APOBEC3A是一种胞苷脱氨酶，可驱动癌细胞中的诱变，DNA复制应激和DNA损伤。尽管APOBEC3A诱导的癌症易感性提供了治疗的机会，但由于APOBEC3A蛋白和mRNA的丰度较低，因此难以量化。在这里，我们描述了一种定量和灵敏的测定方法来测量APOBEC3A在肿瘤中的正在进行的活性。使用从APOBEC3A阳性肿瘤鉴定的热点RNA突变和液滴数字PCR，我们开发了一种测定法来量化APOBEC3A的RNA编辑活性。在预测APOBEC3A对DNA的活性方面，该检测优于基于APOBEC3A的基于蛋白质和mRNA的检测。重要的是，我们证明基于RNA突变的APOBEC3A分析适用于癌症患者的临床样品。
最近对各种癌症类型的癌症基因组学研究已经揭示了驱动肿瘤发展的重要机制，并为癌症治疗提供了机会。间确定的日期的30+突变签名，至少两个与APOBEC（载脂蛋白B mRNA的编辑酶催化多肽样）蛋白质相关1，2，3。APOBEC3家族的成员能够将DNA和/或RNA 4中的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶。特别地，APOBEC3A（A3A）和APOBEC3B（A3B），靶向在单链DNA中的TPC基序（单链DNA）4，5，6，7，被示出为APOBEC签名突变的患者的肿瘤中的主要来源1，2，3。A3A和A3B通常在病毒感染后表达，以防御细胞对外源DNA或RNA的侵害，但在增殖正常细胞中不表达4。然而，A3A和A3B表达在肿瘤中的〜50％检测到4，8，9。在乳腺癌，肺癌，头颈部癌，食道癌，膀胱癌，和子宫颈癌，A3A和A3B被异常表达，这是与高水平APOBEC签名突变相关联的2，4，8，10。在癌细胞中由A3A和A3B诱导的诱变可能不仅有助于肿瘤的发展，而且还具有脆弱性。在癌细胞中A3A和A3B活动诱导DNA复制的应力和DNA断裂9，10，11，12，13，提供了一个机会，以靶向癌细胞窝藏高水平A3A的/通过破坏DNA损伤应答乙活动（DDR）10，14。为了利用A3A / B诱导的癌细胞脆弱性，定量测量肿瘤中的A3A / B活性至关重要。在这项研究中，我们研究了如何具体量化肿瘤中A3A的活性。
虽然A3A和A3B具有相似的胞苷脱氨酶活性，但它们的底物特异性并不相同。Gordenin实验室以酵母为模型来表征A3A / B介导的诱变，鉴定出A3A和A3B底物位点的差异，其中A3A偏爱YTCA基序，A3B偏爱RTCA基序（R为嘌呤，Y为嘧啶）15。此外，我们最近发现，A3A而非A3B在DNA茎环中表现出对底物位点的偏好8。重要的是，不同癌症患者中反复出现的APOBEC签名突变并非随机分布在基因组中，而是富含DNA茎环，这表明A3A是肿瘤突变的主要驱动力。类似于其对DNA茎环的偏好，A3A还以序列特异性方式识别RNA茎环16。A3A和A3B的独特序列和结构偏好使得区分这些酶对肿瘤诱变的作用成为可能。
除了底物特异性方面的差异外，A3A和A3B的催化活性也不同。A3A比A3B具有更高的催化活性，但在肿瘤中A3B通常以高于A3A的水平表达。当在癌细胞中过表达时，诱导A3A DNA复制应激，DNA双链断裂（DSB的），和细胞周期停滞在催化活性依赖的方式10，11，12，14。重要的是，A3A表达细胞成为依赖于共济失调毛细血管扩张症和RAD3相关蛋白（ATR）检查点途径容忍引起A3A表达DNA损伤10，14。ATR的抑制10，14或它的效应激酶Chk1 14导致以A3A依赖性方式增加细胞死亡，表明潜在地使用ATR或Chk1抑制剂靶向具有高A3A活性的肿瘤。此外，参与耐受和去除DNA中尿嘧啶的跨病变合成（TLS）或碱基切除修复（BER）的抑制，强烈地使表达A3A的癌细胞对ATR抑制剂10敏感。我们以前表明，某些癌细胞系中内源性A3A和A3B的消耗减少了它们对ATR抑制的敏感性，这表明A3A和A3B都可能导致肿瘤的脆弱性。
迄今为止，对肿瘤中A3A / B活性的量化一直是一个挑战。已经开发了基于细胞提取物的体外测定法来测量A3A / B的活性。尽管这些体外测定有助于理解A3A / B的生化特性，但由于需要大量细胞，因此它们不容易应用于肿瘤样品。此外，尽管给定足够的时间，A3A和A3B会在基因组中留下清晰的突变足迹，但这些足迹与酶的当前正在进行的活动并不直接相关。有趣的是，最近的一项研究表明，APOBEC诱变以一种偶发的方式发生在肿瘤中17从而增加了癌细胞中不耐受持续的高A3A / B表达的可能性。最后，由于A3A的低表达，A3A蛋白和A3A mRNA均难以在有限数量的癌细胞中进行定量，这使得预测肿瘤中当前正在进行的A3A活性水平特别具有挑战性。
在这项研究中，我们开发了一种策略来量化A3A在肿瘤中的持续活性。我们发现肿瘤中的A3A表达和A3A介导的DNA诱变（而不是A3B的突变）与RNA茎环中的APOBEC特征突变相关。这些RNA突变不存在于其DNA模板中，表明它们是由A3A直接产生的。使用从A3A阳性肿瘤和液滴数字PCR（ddPCR）鉴定的RNA茎环中的热点APOBEC签名突变，我们开发了一种定量和灵敏的测定方法来测量A3A的RNA编辑活性。由于RNA的不稳定，短暂的性质，A3A的RNA编辑活性准确反映了A3A当前正在进行的活性。我们证明基于RNA突变的A3A分析在预测当前对DNA的A3A活性方面优于基于APOBEC3A蛋白质和mRNA的分析。最后，我们表明基于RNA突变的A3A分析可用于癌症患者的临床样品。总之，我们的研究结果提出了一种新的策略来应对肿瘤中A3A的失调，这将为研究A3A在肿瘤进化中的作用以及针对A3A引起的癌症治疗中的脆弱性提供新的机会。
最近的癌症基因组学研究中发现的APOBEC签名肿瘤中最常见的突变签名之一1，2，3，18。为了鉴定以A3A或A3B为主的APOBEC +肿瘤，我们试图分离A3A和A3B对APOBEC签名突变的贡献（图 1a，b）。我们分析了来自TCGA和其他项目的1686种多种癌症类型的肿瘤的全基因组测序（WGS）数据（图 1a和补充表 1）），并根据（1）APOBEC特征突变的频率，（2）A3A特征的水平（A3A优选的YTC基序和DNA茎环）和（3）A3B特征的水平（A3B）对突变进行分类-首选RTC主题）（图 1b）。我们将肿瘤分为三类：具有高水平A3A特征突变（A3A +）的肿瘤，具有高水平A3B特征突变（A3B +）的肿瘤和既没有A3A特征突变也没有A3B特征突变的肿瘤（APOBEC-）（图 1b）。该分析表明，在整个癌症中，A3A签名（A3A +）比A3B签名（A3B +）更为普遍。但是，A3A和A3B的贡献在不同的癌症类型中有所不同。膀胱癌，宫颈癌，头颈癌，肺癌，子宫内膜癌和甲状腺癌以A3A为主，而A3B在肾癌和肉瘤中占主导地位（补充图 1）。乳腺癌的独特之处在于既包括许多以A3A为主的肿瘤，也包括许多以A3B为主的肿瘤（补充图 1）。
a，b对患者肿瘤样品（来自TCGA和其他项目，请参见补充表1）的全基因组测序（WGS） 进行分析，分析其在TpC基序中的突变频率。根据每个患者的肿瘤样品在TpC模序中的突变水平及其在RTC与YTC序列中的突变频率绘制图。c，d根据患者的A3A表达水平和YTC序列中的突变频率绘制患者的肿瘤标本。颜色代码指示患者的肿瘤类型（a，c）或DNA茎环（b，d）中的APOBEC3A突变频率。
接下来，我们测试了A3A mRNA的水平是否与A3A +肿瘤中的A3A标志突变相关（图 1c，d）。A3A mRNA和A3A签名突变之间的相关性很差（图 1d），这表明A3A签名突变无法预测肿瘤中A3A的表达。该结果表明，许多携带A3A特征突变的肿瘤在mRNA分析时不再表达A3A，这与最近的报道一致，即在肿瘤发生过程中以情景方式产生APOBEC特征突变17。此外，一些肿瘤表达A3A，但没有可检测水平的A3A特征突变（图 1d），大概是因为这些肿瘤表达A3A的时间不足以产生足以克隆扩增的突变，从而无法通过批量肿瘤测序检测到。因此，我们得出结论，不能从A3A签名突变的水平可靠地推断出肿瘤中A3A表达和活性的水平。
的细胞提取物为基础的体外测定常用于测量在癌细胞中APOBEC活动5，8，9。在该测定中，将含有单个TpC位点的单链DNA（ssDNA）寡核苷酸与细胞提取物一起孵育。当TpC位点中的C被细胞提取物中的APOBEC脱氨基时，所得的U被尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）裂解，导致一个无碱基位点（AP位点）。然后，ssDNA中的AP位点在95°C的碱性缓冲液中发生位点特异性断裂，可以通过电泳观察和定量（补充图 2a）。
为了测试这种体外APOBEC分析是否可用于预测A3A活性，我们选择了一组既表达A3A和A3B，又表达A3B或既不表达A3A也不表达A3B的癌细胞系（图 2a，b）。我们没有发现任何仅表达A3A的细胞系10。在该细胞系组中，在表达A3A和/或A3B的所有细胞系中检测到APOBEC活性（图 2c，d）。但是，这些细胞系中的APOBEC活性与A3A或A3B mRNA不相关。因此，标准的体外APOBEC分析无法预测癌细胞中的A3A。
通过RT-qPCR确定的一组癌细胞系中A3A和A3B mRNA表达的分析。误差线：SD（n = 3）。b通过Western Blotting分析所示癌细胞系中的A3B水平。c本研究中使用的DNA寡核苷酸示意图。polyA-TC：无任何二级结构的寡核苷酸（单链DNA）。NUP93：基因NUP93中的天然存在的DNA发夹。d对所示细胞提取物（30μg）的PolyA-TC和NUP93底物的脱氨活性。ËBICR6细胞中的A3A和/或A3B敲低。在对PolyA-TC和NUP93底物进行敲除后，监测BICR6细胞提取物中的脱氨活性（30μg）。源数据作为源数据文件提供。
我们最近显示，A3A而不是A3B在DNA茎环8中更喜欢TpC位点。例如，NUP93基因中的TpC位点位于DNA茎环中，而含有该TpC位点的DNA寡核苷酸（NUP93）在体外是A3A的强底物（图 2c）。当NUP93的茎被破坏时，所得的线性ssDNA寡核苷酸（polyA-TC）成为A3A的不良底物（图 2c）。与A3A相比，A3B在NUP93和polyA-TC上显示出类似的活性。为了测试DNA茎环和线性底物是否可以帮助区分A3A和A3B活性，我们在体外用NUP93和polyA-TC测试了细胞系。NUP93和polyA-TC均未引发与A3A水平相关的活性（图 2d）。BICR6是表达A3A和A3B的细胞系（图 2a，b）。我们使用siRNA敲低BICR6细胞中的A3A，A3B或A3A和A3B（图 2e和补充图 2b，c）。耗尽A3A或A3B会部分降低APOBEC对NUP93的活性，而耗尽A3A和A3B则实际上废除了该活性。因为polyA-TC是A3A的不良底物，所以与A3A的消耗（36％；图2e）相比，A3B的消耗减少了对polyA-TC的活性（71％ ）。这些结果表明，A3A和A3B都有助于细胞提取物中检测到的APOBEC活性。此外，即使使用DNA茎环底物，体外APOBEC分析也无法预测癌细胞中的A3A活性。
A3A不仅对ssDNA表现出活性，而且对单链RNA也表现出活性。在下面的炎症或过度表达A3A的单核细胞中检测到A3A对茎环UPC位点的RNA编辑活动16，19。然而，尚不清楚癌细胞中是否存在A3A的RNA编辑活性。为了研究A3A是否会修饰肿瘤中的RNA，我们比较了A3A +和APOBEC-肿瘤，并在转录组中鉴定了经常在RNA中获得C-> U突变但在同一患者的相应DNA中没有发生突变的胞嘧啶（补充图 3 – 6和补充表 2）。我们认为这些RNA突变不是由突变的DNA模板的转录产生的，而是APOBECs RNA编辑活性的产物。进行过APOBEC依赖性RNA编辑的位点显示，如先前报道的16，CAUC基序在具有4-nt环和强配对发夹的茎环中富集（图 3a，b和补充图 7）。为了进一步确定APOBEC产生的RNA突变的结构特异性，我们将分析限于茎环，并比较了大小和基序位置不同的环（图 3b）。在A3A +肿瘤而非A3A- / A3B-肿瘤中，在3、4和5个核苷酸的环中鉴定出RNA突变（图 3b））。另外，A3A +肿瘤中的RNA突变在环的特定位置富集。对于3、4和5个核苷酸的环，当UpC基序的U位于环的中心时，观察到最高的突变频率（图 3b）。在A3A +肿瘤的所有APOBEC签名RNA突变中，DDOST 558C> U突变最为常见（图 3b，c和补充表 3）。在显示强A3A特征的肿瘤中，将近 8％的DDOST RNA编辑在C558位置。每个RNA靶标的已编辑RNA的平均比例通常为百分之几（图 3b和补充表 3）），但是在单个样本中，这一比例可以达到> 30％（补充图 5）。值得注意的是，DDOST的C558位于一个由CCAU C G基序形成的4 nt环中（图 3c），这是A3A +肿瘤中RNA诱变的最佳结构/序列环境（图 3a）。因此，A3A对DNA和RNA茎环的结构偏好相似，并且A3A在肿瘤的最佳底物位点产生RNA热点突变。
一个 A3A为主的肿瘤（APOBEC3A +）和肿瘤而不APOBEC突变或活性（APOBEC-）的比较揭示经历频繁APOBEC依赖性C->ûRNA编辑位点。最频繁编辑的前50个站点被汇总到一个徽标中，显示每个位置上碱基的相对频率。b通过发夹特征对位点进行分类揭示了APOBEC依赖性编辑的结构偏好。发夹环中暴露的UpC位点以较高频率突变。U在环中的位置会影响变异性，在四个核苷酸的环中，C的最高RNA编辑频率位于C的3'-最末端。c DDOST和D基因中茎环结构的示意图CYFIP1，是患者肿瘤样品中两个APOBEC编辑程度最高的RNA位点。d在每位患者中检测到的RNA茎环编辑水平以绿色叠加在图1b中，这些患者 可获得RNA测序数据。e RNA茎环编辑水平与患者肿瘤中A3A的表达量密切相关（ρ = + 0.72，p = 3×10 -55）。
为了进一步研究A3A和A3B对肿瘤中RNA突变的贡献，我们选择了通过DNA和RNA测序进行分析的患者肿瘤（图 3d，e和补充图 8A，B）。与A3B +肿瘤相比，A3A +肿瘤中的APOBEC签名RNA突变更为频繁（图 3d）。与DNA突变相反（图 1d），RNA突变与肿瘤中A3A的mRNA水平密切相关，而与A3B的mRNA水平无关（图 3e，补充图 8B）。这些结果表明，A3A但不是A3B是癌细胞中APOBEC签名RNA突变的主要原因，这增加了RNA突变是肿瘤中A3A活性的预测因子的可能性。
接下来，我们寻求开发一种策略来检测和量化肿瘤中A3A产生的RNA突变。液滴数字PCR（ddPCR）是一种定量且灵敏的方法，可检测SNP，稀有突变，拷贝数变异和基因重排。ddPCR基于遵循Poisson分布将PCR反应分成小滴并产生包含零个，一个或多个模板序列拷贝的分区。PCR扩增后，分别评估液滴的荧光，从而可以对模板序列进行绝对定量。重要的是，可以同时使用两个荧光探针来确定分子种群中两个序列变体的比例。考虑到ddPCR的这些理想功能，我们测试了ddPCR是否可用于量化细胞中A3A产生的RNA突变。
我们先前已经产生了U2OS衍生的细胞系，这些细胞系在强力霉素（DOX）处理后可诱导表达野生型A3A（A3A WT）或催化失活的A3A突变体（A3A E72A）（补充图 9A）。A3A诱导后两天，将总RNA分离，逆转录成DNA，然后通过ddPCR分析（图 4a）。为了检测A3A介导的RNA编辑，我们选择DDOST 558C> U和CYPIF1 3222C> U（A3A +肿瘤中两个最常见的RNA热点突变）作为ddPCR的靶标（图 3b，c）。两者DDOST 558C>ù和CYPIF1 3222C>û突变发生在最适合A3A的RNA茎环中（图 3c）。我们设计了用FAM或HEX标记的TaqMan探针，分别识别野生型（WT）或突变序列（图 4a）。ddPCR后显示FAM（WT）和HEX（突变）荧光的液滴被定量并绘制在二维散点图中（图 4b）。计算WT和突变体液滴之间的比例，以确定细胞中特定RNA突变的频率。在U2OS细胞中诱导A3A WT而不诱导A3A E72A有效诱导DDOST 558C> U和CYPIF1 3222C> U RNA突变（图 4b，c和补充图 9a）。在未转化的RPE1-hTERT细胞中也获得了相似的结果（图 4d）。值得注意的是，我们在仅表达A3B的细胞中未检测到任何显着的RNA编辑活性（图 4c和补充图 9B），表明该活性特别可归因于A3A。总之，这些结果表明基于RNA突变的ddPCR可用于检测细胞中A3A的RNA编辑活性。
液滴数字PCR（ddPCR）策略的示意图，用于检测A3A的RNA编辑。b在U2OS细胞中表达野生型A3A或催化失活的突变体A3A（A3A E72A）后，通过ddPCR扩增的野生型（绿色）或编辑的（蓝色）DDOST散点图。c，d用强力霉素（DOX）诱导或诱导诱导表达A3A，A3A E72A或A3B的U2OS衍生或RPE1-hTERT衍生的细胞系，或未诱导。通过ddPCR分析定量U2OS或RPE1-hTERT细胞中DDOST 558C> U和CYFIP1 3222C> U的编辑水平。误差条：SD（Ñ ≥3）。Ë用增加量的表达A3A-Flag / GFP的载体转染HEK-293T细胞。通过Western印迹分析HEK-293T细胞提取物中的A3A蛋白水平。EV空向量。f分别与0.2μg或1μgHEK-293T细胞提取物孵育后，测量NUP93和PolyA-TC底物上的脱氨活性，如e中所示，表达的A3A含量增加。g通过ddPCR分析对编辑的DDOST 558C> U进行定量，与通过电泳迁移率分析法监测NUP93 DNA的切割密切相关，如f所示。误差线：SD（n = 3）。为了进行ddPCR定量，从e和f所示的相同HEK-293T细胞库中纯化RNA 。源数据作为源数据文件提供。
由于A3A使用相同的催化结构域使ssDNA和RNA脱氨基，因此可以预期A3A的RNA编辑活性与其对ssDNA的活性相关。为了测试A3A在ssDNA和RNA上的活性是否紧密相关，我们在HEK293T细胞中瞬时表达了不同量的A3A（图 4e），并同时进行了ddPCR和体外APOBEC分析（图 4f，g）。由于HEK293T细胞不表达内源性A3A / B，因此在体外测定中检测到的唯一APOBEC活性来自外源性A3A（图 4f）。随着HEK293T细胞中A3A水平的升高，通过ddPCR检测到的RNA编辑活性和通过体外测定检测到的DNA脱氨活性均相应增加。重要的是，RNA编辑活性的增加与DNA脱氨活性的增加成正比，表明A3A的两个活性紧密相关。因此，ddPCR A3A RNA编辑测定可用于预测A3A对DNA的活性。
为了测试ddPCR分析是否足够灵敏以检测癌细胞中内源性A3A的活性，我们选择了一组以不同水平表达A3A和/或A3B的癌细胞系（图 5a）。水平DDOST 558C>ù和CYFIP1 3222C>û RNA突变与ddPCR测定法分析。为了从背景噪声中区分出阳性信号并确定重要的RNA编辑活性的阈值，我们手动应用了三个HEX荧光阳性小滴20和0.25突变DDOST的截止值每微升拷贝数（在ddPCR的初始步骤中每个样品产生20,000个液滴）。在两种表达A3A的细胞系NCI-H2347和BICR6中检测到了显着的RNA编辑活性（图 5b）。相反，在仅表达A3B或均不表达A3A或A3B的其他细胞系中检测到的信号低于可靠的RNA突变的临界值（图 5b），表明它们缺乏明显的A3A活性。此外，敲除A3A可以废除BICR6细胞中的RNA编辑，从而证实了ddPCR分析对A3A活性的特异性（图 5c和补充图 10A））。这些结果进一步支持了A3A而不是A3B促进癌细胞中RNA热点突变的观点。此外，基于RNA突变的ddPCR测定法是一种特异性和灵敏的方法，用于量化癌细胞中内源性A3A的RNA编辑活性。
通过RT-qPCR确定的一组癌细胞系中A3A和A3B mRNA表达的分析。误差线：SD（n = 2）。b在已知A3A下降后，通过ddPCR分析定量BICR6细胞中DDOST 558C> U和CYFIP1 3222C> U的水平。误差条：SD（Ñ ≥3）。c通过ddPCR分析定量编辑的DDOST 558C> T和CYFIP1 3222C> T。误差线：SD（n = 3）。（* p = 0.0352为DDOST和p = 0.0111为CYFIP1通过双尾吨-test）源数据作为源数据文件提供。
除了A3A RNA编辑活性外，A3A蛋白和mRNA水平也可以预测A3A对DNA的活性。我们直接比较了ddPCR分析与基于A3A蛋白质和mRNA的分析来监测A3A表达/活性的能力。我们发现用吉西他滨和干扰素-α处理BICR6细胞诱导了A3A表达（图 6a–c和补充图 10B）。通过A3A mRNA的定量PCR（qPCR），内源性A3A蛋白的Western印迹和A3A产生的RNA热点突变的ddPCR检测到A3A的这种诱导。因此，对于A3A的可靠诱导，所有这三种方法都可以正常工作。但是，值得注意的是，只有qPCR和ddPCR而不是Western blot检测到未处理的BICR6细胞中的基线A3A表达/活性（图 6a–c），表明qPCR和ddPCR比Western blot更为敏感。与BICR6细胞相似，吉西他滨和干扰素-α在PC9细胞中诱导A3A。尽管在PC9细胞中无法检测到A3A的基线表达（补充图 10C），但qPCR和ddPCR均清楚地检测到了A3A的诱导（图 6d，e）。但是，与BIRC6细胞中的强诱导作用相反，PC9细胞中A3A蛋白的诱导作用太弱，无法通过Western blot检测到（图 6f）。这些结果也支持以下观点：qPCR和ddPCR在检测A3A表达/活性方面比蛋白质印迹更敏感。
a-f的 A3A的水平通过RT-qPCR，ddPCR，和免疫印迹监控BICR6或以下与吉西他滨（0.5μM）和干扰素αA/ d（750毫升ü治疗PC9细胞-1）48小时，释放到无药培养基持续24小时，48小时或72小时。误差条：SD（Ñ ≥3）。源数据作为源数据文件提供。
考虑到APOBEC签名突变很可能在肿瘤进化过程中以一种发作的方式产生17，因此A3A在肿瘤中的表达可能是短暂的。为了测试qPCR，western blot和ddPCR是否能可靠地监测A3A的瞬时表达/激活，我们用吉西他滨和干扰素-α处理了BICR6细胞，然后将其释放到无毒培养基中。如通过qPCR检测到的，A3A mRNA在释放后迅速下降（图 6a）。但是，western blot和ddPCR分析表明，释放后至少3天，A3A蛋白及其RNA编辑活性仍然很高（图 6b，c）。在PC9细胞中，尽管通过蛋白质印迹，qPCR和ddPCR检测未检测到A3A蛋白，但释放后A3A mRNA的下降速度比A3A活性下降得更快（图 6d–f）。因此，在瞬时A3A表达的情况下，A3A mRNA不是A3A蛋白和活性的可靠预测因子。这可能是因为A3A蛋白比A3A mRNA稳定得多。在这种情况下，用于监测瞬时A3A表达/活性的ddPCR比qPCR更为准确。
接下来，我们测试了基于RNA突变的ddPCR测定法是否可以应用于癌症患者的临床样品。最近的一项研究表明，A3A在AML（成人急性髓细胞性白血病）细胞14中高度表达。为了调查A3A在血液癌症中是否普遍表达，我们收集了18名AML或MPN（骨髓增生性肿瘤）患者的血样（补充表 4）。）。从这些样本中分离出的RNA量在患者之间差异很大。当我们使用qPCR分析A3A mRNA时，由于mRNA的丰度低，在某些样品中参考基因（肌动蛋白）的循环阈值（Ct）值很高（Ct> 25）。此外，样品中参考基因的Ct值发生很大变化（最多7个周期），因此使用qPCR比较不同样品中A3A mRNA的水平并不可靠。与qPCR相比，ddPCR是直接定量特定序列的DNA分子的方法，可以直接确定每个样品中野生型和已编辑模板的拷贝数以及编辑效率。当我们使用ddPCR A3A分析法分析血液样本中的RNA时，检测到了广泛的A3A活性（图 7a）。值得注意的是，即使在RNA含量非常低的样品中，我们也检测到显着的A3A活性高于三个HEX荧光阳性液滴和每微升0.25突变的DDOST拷贝的阈值。来自患者样本UCI-642，UCI-632，UCI-463、2015-004和2019-023的信号低于此阈值，表明它们对A3A活性呈阴性。为了通过ddPCR验证A3A活性的定量，我们为参考基因选择了4个具有相似Ct值（Ct = 20±1）的样品，这使我们能够通过qPCR比较这些样品中A3A mRNA的水平（图 7b）。其中两个样品的A3A mRNA和活性较低或没有检测到，而另两个样品的A3A mRNA均较高，并且编辑的DDOST 558C> T RNA 含量较高（图。 7b，c）。因此，当在临床样品中通过qPCR可定量A3A mRNA时，A3A mRNA与A3A活性高度相关。然而，基于RNA突变的ddPCR分析甚至可以检测由于mRNA含量低而无法通过qPCR可靠分析的样品中的A3A活性，这表明ddPCR分析是一种量化癌症临床样品中A3A活性的更灵敏方法。耐心。
a在一组患者血液肿瘤样品中使用ddPCR测定法定量编辑的DDOST 558C> U的水平。对于每个样品，进行独立的PCR反应以确定DDOST 558C> U的编辑水平。误差条：SD（Ñ ≥3）b，c ^ A3A mRNA和编辑的水平DDOST 558C>û分别通过RT-qPCR和ddPCR分别所指示的患者的血液肿瘤样品中进行定量。对于每个样品，进行三个或更多个独立的PCR反应以确定A3A mRNA或DDOST 558C> U的水平。错误栏：SD编辑的DDOST 558C> Uc中显示的水平结果与相应患者样品的a重复。源数据作为源数据文件提供。
从最近的癌症基因组学研究中，APOBEC蛋白已成为多种癌症诱变的关键驱动因素4。癌细胞中APOBEC介导的诱变可能以多种方式促进肿瘤的发展。通过APOBECs产生可以激活癌基因和灭活肿瘤抑制中的突变，增加癌细胞的增殖或存活优势4，18，21，22。APOBEC诱导的突变也可促进肿瘤的异质性，增加的肿瘤发生转移或开发的抗治疗的能力17，21。此外，我们和其他人最近发现，A3A / B表达可诱导复制应力和DNA损伤，产生超出突变基因组不稳定10，14。A3A / B诱导的基因组不稳定性为靶向治疗提供了机会。例如，在癌细胞系敏感性赋予ATR抑制剂A3A表达10，14。为了了解A3A在肿瘤进化中的作用并针对A3A诱导的癌细胞脆弱性，开发定量和灵敏的测定肿瘤中A3A活性的测定至关重要。
使用A3A和A3B的独特突变特征，我们开发了一种计算策略来鉴定以A3A或A3B为主的肿瘤。出人意料的是，在以A3A为主的肿瘤中，A3A签名突变的水平与A3A mRNA水平没有很好的相关性，这表明A3A突变足迹无法可靠地预测肿瘤中当前正在进行的A3A活性。与我们的发现一致的是，最近的一项研究表明，APOBEC特征突变是在肿瘤中以情节方式产生的17。。癌细胞中的病毒感染或其他致癌应激可能会暂时激活A3A，即使不再表达A3A，也会留下突变足迹。由于其强大的活性和诱导高水平的基因组不稳定性的能力，因此可能无法在肿瘤中很好地耐受持续的A3A表达，从而选择在瞬时表达后关闭A3A的肿瘤细胞。不管A3A足迹和表达分离的潜在机制如何，我们的发现表明A3A突变特征并不是肿瘤中目前正在进行的A3A活性的可靠预测因子。
已知A3A响应病毒感染不仅修饰DNA而且修饰RNA。在这项研究中，我们发现即使在没有相应的DNA突变的情况下，从肿瘤的RNA中也检测到A3A标志突变，这表明这些RNA突变是由A3A直接产生的。RNA突变与肿瘤中A3A的表达相关，但与A3B的表达不相关。与A3A产生的DNA突变相似，A3A诱导的RNA突变富含茎环。然而，在RNA茎环中，UpC基序周围的序列不同于DNA茎环中TpC基序周围的序列。例如，在具有4-nt环的RNA茎环中，UpC基序最常以A或U开头，而在DNA茎环中，TpC基序通常以C或T开头。我们推测，序列偏好的差异对于补偿RNA和DNA主链之间的结构差异是必要的。与单链DNA结合的A3A的结构表明A3A与DNA的糖磷酸骨架之间存在一些直接相互作用6，23，24，这表明A3A可以识别在一个稍微不同的方式RNA底物。我们的发现表明，A3A对RNA的活性与其对DNA的活性密切相关，这表明可以通过以下A3A介导的RNA编辑来监测A3A对DNA的当前影响。但是，A3A在等效的DNA和RNA底物上的比活性可能并不相同。
尚不清楚在癌细胞中由A3A编辑RNA的功能意义。由于在四个核苷酸的环中UpC基序（CAU C）周围的序列保守性，肿瘤中许多A3A产生的RNA突变将一个异亮氨酸密码子转换为另一个异亮氨酸密码子（A UC > A UU）。在肿瘤中，在由A3A编辑的RNA中仅检测到少数错义突变。某些错义RNA突变是否会产生功能获得突变或显性阴性蛋白突变尚待研究。RNA突变对非编码RNA的可能影响也需要探索。肿瘤中每个RNA靶标的编辑RNA比例通常在患者中平均为1–10％（图 3b））。所有或大多数肿瘤细胞都可能有少量的RNA被编辑。或者，一小部分肿瘤细胞可能具有高水平的编辑过的RNA。我们使用表达A3A的稳定细胞系进行的实验表明，最多可以编辑DDOST RNA的30％（图 4c，d），这表明A3A对某些RNA的活性比其DNA模板强得多。此外，编辑的DDOST 558C> T RNA在单个肿瘤中可以达到> 30％（补充图 5）。试图推测在某些致癌环境中，A3A可能主要起RNA编辑器的作用，而不是DNA突变子，从而提供了其在癌症中失调的另一种解释。
与DNA突变相反，RNA突变不能在细胞分裂过程中通过基因组复制而遗传。此外，由于RNA的瞬态和不稳定特性，在负责的酶失活后，RNA突变将迅速消失。因此，A3A的RNA编辑活性为测量其当前正在进行的活性提供了独特的机会。我们利用了DDOST和CYFIP1中的热点编辑站点mRNA和高度敏感的ddPCR方法，以开发定量分析A3A的RNA编辑活性的方法。我们确认该测定法对A3A特异，但对A3B不特异。重要的是，这种基于RNA突变的A3A分析在预测细胞系中DNA的A3A活性方面比基于A3A蛋白质和mRNA的分析更为灵敏，为迄今为止测量癌细胞中目前正在进行的A3A活性提供了迄今为止最定量，最灵敏的分析方法。
在这项研究中，我们证明了基于RNA突变的A3A分析可以应用于血癌患者的血液样本。即使在无法通过A3A RT-qPCR可靠分析的低定量样品中，基于RNA突变的ddPCR检测也能检测到A3A活性。应当指出，ddPCR已经被用于检测病原体，病毒，拷贝数变异和稀有突变25。此外，食品药品监督管理局（FDA）最近批准了使用ddPCR监测慢性粒细胞白血病（CML）患者对酪氨酸激酶抑制剂治疗的反应26。在未来的研究中，测试基于RNA突变的A3A分析是否足够灵敏以检测癌症患者不同类型肿瘤样品中A3A活性至关重要。
癌细胞与显著A3A活性依赖的DNA修复途径和ATR检查点容忍A3A诱导复制应力和基因组不稳定性10，14。在表达A3A的癌细胞中抑制ATR会导致复制灾难和细胞死亡，而抑制TLS或BER则进一步增强了对ATR抑制剂的敏感性10。表达A3A的癌细胞对ATR检查点的这种依赖性为使用ATR抑制剂进行靶向治疗提供了机会。许多ATR抑制剂的临床试验已经在进行27，28。我们开发的基于RNA突变的A3A检测方法可以鉴定具有显着A3A活性的肿瘤，从而有助于鉴定可能受益于ATR抑制剂治疗的患者。我们设想将开发其他治疗策略，以利用A3A诱导的癌细胞脆弱性。基于RNA突变的A3A测定法也可以用于促进这些未来的治疗。除指导治疗外，基于RNA突变的A3A分析还可用于监测肿瘤发生过程中A3A的失调。这些研究可以帮助我们了解在肿瘤进化过程中何时，为什么以及如何激活和灭活A3A。定义A3A的背景和作用窗口可能有助于解决A3A是否以及如何促进肿瘤异质性，转移和耐药性。
分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）和其他项目的配对肿瘤正常测序数据，以研究DNA和RNA水平下APOBEC酶活性的分子相关性。分析中包括来自全外显子DNA测序（WXS），全基因组DNA测序（WGS）和RNA测序（RNA-Seq）的数据，所有数据均与人类基因组构建hg19对齐。补充方法中提供了有关计算分析的详细说明 。
由GenScript用β珠蛋白内含子和C端的Flag标签合成APOBEC3A和APOBEC3B cDNA。通过定点诱变构建催化死亡的突变体APOBEC3A-E72A。通过使用Gateway克隆系统（Thermo Fisher Scientific）将cDNA插入pInducer20或pDEST53载体中来产生表达APOBEC3A-Flag，APOBEC3A-E72A-Flag和APOBEC3B-Flag的质粒。
通过感染U2OS细胞慢病毒下一个多西环素诱导型启动子（pInducer20）表达APOBEC3A，APOBEC3A-E72A，或APOBEC3B产生，并用G418（400微克毫升选择U2OS衍生的细胞系-1）10。将U2OS衍生细胞维持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中。为了表达蛋白质，将U2OS细胞与强力霉素（200 ng mL -1）48小时。将U2OS，RPE1-hTERT和HEK-293T细胞保存在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中。将OVCAR5，PC9和NCI-H2347细胞维持在RPMI-1640 GlutaMAX-1中，并补充10％FBS，1％青霉素/链霉素，1％葡萄糖和1％丙酮酸钠。TOV21G，OV17R和BICR6细胞维持在DMEM / F12 GlutaMAX-1中，并补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素。SKBR3在补充了10％FBS和1％青霉素/链霉素的McCoy's 5A中维持。以上细胞系购自ATCC或Sigma-Aldrich。
siRNA转染是通过Lipofectamine RNAiMax（Thermo Fisher Scientific）进行转染而进行的。siRNA购自Thermo Fisher Scientific（Select siRNA）。siRNA转染后16小时，用指定的药物处理细胞。这项研究中使用的siRNA的序列为：
siCTL：目录＃4390846
siAPOBEC3A：CGACAGUACCAGACUCCAUtt
siAPOBEC3B：CCUCAGUACCACGCAGAAAtt
在这项研究中使用的抗体是：Flag-M2单克隆抗体（Sigma-Aldrich＃F1804）
GAPDH多克隆抗体（EMD Millipore＃ABS16），Flag多克隆抗体（Sigma-Aldrich＃F7425），APOBEC3B单克隆抗体（Abcam＃ab184990），APOBEC3A / B多克隆抗体（Santa Cruz＃sc-86289）和Ku70单克隆抗体（Gene Tex＃GTX70271）。
吉西他滨购自Selleckchem，并溶于DMSO。强力霉素和纯化的人干扰素-αA/ D购自Sigma-Aldrich。
该脱氨基APOBEC测定用细胞提取物从所指示的细胞系进行8，10。在25 mM HEPES（pH 7.9），10％甘油，150 mM NaCl，0.5％Triton X-100、1 mM EDTA，1 mM MgCl 2，RNase A（0.2μgml -1）和1 mM ZnCl2 中裂解细胞和蛋白酶抑制剂。超声处理细胞裂解液，在4°C下孵育30分钟，然后在4°C下以16,000× g离心10分钟 。通过Bradford测定法（Bio-Rad）测定上清液的蛋白质浓度。
如先前描述的方法进行脱氨反应测定8，10。将含有8μL标准化量的细胞提取物（表达A3A或A3B）的反应（50μL）在含有DNA寡核苷酸（20 pmol DNA寡核苷酸，50 pmol）的反应缓冲液（42μL）中于37°C孵育1小时。 mM Tris（pH 7.5），1.5单位尿嘧啶DNA糖基化酶（NEB），RNase A（0.1μgmL -1）和10 mM EDTA）。然后，在95°C下40分钟后，将100 nM NaOH添加到反应中。最后，将50μL的甲酰胺添加至反应中（最终为50％），并将反应在95℃下孵育10分钟，随后在4℃下孵育5分钟。在20％变性丙烯酰胺凝胶（8 M尿素，1X TAE缓冲液）上监测DNA裂解，并在65°C和150 V下运行80分钟。DNA寡核苷酸探针由Thermo Fisher Scientific合成。本研究中使用的DNA寡核苷酸探针的序列为：
PolyA-TC：5′-（6-FAM）-AAAAAAAAA TC GGGAAAAAAA-3′
NUP93：5′-（6-FAM）-GCAAGCTGT TC AGCTTGCTGA-3′
根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从细胞中提取总RNA。提取后，使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对总RNA进行反转录。在CFX Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad）中，使用SYBR Green（PowerUp SYBR Green Master Mix，Thermo Fisher Scientific）通过实时qPCR分析RT产物。对于每个测试的样品，将指示的mRNA水平相对于肌动蛋白mRNA水平进行标准化。本研究中使用的PCR引物的序列为：
肌动蛋白前移：CCAACCGCGAGAAGATGA
肌动蛋白反向：5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAG
APOBEC3A前转：GAGAAGGGACAAGCACATGG 9
APOBEC3A反向：TGGATCCATCAAGTGTCTGG 9
APOBEC3B-前传：GACCCTTTGGTCCTTCGAC 9
APOBEC3B反向：GCACAGCCCCAGGAGAAG 9
使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对纯化的RNA进行反转录。总共20 ng（用于DDOST 558C> T扩增）或40 ng（用于CYPIF1 3222C> TcDNA），并在PCR反应中添加了指示的引物（2μL）（探针ddPCR Supermix（Bio-Rad的No dUTP）混合物），总共25μL。然后，将20μL反应混合物与70μL探针液滴产生油（Bio-Rad）一起添加到DG8柱（Bio-Rad）中，然后使用QX200 Droplet Generator（Bio-Rad）产生液滴。接下来将液滴转移到96孔板中，然后在以下条件下在热循环仪（C1000 Touch Thermal Cycler，Bio-Rad）中开始PCR反应：在95°C下5分钟，在94°C下40个循环30 s ，53°C持续1分钟，然后98°C持续10分钟（升温速率：2°C s -1）。用QX200液滴读取器（Bio-Rad）分析液滴，用于荧光素亚酰胺（FAM）和六氯荧光素（HEX）探针的荧光测量。基于阳性和阴性DNA寡核苷酸对照进行门控。使用QuantaSoft分析软件（Bio-Rad）分析ddPCR数据，以获得部分富集的编辑RNA。每个样品分析三个或更多的生物学重复。DDOST和CYFIP1引物可从Bio-Rad购买（DDOST 558C＃10031279，DDOST 558T＃10031276和CYFIP1 3222C / T＃1863024）。
从血液系统恶性肿瘤患者中获取外周血或骨髓。所有参与者均同意根据赫尔辛基宣言进行的研究。这项研究得到了加州大学欧文分校的机构审查委员会的批准。使用Ficoll-paque PLUS（GE Healthcare）通过密度梯度分离单核细胞（MNC），并通过氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液裂解红细胞。然后立即将细胞沉淀并保存在-80°C直至使用。根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从细胞中提取RNA，并通过qPCR或ddPCR进行分析。
所有的蛋白质印迹和DNA凝胶均重复至少3次，并在本文中显示了代表性图像。
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