在现代社会中，由无序曝光引起的昼夜节律紊乱普遍存在，并增加了患心血管疾病的风险。发生这种情况的机制很大程度上未知。缺乏载脂蛋白E（ApoE -/-）的小鼠通常被研究以阐明动脉粥样硬化的机制。在这项研究中，我们确定了光诱导的昼夜节律紊乱对ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化的影响。我们首先从ApoE -/-小鼠的组织中表征了行为，光反应性和分子计时的昼夜节律，这与ApoE + / +小鼠的节律没有区别。这些数据表明ApoE -/-小鼠没有固有的昼夜节律破坏，因此是我们研究的合适模型。接下来，我们通过将ApoE -/-小鼠暴露在恒定光照下12周来诱导昼夜节律的严重破坏。持续的光照会加剧雄性而非雌性ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化。由于VLDL / LDL分数增加，暴露在恒定光照下的雄性ApoE -/-小鼠血清胆固醇浓度增加。综上所述，这些数据表明，ApoE -/-小鼠是研究光诱导的昼夜节律紊乱的合适模型，而加剧的血脂异常可能介导了持续不断的光照引起的动脉粥样硬化病变的形成。
在美国，每年有超过60万人死于心脏病1。动脉粥样硬化是动脉中斑块的逐渐积聚，是引起心血管疾病（CVD），中风和心肌梗塞的主要原因2。有包括吸烟，高血压，升高的低密度脂蛋白（LDL）胆固醇，肥胖，糖尿病和炎症几个公认的CVD危险因素3，4，5。流行病学和临床研究已经表明，昼夜中断也增加CVD的风险6，7，8。
昼夜节律是基因表达，生理和行为的24小时振荡。这些节奏与环境周期有关或同步。这使得生物预测环境预测的每天的变化，以增加他们的健身9，10，11。哺乳动物的昼夜节律是由位于人体12几乎每个组织中的分子钟产生的。这些时钟是分层组织的。视网膜检测并向视交叉上核（SCN）中的主时钟发送有关明暗周期的信息。SCN继而协调遍及主体12的时钟的定时。。在分子水平上，计时机制是负转录/翻译反馈环13。转录因子BMAL1和CLOCK二聚化并驱动Period和Cryptochrome基因的转录。然后PERIOD和CRYPTOCHROME反馈并抑制BMAL1和CLOCK的转录因子活性，从而抑制了它们自己的转录。此反馈循环大约需要24小时才能完成，因此会产生24小时的分子节奏。
最近的一项荟萃分析表明，倒班工人，谁的经验慢性扰乱昼夜节律和无序曝光和食物摄入量，有20-40％的增加心血管疾病的危险性6，8。实验室研究还表明，昼夜节律紊乱与CVD危险因素之间存在因果关系。在一项对照实验室研究中，年轻，健康的成年人经历了轮班工作方案，持续了8天，参与者的血压升高和不良炎症与CVD相关14。尽管昼夜节律紊乱与CVD之间存在关联，但其潜在机制在很大程度上尚不清楚。这项研究的目的是建立一个小鼠模型，以研究光诱导的昼夜节律破坏对动脉粥样硬化的机制。
在小鼠中先前的研究已经表明，昼夜分子钟表机构的遗传破坏导致心血管病理15，16，17，18，19。小鼠缺乏功能BMAL1，和时钟Δ19突变体，这两者具有受损或心律失常生物钟，增加了病理血管重塑小鼠相比具有功能的时钟17。Bmal1 -/-或Clock ∆19小鼠，缺乏载脂蛋白E（ApoE -/-）或低密度脂蛋白受体缺乏（Ldlr -/-）的背景，有不正常的胆固醇代谢和运输，增加动脉粥样硬化15，16。此外，缺失BMAL1在髓样细胞或的Rev-erbα骨髓来源的细胞在小鼠中动脉粥样硬化增加，在调节动脉粥样硬化表现出在免疫系统生物钟的角色18，20。但是，一项研究表明，成年期Bmal1的诱导型缺失不会增加动脉粥样硬化，这表明BMAL1缺乏症的有害作用可能是发育性的19。
总的来说，对突变小鼠的研究提供了昼夜节律基因突变会增加动脉粥样硬化的原理证据。一些研究还表明，昼夜节律的基因的遗传变异存在于人类与CVD危险因素相关联和昼夜基因表达通过动脉粥样硬化改变在细胞在血管壁21，22，23，24，25，26。但是，更多的研究表明，通过环境干扰因素破坏昼夜节律，例如轮班工作中光线和食物的无序暴露，夜间暴露于人造光以及深夜吃零食会增加人患CVD的风险8，14，27，28，29。因此，通过非遗传方式对小鼠的昼夜节律系统进行扰动可能是模拟昼夜节律对人类动脉粥样硬化的影响的理想选择。
这项研究的目的是建立一个模型系统，以研究光诱导的昼夜节律紊乱对动脉粥样硬化的影响。理想的小鼠模型应具有正常的昼夜节律和对光的正常响应，并且这些节奏应易于受明暗周期的干扰而破坏。为此，我们首先表征了ApoE -/-小鼠的昼夜节律。我们选择研究ApoE -/-小鼠，因为它们自发发展为动脉粥样硬化30。接下来，我们试图确定在恒定的光照下昼夜节律的破坏是否会增加ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化。
我们首先表征了C57BL / 6 J ApoE -/-小鼠的日常和昼夜节律运行活动节律。我们发现，ApoE -/-小鼠在12 h光照：12 h黑暗（12 L：12D）中每天都有滚轮活动的节奏，这与ApoE + / +小鼠没有区别（图 1a，b；所有个体的活动图）在图S1，S2中示出的小鼠 。在12 L：12D的ApoE -/-和ApoE + / +小鼠中，轮转活动节奏的幅度没有显着差异（图 1c，d，表 S1，t检验p = 0.21）。在12 L：12D中，ApoE -/-和ApoE + / +小鼠之间的日常活动水平没有显着差异（图 S3a，表 S1，t检验p = 0.99）。
ApoE -/-小鼠中的昼夜节律行为节律与ApoE + / +小鼠没有区别。ApoE + / +（a）和ApoE -/-（b）小鼠在12 L：12D中饲养7天（LD），然后释放到恒定黑暗中7天（DD）的车轮运行活动的代表性单作图）。黄色阴影显示灯亮。在12 L：12D中从7天开始产生平均活性谱（c）。LD（d）的振幅是12 L：12D中7天的χ2周期图的峰值Qp。夹带的相角（e）是通过在恒定的黑暗中绘制第1-5天活动开始的回归线，然后将其延伸到12 L：12D的最后一天来确定的。熄灯后开始活动时，出现一个正相角。在持续黑暗中，使用χ2周期图确定第1至7天的自由行驶时间（f）。ApoE + / + 和ApoE -/-小鼠之间没有显着差异。数据是平均值±SEM。
接下来，我们将小鼠放到不断黑暗的环境中，以测量昼夜节律的行为节律。我们发现在ApoE -/-和ApoE + / +小鼠中，夹带到明暗循环的相角相同（图 1e，Mann-Whitney p = 0.24）。在持续的黑暗中，ApoE + / +和ApoE -/-小鼠之间的车轮行驶活动的自由行驶时间没有显着差异（图 1f，表 S1，t检验p = 0.08）。活动节律的幅度（图 S3d，t检验pApoE -/-小鼠在恒定的黑暗中（表 S1） = 0.03），日常活动水平（图 S3b，t-检验p = 0.05）略有降低。
接下来，我们在恒定的光线下测量前7天的昼夜节律行为节律（图 S4；图S5中显示的所有单个小鼠的活动图 ）。自由运行周期（图 S4C，曼-惠特尼p = 0.29）和振幅（图 S4D，吨 -test p = 0.46）在恒定光车轮运行的活动节律并未之间显著不同的载脂蛋白E + / +和ApoE -/-小鼠（表 S1）。在ApoE + / +和ApoE -/-小鼠之间，在恒定光照下的日常活动水平也相似（图7。 S3c，表 S1，t检验p = 0.92）。
C57BL / 6 J小鼠中昼夜运动活动节律的阶段（或时间）响应于第31天的某些时间的曝光而变化。在早期的主观夜晚[在昼夜节律时间（CT）14-16]曝光延迟相位，而在后期主观天（CT21-23）光进入活动节律的相位31，32。在另一方面，在主观天（CT1-11）光具有在活动节律的相位没有影响31，32。这种光响应性是SCN如何带入明暗周期以及SCN如何根据明暗周期的变化进行调整（例如，旅行到新的时区之后）。因此，我们接下来测试了ApoE中对光脉冲的相位响应-/-小鼠。我们将ApoE -/-和ApoE + / +小鼠饲养在恒定的黑暗中，然后在CT8-10，CT14-16或CT21-23处施加单个15分钟的光脉冲（图 2，所有单个小鼠的光脉冲在图S6，S7，S8中示出 。在任何阶段，ApoE -/-和ApoE + / +小鼠之间对光脉冲的相位响应幅度没有显着差异（表 S1）。两种基因型均未对CT8-10处的光脉冲产生相位响应（t -test p = 0.94），两种基因型在CT14–16处相对于光脉冲呈相位延迟（t检验p = 0.64），在CT21–23时相对于光脉冲呈相位提前（曼-惠特尼p = 0.16）。这些数据证明ApoE -/-小鼠具有与ApoE + / +小鼠无法区分的昼夜生理反应。
在ApoE + / +和ApoE -/-小鼠之间，对光脉冲的相位响应没有差异。ApoE + / +（a–c）和ApoE -/-（d–f）小鼠的代表性活动图在昼夜节律时间（CT）8-10（主日）施以单个15分钟的光脉冲（以黄色框表示） ，14-16（主观夜晚）或21-23（主观夜晚）在持续黑暗（x轴：小时； y轴：天）中。ApoE + / +和ApoE -/-小鼠之间没有显着差异（g）。数据是平均值±SEM。
接下来，我们 通过使用PERIOD2 :: LUCIFERASE报告基因33测量雄性和雌性ApoE + / +和ApoE -/-小鼠的组织培养的生物发光，从而测量了APOE缺乏对分子计时机制的影响（图 3，图 S9，表 S2）。我们分析了从组织的ApoE - / -小鼠在8至20周龄，因为载脂蛋白E - / -小鼠自发在〜12周龄发展动脉粥样硬化，因此，我们可以前后动脉粥样硬化的发展后，分析组织的节奏34。SCN中PER2 :: LUC节律的周期（p = 0.10），肝脏（p = 0.76），垂体（p = 0.25），肺（p = 0.88），肾脏（p = 0.51），主动脉（p = 0.38），脾脏（p = 0.68）和白色脂肪 8周龄的ApoE + / +小鼠和8周龄和20周龄的ApoE -/-小鼠之间的组织（p = 0.66）无显着差异（单向方差分析；图 3a，表 S2）。同样，我们发现SCN（p = 0.54），肝（p = 0.87），垂体（p = 0.36），肺（p = 0.15），肾（p = 0.59），主动脉（p = 0.62），脾（p = 0.41）和白色脂肪组织（p = 0.73）在ApoE + / +和ApoE -/-小鼠之间在8周和20周龄（单向方差分析，图 3b，表 S2）。在8周龄和20周龄的8周龄ApoE+ / +小鼠和ApoE -/-小鼠之间，组织PER2 :: LUC节律的振幅也相似（表 S2）。这些数据表明，APOE缺乏不会改变分子计时机制。
在ApoE -/-小鼠中，组织中的分子计时基因节律没有改变。从8周龄的ApoE + / +小鼠（浅灰色），8周龄的ApoE -/-小鼠（深灰色）和20周龄的ApoE -/-小鼠（蓝色）中培养组织。根据培养期间12至36 h的时间间隔内PER2 :: LUC表达的峰值确定相（平均值±SEM），并相对于最后亮灯作图。白条表示灯亮，黑条表示灯灭。SCN：视交叉上核；WAT：白色脂肪组织。n = 5-10 /组织/组。ApoE + / +和ApoE -/-之间没有显着差异老鼠。数据是平均值±SEM。
接下来，我们研究了长期暴露于恒定光照下对动脉粥样硬化的影响（图 4，表 S3）。与以前在野生型小鼠中的研究相似，在恒定光照下饲养的ApoE-/-小鼠的运动活动性心律不齐或节律被破坏（图 4b，图S10，S11，S12，S13中所有小鼠的活动图） ；图 S14）35。男性（图 4c，t检验p = 0.001），但女性则不是（图 4e，曼-惠特尼p = 0.08）的ApoE - / -容纳在恒定的光小鼠在更动脉粥样硬化的连接面 12D（表：相对于对照12升主动脉 S3）。同样，暴露于ApoE -/-小鼠的雄性（图4d，Mann-Whitney p = 0.04）在主动脉根部的动脉粥样硬化病变区域增加 ，而在雌性（图 4f，t -test p = 0.20）中没有增加。恒定光（表 S3）。
持续的光照会加剧雄性ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化。放置在对照12 L：12D（a）或恒定光照（b）中12周的雄性ApoE -/-小鼠的总体运动活动的代表性单作图。黄色阴影显示灯亮。面部主动脉的动脉粥样硬化病变面积百分比（c，e）和男性（c，d）和女性（e，f）主动脉根的平均病变面积（d ，f）ApoE -/-将小鼠置于对照12 L：12D（黑色符号）或恒定光照（红色符号）中12周。来自单个小鼠的数据是封闭符号，开放符号是平均值±SEM（c–f）。* p <0.05，** p = 0.001。
接下来，我们研究了暴露于恒定光下可能增加雄性ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化的潜在机制。雄性ApoE -/-小鼠 在12 L：12D和恒定光照下具有相似的体重（t-测试p = 0.13）和卡路里消耗（t -test p = 0.52），尽管在恒定光照下（Mann-惠特尼p = 0.008）（表 S4）。
与对照12 L中的雄性相比 ，由于VLDL / LDL颗粒的增加（图5b），在恒定光照下饲养的雄性ApoE -/-小鼠总血清胆固醇浓度增加（图 5a，Mann-Whitney p = 0.009）。 12D。与对照组12 L：12D相比，雌性ApoE -/-小鼠的总血清胆固醇浓度（图S15a，t-检验p = 0.47）或脂蛋白上胆固醇的分布（图 S15b）没有显着差异。 持续照明（表 S3）。暴露于恒定光下并没有显着改变雄性（图S16a，Mann-Whitney p = 0.07）或雌性ApoE -/-小鼠（图 S16b，t-检验p = 0.40）（表 S3）的总血清甘油三酸酯浓度 。
持续的光照会增加雄性ApoE -/-小鼠的VLDL / LDL-胆固醇浓度。雄性ApoE- /的总血清胆固醇浓度（a：每只小鼠为闭合符号，空心符号为平均值±SEM）和胆固醇在脂蛋白上的分布（b：平均值±SEM，n = 4-5 /组，进行FPLC）−在对照12 L：12D（黑色）或恒定光照（红色）中饲养12周的小鼠。** p = 0.009。
接下来，我们测量了主动脉根血管壁中的巨噬细胞，作为炎症的标志（图 6）。与12 L：12D小鼠相比，雄性ApoE -/-小鼠的恒定光照不会改变主动脉根部病变的巨噬细胞含量百分比（图 6c，t检验p = 0.62，表 S3）。
持续的光照不会增加雄性ApoE -/-小鼠主动脉根中动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞。对照12 L：12D（a，黑色符号）或恒定光照（b，红色符号）中的雄性ApoE-/-小鼠的主动脉根（a，b）和动脉粥样硬化病变的CD68染色百分比（c）的代表性CD68免疫染色），持续12周。来自单个小鼠的数据是闭合符号，而开放符号是平均值±SEM（c）。ApoE + / +和ApoE -/-雄性小鼠之间没有显着差异。
ApoE -/-小鼠是用于研究动脉粥样硬化的公认的啮齿动物模型36。从〜12周龄开始，雄性和雌性ApoE -/-小鼠即使进食低脂（非西方）饮食，也会自发地在主动脉中形成动脉粥样硬化病变34。使用低脂饮食会导致动脉粥样硬化的小鼠模型对我们的实验设计至关重要。这是因为饮食诱发的肥胖症的增加动脉粥样硬化的ApoE - / -小鼠和高脂肪饮食喂养破坏雄性野生型小鼠的每日节律37，38。因此，在这项研究中，我们试图排除高脂饮食喂养对动脉粥样硬化和昼夜节律的潜在混杂影响，以分离持续的光诱导昼夜节律破坏的影响。为此，在研究期间，我们以低脂饮食喂养了ApoE -/-小鼠。该方案可防止雄性ApoE -/-小鼠食欲亢进和肥胖。因此，在恒定光照下饲养的雄性ApoE -/-小鼠中动脉粥样硬化的恶化与肥胖引起的全身代谢功能障碍无关。
这项研究的第一个目标是确定ApoE -/-小鼠是否是研究光诱导的昼夜节律紊乱对动脉粥样硬化的影响的合适模型。理想的模型应该没有固有的昼夜节律异常。先前的一项研究发现，ApoE -/-小鼠在持续的黑暗中具有不稳定的活动节奏，并且昼夜节律对光的反应能力减弱39。因此，我们首先全面表征ApoE -/-小鼠行为和光反应性的昼夜节律以及组织中的分子昼夜节律。我们发现ApoE -/-小鼠与ApoE + / +没有区别除了在恒定的黑暗中ApoE -/-小鼠的总活性和幅度略有降低外，其他所有参数的小鼠均显着降低。ApoE -/-和ApoE + / +小鼠的内源性（自由行驶）和带动性的转轮运动节奏以及一天中不同时间对光脉冲的响应性相同。而且，SCN和周围组织中的分子计时节奏以及这些生物钟之间的相位关系在ApoE -/-和ApoE + / +小鼠中是相同的。我们假设我们的结果与以前的研究不同，因为ApoE -/-先前研究中使用的小鼠可能具有混合遗传背景，而我们研究中的ApoE -/-小鼠回交10次进入C57BL / 6 J背景。遗传背景明显影响小鼠的昼夜活动节律，C57BL / 6 J菌株具有稳定的高振幅行为节律40。总而言之，我们发现ApoE -/-小鼠没有昼夜节律异常，因此是研究光诱导的昼夜节律破坏对动脉粥样硬化的影响的理想模型。
这项研究的第二个目标是研究持续暴露于生物钟的节律对动脉粥样硬化的影响。大多数以前的研究调查了动脉粥样硬化使用节律基因突变小鼠生物钟混乱的影响15，16，17，18，19。据我们所知，只有两项研究检查了光诱导的昼夜节律紊乱对小鼠动脉粥样硬化的影响。一项研究推断，每周一次的明暗循环反转会加速ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化发展，但缺乏定量数据41。最近的第二项研究表明，每周一次的明暗循环反转会增加雌性APOE * 3-Leiden.CETP小鼠的严重动脉粥样硬化病变，这是由于血管壁中的巨噬细胞含量增加，炎症，氧化应激和趋化标记增加了42。然而，来自本研究的数据表明，暴露于恒定光下的雄性ApoE -/-小鼠中动脉粥样硬化的增加是由VLDL / LDL胆固醇的增加而不是巨噬细胞含量的增加驱动的。另外，在以前的研究中，小鼠饲喂西方饮食（高脂肪和高胆固醇），其独立地引起代谢紊乱，肥胖症，并破坏昼夜节律27，43，44，45，46，47，48。因此，我们的研究是独特的，因为我们发现即使在给小鼠饲喂低脂饮食时，无序曝光也会加剧动脉粥样硬化。我们研究的另一个优势是，我们对雄性和雌性 ApoE -/-小鼠都进行了研究，而在先前的研究中只能研究雌性，因为雄性APOE * 3 Leiden.CETP小鼠在富含胆固醇的饮食下不会发展成动脉粥样硬化。
在小鼠中，持续不断的光照会增加运动节律的时间，并长期引起心律不齐49。在组织水平，恒定的光会使SCN中的细胞振荡器失谐，从而导致SCN的整体节律变低或消失35。由于SCN是主生物钟，在整个身体，恒定光曝光的SCN上导致的昼夜节律的全身破坏效果坐标生理和行为节律35，50。以前的研究表明，恒定的光曝光增加体重，破坏胰岛素敏感性，降低甘油三酯衍生的脂肪酸和通过褐色脂肪组织对葡萄糖的摄取51，52，53岁。然而，没有研究检查持续暴露于动脉粥样硬化的影响。在当前的研究中，我们发现暴露在恒定光下会增加雄性ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化脂蛋白和动脉粥样硬化病变区域的胆固醇。根据脂质假说，血液中的胆固醇的慢性升高水平的动脉粥样硬化引起54，55，56。在雌性ApoE中-/-小鼠，持续的光照不会增加总胆固醇或VLDL / LDL-胆固醇的浓度，也不会增加动脉粥样硬化的病变面积。脂质对光诱导的昼夜节律紊乱的反应中性别差异的潜在机制尚不清楚，但可能是由于循环性激素的差异所致。
总之，我们发现ApoE -/-小鼠的昼夜节律与ApoE + / +小鼠没有区别。另外，昼夜节律紊乱和持续的光照增加了雄性ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化，但没有增加。这些数据共同建立了雄性ApoE -/-小鼠，作为研究光诱导的昼夜节律紊乱对动脉粥样硬化的影响的合适模型。
C57BL / 6 J ApoE -/-（N10）小鼠购自The Jackson Laboratory（股票编号002052），并与野生型C57BL / 6 J小鼠（来自The Jackson Laboratory）一起繁殖，以产生C57BL / 6 J ApoE杂合子+ / -老鼠。繁殖杂种C57BL / 6 J ApoE +/-雄性和雌性以产生ApoE + / +和ApoE -/-小鼠（N11-N12）用于实验。对于生物发光实验，将PERIOD2 :: LUCIFERASE 33杂合的ApoE +/-小鼠（最初从Joseph Takahashi博士那里获得，然后与来自Jackson实验室的C57BL / 6 J小鼠回交了25代）。ApoE +/-小鼠产生的ApoE + / +和ApoE -/-小鼠对于实验PER2 :: LUC是杂合的。饲养员和断奶仔猪以12 L：12D饲养，随意喂养标准啮齿动物实验室饮食（Teklad 2918）和水。在三周大时，将后代断奶并与同性兄弟姐妹一起饲养。根据杰克逊实验室网站上的协议对ApoE-/-进行基因分型。PER2 :: LUC的基因分型通过测量尾部剪断的生物发光来确定。对于所有实验，将小鼠单独饲养在带有行走轮（直径：11 cm）的笼子（33 cm×17 cm×14 cm）中，并喂养低脂饮食（Research Diets D12450K，10％大卡脂肪）和水随意的。如以下针对每个具体实验所指示的，运行轮已解锁（可以旋转）或锁定（无法旋转）。所有程序均根据肯塔基大学动物保护与使用委员会批准的动物协议2015–2211进行。
在7至8周大时，将雄性和雌性ApoE -/-和ApoE + / +小鼠单独饲养在带有未锁定跑轮的笼中。将笼子放在带有白色LED灯（强度250至350 lux）的12 L：12D的不透光盒子中。使用ClockLab系统（Actimetrics，Inc，Wilmette，IL）每分钟记录一次车轮转速。将小鼠在12 L：12D中饲养7天，然后在恒定的黑暗中饲养7天。使用ClockLab分析软件（Actimetrics）分析数据。在12 L：12D中汇总了7天的车轮行驶活动（5分钟箱）的平均活动概况。振幅（Q p车轮运行节奏）是χ的峰值2在12 L：12D中7天或在持续黑暗中7天或在持续光照中7天的周期图。在12 L：12D中测定7天的平均每日活动，或在持续黑暗中测定7天，或在持续光照下测定7天。夹带的相角是通过在恒定的黑暗中将线性回归线拟合到5天来确定的，然后将其延伸回12 L：12D的最后一天。车轮运行的活动的持续黑暗自由运行期间被确定χ 2周期图Alpha设置在恒定黑暗1-7天至0.001。在持续黑暗中并每周照明一次（见下文）18天后，我们将小鼠放回到12 L：12D中20天，然后将它们放到恒定光照下21天。恒定光线下车轮行驶活动的自由行驶时间由χ确定2个周期图，连续1-7天。车轮行驶活动数据以归一化格式（ClockLab）在6分钟的时段内以活动图的形式显示。
雄性和雌性ApoE + / +和ApoE -/-小鼠（在光脉冲时为12-18周龄）被单独关在笼子里，随意放养进入解锁的运行轮。将笼子放在12 L：12D的不透光盒中，并带有白色LED灯（强度为250至350 lux）。然后将小鼠释放到持续黑暗中7天。通过使用ClockLab Analysis的线性回归确定在光脉冲当天的活动开始时间，命名为CT12。在CT8–10（主观日）或CT14–16（主观夜间）或CT21–23（主观夜间）施行单个光脉冲（15分钟，150 lux白色LED）。然后，小鼠在光脉冲后自由奔跑7天。使用ClockLab Analysis软件，通过测量光脉冲前7天与活动开始的直线拟合与光脉冲后7天与活动开始的直线拟合之间的时间，确定相移的大小。一些小鼠每3周接受超过1个光脉冲，并且在两次脉冲之间的一周内更换笼子。每只鼠标接收的光脉冲不超过3个，而单个鼠标从未在同一CT上接收光脉冲。
对PER2 :: LUC杂合的雄性和雌性ApoE -/-和ApoE + / +小鼠（7周龄）单独饲养在有锁轮的笼中（有轮，但无法旋转）在12 L：12D中。在8周或20周大时，不进行麻醉就通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并如前所述解剖并培养了主动脉，肾脏，肺，肝，垂体，脾脏，SCN和白色脂肪组织外植体，并对其进行了培养57。使用32通道LumiCycle仪器（Actimetrics Inc.）每10分钟测量一次生物发光。通过30分钟的相邻平均值对数据进行平滑处理，并使用LumiCycle Analysis软件（Actimetrics Inc.）进行去趋势处理。使用LumiCycle Analysis软件（Actimetrics）从培养12至36小时之间的周期中确定振幅（拟合优度≥90％）。数据被导出到ClockLab分析软件以分析周期和阶段。根据与3-5个周期的顶相拟合的回归线确定周期。该阶段是在培养中12–36小时之间发生的生物发光峰的顶峰相。
在7周大时，将雄性和雌性ApoE -/-小鼠单笼关在笼子中，将运行轮锁定在不透光的盒子中，以12 L：12D放置。用无源红外传感器连续记录总体运动活动，并使用ClockLab采集系统（Actimetrics Inc.）以一分钟的间隔进行收集。在8周大时，将小鼠随机分组，以留在12 L：12D中或在恒定光照下饲养12周。在ZT9-ZT12之间每周一次测量体重和食物重量，其中ZT0点亮，ZT12熄灭，持续时间为12 L：12D，或者在恒定光照下小鼠的相应本地时间。χ 2使用ClockLab Analysis软件，使用周期图确定在最后的28天内在持续光照下总体运动活动是否有节奏。如果主要峰超过α设定为p = 0.001（周期范围为20-36 h），则活动是有节奏的。
在20周龄时，在ZT6–9之间（或在恒定光照下小鼠的相应本地时间），用吸入的异氟烷麻醉小鼠，直到对脚趾收缩无反应，然后通过颈脱位安乐死。通过心脏穿刺收集血液，并通过离心分离血清并保存在-80°C下。通过左心室穿刺向主动脉灌注NaCl（0.9％wt / vol）。如前所述，从主根到to分叉处解剖主动脉58。将心脏从主动脉中取出并保存在-80°C下。该研究排除了具有严重器官异常的小鼠（排除雌性恒光组的2只小鼠，以扩大肾脏）。将主动脉在室温下于10％中性缓冲的福尔马林中保存24小时，然后转移至0.9％NaCl溶液中并在室温下保存。
为了测量面部主动脉中的动脉粥样硬化病变区域，去除主动脉周围脂肪组织，纵向切开主动脉，并使用Image-Pro 7.0软件拍照。主动脉弓被定义为左锁骨下动脉根部远端3 mm的上升弓。一位不了解实验治疗方法的研究人员使用Image-Pro 7.0软件测量了主动脉弓的动脉粥样硬化病变区域，并由不了解实验组的另一位研究人员进行了分析。
如先前所述58测量主动脉根部的动脉粥样硬化病变区域。简而言之，从主动脉瓣起点到升主动脉的9个连续组织切片（10 µm）用油红色O染色。连续切片分布在八张连续的载玻片之间，每张载玻片的间隔约为80 µm。如上所述，由两名研究人员使用Image-Pro 7.0软件对从内部弹性层到腔边缘的病变进行定量。
分析了总血清胆固醇（胆固醇E酶试剂盒，Wako Pure Chemical Industries试剂盒，山景城，加利福尼亚）和甘油三酸酯浓度（L型甘油三酸酯M酶颜色A和色B，Wako Pure Chemical Industries试剂盒，加利福尼亚山景城）。通过快速蛋白质液相色谱法（FPLC）（Leica CM1860）从各个血清样品（50 µl）中分析脂蛋白胆固醇和甘油三酸酯的分布。收集级分，并使用上述Wako试剂盒测定胆固醇和甘油三酸酯的浓度。对于每组，分析了平均血清总胆固醇浓度附近的4-5个样品。
使用MicroProbe系统，如先前所述，使用大鼠抗小鼠CD68（Bio-Rad，目录号MCA1957），大鼠IgG2b（BD），对升主动脉的冷冻连续切片（邻近被油红O染色的切片）进行巨噬细胞免疫组化分析。 PharMingen，Cat＃559478）和生物素化的兔抗大鼠IgG（Vector，Cat＃BA-4001）抗体59。免疫反应性用红色发色团3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）（载体）观察。如上所述，由两名研究人员使用Image-Pro 7.0软件在主动脉根部从内弹力层到腔边缘的第一个连续切片中对巨噬细胞含量进行定量。CD68染色的面积表示为动脉粥样硬化病变面积的百分比。
使用G * Power（Heinrich HeineUniversitätDüsseldorf）对昼夜节律行为参数和面对动脉粥样硬化病变区域进行先验功效分析（α= 0.05，功效= 0.80，效应大小为1至1.5）（表 S5）。使用两尾Student's t比较了ApoE + / +和ApoE -/-小鼠在每个CT上的昼夜节律行为参数（振幅，日常活动，夹带的相角，周期）和对光脉冲的响应相移。-检验，除非数据不是正态分布或具有不相等的方差，在这种情况下，将使用Mann-Whitney检验。单向方差分析用于比较各组中各组织的生物发光节律的周期，相位和幅度。在动脉粥样硬化病变区前位主动脉和主动脉根部，血清总胆固醇和甘油三酯的浓度，累积食物摄入，累计自发活动，而病变的巨噬细胞的百分比的ApoE / - -同性别的小鼠12升之间的比较：使用两尾学生t的 12D和恒定光照条件-检验，除非数据不是正态分布或具有不相等的方差，在这种情况下，将使用Mann-Whitney检验。使用OriginPro 2016（马萨诸塞州北安普敦）进行统计测试。数据表示为平均值±SEM。显着性归因于p ＜0.05。
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