野生型Rad51弱的迁移率迁移（图   6b）。尽管L2突变体的EMSA模式具有相似的K D值，但它与野生型Rad51的EMSA模式存在实质性差异，这一事实增加了由Rad51-L2形成的dsDNA细丝的构型与野生型Rad51 形成的dsDNA细丝构象不同的可能性。输入Rad51。

一个是通过测量荧光各向异性观察到野生型的Rad51（蓝色），的Rad51-L1（红色），-L2（绿），或-S2（紫色）的Rad51双链DNA长丝形成。将Rad51蛋白滴定到含有dsDNA（3 µM bp）的反应混合物中。b凝胶位移测定。将各种浓度的野生型和突变型Rad51蛋白（1.25、2.5、5.0和10 µM）与dsDNA（10 µM核苷酸）混合。在37°C下孵育15分钟后，Rad51-dsDNA细丝与戊二醛交联。CRad51-dsDNA细丝的伸长。（上）示意图描述了使用FRET观察Rad51-dsDNA细丝的伸长。通过在493 nm处激发，收集了在同一链上被11个核苷酸隔开的荧光素（绿色）和若丹明（红色）的发射光谱。黄色球代表Rad51单体。（下）荧光素和若丹明的发射光谱。将野生型Rad51（左下方）或Rad51-L2（下部中央）（每个8 µM）和Swi5-Sfr1（0.8 µM）与双标记的dsDNA（3 µM bp）混合，并分析荧光素和罗丹明的发射光谱如“方法”中所述，在493 nm激发后收集样品。（右下）FRET效率（E FRET从此处和补充图5所示的发射光谱中计算出在ATP或AMP-PNP存在下含有野生型Rad51或Rad51-L2的每种反应条件   。d，e中的橙色虚线表示与B型DNA相比两个荧光团之间的距离。* p  = 1.32×10 -5，** p  = 4.17×10 -13和*** p  = 1.17×10 -5（通过两尾Student t检验）。数据（a，c）表示为平均值±sd（n  = 3个独立实验，但n ＝仅在c）中对DNA的6个独立实验。源数据作为源数据文件提供。

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Rad51-L2无法完全延伸dsDNA

双链DNA在突触后长丝是约1.5x比B型DNA长26，44，45。为了检查Rad51-L2是否形成了细长的突触后细丝，我们通过基于FRET的分析方法使用如前所述的双标记dsDNA分析了Rad51促进的dsDNA延伸（图   6c）。所述ê FRET值在野生型的Rad51的存在减少了0.459，这表明双链DNA时的Rad51结合（图细长   6C和补充表   6）。这相当于B型DNA长度的1.37倍。Swi5-Sfr1对E FRET值（1.39x B型DNA）影响很小。该Ë FRET在AMP-PNP（1.44×B型DNA）存在下，该值进一步降低。反应中缺少ATP会大大削弱dsDNA的延伸（补充图   5c）。因此，与ssDNA延伸非常相似，dsDNA延伸需要ATP结合而不需要水解。重要的是，对于Rad51-L2突触后丝，E FRET的降低明显较小（0.370）（图   6c，补充图   5d和补充表   6）。此值对应于B型DNA长度的1.28倍。像野生型Rad51一样，Swi5-Sfr1 对Rad51-L2（1.30×B型DNA）的E FRET值没有实质性影响。E FRET的减少即使在存在AMP-PNP的情况下，Rad51-L2的值也小于野生型Rad51（1.33×B型DNA，而野生型Rad51为1.44×）。野生型Rad51和L2突变体之间的这些值差异具有统计学意义。因此，这些结果清楚地表明，Rad51-L2的dsDNA延伸受到损害，这很可能解释了为什么Rad51-L2在C1-C2过渡中有缺陷。

很难想象Rad51细丝如何催化DNA链交换反应。在这项研究中，为破译DNA链交换反应的分子机制，我们应用了多种基于FRET的分析系统来分析Rad51的三个DNA结合位点突变体：Rad51-L1，Rad51-L2和Rad51-S2。Rad51-L1和Rad51-L2突变体分别在位点I的L1和L2的保守氨基酸残基处具有单一突变，而Rad51-S2突变体在位点II的两个保守性氨基酸残基处具有突变，均已提出发挥DNA结合同样重要的作用15，25。三种突变蛋白相对于野生型Rad51表现出不同的特征。

Rad51-L1（R257A）突变体显示DNA链交换活性几乎完全丧失（图   1 d和2）。尽管Rad51-L1对ssDNA的亲和力略有降低（K D比野生型Rad51 高1.85倍）（补充表   3），但Rad51-L1形成的突触前丝显示出与野生型Rad51相当的特性，包括延伸的ssDNA构象和对Swi5-Sfr1的响应性（图   5）。然而，该突变体显示出与dsDNA结合的严重缺陷（图   6a，b），因此不能形成C1。这些发现表明，Arg-257对于捕获dsDNA和形成C1中间体很重要（图   7a）。）。

a Rad51的每个DNA结合位点在DNA链交换反应中的作用。黄色圆圈，黑色线和红色双线分别表示Rad51单体，ssDNA和供体dsDNA分子。b链交换反应的模型按突触前长丝（显示了三种与ssDNA结合的Rad51单体），C1，C2和突触后长丝的顺序进行。仅显示了L1中的Arg-257（橙色），L2中的Val-295（黄色）（浅蓝色）和位点II（Arg-324和Lys-334，紫色）。通过对接图1b中所示的SpRad51-ssDNA细丝模型来构建C1的结构模型。 和扩展的dsDNA。传入的dsDNA保留其双链碱基对，而入侵的ssDNA（红色）与传入的dsDNA的互补链（蓝色）对齐（但不配对）。突触前细丝的L1中的Arg-257和L2中的Val-295分别与互补链和侵入链紧密相邻。由于在初始模型中观察到空间位阻（补充图   6a），因此dsDNA与位点II（Arg-324和Lys-334）分离。通过对接图1c中所示的SpRad51-dsDNA细丝模型来构建C2的结构模型 和扩展的ssDNA。由入侵的ssDNA（红色）和进入的dsDNA的互补链（蓝色）组成的异源双链体已经参与碱基配对，并且非互补的ssDNA（绿色）已从进入的dsDNA置换。L1中的Arg-257和L2中的Val-295从相反方向插入进入的dsDNA，稳定了异源双链DNA。位点II与被置换的ssDNA相互作用。源数据作为源数据文件提供。

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Rad51-L2（V295A）突变体形成了C1，但随后的反应比野生型Rad51慢得多，即使存在Swi5-Sfr1也是如此（图   2和补充表   2）。流产链交换测定显示，Rad51-L2积累的C1水平高于野生型Rad51（图   3）。一致地，用2AP进行的DNA链交换测定法直接证明Rad51-L2形成的C2中间体水平明显低于野生型Rad51（图   4）。Rad51-L2形成的突触前丝表现出与野生型蛋白相似的特性（图   5），Rad51-L2保留了dsDNA结合活性（图   6a，b）。因此，我们得出的结论是，V295A突变特别损害了C1-C2的转化（图   7a）。值得注意的是，Rad51-L2不能完全拉伸ssDNA或dsDNA。但是，尽管可以通过加入Swi5-Sfr1或AMP-PMP来克服ssDNA延伸的缺陷，但dsDNA延伸的缺陷却不能，这表明V295在dsDNA延伸中起着关键作用（图   5 d和6c）。RecA-dsDNA晶体学数据15和人类Rad51-dsDNA复合物的冷冻EM观察26提示相应的氨基酸侧链插入两个三胞胎之间以稳定dsDNA。综上所述，我们提出L2环中的V295通过稳定C2中间体中的异源双链DNA来促进链交换反应。

像L1突变体，所述的Rad51-S2（R324A和K334A中位点II）突变体显示DNA链交换活性（图的近完全丧失   1 d和2）。该突变体没有产生可计算的dsDNA K D值（图   6a和补充表   3），并且包含Rad51-S2的链交换反应中的k 1和k -1值大大降低，表明C1形成严重缺陷。 （图   2和补充表   2）。这些观察结果与位点II参与dsDNA结合的观点一致，如先前所提出的14，16。有趣的是，该突变体对ssDNA的亲和力也大大降低（图 5a，b和补充图 3a），这表明位点II不仅对于dsDNA结合而且对ssDNA结合都很重要。此外，由Rad51-S2形成的突触前丝显示出与野生型Rad51相似的关闭速率，并且与野生型丝相似地延长了S2丝。此外，Swi5-Sfr1介导的稳定作用对于Rad51-S2形成的突触前丝是正常的（补充表 4）。因此，观察到的低亲和力是因为Rad51-S2在ssDNA上的开启率比野生型蛋白质低得多（图 5）。）。综上所述，这些观察结果表明，由这种突变引起的链交换缺陷主要是由于与ssDNA和dsDNA的结合缺陷，而不是由于形成异源双链DNA所需的催化功能缺陷（图   7a）。）。因此，我们假定位点II充当ssDNA和dsDNA的进入门。

为了探索涉及的机制，我们使用对接模拟构建了两个反应中间体的结构模型。在C1复合物中，供体dsDNA和突触前丝中的ssDNA对齐而不参与碱基配对。因此，我们尝试通过结合图1b中建模的SpRad51-ssDNA细丝和具有最小空间位阻的扩展B型DNA 来构建C1的结构模型   。然而，正如Xu等人所暗示的，当L1中的Arg-257被插入到dsDNA的三联体间隙中时。如图26所示，位点II定向为与dsDNA相互作用，L2与dsDNA之间发生了碰撞（补充图   6）。避免这种冲突的唯一方法是使dsDNA的一条链穿过L2环，或者使dsDNA远离L2。由于C1无法使用前一种配置，因此我们采用了后一种选项。结果，dsDNA与位点II分离。所得的C1模型如图7b所示   。在这个模型中，VAL-295插入物的在两者之间的细长的ssDNA两个三联体在侧链原始突触前复杂的，如先前所报道的15，26。

在C2复合物中，突触前丝中最初侵入的ssDNA与供体dsDNA的互补链缠绕在一起。按照这种配置，在对应于置换链的延伸ssDNA与图1b中建模的具有最小空间位阻的突触后丝之间进行了对接模拟   （图   7b）。这导致位点II与置换链的相互作用而没有任何明显的空间位阻。在得到的C2结构中，L1中的Arg-257和L2中的Val-295从相反方向插入dsDNA，从而稳定了异源双链DNA，如前所述26。这些观察结果暗示Arg-257和Val-295可能有助于募集互补链并降低互补链的能量状态，以便在同源搜索中进行碱基配对26。

基于上述结果和可用的结构信息，我们提出了以下链交换反应模型。首先，位点II中的Arg-324和Lys-334促进了ssDNA的捕获，形成了突触前丝。随后，突触前丝中L1中的Arg-257介导dsDNA捕获，导致C1形成。站点II中的基本补丁程序还有助于充当dsDNA捕获的入口门。一旦L1中的Arg-257插入dsDNA，dsDNA便与II位分离。因为位点II和dsDNA之间的强静态相互作用不利于链交换，所以dsDNA从位点II在C1复合物中的释放对于向C2复合物的发展至关重要。从位点II释放dsDNA后，L2环中的Val-295插入进入的dsDNA中，从而在dsDNA中形成三联体之间的缺口，这减少了堆叠交互。这可能导致三联体扑动的可能性增加，这在同源性搜索中被利用。当捕获的dsDNA与ssDNA具有同源性时，会瞬间形成3 bp的从头异源双链。如果同源性很强，则在每个三联体处依次插入Arg-257和Val-295会导致异源双链体延伸，从而导致C2复合物形成。该反应对应于C1-C2跃迁。重要的是，L2回路中的Val-295直接参与此步骤，如实时测定结果所示（图2）。在每个三联体上连续插入Arg-257和Val-295会导致异源双链体延伸，从而导致C2复合物形成。该反应对应于C1-C2跃迁。重要的是，L2回路中的Val-295直接参与此步骤，如实时测定结果所示（图2）。在每个三联体上连续插入Arg-257和Val-295会导致异源双链体延伸，从而导致C2复合物形成。该反应对应于C1-C2跃迁。重要的是，L2回路中的Val-295直接参与此步骤，如实时测定结果所示（图2）。 2）。此外，Val-295还可以稳定C2络合物中的异源双链。位点II还稳定了C2复合物中置换的ssDNA，其以互补的方式起作用以防止发生逆反应。

RecA的位点II被认为在dsDNA捕获和同源性搜索中起关键作用。以前认为，当突触前丝遇到同源序列时，双链体DNA的互补链会移入位点I，与初始ssDNA形成异源双链体。据认为，这一过程将得到第二地点25的帮助。然而，最近的研究表明RecA的和HsRAD51结合单链DNA比更强烈的双链DNA和捕捉只有一个双链DNA链的该网站II，离开基地采样结合的互补链提供18，19，48。此外，酿酒酵母据EMSA判断，Rad51-II3A（ScRad51-II3A）突变体在II号位点有两个突变（K361A和K371A），在Walker A模体中有一个突变（R188A），据显示对ssDNA和dsDNA的结合亲和力降低。49。从这个意义上讲，ScRad51-Il3A突变体与此处介绍的SpRad51-S2突变体相似，尽管前者在Walker A母题中有一个额外的突变。此外，Cloud等。结果表明，ScRad51-II3A突触前细丝不能与异源dsDNA 49结合，这与我们对SpRad51-S2 C1形成严重缺陷的证明非常吻合（图   2）。总的来说，我们使用Rad51-S2获得的结果与这些最新观察结果基本一致。因为C2复合物的形成需要L2环中的Val-295，但在位点II中没有残基，所以位点II的基本作用必须是提供有利于ssDNA和dsDNA结合的基本补丁。

这两个对应的Val-295在SpRad51的L2的ILE-199的RecA和Val-273 HsRAD51的，的，显示出插入到这两个单链DNA的-三重态间间隙和双链DNA细丝15，26。我们的数据清楚地表明，Val-295对于延长ssDNA和dsDNA确实很重要。HsRad51细丝的冷冻-EM结构表明，Val-273比dsDNA 26更浅地插入ssDNA的三重间隙。我们期望浅插入Val-295足以稳定细长的ssDNA细丝，但是稳定细长的dsDNA细丝需要更深的Val-295插入。值得注意的是，Swi5-Sfr1或AMP-PNP可以完全克服ssDNA延伸中L2突变体的缺陷（图   5d），两者的诱导的活性的突触前灯丝29，42。相反，Swi5-Sfr1或AMP-PNP不能抑制dsDNA延伸中L2突变体的损伤。由于L2突变体在C1-C2过渡中存在严重缺陷，因此观察到的dsDNA延伸受损意味着dsDNA延伸对于C1-C2过渡至关重要。有趣的是，ssDNA和dsDNA延伸都不需要ATP水解，因为延伸是在AMP-PNP存在的情况下发生的，而C1–C2过渡需要ATP水解27。ATP水解可能与L2的运动有关，L2的运动最初位于突触前细丝中的ssDNA，然后位于从头异源双链体中的dsDNA。

Rad51-L2突变体在不存在DNA或存在ssDNA的情况下显示出降低的ATPase活性。但是，在存在dsDNA或同时存在ssDNA和dsDNA的情况下，ATP水解均未显示缺陷（图   1f）。L2突变体的ATP水解缺陷不能由不能结合ssDNA来解释，因为L2突变体与野生型Rad51相似地结合ssDNA（图   5）。更重要的是，野生型的Rad51 裂殖酵母表现出实质性的ATP酶活性，即使在不存在的ssDNA（图的   1F），如先前所报道的29，42，50，不像ScRad51或HsRad51 51，52。因此，我们推测存在ssDNA的情况下L2的低ATPase活性不是L2突变体无法驱动C1-C2转变的主要原因。尽管野生型蛋白的ATPase活性被ssDNA略微刺激，但L2突变体未观察到这种ATPase刺激。预计不会在L2突变体中发生的Val-295插入ssDNA三联体之间可能会诱导ssDNA对ATPase的刺激，因此有可能解释了为什么L2突变体会失去ssDNA刺激的ATP水解。

最近的研究表明，Rad51蛋白细丝可以起到通过阻止溶消化，保护DNA在复制叉53，54。重要的是，Rad51驱动DNA链交换的能力似乎对于这种作用是必不可少的。由于L1和L2突变体大多精通ssDNA结合并且能够形成稳定的突触前细丝（图   5a，c），因此检查它们是否擅长复制叉保护将很有趣。

总之，由于现在可以使用多个实时分析系统分析链交换反应的三个步骤，因此我们的结果为反应机理提供了新的见解，而常规分析无法对其进行剖析。本文介绍的概念模型为详细了解Rad51依赖性同源重组背后的精确分子机制提供了框架。

蛋白质类

Rad51，Swi5-Sfr1复合物和RPA复合物（Rpa1-Rpa2-Rpa3）使用大肠杆菌 BL21-Codonplus（DE3）RIPL（Agilent）过表达。每种情况下的表达条件都相同（在18°C下用1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷[IPTG]诱导〜15 h诱导）。将细胞沉淀重悬于含有300 mM NaCl的R缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA，1 mM DTT和10％甘油）中，并通过超声处理破坏。将全细胞提取物以50,000× g离心  1 h。后续步骤取决于蛋白质，如下所述。

对于Rad51，将硫酸铵添加到上清液中至35％饱和度，并将混合物以18,000× g离心。 1小时。然后将沉淀重悬于含有100 mM KCl的P缓冲液（20 mM磷酸钾pH 7.5、0.5 mM EDTA，0.5 mM DTT和10％甘油）中，并将混合物置于SP Sepharose（GE Healthcare）柱上。收集流通部分并将其上样到Q Sepharose（GE Healthcare）色谱柱上，并用100至800 mM KCl的线性梯度洗脱蛋白质。Rad51蛋白的峰级分出现在〜400 mM KCl处。用P缓冲液将级分稀释4倍，并加载到Hitrap Heparin柱（GE Healthcare）上。Rad51以〜300 mM KCl洗脱。用P缓冲液将峰馏分稀释3倍，然后上样到Resouce Q（GE Healthcare）色谱柱上。Rad51以约400 mM KCl洗脱。合并峰级分，用含有200 mM KCl的P缓冲液透析，使用Amicon Ultra-4（10k）离心过滤器浓缩，然后将小等分试样在液氮中冷冻，然后储存在-80°C下。通过测量在280 nm处的吸光度（ε= 18,600）确定蛋白质浓度。

使用与野生型Rad51相同的方法纯化Rad51-L2和Rad51-S2突变蛋白。对于Rad51-L1，在Q琼脂糖层析后，使用HiTrap Blue色谱柱代替HiTrap肝素色谱柱（GE Healthcare）。蛋白在P缓冲液中以0 M至2 M KCl的线性梯度洗脱。Rad51-L1蛋白的其他纯化步骤与野生型Rad51相同。

对于Swi5-Sfr1，将硫酸铵添加到上清液中至40％饱和度，并将混合物以18,000× g离心。 1小时。将沉淀重悬于含有100 mM NaCl的R缓冲液中，并将混合物置于Q Sepharose（GE Healthcare）柱上，并用100至1000 mM NaCl的线性梯度洗脱蛋白质。Swi5-Sfr1复合物的峰级分出现在〜300 mM NaCl处。将级分用R缓冲液稀释3倍，并加载到Hitrap Heparin（GE Healthcare）柱上。Swi5-Sfr1复合物在〜600 mM NaCl中洗脱。将洗脱的级分加载到16/60 Superdex 200 pg凝胶过滤柱（GE Healthcare）上，并在含有1 M NaCl的R缓冲液中显影。合并峰级分，在含200 mM NaCl的R缓冲液中透析，使用Amicon Ultra-4（10 k）离心过滤器浓缩，将小等分试样在液氮中冷冻，然后储存在-80°C。

对于RPA，将硫酸铵添加到上清液中至45％饱和度，并将混合物以18,000× g离心。 1小时 将沉淀重悬于含有50mM NaCl的R缓冲液中，并将混合物置于SP琼脂糖凝胶（GE Healthcare）柱上，并用50至1000mM NaCl的线性梯度洗脱蛋白。RPA的峰级分出现在〜300 mM NaCl处。将这些级分用R缓冲液稀释3倍，并加载到Hitrap Heparin（GE Healthcare）柱上。RPA在〜600 mM NaCl中洗脱。将洗脱的级分加载到16/60 Superdex 200 pg凝胶过滤柱（GE Healthcare）上，并在含有1.5 M NaCl的R缓冲液中显影。合并峰级分，在含有100 mM NaCl的R缓冲液中透析，使用Amicon Ultra-4（10k）离心过滤器浓缩，将小等分试样在液氮中冷冻，然后保存在-80°C。通过测量在280 nm处的吸光度（ε= 97,640）确定蛋白质浓度。

DNA底物

本研究中使用的寡核苷酸列于表   1。83聚体寡核苷酸16A（ - ）用于形成在配对的突触前长丝和位移测定27，31，55。为了准备供体dsDNA进行配对和置换分析，将16A（-）从3'端截短43个碱基，得到16A（-）_ 40bp，并对其互补链进行退火。使用16A（-）_ 3×2AP对使用2-氨基嘌呤（2AP）的DNA链交换反应进行实时分析。使用5'TAMRA标记的寡聚dT（72-mer）进行ssDNA结合测定。dsDNA结合分析是用5'TAMRA标记的16A（-）_ 72 bp进行的，该片段从3'端被截短11个碱基，并与其互补链退火。为了通过FRET研究Rad51-ssDNA和-dsDNA细丝的构象，对16（A）（-）_ F + R_73bp进行了荧光素和若丹明内部标记（在dsDNA情况下退火至其未标记的互补链）。所有寡核苷酸DNA均购自Eurofins Genomics。

实时DNA链配对和置换测定

所有反应均在缓冲液A（30 mM HEPES-KOH [pH 7.5]，15 mM MgCl 2中进行，1 mM DTT，0.1％[w / v] BSA，0.0075％Tween-20、0.25 mM ATP）。在配对分析中，在37°C下，将Rad51蛋白（1.5 µM）添加到含有荧光素标记的ssDNA（36 nM，片段浓度）的缓冲液A（1.6 ml）中。温育5分钟后，将Swi5-Sfr1（0.15μM）加入反应混合物中，并继续温育另外5分钟。将混合物（1.5ml）转移到设置在荧光分光光度计（FP-8300，JASCO）中的比色杯中。通过将罗丹明标记的dsDNA（36 nM片段浓度）注射到反应混合物中来开始配对反应。在493nm激发后，在525nm监测荧光素的荧光变化。在置换实验中，反应步骤与配对实验相同，除了反应体积较小（130 µl），并手动添加荧光素和若丹明标记的dsDNA。在配对分析的情况下，使用以下公式对实验数据进行归一化，其中F raw是来自原始数据的荧光强度，F change_p是使用等式计算的荧光变化。（1）。

在时间0的F raw是在通过添加dsDNA底物开始反应之前的最后20s中监测的平均荧光。

使用等式计算底物％。（2）。

配对测定的最大FRET效率（E max）计算为0.317。

使用等式计算配对测定的E max。（3）。

在位移测定的情况下，使用以下方程式对实验数据进行归一化，其中F raw是来自原始数据的荧光强度，F change_d是使用等式计算的荧光变化。（4）。

在时间0的F raw是死区时间后前5 s测得的平均排放量。

产品％使用等式计算。（5）。

位移测定的E max计算为0.279。用于计算置换分析的E max的公式与配对分析所用的公式相同。

流产DNA链交换测定

反应步骤与配对测定法相同，除了反应体积较小（150μl），并手动添加同源dsDNA。反应开始后五分钟，十分钟或二十分钟，添加EDTA（50 mM）以解离三链中间体。如上所述监测反应。通过与配对测定相同的方法计算底物％。使用等式计算C1％的量。（6），其中S before是加入EDTA之前的底物量，S after是加入EDTA 之后 200s的底物量。

使用包含2AP的DNA进行实时DNA链配对

使用含有2AP的DNA进行DNA链配对的实时分析的程序与DNA链置换测定的方法基本相同，不同之处在于突触前丝形成在16A（-）_ 3×2AP上，并添加了未标记的dsDNA。引发反应。在310 nm激发后，在375 nm处监测2AP的荧光变化。每秒收集一次数据。使用以下方程式对实验数据进行归一化，其中F raw是来自原始数据的荧光强度，F change_2AP是使用等式计算的荧光变化。（7）。

在时间0的F raw是在通过添加dsDNA底物开始反应之前的最后20s中监测的平均荧光。

使用等式计算底物％。（8）。

产品％使用等式计算。（9）

Q max是配对分析中2AP的最大猝灭效率，可使用等式计算得出。（10）。

野生型Rad51和Rad51-L2之间的Q max值没有显着差异（补充表   7）。

使用荧光各向异性的DNA结合测定

在ssDNA结合测定中，缓冲液B（30 mM HEPES-KOH [pH 7.5]，100 mM KCl，3 mM）中含有3 µM（核苷酸浓度）TAMRA标记的oligo dT和1 mM ATP的反应溶液的荧光各向异性的MgCl 2，1mM DTT和5％甘油）中的溶液在激发后575纳米在FP-8300荧光分光光度计（JASCO）测量在546nm处。将Rad51添加到反应溶液中，并在25℃下孵育5分钟。然后测量反应的荧光各向异性，向反应溶液中加入更多的Rad51，并重复上述相同的操作。如图5a所示，对Rad51浓度进行滴定。 。对于dsDNA结合测定，实验步骤与ssDNA结合测定相同，不同之处在于反应溶液中含有3 µM（bp）TAMRA标记的dsDNA，并使用了不同的Rad51滴定系列，如图6a所示。   。根据实验数据，使用等式计算解离常数。（11），其中[Rad51]是Rad51的浓度，n是希尔系数。

荧光各向异性对Rad51结合动力学的影响

在标准关联分析中，将含有2 ml反应缓冲液B加1 mM ATP和1.2 µM（核苷酸）TAMRA标记的oligo dT的1.0×1.0 cm比色皿放在荧光光谱仪中于25°C放置。用磁力搅拌器以450rpm连续搅拌反应混合物。在546 nm激发后，在575 nm每秒监测一次TAMRA的荧光各向异性。测量开始后六十秒，将Rad51以0.4 µM的最终浓度注入反应混合物中。温育5分钟后，将指示浓度的Swi5-Sfr1注入反应中，并继续温育另外5分钟。

在解离分析中，将含有2 ml反应缓冲液B和1 mM ATP的1.0×1.0 cm比色杯置于25°C的分光荧光计中。将反应混合物以450rpm连续搅拌。配有磁力搅拌器。测量开始后六十秒，将来自缔合测定的50μl反应混合物注入比色杯中。每1 s监测荧光各向异性（FA）1000 s。根据解离分析的结果，使用等式计算解离速率常数（k off）。（12），使用KaleidaGraph，版本4.5.1（Hulinks）。

FA（t）表示在时间t（s）的FA。

Rad51结合后DNA的延伸

将内部用荧光素双标记的ssDNA和ROX（3 µM核苷酸浓度）与反应缓冲液B加1 mM ATP或1 mM AMP-PNP混合，并将混合物在25°C下孵育。5分钟后，在493 nm处激发时在500至650 nm处测量了发射光谱。第一次测量后，向反应混合物中加入3 µM Rad51，并将溶液在25°C下孵育。5分钟后，在上述相同条件下测量发射光谱。第二次测量后，将0.3 µM Swi5-Sfr1添加到反应溶液中。5分钟后，在上述相同条件下测量发射光谱。归一化的整数 使用等式计算 （13）。

使用公式计算FRET效率（E FRET）。（14）。补充表8列出了用于计算FRET效率的常数   。I D是在525 nm处的供体（荧光素）的荧光发射。我阿是（ROX）受体的荧光发射在605nm，φ d和φ 甲分别供体和受体，的量子产率; 和余525分之605指示供体的发射是如何影响在605nm的发射。

I D  =（525 nm处的荧光强度）