造血干细胞（HSC）的命运选择包括自我更新，分化，迁移和凋亡。要在组织损伤和应激期间快速再生，需要干细胞中的HSC自我更新分裂，但是尚不清楚如何精确调节细胞内钙信号以维持正常造血功能的命运。S100A6基因敲除（KO）HSC在稳定状态下具有减少的HSC隔室中的总细胞数，减少的髓样输出以及增加的凋亡HSC数。S100A6KO HSCs的自我更新和再生能力受损，对5-氟尿嘧啶无反应。我们的转录组学和蛋白质组学分析表明，S100A6是关键的HSC调节剂。有趣的是，S100A6KO HSCs的磷酸化Akt（p-Akt）和Hsp90含量降低，线粒体呼吸能力受损，线粒体钙水平降低。我们表明，S100A6在细胞因子刺激后调节HSC的细胞内和线粒体钙缓冲作用，并已证明Akt激活剂SC79可以还原HSC中的细胞内和线粒体钙水平。通过激活Akt途径恢复造血集落形成活性和S100A6KO的Hsp90活性。我们显示p-Akt是S100A6在主要通过控制线粒体代谢功能和Hsp90蛋白质量来调控HSC自我更新的主要下游机制。我们表明，S100A6在细胞因子刺激后调节HSC的细胞内和线粒体钙缓冲作用，并已证明Akt激活剂SC79可以还原HSC中的细胞内和线粒体钙水平。通过激活Akt途径恢复造血集落形成活性和S100A6KO的Hsp90活性。我们显示p-Akt是S100A6在主要通过控制线粒体代谢功能和Hsp90蛋白质量来调控HSC自我更新的主要下游机制。我们表明，S100A6在细胞因子刺激后调节HSC的细胞内和线粒体钙缓冲作用，并已证明Akt激活剂SC79可以还原HSC中的细胞内和线粒体钙水平。通过激活Akt途径恢复造血集落形成活性和S100A6KO的Hsp90活性。我们显示p-Akt是S100A6在主要通过控制线粒体代谢功能和Hsp90蛋白质量来调控HSC自我更新的主要下游机制。
造血作用是由血液系统细胞成分的产生来定义的。造血干细胞（HSC）能够根据需要通过多种信号传导和分化途径再生不同的血细胞类型[ 1 ]，而这种稀有种群为基于干细胞的疗法提供了有希望的机会来对抗血液系统疾病[ 2]。
线粒体是参与造血和造血干细胞命运的决定[ 3，4 ]。造血干细胞表现出较低的基线能源生产和降低的最大呼吸比祖细胞尽管在造血干细胞更高水平的线粒体含量[ 5，6 ]。线粒体提议功能作为一个重要的细胞器，以确定HSC命运决定和线粒体导致细胞功能[严重的影响的崩解4，7，8 ]。据报道，基因敲除（Uqcrfs1）是线粒体复合物III的一个重要亚基，可导致干细胞特性的严重缺陷[ 4]。]。同样，有条件地删除SdhD基因（线粒体复合体II的一个亚基）对于HSC的生存和维持至关重要[ 7 ]。
细胞内Ca 2+ /胞质Ca 2+（Ca i 2+）是重要的次要信使，它调节几种细胞内途径。所述SCF /的c-kit HSC途径刺激的Ca的参与我2+造血[ 9 ]。先前的报道表明钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（Camk4）参与了HSC的维持[ 10 ]。钙调蛋白是一种Ca 2+信号蛋白，具有保守的钙结合基序，称为EF手[ 11]。尽管S100蛋白家族具有两个不同的EF手（如钙调蛋白）的功能域，但S100蛋白具有组织特异性的细胞内和细胞外功能[ 12 ]。S100A6（钙环蛋白）是EF-手钙结合蛋白家族的成员，当刺激静态细胞增殖时发现S100A6会增加[ 13 ]。最近，发现S100A6在神经干细胞中表达，并且也从间充质干细胞分泌[ 14]，因此我们推测S100A6是HSC自我更新的潜在调节剂。S100A6表达已知在与预后不良白血病中被上调和它施加在混合谱系白血病/ AF4阳性白血病细胞[抗细胞凋亡作用（MLL）15，16，17 ]。但是，要开发针对S100A6的靶向治疗骨髓性白血病，必须了解S100A6的缺失如何影响正常的血液发育。S100A6与热激蛋白Hsp70 / Hsp90复合物相互作用[ 18 ]，但是尚不清楚HSC中S100A6和Hsp90调控的机制途径。SDF-1 / CXCR4轴是Akt激活物[ 19 ]，而干细胞因子（SCF）与c-kit受体激活的Akt信号传导结合以调节细胞存活[ 20 ]。我们感兴趣的是探讨S100A6是否在SDF-1或SCF刺激下以钙依赖的方式介导Akt和Hsp90生存途径。最近的研究表明，细胞因子刺激和Ca 2+的组合线粒体途径对于应激过程中HSC的分裂至关重要[ 21 ]，但在正常的造血过程中其调控尚不清楚，S100A6-Ca i 2+在HSC维持中的作用尚不清楚。因此，重要的是探索在正常生理条件下S100A6如何通过细胞内和线粒体Ca 2+水平调节HSC的命运选择。
在这项工作中，我们已经证明S100A6通过在HSC系列移植中诱导高植入活性，是HSC自我更新的关键调节剂。我们的结果表明在第一次该S100A6提供在小鼠HSC的抗细胞凋亡作用，这是由在其他系统[几次调查支撑15，16，17]。我们的发现表明，钙依赖性S100A6控制着Akt激活途径，这包括线粒体钙水平，呼吸代谢，Hsp90蛋白和HSC存活的调节。
为了研究维护成人造血，小鼠C57BL / 6背景的纯合的用于条件期间S100A6的体内功能S100A6 FLOX等位基因与小鼠携带进行杂交VAV-酶Cre转基因（图 S1A）[ 22 ]，以产生VAV-Cre重组; S100a6 flox / flox小鼠（突变体）及其Vav阴性同窝仔对照（对照）。为了获得VAV-Cre重组; S100A6ΔΔ（KO），VAV-Cre重组; S100A6 FLOX / FLOX用育成VAV-Cre重组; S100A6FLOX / FLOX VAV-Cre重组几代。S100A6 ΔΔ与对照小鼠相比，对KO小鼠进行了研究，以确定S100A6KO中造血细胞的任何可能异常。在所有实验中均使用8-16周龄的雌性和雄性小鼠，随机分组，并配以同窝的对照组。将小鼠饲养在BMC动物设施中的通风笼中并饲养。隆德地区动物伦理委员会批准了所有动物实验。
原始RNA测序读段已提交给Sequence Read Archive（登录号：PRJNA578124）。可以在稿件发布时访问该数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA578124）。
p值高于置信度0.05的蛋白质已提交给STRING搜索（https://string-db.org），以鉴定生物学功能和相关途径。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库以数据集标识符PXD015854（http://www.ebi.ac.uk/pride）存放到ProteomeXchange联盟。
为了评估S100A6的表达模式，我们用内LSK细胞表面标记CD34和Flt3的（谱系排序从小鼠骨髓造血干细胞-的Sca-1 +的c-Kit +隔室）。与其他分化程度更高的人群相比，S100a6转录本在LT-HSC中大量表达（图 1a）。
一个定量实时PCR（QRT-PCR）的分析S100A6在长期HSC表达（LT-HSC的;（谱系- SCAL-1 +的c-Kit +）LSK CD34 -的Flt3 - ），短期HSC（ST -HSC; LSK CD34 +的Flt3 - ），淋巴样引发的多潜能祖细胞（LMPP; LSK CD34 +的Flt3 +），谱系-，和谱系+细胞。每个值均以HPRT表达标准化，并显示三次重复的平均值±SD（n = 3； * p <0.05； ** p <0.001； *** p <0.0001; 通过不成对的双向t检验进行分析）。b的示意图VAV-Cre重组酶介导的转化S100A6 FLOX等位基因入S100A6 Δ等位基因通过在两个loxP位点之间的DNA的缺失S100A6 FLOX轨迹。这包括整个S100a6外显子2和3（黄色）。显示了外显子1-3。红色三角形是loxP站点。橙色半球是来自切除的新盒式磁带（绿色矩形）的FRT站点。Cre重组酶在loxP位点切割。Ç S100A6在BM造血干细胞（CD150 mRNA表达+，CD48 -，FLT3 -，CD34 -）（ñ = 4）。的mRNA水平Fgd5（Ñ = 4）（d），PLSCR1（Ñ = 8）（É）的Mpl（Ñ = 4）（˚F），S100A8（Ñ = 4）（克），S100A9（Ñ = 3）（ħ），通过qRT-PCR对LT-HSC的（CD150评估+ CD48 - CD34 -的Flt - ）。结果是一式三份的平均值±SD。每个值标准化为ActB表达（* p <0.05； ** p <0.001；通过未配对的双面t检验进行分析）。
为了研究S100A6在HSC中的功能活性并确定S100A6是否是HSC的关键调节剂，我们在造血系统中创建了S100A6条件小鼠KO（S100A6KO）（图 1b和 S1a）。使用Web界面，我们以单细胞分辨率观察了HSPC中S100a6基因的表达。此界面显示来自1656个按索引排序的HSPC的单细胞RNA-seq数据。S100a6在簇1（蓝色）中高度表达，簇1占大多数LT-HSC（79％）（图 S1b）[ 23 ]。
如所预期的定量实时PCR（QRT-PCR）分析既不检测S100A6在S100A6KO细胞在骨髓细胞中的表达来分类与表面标记（CD150 +，CD48 -，FLT3 - ，和CD34 - ）（在每个实验内部对照） （图 1c），在富含c-kit的骨髓细胞中也未检测到S100a6 mRNA（图 S1c）。在缺乏S100A6的HSC中，一些HSC转录物的表达水平（Fgd5，磷脂酰胺酶1（Plscr1）和Mpl）被下调（图 1d–f）。S100家庭成员S100a8S100a9与S100a9没有显着差异（图 1g，h）。在我们的RNA-seq基因列表中发现了七个S100家族成员（S100a1，S100a4，S100a8，S100a9，S100a10，S100a11和S100a13）的转录本，但在WT和KO之间没有显着差异（数据未显示）。值得注意的是，S100A6无效小鼠以正常的孟德尔比例出生，并且成熟到成年，没有任何明显的缺陷（数据未显示）。
我们的发现表明S100A6专门参与了HSC调节，而没有从S100家族成员那里获得补偿功能。
为了检查S100A6条件删除在稳态造血中的作用，我们对鼠血和BM进行了FACS分析。在S100A6缺陷型小鼠中，总细胞数显着降低（图 2a）。另外，稳态S100A6KO在外周血中的髓系谱系输出较低（图 2b）。鉴于低的总细胞数（图 2A），我们通过分析膜联蛋白V和DAPI的表达水平（图研究稳态S100A6KO的细胞凋亡状态 S2a中在LSKCD150）+ CD48 -隔室。我们发现S100A6KO小鼠在LT-HSC中的膜联蛋白V + / DAPI +表达增加（图 2c）。）。在BM免疫表分析基于表面标记（LSKCD150 + CD48 - ）（图用于S100A6WT 2D，上排）和S100A6KO（图 2D，下排）进行。S100A6KO小鼠的LT-HSC（CD150 + CD48 -）（图 2e）和MPP（CD150 - CD48 -）（图 2f）的总细胞数明显减少。我们发现LT-HSC的从LT-HSC（LSKCD150的排序源的显著减少+ CD48 - CD34 -的Flt3 - ）。的c-kit富集后的S100A6KO（图 2克和S2b）。以前的研究报告说，CD9和ESAM是造血干细胞标志物，可以捕获纯鼠造血干细胞[ 24，25 ]。我们使用更严格的门控策略（LSKCD150 + CD48 - CD34 - Flt3 - CD9 Hi ESAM +）进一步分离了纯化的LT-HSC，并确定了该LT-HSC分数的相似降低（图 2h）。
一个全骨髓细胞的总数中S100A6KO小鼠中减少。b稳态外周血中的血统分布。cS100A6KO HSC具有明显更高的凋亡细胞水平。d稳态全骨髓细胞中LSK，CD150，CD48 HSPC间隔的示意图。LT-HSC（CD150的代表性FACS图+ CD48 -和多能祖（MPP，CD150）- CD48 - ）。与WT相比，S100A6KO大大降低了LT-HSC和MPP隔室。e，f直方图总结了骨髓中LT-HSC和MPP内的总细胞数。G的c-kit富集FACS分选骨髓细胞（LSK CD150 + CD48 - CD34 -的Flt3 - ）。h对FACS分选的富含c-kit的骨髓细胞（LSK CD150 + CD48 − CD34 − Flt3 − ESAM + CD9 Hi）进行更严格的门控（* p <0.05; ** p <0.001; *** p <0.0001;全部数据通过不成对的双向t检验和Mann-Whitney U分析测试）。所有单个点代表具有匹配同窝仔的随机生物重复，并重复实验三次。
我们的数据表明，S100A6缺失扰动了HSPC隔室，随着LT-HSC隔室中凋亡细胞数量的增加，大大降低了LT-HSC和MPP的数量以及骨髓输出。
为了阐明在造血干细胞损失S100A6的分子后果，我们执行纯化，使用LT-HSC的（LSKCD150 mRNA的测序全转录物表达分析+ CD48 - CD34 -的Flt3 - ）从两个S100A6WT和KO。差异表达分析揭示了448个差异表达的基因（380个上调和68个下调，p ＜0.05）。S100A6被列为第七个下调程度最高的基因（p值：0.001）（图 3a和 S3a）。我们介绍了前54个经过调整的p基因 <0.2（在KO中上调42；在KO中12下调）。我们的热图表明具有相似表达模式的基因聚在一起（图 3b）。我们根据其相关的生物学过程进行了基因组网络分析，有氧呼吸中丰富了12个下调的基因（图 3b）（图 S3b），而42个上调的基因（图3b）与内在的凋亡信号通路相关（图3b）。 图 S3c）。
一个 RNA-SEQ的火山图表示日志倍数变化和的负对数p WT和S100A6缺陷型LT-HSC（CD150之间的值+ CD48 - CD34 -的Flt - ）。b热图总结了稳定状态下WT（粉红色橙色）和KO（浅蓝色）之间表现出差异表达的54个基因的表达。样品在列中，基因在行中，标准化的表达水平用颜色梯度表示：红色的上调基因，蓝色的下调基因，调整后的p值<0.2。C（上）S100A6缺陷样本中细胞成分的基因本体富集分析。（下）Reactome的基因本体富集分析，用于KO样品中下调的基因（访问NetworkAnalyst 3.0）。d稳态下S100A6WT和KO之间的蛋白质相对丰度的火山图。该X -轴示出了对数标度的倍数变化。该Ÿ -轴显示了对数p值。水平虚线对应于p值＝ 0.05。
为了概述448个差异表达基因对于细胞途径的最重要过程，我们对68个下调的基因集进行了基因本体富集分析，并根据它们相关的细胞成分对这些基因进行了处理。排名最高的细胞成分是“线粒体部分”，包括基因Cs，Tmem70，Mrpl34，Fundc1，Ndufaf3，Atp5s，Poldip2和Rhot1（上面的图 3c）。此外，我们将这68个下调的必需基因定位到基因本体论中描述的Reactome [ 26]，我们发现Reactome中最丰富的顶级生物学过程包括降低胞质Ca ++水平，通过SCF-Kit进行信号传递以及Akt磷酸化胞浆中的靶标（下图 3c） 。我们还进行了基因集富集分析（GSEA），S100A6KO中的下调基因集与线粒体呼吸作用和电子转运链有关，但上调的基因集与氧化应激有关（图 S3d）。我们的转录组数据表明，S100A6KO HSC表现出代谢氧化应激和线粒体功能缺陷。
作为识别S100A6-Ca i 2+信号转导过程中蛋白下调的方法，我们使用了蛋白质组学。我们分析了LT-造血干细胞（LSKCD150 + CD48 - CD34 -的Flt3 -）应用蛋白质组学。 通过学生t检验，使用p <0.05 生成火山图。进行统计分析以比较S100A6WT和S100A6KO。S100A6KO LT-HSC中表达最下调的蛋白质之一是线粒体异柠檬酸脱氢酶（IDH2）（图3d）。 ）。完整的线粒体功能取决于调节和适应性的蛋白质质量控制环境，适当的蛋白质折叠以及有效消除有毒蛋白质聚集体[ 27 ]。我们在构建的相互作用网络中蛋白质的功能富集是在STRING数据库中在线进行的（图 S3e）。在我们的数据中，最有趣的富集GO类别是HSP90蛋白途径，其在S100A6KO中表达下调（上表 1），而凋亡执行阶段蛋白在KO中表达上调（下表 1），这与我们的观察一致从LT-HSC中凋亡细胞水平的增加（图 2c）和转录组数据（图 S3c）。
一起，GSEA和从NetworkAnalyst获得的数据都表明，S100A6支配的Ca 我2+信号传导，Akt途径，和线粒体有氧运动。蛋白质组学数据表明，Hsp90蛋白在S100A6调控的HSC中似乎很重要。
为了研究S100A6KO LT-HSC的功能，进行了一系列竞争性移植和纯化的LT-HSC的移植。在竞争性将整个BM移植到受辐照的小鼠体内后，与WT同窝仔相比，S100A6KO细胞竞争较弱，并且在16周时血液，骨髓和脾脏的重构显着减少（图 4a–c）。重要的是，LT-HSC的（LSKCD150的频率+ CD48 - ）的S100A6KO HSPC隔间降低（图 4D）。为了评估S100A6空细胞中整个BM的再填充缺陷是否是由于LT-HSC功能受损引起的，我们纯化了50个LT-HSC（LSKCD150 + CD48 - CD34-的Flt3 - ESAM + CD9 您好）通过FACS和细胞移植到致死照射的接受者。我们观察到再生能力的显着降低，血液重构减少（图 4e），并且在KO而非野生型LT-HSC初次移植后未能重新填充HSPC隔室（图 4f）。尽管血液的损害重构和LT-HSC的从S100A6KO分选的细胞，该受体小鼠在血液正常谱系分布（图 S4a中），骨髓（图 S4b中），和脾16周（图之后 S4C）。
a – c全骨髓竞争移植测定（16周时的血液，骨髓和脾脏；原发性（1°）（WT n = 8； KO n = 10）；继发性（2°）（WT n = 5； KO n = 6）；第三（3°）移植（WT n = 8； KO n = 8））。d整个骨髓竞争性移植后16周，在1°–3°接受者中LT-HSC的频率（LSK CD150 + CD48 -）（n =类似于（a – c））。Ë通过CD45.1 / 45.2在16周终点（WT n = 3; KO n = 5）确定的血液中50种分类的LT-HSC的重组减少。˚F LT-HSC的（LSK CD150的频率+ CD48 - CD34 -的Flt3 - ESAM + CD9 您好）在主要收件人16周结束的50静脉注射后点排序LT-HSC的移植（WT Ñ = 3; KO Ñ = 5）（ * p <0.05; ** p <0.001; ***或**** p <0.0001；所有数据均通过不成对的双向t检验和Mann-Whitney U检查测试）。克细胞内染色磷酸化4E-BP1（Thr37 / 46）在S100A6WT和KO HSC的（CD150 + CD48 - CD34 -的Flt -）（Ñ = 3; * p <0.05，不成对由分析双面叔检验）。h HSC中磷酸化Akt（Ser473）的细胞内染色（n = 3）。我 S100A6KO骨髓细胞表现出菌落形成单位（CFU）测定减少的集落形成的能力。Akt激活剂，SC79，2–8μg/ ml（Abcam）恢复了KO中的菌落形成能力（WT n = 4； KO n = 6； WT + SC79 n = 3; KO + SC79 n = 3）。** p <0.001，通过Mann–Whitney U检验分析，比较WT和KO。以上所有数据均代表三个独立实验的平均值±SD。
为了了解HSC中S100A6与Akt信号传导相关的机制，我们分析了这些信号传导途径中关键成分的磷酸化。使用FACS对磷酸化蛋白进行的细胞内染色分析显示，在稳态S100A6KO HSC中，p4E-BP1显着降低，而磷酸化Akt（p-Akt）降低（图 4g，h）。我们证实，S100A6在蛋白质水平上影响p-Akt，但不影响总Akt（图 S4d）。我们的蛋白质印迹分析表明KO中p-Akt含量显着降低，但这种降低在SC79处理的KO中得以挽救（图 S4d，e）。尽管PI3K是Akt激活的主要模式，但我们的数据表明PI3K和PTEN活性均保持不变（图 S4f，g）。此外，我们的RNA 序列数据未检测到Pi3kr1和Pten转录本的任何差异（数据未显示）。甲基纤维素（CFU）分析中的祖细胞集落形成显示S100A6KO BM细胞中集落形成活性降低。有趣的是，Akt激活剂SC79拯救了KO BM细胞中的集落形成活性缺陷（图 4i），表明p-Akt是S100A6的靶标。我们的发现表明，通过恢复鼠类HSC中的Akt途径可以挽救S100A6缺乏的HSC，其中我们的数据提供了S100A6如何通过Akt激活途径调节HSC自我更新的潜在机制（同样在图 3c中，下面）。
S100A6因其细胞内和细胞外功能而闻名，S100A6蛋白是根据Ca 2+信号分泌的。S100A6可以形成聚合物并与晚期糖基化终产物的受体结合[ 28 ]。为了确定S100A6对LT-HSC的作用是否是由生态位调节驱动的[ 29 ]，我们进行了反向移植实验，将WT细胞移植到S100A6WT和S100A6KO小鼠中。WT和KO移植的HSC移植到S100A6缺陷型小鼠组之间的逆向移植后16周，血液重构和血统输出无差异（图 S4h，i）。为了证实这一点，我们还尝试通过使用针对钙环蛋白抗体的封闭抗体（H-55）中和WT HSC中的S100A6-Akt信号传导。在不存在H-55的情况下，H-55抑制了WT HSC的集落形成，但没有抑制WT HSC的集落形成（图 S4j）。因此，我们排除了S100A6是利基因素的可能性。我们的研究结果表明，S100A6是LT-HSC繁殖能力的关键调节剂。
我们询问在激活S100A6-Ca i 2+信号的上游刺激后，p-Akt是否是S100A6的主要下游靶标。为了确认我们的转录组发现，并假设S100A6是钙结合蛋白，我们询问了作用于S100A6-Ca i 2+信号传导的外在因素的参与。我们知道，基质细胞衍生因子（SDF-1）和SCF诱导强的Ca 我2+通量[ 30，31，32 ]。因此，我们研究了Ca i 2+的参与通过用细胞因子鼠干细胞因子（mSCF）或趋化因子人类基质细胞衍生因子1（HuSDF-1）刺激富含WT和KO c-kit的细胞来刺激S100A6 HSC中的SPAR。实际上，与LT-HSC群体中的S100A6WT相比，S100A6KO中mSCF诱导的Ca i 2+显着降低（图 5a，b）。此外，S100A6KO还降低了LT-HSC群体中HuSDF-1诱导的Ca i 2+（图 5c，d）。因此，SCF或SDF-1信号通路对Ca i 2+的作用需要在LT-HSC调控中表达S100A6。我们的数据表明S100A6在Akt途径上起作用（图 4g–i），并且已知SCF和SDF-1都是Akt激活剂[9，10 ]。我们的数据有力地表明，在缺少S100A6的情况下，SCF / SDF-1无法刺激钙通量，而Ca i 2+通量的受损会导致Akt途径的下调。
在添加mSCF（a）或HuSDF-1（c）之前（记录了最初的100,000个细胞）和之后立即进行时间门控。将富含c-kit的细胞暴露于mSCF（a）或HuSDF-1（c），数据显示，仅野生型中的HSC对两种刺激均响应，而对S100A6空细胞则无反应，如比例变化所示。在Indo1 的紫色（Ca 2+结合）和蓝色（自由）荧光之间。b，d直方图显示[Ca 2+ ] i，胞质Ca 2+的变化分别由mSCF和HuSDF-1引起。误差棒与Indo1染色S100A6WT和KO的c-kit富集的骨髓细胞代表SD门控上CD150 + CD48 -CD34 -的Flt - （b Ñ = 6; d Ñ = 3; * p <0.05;曼-惠特尼ù测试）。实验重复了三遍。È（上面）对应于变化的[Ca 2+ ] 我之前，期间和与门控MSCF上CD150刺激过50秒后的Fluo-4AM荧光强度测量+ CD48 - CD34 -受体Flt -。（下）追踪在有或没有SC79的情况下mSCF施用的时间和对mSCF刺激有反应的总样本（WT，WT + SC79 n = 6； KO，KO + SC79 n = 8）；***或**** p <0.0001; 通过多重t检验进行分析（以上）; Mann–Whitney U检验（下），代表三个独立的实验。
同样，我们应用的另一个钙指示剂，荧光4来测量中值荧光强度的Ca（MFI）我2+结合后的Ca 2+。当将mSCF添加到细胞中时，MFI从静止值（Fmin）增加到峰值。峰（Fmax）出现在开始应用mSCF之后，然后Ca i2+降至Fmin，其中钙通量持续50 s。我们观察到WT中钙结合增加，但KO中钙结合没有增加（上图 5e）。当我们在WT和KO细胞上用SC79处理富含c-kit的细胞时，KO中的钙结合表现出与WT相似的MFI（下图 5e），表明S100A6-Ca i 2+摄取取决于p-Akt。在一起，我们认为S100A6-Ca i 2+特异性地刺激小鼠HSC中的p-Akt途径。
我们未发表的RNA-seq数据表明，在WT LT-HSC中5FU胁迫后，S100A6表达特别增加，但在S100A6KO中没有。S100A6促进癌细胞增殖[ 33 ]。为了了解S100A6KO在自我更新和重构方面的缺陷是否可能是由于循环次数增加以及可能导致HSC衰竭，我们对LT-HSC（LSKCD150 + CD48 − CD34 − Flt3 −）细胞进行了qRT-PCR，除了Ccna2转录物显着减少外，大多数细胞周期基因均未见任何差异（图 S5a）。我们在富含c-kit的骨髓细胞上使用Ki67 / DAPI染色评估了HSC的细胞周期状态。我们发现S100A6KO HSC的循环状态没有差异（图 S5b，c）。此外，我们的RNA-seq数据显示WT和KO LT-HSC之间的细胞周期基因表达没有显着差异（数据未显示）。
为了从功能上测试S100A6KO的细胞周期状态，我们通过向WT和KO小鼠中静脉注射骨髓清除剂5FU来创建短暂的造血应激。用5FU治疗后，HSC迅速循环[ 34 ]。对于5FU处理的BM的分析，沿谱系混合物抗体中不包含Mac-1（CD11b）用于选出谱系阴性细胞，因为已知整联蛋白Mac-1的表达在5FU处理后会增加[ 35 ]。S100A6WT和KO小鼠在5FU方案的单次注射中存活下来（数据未显示），但是KO小鼠表现出极低的LT-HSC频率（LSKMac-1 lo/ Mac-1 - CD150 + CD48 -）（图。 6a）和LSKMac-1 - CD150 + CD48 - 。细胞（图 6B）在5-FU给药后12天总骨髓。鉴于这些表面标志物（LSKMac-1 - CD150 + CD48 - ）足以解释我们的观察，我们进一步施加的更严格的门控策略如图（图 2H）。有趣的是，虽然5天后5FU诱导的骨髓抑制导致LT-HSC升高（LSKMac-1 - CD150 + CD48 - ESAM + CD9 Hi）在WT细胞中，KO LT-HSC细胞的绝对总细胞数和频率大大降低了（图 6c，d）。在有或没有5FU应激的S100A6KO小鼠中，总细胞减少了（图 6e）。这些数据表明，在不存在S100A6的情况下，LT-HSC对化学毒性应激的反应减弱。
一个 LT-HSC（LSKMac的频率LO / Mac的- CD150 + CD48 -在总骨髓5FU给药后12天（WT）ñ = 3，KO Ñ = 5）。b 5FU给药后12天，总骨髓中LT-HSC的频率（LSKMac - CD150 + CD48 -）（WT n = 4，KO n = 5）。c，d严格的LT-HSC门控频率和细胞总数（LSKMac - CD150 + CD48 - ESAM + CD9喂 5FU后12天，在富含c-kit的骨髓细胞中。稳态（SS），通过5FU给药（S）引入的压力（SS（WT，KO）n = 4； S（WT，KO）n = 3）。e 5FU给药12天后富含c-kit的骨髓细胞总数的绝对数（SS（WT，KO）n = 4; S（WT，KO）n = 3）（* p <0.05; ** p <0.001 ; ***或**** p <0.0001；所有数据均通过不成对的双向t检验和Mann-Whitney U检验进行了剖析。f LT-HSC中Hsp40的细胞内染色（n = 3）。GLT-HSC中Hsp90的细胞内染色。Akt激活剂SC79恢复了KO（f，g）（n = 3）中的Hsp90活性。数据代表独立实验的平均值±SD。* p <0.05；** p <0.001，门控上CD150 + CD48 - CD34 -受体Flt - ，分析由不成对双面吨 -test。单个组中内部值的方差小于不同样本之间的相互作用引起的方差（单向方差分析，p = 0.006）。
我们的下一个问题是了解S100A6在LT-HSC的生理应激条件下的作用。已知在热应激后S100A6表达增加[ 13 ]，因此我们研究了在不存在S100A6的情况下伴侣蛋白的活性。HSP90是一种必需的分子伴侣的是有助于在蛋白质折叠的质量控制[ 36，37 ]。在正常细胞中，Hsp90存在于线粒体中，并强烈存在于细胞质中[ 38 ]。Hsp90的结合于Akt在体内，但这种复合物形成的破坏增加凋亡细胞[ 39，40 ]。S100A6在体外也与GST截短的Hsp90弱结合[ 41]。S100A6通过四肽结构域与Hsp70 / Hsp90组织蛋白（Hop）缔合，并调节Hop复合物的形成。内源性S100A6在体内以Ca 2+调节的方式调节Hsp70-Hop-Hsp90异源复合物的组装[ 18 ]。尽管我们发现在S100A6KO HSC中伴侣蛋白Hsp70的MFI没有差异（图 S6a），但我们观察到Hsp40（图6f）和Hsp90（图6g）的MFI显着降低 。 ），并重申S100A6调节造血系统中的Hsp40-Hop-Hsp90异源复合物。接下来，我们问是否可以通过以S100A6依赖性方式重新激活Akt途径来拯救Hsp90活性。我们的结果表明，SC79恢复了S100A6KO HSC中的Hsp90活性（图 6g）。两者合计，因此，我们建议S100A6通过与Akt激活途径的连接影响Hsp90伴侣系统。该结果证实细胞内Hsp90蛋白降低是由于S100A6的缺乏（以上表 1）。
接下来，我们询问受损的S100A6-Ca i 2+感应，Akt信号传导和Hsp90伴侣系统是否导致LT-HSC代谢功能障碍。为了研究HSC 中Ca 2+内流和Ca 2+释放过程中线粒体Ca 2+稳态是否受S100A6和p-Akt依赖性，我们应用Ca 2+敏感荧光指示剂Rhod-2监测线粒体Ca 2+（Ca m 2+） 浓度。然后，我们用mSCF刺激了富含c-kit的细胞，这使Ca m 2+从Fmin 升高到峰值，然后返回其Fmin，总共持续50 s。类似地，正如我们在Ca i 2+中所注意到的（图。 在图5e）中，S100A6KO显示没有吸收Ca m 2+（以上图 7a）。令人惊讶的是，SC79重新激活了S100A6KO HSC，并吸收了Ca m 2+，类似于WT（下图 7a）。
一个（以上）在线粒体钙之前，期间通过RHOD-2 AM荧光强度测定的相应变化，并与MSCF刺激超过50秒，门控上CD150之后+ CD48 - CD34 -的Flt - 。（下图）追踪在Rhod-2荧光上mSCF的施加时间以及对mSCF刺激阶段有反应的总样品（WT，WT + SC79 n = 6； KO，KO + SC79 n = 8）；***或**** p <0.0001; 通过多重t检验进行分析（以上）; 曼恩·惠特尼U检验（下）。b Mdm2的 qRT-PCR分析将mRNA表达和相对mRNA表达标准化为ActB表达水平，并显示平均值±SD（n = 6）。的MitoTracker的胞内染色深红色（Ç）和绿色的MitoTracker（d）在S100A6WT和KO肝星状细胞30分钟，并通过选通CD150流式细胞术分析+ CD48 - CD34 -的Flt - 。在Mitotracker深红色染色之前，在室温下将c SC79加入富含c-kit的细胞中20分钟。e S100A6KO LT-HSC的频率（LSK CD150 + CD48 − CD34 − Flt3 −）从富含c-kit的总BM细胞中恢复，经Akt激活剂SC79处理（* p <0.05；通过Mann-Whitney U检验分析）。f使用Seahorse XF96分析仪确定耗氧率（OCR）曲线。g S100A6空细胞的最大呼吸能力和储备呼吸能力下降。* p <0.05；* * p <0.001；*** p <0.000，由多次t检验确定。条形表示平均值±SD（n = 7）。HS100A6通过小鼠HSC中Akt和Hsp90相互作用调节线粒体氧化磷酸化的摘要。所有数据代表独立实验的平均值±SD。* p <0.05，通过不成对的t检验分析。
S100A6与小鼠双分钟2同源物（Mdm2）结合[ 42 ]，而Mdm2是线粒体标记物[ 43 ]，我们认为在缺少S100A6-Ca i 2+轴的情况下可能会在维护中负面调节Akt下游目标Mdm2途径HSC。我们的qRT-PCR证实在S100A6KO HSC 中Mdm2的表达降低（图 7b）。Mdm2被认为是火山图中重要的下调基因之一（图 3a）。但是，S100A6WT和KO HSC之间的Cdkn1a （p21）转录本（p53的下游靶基因，图 S5a）没有差异。
为了研究S100A6KO对线粒体功能的影响，我们使用FACS使用线粒体特异性标签（分别为深红色和线粒体绿色）来评估主动呼吸的线粒体和总线粒体水平。为了排除由Mitotracker染料的主动挤出引起的伪影，我们在维拉帕米存在下进行了实验。然而，维拉帕米也是钙进入[抑制剂6，32 ]。我们在图7c中排除了维拉帕米， 以评估生理钙对线粒体活性的影响。我们观察到在WT和KO之间添加维拉帕米之前和之后的比例没有明显差异（图 7d）。我们的数据表明，S100A6KO的线粒体活性降低（图 7c），但线粒体质量相似（图 7d）。有趣的是，SC79还原了S100A6KO中的线粒体活性（图 7c）。从相同的细胞样品中，在SC79上接受处理后，回收了S100A6KO的LT-HSC片段（图 7e），这表明我们能够挽救在KO中观察到的丢失细胞（图 2g）。）。
鉴于Ca 2+离子刺激了三种关键的高能线粒体脱氢酶的活性[ 44 ]，我们通过使用Seahorse XF96分析仪测量其耗氧率（OCR）来评估其在HSC中的氧化磷酸化（OXPHOS）水平。评估了来自WT和KO小鼠的相同数量的LSK +FACS分选的细胞。通过依次添加寡霉素，碳氰化物对三氟甲氧基苯基hydr（FCCP）和抗霉素A /鱼藤酮，在基础水平和代谢应激后监测OCR。S100A6KO LSK +细胞与野生型WT相比，显示出较低的基础OCR和ATP产生水平（图 7f，g）。重要的是，在缺少S100A6的情况下，LSK+细胞显示出最大呼吸水平和剩余呼吸能力的强烈降低，表明这些细胞执行OXPHOS的能力受损（图 7f）。柠檬酸合酶的低转录水平（图 3a）和IDH2的低蛋白水平（图 3d）表明TCA周期在S100A6KO LT-HSC中受到影响，因此进一步导致线粒体功能受损，从而通过OXPHOS产生细胞能量电子传输链（图 7f，g）。我们的数据强烈表明，S100A6KO对LT-HSCs的线粒体呼吸有负面影响，而完整的S100A6-Ca i 2+ 通过Akt激活途径流入对线粒体能量产生至关重要。
在这项研究中，我们表征了重要的伴侣样钙传感器蛋白S100A6及其在调节HSC中的作用。我们已经证明S100A6在维持稳态HSC中起着至关重要的作用。通过对小鼠S100A6基因进行基因破坏，我们的大量转录组学和蛋白质组学数据表明S100A6KO HSCs的Ca i 2+水平降低，Akt磷酸化靶标，线粒体mRNA和Hsp90蛋白水平降低。我们的系列移植试验表明，S100A6对于HSC自我更新至关重要，钙的摄取对于细胞内和线粒体功能均至关重要，这表明完整的钙依赖性S100A6信号传导对HSC命运选择的调节起着关键作用。我们的数据说明了S100A6是Ca的直接应答者细胞内和线粒体HSC上的2+信号传导，并通过细胞因子SCF或趋化因子SDF-1传递信号来调节干细胞活性。我们的发现还显示了Ca i 2 +，Ca m 2+和HSC相互连接。S100A6通过调节造血系统中的Akt激活途径来维持菌落形成能力和LT-HSC种群。有趣的是，我们已经通过保持OXPHOS活性，发现了S100A6作为完整线粒体代谢的先决条件调节剂的重要作用。我们的5FU数据表明S100A6KO HSC对化学毒性应激无反应，表明S100A6的作用是通过与Akt-Hsp90分子伴侣化系统协作以保护细胞免受应激，从而获得适当的蛋白质质量。
我们的结果表明，S100A6KO在稳态条件下会降低髓样输出量。PLSCR1所需的正常髓和报告协作用Ca 2+发展为急性骨髓性白血病[ 45，46 ]。我们认为，在缺少S100A6的情况下，破坏的Plscr1会导致骨髓输出减少。我们的结果表明S100A6保持了髓系，并且与先前的研究一致，S100A6在髓样细胞中表达[ 47 ]。
先前的研究表明，S100A6易位是独特的，并且依赖肌动蛋白应激纤维，但不依赖经典的Golgi-ER途径来响应Ca i 2+水平的升高[ 48 ]。我们对Grp94（图S6b）和Grp75（图 S6c）的细胞内染色分析 表明，WT和KO之间没有显着差异。GRP94和Grp75的是ER蛋白[ 49，50 ]。此外，我们的数据显示，在没有S100A6的情况下，S100A8和S100A9的转录水平没有差异（图 1g，h）。已知S100A8和S100A9通常与Golgi-ER相关[ 47]。这些发现表明，S100A6利用独特的易位途径，该途径将蛋白质引导至某些亚细胞区室，以执行其生理任务。这表明S100A6没有作用于经典的高尔基-ER途径。
在图 7h中，图示出了S100A6在调节HSC中的复杂性。它描述了S100A6在鼠HSC中的作用以及S100A6-Ca i 2+依赖性调节如何通过各种中间体影响线粒体代谢。在存在S100A6-Ca i 2+的情况下，用SCF或SDF-1刺激会增加Ca i 2+的浓度，从而募集S100A6与p-Akt相互作用并激活p-Akt-Hsp90途径。S100A6KO不会改变小鼠HSC中p-Akt的上游激活物PI3K的表达（图 S4f，g），同样，Pi3kr1和Pten转录本也未改变（图 S5a）。Akt包含一个pleckstrin同源结构域（PHD）[ 51 ]，我们的RNA 序列数据显示Plekhf2转录本在S100A6KO HSC中被下调（数据未显示）。我们认为S100A6可能通过PHD与Akt相互作用，从而在SCF / c-kit刺激后促进Akt易位至膜。S100A6-Ca i 2+激活的p-Akt途径还调节伴侣蛋白成员Hsp90和Hsp40进行适当的蛋白折叠（图 6f，g）。S100A6蛋白在野生型中维持线粒体钙和呼吸功能。相反，刺激Ca i 2+在缺少S100A6的情况下，无法检测到SCF或SDF-1的瞬时活动，因此p-Akt途径被切断。此外，Hsp90陪伴系统被下调。鉴于我们的发现，S100A6缺陷型细胞在Hsp90分子伴侣系统中的分子特征降低，从而导致对HSC完整性的损害[ 52 ]，S100A6的缺失会引起OXPHOS /代谢功能障碍。由于上述所有原因，S100A6无效小鼠中的HSC表现出细胞凋亡增加。
S100A6介导的Akt调节代表了针对针对MLL-AF4白血病患者的新疗法开发的目标窗口，这些患者可以用抑制表达S100A6的药物治疗。
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