线粒体DNA（mtDNA）的自主复制和分离创造了潜在的冲突冲突，该冲突是由在对“自私”特征（例如复制优势）进行积极选择的情况下单倍型出现引起的。但是，很少有这种现象在自然种群中发生的案例。在这里，我们调查了犬可传播性病（CTVT）中mtDNA水平转移的频率，CTVT是一种传染性癌症克隆，偶尔会从其宿主获得mtDNA。值得注意的是，一种犬的mtDNA单倍型A1d1a反复和最近已定殖于CTVT细胞中，从而反复取代了现有的CTVT单倍型。预计会影响转录的A1d1a控制区多态性已固定在A1d1a重组事件的产物中，并在其他CTVT mtDNA背景下以体细胞形式发生。
哺乳动物细胞携带数以万计的线粒体基因组（mtDNA）拷贝，这是一个自主复制的〜17,000个碱基对（bp）环形染色体，其编码氧化能量代谢所必需的基因。选择对mtDNA中产生的遗传变异有两个作用。首先，它可以作用于线粒体功能改变（适应性选择）产生的细胞或生物表型，其次，它可以驱动具有复制或分离潜能的单倍型频率改变（自私选择）1。后者已经在几个实验和天然设置中观察到，并且，如果比自适应选择更强，具有维持或修正有害线粒体等位基因的电位1，2，3，4，5。自私选择可以是在治疗线粒体移植上下文中特别重要，并且很少被理解为其中在人类或动物群体天然存在的线粒体DNA在“自私”适合度性状变化的程度的 1，2，6，7。
用于研究mtDNA动力学的一种不寻常但特别有价值的自然模型是犬可传播的性病（CTVT）。CTVT是狗的一种传染性癌症，在交配过程中会通过活癌细胞的转移而传播，从而引起生殖器肿瘤8。这种疾病在世界范围内发现的，首先从个人的创始人狗'住那几千年前的体细胞出现9，10。虽然CTVT核基因组是无性系和表示创始人狗的DNA，线粒体DNA CTVT是多克隆并通过水平传输从瞬态主机周期性地获取的11，12。CTVT细胞捕获mtDNA导致自然竞争分析，从而在体内评估犬对mtDNA单倍型对的相对适应性。在这里，我们确定通过CTVT重复捕获单个犬的mtDNA单倍型A1d1a。该单倍型可能通过可能影响mtDNA转录和复制的调控多态性而赋予自私的选择优势。
我们评估了从所有居住大洲的43个国家/地区收集的539个CTVT肿瘤队列中mtDNA捕获的频率（补充数据 1）。通过比较使用核和mtDNA序列（分别为整个外显子组13和全长mtDNA基因组）构建的系统树，我们确定了19个水平转移事件（图 1a，表 1，补充图 1，补充图 2，补充数据 2）。值得注意的是，这些mtDNA捕获中有11个涉及单个犬类单倍型，即A1d1a（图 1a，表 1，补充图 1）。，补充图 2，补充图 3，补充数据 2）14。尽管在CTVT宿主狗种系中A1d1a的患病率相对较高，但很明显，相对于其他犬类单倍型，这种单倍型相对于CTVT的水平转移更为丰富（p <0.001，根据模拟得出的经验p值，当限制对肿瘤-宿主对的分析，方法，图 1b，补充图 4，补充数据 1，补充数据 3）。
539 CTVT肿瘤（彩色）和494只狗（黑色）的 MtDNA（左）和核DNA（右）最大似然系统树。mtDNA和核树上的等效CTVT之间的对应关系由mtDNA供体单倍型指示和着色。树木以枝幕图的形式呈现，没有分支的长度。高分辨率树显示在补充图。 1和2。b代表全球CTVT寄主狗种群中18种犬mtDNA单倍型的频率（n = 495）（左），以及涉及539个CTVT的人口中每种单倍型的CTVT水平转移（HT）事件的数量（右）。显示了供体单倍型（彩色圆点）和异质性水平转移事件（星号（*）和较浅的阴影）。异质性肿瘤携带亲本和引入的单倍型。A1d1a异质水平转移事件涉及mtDNA重组。代表A1d1a的条用绿色突出显示。C推断出19个CTVT mtDNA水平转移事件的地理位置。每次水平转移均用供体单倍体上色的点表示。如果将水平转移产生的所有CTVT都在同一位置采样，则可以推断为水平转移的位置。如果在几个地点被发现从水平转移衍生CTVTs，然后水平转移的可能部位推测基于进化信息12，13。异质水平转移事件以星号（*）表示。d自每次水平转移（HT）事件以来获得的体细胞mtDNA突变数。CTVT数量（n ＝ 539）表示属于每个HT事件。条形分为两类：较深的阴影表示每个HT组内多态的自信体细胞突变，误差条代表突变范围。较浅的阴影表示每个HT组中固定的变体，无法确定其体细胞或种系状态（请参见方法）。代表A1d1a HT的条用绿色突出显示。显示了供体单倍型（彩色点）和异质性（星号，*）。
在全世界的八个地方，包括伯利兹，智利，哥伦比亚，格林纳达，印度，尼加拉瓜，巴拉圭和冈比亚，观察到了源自A1d1a水平转移的CTVT簇（图 1c，表 1，补充图 4）。核树的结构表明，A1d1a分别取代了七个最常见的两种CTVT单倍型CTVT_HT1和CTVT_HT2（图 1，表 1，补充图 1）。十一次A1d1a水平转移中的十次在CTVT细胞内固定（同质）。在剩余的A1d1a水平传输中（HT3，表 1，补充数据 1）），A1d1a与CTVT_HT1重组，可能通过拷贝选择重组15进行重组，并且从该水平转移中获得的队列中的两个肿瘤各自携带mtDNA重组产物12的异质混合物。
mtDNA体细胞突变（每个水平转移事件后出现的突变）的积累提供了从mtDNA水平转移12开始的时间估计。CTVT中19个水平转移事件中的14个，包括全部11个A1d1a捕获，携带很少的体细胞突变（A1d1a水平转移中每个mtDNA基因组平均0.59个体细胞突变，不包括其种系或体细胞状态未知的变体，图 1d，补充数据 4）， 方法）。假定每年0.0201突变一个CTVT线粒体体细胞突变率（0.0127-0.0393，95％最高后验密度间隔12，13，方法），这意味着所有A1d1a水平转移都是最近发生的，可能是在最近几十年之内（图 1d，补充数据 4）。
A1d1a可能以比其他单倍型更高的频率在细胞之间转移。为了检验这种可能性，我们测量了A1d1a拷贝数，该特征可能会影响mtDNA捐赠的可能性。在具有A1d1a的狗或肿瘤组织与具有其他单倍型的狗或肿瘤组织之间，MtDNA的拷贝数没有差异（补充图 5）。此外，具有种系A1d1a的狗没有聚集在核系统发育树上（补充图 6）。），表明A1d1a寄主狗的核遗传特征不太可能使这些动物更有效地将mtDNA捐赠给CTVT。尽管我们不能排除A1d1a确实以比其他单倍型更高的频率在细胞之间转移的可能性，但似乎更合理的是，相对于种群频率，单倍型之间潜在的水平转移机会是恒定的。一旦进入CTVT细胞，由A1d1a特异性变体编码的性状相对于其他单倍型可能具有选择优势。
我们注释了A1d1a相对于其他犬类单倍型的遗传特征，以寻找可能是该单倍型选择优势的基础的变异。与其他16个主要的狗单倍型组相比，A1d1a具有8个单核苷酸多态性（SNP）和一个短插入，此单倍型是独特的（或在某些情况下与相关的A1d1单倍型共有）（图 2a，补充数据 5））。这些变体中的六个发生在蛋白质编码基因中，其中一个被预测会引起非同义变化（MT-CO2中的 7593T> C ）（图 2a，补充数据 5）。其余变体属于核糖体DNA（一个变体）和线粒体控制区（两个变体）（图 2a，补充数据 5）。控制区域是包含线粒体DNA复制和转录的起始所需的元件的非编码调节区16，17。A1d1a和CTVT_HT1进行了重组的转移事件HT3提供了进一步完善候选区域以进行A1d1a内阳性选择的机会。使用长序列读取，我们在源自HT3的两个肿瘤中分阶段了重组mtDNA单倍型（方法12）。两种HT3肿瘤均带有重组单倍型的异质库。然而，在这些肿瘤中，所有单倍型所携带的唯一的A1d1a特异性变异体是在对照区域中插入两个胞嘧啶16660insCC（图 2b）。此外，在CTVT_HT1和CTVT_HT2 mtDNA背景下，两次观察到由于体细胞突变而产生的16660insCC（图 2a，补充数据 5）。在一起，这些发现提出了16660insCC作为驱动A1d1a阳性选择的候选者。
相对于其他16个狗单倍型组，A1d1a单倍型独有的遗传变异（在某些情况下与相关的A1d1单倍型共有，补充数据 5）。每个变体上方显示了其他非A1d1a CTVT mtDNA背景上的体细胞发生次数。蛋白质编码基因中的变体被标注为同义（S）或非同义（NS），其他变体被标注为出现在核糖体RNA（rRNA）或控制区域（CR）中。显示了MtDNA（MT）基因组坐标。b使用长读测序在属于HT3组的两个肿瘤（标记为肿瘤1和肿瘤2）中检测到的MtDNA单倍型，其中A1d1a和CTVT_HT1进行了重组，每个肿瘤中均存在重组产物的异质混合物。在两个肿瘤中所有单体型中固定的区域用虚线框指示。显示了两个肿瘤的CTVT细胞mtDNA群体中每个重组单倍型（H）的估计频率。c 16660insCC序列上下文和相对于控制区特征的位置。标记保守序列嵌段（CSB）1-3，以及轻链启动子（LSP），重链启动子（HSP）和十个核苷酸（nt）重复序列。1660insCC在A1d1a中与16672C> T同时出现，这是几种犬型单体型上的一种多态性。
16660insCC发生在犬控制区域内的保守序列区3（CSB3）和tRNA-Phe之间（图 2c）。尽管此基因座在物种间保守性很差，但人mtDNA中的等效序列区域包含两个线粒体转录启动子之一，即轻链启动子（LSP）。从LSP转录起始产生的光链多顺反子和前导链的mtDNA的复制起始引物两者18，19。使用cDNA末端的5'快速扩增，我们将犬LSP转录起始位点（LSP-TSS）定位到16648insCC下游12–15 bp的位置16648（方法）。在人类中，转录起始复合物识别LSP-TSS上游等距离处的区域，这表明16660insCC可能位于犬LSP 20的转录起始复合物结合模块内。该发现暗示16660insCC可能影响转录活性。
为了进一步表征16660insCC对mtDNA转录的影响，我们对携带两种最丰富的CTVT单倍型CTVT_HT1和CTVT_HT2以及A1d1a的CTVT肿瘤进行了RNA测序。A1d1a CTVT在核树上在系统发育上不相关，并且源自三个不同的水平转移事件（补充图 1，补充数据 1，补充数据 6A）。与CTVT_HT1和CTVT_HT2 CTVT相比，A1d1a CTVT中mtDNA蛋白质编码基因RNA的丰度（包括重链和轻链转录本）降低了（平均转录本丰度降低了39％；p = 0.015，双面Mann-Whitney检验），尽管各组之间的转录本丰度差异很大（图 3a，补充数据 6B）。在一组在CTVT_HT1和CTVT_HT2单倍型背景上携带16660insCC（两个肿瘤）和16660insC（一个肿瘤）体细胞突变，在重组CTVT_HT1 / A1d1a背景下（一个肿瘤）携带16660insCC的肿瘤组中，平均mtDNA转录丰度也降低了。差异无统计学意义（平均转录本丰度降低30％；p = 0.093，双面Mann–Whitney检验）（图 3a，补充数据 6B）。此外，与CTVT_HT1和CTVT_HT2 CTVT相比，A1d1a CTVT中13个mtDNA基因的丰度显着降低（q <0.05，双向Wald检验，多次检验校正；方法）（补充数据 6B）。在具有A1d1a的CTVT与具有CTVT_HT1和HT2单倍型的CTVT之间，一组核编码的线粒体相关基因转录子的丰度没有变化（补充数据 6C）。将CC插入人LSP中与犬16660等效的位置后，在体外测定中消除了轻链转录（补充图 7）），表明该基因座与轻链转录起始高度相关。这些分析暗示了16660insCC是调控序列，其作用是减少mtDNA基因转录。
CTVT_HT1，CTVT_HT2，CTVT_A1d1a和CTVT_HT1 / HT2 + insCC / insC / Rec CTVT中mtDNA蛋白质编码基因RNA 的平均数量（n = 33）。在CTVT_HT1 / HT2 + insCC / insC / Rec CTVT（以灰色表示）的组中，在CTVT_HT1或CTVT_HT2单倍型背景下，两个携带16660insCC，一个携带16660insC作为体细胞突变，另一个在CTVT_HT1 / A1d1a重组背景上携带16660insCC。点代表每组各CTVT中mtDNA蛋白质编码基因转录本的平均丰度，菱形表示每组mtDNA蛋白质编码基因的平均均数，条形表示平均值的95％置信区间。星号（*），p = 0.015（双面曼-惠特尼检验；方法）。补充数据 6B提供批量校正的笔录丰度数据。b一个模型，该模型解释了CTVT对A1d1a单倍型的重复捕获。（1）相对于种群单倍型频率，所有犬的mtDNA单倍型都有CTVT水平转移的机会。（2）A1d1a mtDNA单倍型在控制区域16660insCC中带有一个插入，该插入在其他单倍型中不存在，并且可能具有调节功能。（3）相对于两种最常见的CTVT mtDNA单倍型，具有A1d1a mtDNA单倍型的肿瘤中MtDNA蛋白质编码转录本的丰度降低。（4）A1d1a mtDNA水平转移后，A1d1a通过自私的复制优势变为同质。
对mtDNA编码的蛋白质编码基因进行的负选择表明线粒体功能对于CTVT生物学很重要12。因此，在线粒体基因转录物丰度的下降，在A1d1a CTVT如观察到的，不太可能是自适应为CTVT细胞，尽管其可以是中性的21。然而，我们量化了两种可能的适应性表型，有丝分裂率和肿瘤对化学疗法的反应时间。这些特征在A1d1a CTVT和CTVT_HT1和CTVT_HT2 CTVT之间没有区别（补充图 8）。此外，A1d1a特异的多态性集并没有立即提出适应性功能相关性的机制（补充数据 5）。总的来说，我们不能排除A1d1a适应CTVT细胞的可能性。但是，没有证据支持该假设。相反，我们的工作支持一个模型，通过该模型，A1d1a控制区的调控变异体可减少此单倍型的转录。鉴于转录和复制耦合mtDNA中22，23，我们建议A1d1a有利于复制在转录，赋予A1d1a与复制优点，即驱动此单倍型，以经由选择自私固定（图 3B）。
对CTVT mtDNA多样性的一项调查显示，单个犬mtDNA单倍型A1d1a已经通过水平转移反复和最近定居了CTVT细胞。尽管我们不能排除A1d1a具有水平转移倾向或为CTVT细胞提供适应性优势的可能性，但我们的数据最有力地支持了一种模型，其中A1d1a通过自私的选择替代了其他mtDNA单倍型。
线粒体DNA的完整性对于CTVT生物学重要的12，并已提出了本身的mtDNA交换正选择通过更换单倍型的降解的体细胞突变11，12。但是，假设相对于种群频率，A1d1a水平转移的速率与其他单倍型相似，相对于种群频率，我们的观察结果表明，尽管它们具有很高的体细胞突变负担，大多数水平转移仍会导致现有的CTVT mtDNA得以维持。也许几个世纪的单倍型替换和细胞内单倍型竞争已经优化了CTVT mtDNA内的“自私”性状，因此尽管具有潜在的适应性选择优势，现在很少有狗单倍型可以与现有的CTVT mtDNA竞争。另一方面，鉴于其mtDNA转录物丰度降低，A1d1a实际上对CTVT细胞具有不良适应性，似乎是长期克隆进化可能产生的意想不到的有害后果。
如果不知道将mtDNA水平转移到CTVT中的潜在频率，或者不知道每个事件转移的mtDNA拷贝数，则无法量化在A1d1a上进行选择的强度。此外，缺乏用于研究犬线粒体置换的实验室工具，尤其是CTVT细胞系的缺乏，排除了对该过程的直接实验研究。但是，观察到在非A1d1a CTVT mtDNA上发生的同质体体16660insCC突变增加了对这种变异进行选择的可能性，在某些情况下可能足以驱动单个分子的固定（尽管我们不能排除观察到的可能性体细胞16660insCC突变通过中性遗传漂移实现了同源性）。
有趣的是，在该CTVT队列中观察到的大多数（19个中的14个）水平转移事件，包括所有11个A1d1a水平转移，都是最近发生的。这可能反映出CTVT种群呈指数级增长13，或者可能是古代A1d1a CTVT谱系无法持续存在的原因。然而，线粒体DNA水平传输的频率已被链接到细胞应激在多种模型系统中的24，25，和化疗曝光已经提出了提高mtDNA的捕获率26。因此，有可能是化疗的使用，广泛用于治疗因为CTVT 20世纪80年代27，28，提高了CTVT中mtDNA捕获的频率。我们观察到最近mtDNA水平转移的所有地方的兽医报告说，CTVT使用了化学疗法。此外，在某些情况下，兽医指出接受化学疗法的动物并非常规与其他狗隔离开来，从而创造了条件，使经化学疗法暴露的CTVT细胞得以传播。尽管我们不能排除偶然发生的可能性，但在不同文化背景下对化学疗法的不同接受和态度也可能解释了中美洲水平转移事件的明显过剩（图 1c）。因此，人为干预可能影响了最近出现的A1d1a CTVT簇。
线粒体DNA的复制自主权提供了自私的单倍型演化范围，尽管细胞或有机体健康的潜在不良后果3，4，29。这种进化的冲突有可能在生殖系通过维护在鸡蛋中线粒体DNA的瓶颈实行战略控制1，30，31。然而，已经表明，这些过程可驱动的体细胞和生殖系持久“自私”线粒体等位基因，其中一些可以是适应不良，甚至致病2，30。重要的是，供体和受体的mtDNA单倍型的复制驱动器应该在线粒体移植疗法被考虑，并且可以是用于该过程的成功是至关重要的1，6，7，32。尽管CTVT被认为是一种生物怪异的现象，但它的周期性摄取和线粒体单倍体的并置为哺乳动物线粒体基因组中自然多态性的进化后果提供了广泛而出乎意料的见解。
这项研究得到了剑桥大学伦理与福利委员会兽医系的批准（参考编号CR174）。从拥有者，或从无责任犬情况下的另一负责人处获得了收集样品的知情同意。将肿瘤和宿主（性腺，皮肤，血液或肝脏）组织样品收集到RNAlater（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）中，并保存在-20°C直至处理。使用Qiagen DNeasy血液和组织提取试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）提取基因组DNA。使用Qiagen AllPrep提取试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）提取总RNA。样本信息在补充数据 1中提供。
通过检测CTVT特异性LINE-MYC基因组重排12或通过组织病理学分析，进行定量PCR分析以确认CTVT诊断。
根据制造商的说明，使用标准方法构建了插入大小为100–400个碱基对（bp）的Illumina全基因组DNA测序文库。设计了针对犬类蛋白质编码基因组和microRNA的探针（43 Mb，安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉; ELID ID 0679931、0677981、0679121、0679911、0677901和0679891），并用于使用标准捕获犬外显子组根据制造商说明的方法。测序是在Illumina HiSeq2000仪器上使用V3和V4测序化学方法（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）以75 bp的配对末端读数进行的。肿瘤和宿主的测序分别为平均外显子组深度〜132×和〜104×。序列读数被对准到CanFam3.1犬参照基因组33，34使用Burrows–Wheeler Aligner的Backtrack Alignment 35（BWA-backtrack）v0.5.9-r16 + rugo以及选项'-l 32 -t 6'。Baez-Ortega等人详细介绍了已测序外显子区域的基因组组成信息。13。
生成了33个CTVT（1208Ta-Dog，1210Ta-Dog，1247Ta-Dog，126Ta-Dog，131Ta-Dog，1532Ta-Dog，24Ta-Dog，335Ta-Dog，341Ta -狗，355Ta-狗，365Tb-狗，366Ta-狗，410Ta-狗，423Ta-狗，439Tb-狗，459Ta-狗，464Ta-狗，468Ta-狗，550Ta-狗，556Tb-狗，559Ta-狗，560Ta-Dog，608Ta-Dog，609Ta-Dog，645Ta-Dog，652Ta-Dog，666Ta-Dog，683Ta-Dog，773T1a-Dog，79Ta-Dog，809Ta-Dog，851Ta-Dog和855Ta-Dog）使用标准方法根据制造商的说明使用Ribo-Zero核糖体RNA去除试剂盒（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）。将文库在Illumina HiSeq4000仪器（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）上以75 bp的配对末端读数进行测序，平均深度约为168× 13。样品分三批处理（补充数据 6A）。
使用鸭嘴兽36 v0.8.1作为定制计算管道的一部分（Somatypus v1.3，https://github.com/baezortega/somatypus）13，调用了核基因组中的取代。使用与上述相同的定制计算管道调用线粒体基因组中的取代，并对单个过滤和合并步骤以及最终过滤步骤进行以下修改：如果≥3支持读图且图谱质量≥20且碱基质量≥，则调用替换检测到20个，并且将读取末端10 bp以内的碱基质量设置为0。
小的插入和在线粒体基因组缺失（插入缺失）用samtools和bcftools从全基因组测序数据中提取37，38。使用带有选项-C50和-gf的Samtools v0.1.18 mpileup从索引的bam文件创建原始bcf文件，并使用bcftools v0.1.17视图（选项-bvcg）调用indel。
为了进行最大似然拓扑推断，用539个CTVT，494条狗（补充数据1和2），CanFam3.1犬线粒体参考序列和图1a和补充图2所示的线粒体DNA（mtDNA）系统发育树 构建而成 。 根植于两个土狼基因组（GenBank登录号：DQ480510.1，DQ480509.1）。我们使用变体等位基因片段或在属于HT3的肿瘤中，使用PacBio测序（见``MtDNA重组分析''）在异质性肿瘤中分阶段提取不同的单倍型，并且每个单倍型都作为单独的样本包含在树中（补充数据 2））。一只狗的样本（15公顷，补充数据 1）因CTVT污染而被丢弃。使用最大似然法和广义时间可逆（GTR）替换模型，通过RAxML 39 v8.2.9 执行树推断。使用RAxML v8.2.9中实现的快速引导算法，总共产生了500个引导程序副本。
在所表示的核DNA的最大似然系统树图 1A和补充图 1使用跨越同一组的539种CTVT肿瘤和494只正常犬（补充数据基因型148030个核CTVT体细胞突变构建 1），使用与GTR替代模式在RAxML网站异质性的伽玛模式13，39。使用RAxML v8.2.9中实现的快速引导算法，总共产生了500个引导程序副本。
对于缠结图构建，使用在Dendrocope 40 v3.5.10中构建的缠结图评估mtDNA上等效的CTVT肿瘤与核树之间的对应关系。
对于水平转移组推断，如果在mtDNA与核系统发生树之间发现不一致，则推断mtDNA水平转移。在携带两种或两种以上不同mtDNA单倍型的肿瘤中推断出异质水平转移，它们均以超过10％的频率出现，并且不能由匹配的宿主单倍型解释（表 1，补充数据 2）。异质性肿瘤携带来自亲本CTVT的单倍型和新转移的单倍型，但HT3组除外，后者携带重组单倍型的异质混合物。如果将CTVT组聚集在mtDNA和核系统发育树上，则认为它们属于单个水平转移事件（图 1a，补充图。 1和2）。
单体型命名系统是改编自弗雷格尔等人提出的进化犬的mtDNA系统发育命名法。14。用495条狗（补充数据1），CanFam3.1狗线粒体参考序列构建了mtDNA系统发育树 ，并以两条土狼（GenBank登录号：DQ480510.1，DQ480509.1）为根（补充图 3）。使用RAxML 39 v8.2.9，使用具有GTR替换模型的最大似然方法进行树推断。树形拓扑用于将狗分配给以下18个单倍型之一：A1，A1a1，A1b，A1c，A1d1，A1d1a，A1d2，A1e，A1f，A1h，A2，A4，A5，A6，B1，B2，C1和C2（图 1b，补充图 3，补充数据 3）。
CTVT_HT1和CTVT_HT2在〜469.28年前发生了分歧（240.34–744.31，最高后密度间隔95％）13。假设CTVT_HT2体细胞mtDNA突变的平均数= 9.437，并假设mtDNA突变率保持恒定，我们估计CTVT mtDNA突变率每年为0.0201突变（0.0127-0.0393，最高后验密度区间为95％）（补充数据 4） 。水平转移事件HT1，HT2，HT4和HT5中的取代数如Strakova等人所述。12。在HT3中，由于mtDNA重组，无法确定体细胞或种系的替代状态。
给定在狗群中观察到的单倍型频率（补充数据3），并假设每个单倍型具有相等的水平转移机会，进行模拟以计算在观察到的频率下A1d1a水平转移的概率 。在R 41中进行了10000次重复的模拟，将随机种子设置为76。经验p值来自模拟比例，其中A1d1a水平转移的次数等于或超过观察值。进行了更保守的分析，仅包括匹配的肿瘤-宿主对。用于此分析的代码可从https://github.com/TransmissibleCancerGroup/Mixed获得。
计算了正常犬卵巢（n = 42）和睾丸（n = 41）组织以及CTVT肿瘤（n = 337）的MtDNA拷贝数（补充图 5）。以下等式用于计算mtDNA拷贝数：（mtCOV-T / nuclCOV-T）×P，其中mtCOV-T =线粒体的平均覆盖率×mtDNA肿瘤分数，nuclCOV-T =核基因组的平均覆盖率×核肿瘤分数，P =倍性。CTVT肿瘤和犬的倍性估计为两个42。MtDNA肿瘤分数是从变体等位基因分数（VAF，即支持替代变体的读段数占覆盖替代变体位置的读段总数的一部分）估算的。核肿瘤分数由整个外显子组测序数据使用以下方程式估算：（T-VAF的模式）×2，其中T-VAF =体细胞肿瘤变异等位基因分数13。使用R 41中实施的不成对的两尾学生t检验来检验统计学显着性。
使用从495个CTVT寄主狗（补充数据 1）和从“狗基因组SNP数据库”（ftp://download.big.ac.cn/dogsd/bam/ ）43（样本ID：ISW，CRW，CHW，LUPWRUS00001，LUPWRUS00002，LUPWRUS00003和LUPWCHN00001）（补充图 6）13。为了说明杂合和纯合变体的存在，使用p-距离度量来计算比对序列之间的距离，如phangorn 44的“ dist.p”功能中所实现的 v2.3.1 R程序包。系统发育树是使用neighbour-joining算法构建的，该算法在phangorn程序包的“ NJ”功能中实现。
通过针对其他CTVT和狗样本（属于HT3的CTVT，已在CTVT_HT1之间进行重组）过滤，可以识别出A1d1a常见且独特的取代和小插入和缺失（indels），在某些情况下，还涉及相关的A1d1单倍型。定义A1d1a特定的变体时未考虑A1d1a和A1d1a（补充数据 1和5）。插入缺失使用综合基因组浏览器（IGV）目视确认45，46。使用变体效果预测器47（补充数据 5）进行注释，并在可能的情况下，通过使区域与人类对齐并使用Mitomap评估变体来评估每个变体的功能相关性48。在495例CTVT肿瘤中评估了每种A1d1a特异性遗传变异的体细胞发生情况（补充数据 1和 5）。
通过在mtDNA系统发育树上搜索异常值，并通过可视化针对mtDNA基因组坐标绘制的mtDNA VAF，可以识别出潜在的重组样品。使用来自HT3的559T和1315T样品的5 µg基因组DNA创建标准的PacBio基因组文库，而不使用剪切或扩增技术12。PacBio（太平洋生物科学公司，Menlo Park的，CA，USA）的数据读取与CanFam3.1 mtDNA基因组中SMRT视图V2.3.0（太平洋生物科学公司，Menlo Park的，CA，USA），并在IGV被查看45，46。如图2b所示，分别通过目视检查对559T和1315T中的三种或两种最常见的单体型进行分阶段。 。在两个样品中还鉴定出了其他水平较低（小于5％）的单倍型，未在图 2b中显示。
使用biobambam2 49 v2.0.79软件从每个肿瘤BAM文件生成两个分别包含原始正向和反向读取的FASTQ文件，并使用Salmon 50 v0.8.2软件13通过转录本丰度定量估算基因表达。使用DESeq2 51 v1.14.1 R软件包进行了基因特异性差异表达分析，以比较CTVT_A1d1a表达与CTVT_HT1和CTVT_HT2表达（补充数据 6）。为了说明批次效应，将每个样品的批次和HT组都作为变量包括在差异表达分析的设计公式中。因为分析是针对mtDNA编码的基因（n = 13，补充数据 6B）和核编码的线粒体相关基因（n = 7，补充数据 6C），进行了严格的假设检验，因此通过Benjamini-Hochberg多重检验校正调整p值时仅考虑了这些基因。
为了评估HT组之间转录本丰度的总体变化，使用DESeq2中的rlog函数转换了mtDNA蛋白编码基因的原始读取计数，并使用limma 52 v3.38.3 R程序包进行了批量效应校正。批处理效应校正后，对数转换被反转，校正后的估计值将按比例缩放以使其与原始转录本丰度估计值可比。从批次校正的估计值计算每个样品和每个HT组的mtDNA蛋白编码基因的平均丰度（图 3a，补充数据 6B）。使用双面曼恩-惠特尼检验（如R 41中所述）检验组之间总体笔录丰度差异的统计学显着性）上每个组中每个基因的批次校正的mtDNA转录丰度（而不是平均丰度）。为了确认批次校正后的估计结果，分别比较了批次1和2的CTVT_A1d1a组和CTVT_HT1和CTVT_HT2组的未校正mtDNA转录丰度估计值，发现每批CTVT_A1d1a组的转录本丰度相对降低了（49％ 批次1 降低p = 0.0002 ；批次2 降低p = 0.0088；批次2仅具有一个A1d1a CTVT。
MDCK细胞系（ECACC 84121903）在含有青霉素-链霉素（10,000 U / ml，Gibco）和10％胎牛血清（10270106，Gibco）的DMEM（31966047，Gibco）中粘附生长。分离线粒体提取物53，并使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）提取RNA。根据制造商的说明，使用第二代5'/ 3'RACE试剂盒（罗氏，巴塞尔，瑞士）绘制LSP转录起始位点（LSP-TSS）的位置。简而言之，使用预先设计的LSP-P1引物（5'-GTA AAC TCA TGT CAT CTA TTA TAC-3'）合成cDNA，纯化并使用dATP和末端转移酶拖尾。使用特定的LSP-P2引物（5'-CTT ATT TAT GTC CCG CCA AAC C-3'）和寡聚dT-Anchor引物进行聚合酶链反应（PCR）。凝胶纯化PCR产物并测序以鉴定LSP-TSS。
为了鉴定MDCK的mtDNA单倍型，使用AllPrep提取试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）提取DNA，并使用引物F-16499（5'-CCC）在PCR反应中扩增线粒体位置16499-111之间的区域。 CGT AAA CTC ATG TCA TCT ATT-3'）和R-111（5'-GTG GAG GCT TGC ATG TGT AA-3'）。使用QIAquick试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）纯化PCR产物，并测序以确认16660insCC的存在，表明MDCK具有单倍型A1d1a。通过在第二个单倍型为B1的犬细胞系（使用样品135H生长的犬成纤维细胞系）中进行启动子作图，我们证实了LSP-TSS在非A1d1a犬细胞中没有变化。
重组人POLRMT，TFAM，TFB2M和TEFM中表达并纯化54，55。转录反应的模板由克隆在BamHI和HindIII限制性酶切位点之间的包含人mtDNA序列的pUC18（含LSP的模板的位置1–477和含LSP和HSP的模板（重链启动子）的位置1–742）组成。创建的构建体包括野生型模板，+ CC模板以模拟人线粒体基因组中等价位（即LSP转录起始位点上游〜15 bp）的犬16660insCC和+ TT模板以建模16660insCC，并进行反映胸腺嘧啶在人类序列中的延伸。模板用BamHI或HindIII线性化（如补充图 7所示））以生成适当的径流转录产物。转录反应（25微升）含有500飞摩尔POLRMT，500 TFB2M，TFAM（如所指出，补充图 7），90飞摩尔模板DNA，10mM的Tris-盐酸（pH8.0）中，10毫摩尔MgCl 2，64 mM的氯化钠，100 μg/ ml BSA，1 mM DTT，100μMATP，100μMCTP，100μMGTP，10μMUTP，0.02μM[α-32P] UTP（3000 Ci / mmol）和4单位鼠类RNase抑制剂（New England Biolabs （美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。指出之处（补充图 7），反应也包含1 pmol TEFM。将反应液在32°C下孵育30分钟，然后加入200μl终止缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.2 M NaCl，1 mM EDTA，150μg/ ml蛋白酶K和0.1 mg终止反应） / ml糖原），并在42°C下孵育45分钟。然后将反应物沉淀出乙醇，并重悬于10μl上样缓冲液（98％甲酰胺，10 mM EDTA，0.025％二甲苯基氰基FF和0.025％溴酚蓝）中。通过4％变性PAGE（1x TBE，7 M尿素）分离样品，并使用放射自显影成像。
还尝试了犬mtDNA转录反应。分离出MDCK线粒体裂解物53。转录反应的模板由含有犬mtDNA序列的pEX-A128组成（假定模板同时包含LSP和HSP的位置为16430-16727）。创建的构建体包括一个非A1d1a模板和一个包含16660insCC的A1d1a模板。模板用BamHI和NotI或EcoRI和SspI线性化以生成可变长度的径流转录产物。如上所述，用不同量的新鲜提取的MDCK原生质体裂解物（1.25，2.5 µl）和不同量的模板DNA（100和200 fmol）进行转录反应（25 µl）。使用此方法未检测到来自犬LSP或HSP的转录。
在兽医病理学家的指导下，由一个评分员进行了盲目的组织病理学评分研究。对28个A1d1a CTVT组织学样本以及31个CTVT_HT1和CTVT_HT2 CTVT对照进行了评分。CTVT_HT1和CTVT_HT2对照在系统发育上与A1d1a肿瘤匹配。28个A1d1a CTVT属于8个水平转移组（HT3，2个肿瘤; HT8，6个肿瘤; HT9，13个肿瘤; HT10，1个肿瘤; HT13，1个肿瘤; HT14，1个肿瘤; HT16，1个肿瘤; HT17，3个肿瘤）。在评分之前，使用Hamamatsu Nanozoomer 2.0-HT玻片扫描仪（C9600）扫描组织学玻片，并使用NDP.view2软件（Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，日本）进行观察。每个视野被定义为至少包括一半的CTVT实质，避免出现人工畸变，溃疡或出血区域。如图2所示，评估了NDP.view2）上的周长722 µm。使用R 41中实施的不成对的两尾学生t检验来检验统计学显着性。
在伯利兹和哥伦比亚对53个CTVT肿瘤（4个A1d1a CTVT和49个CTVT_HT1和CTVT_HT2 CTVT）对长春新碱的化疗反应做出了一项盲法研究（伯利兹有13个CTVT，哥伦比亚有40个CTVT）。每周用静脉注射硫酸长春新碱（剂量为0.02-0.025 mg / kg或0.5 mg / m 2）治疗CTVT肿瘤，并测量肿瘤减少到其原始体积的50％所需的时间（补充图 8）。）。该分析排除了属于CTVT_HT1和CTVT_HT2组的单个肿瘤，在研究期内未达到其原始体积的50％。通过基因分型来回顾性确定每种肿瘤的线粒体单倍型。使用不成对的两尾学生t检验了统计学显着性在R 41执行的测试。
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