由SARS-CoV-2冠状病毒引起的COVID-19疾病已成为大流行性健康危机。抗病毒抑制剂的一个有吸引力的靶标是主要蛋白酶3CL M pro，因为它在加工从病毒RNA转化的多蛋白中起着至关重要的作用。在这里，我们报告了未配体的SARS-CoV-2 3CL M pro的室温X射线结构，揭示了在接近生理温度时活性位点的无配体结构和催化位点腔的构型。与先前报道的低温无配体和抑制剂结合结构的比较表明，室温结构可能在生理温度下提供更多相关信息，以帮助进行分子对接研究。

命名严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS）2，或SARS-CoV的-2，新的冠状引起世界大流行疾病称为COVID-19 1，2，3，4。现在正在进行一项重要的研究工作，以重新利用现有药物并设计针对病毒5各个组成部分的新治疗剂。病毒单链RNA基因组与早期SARS冠状病毒（SARS-CoV）的同源性为82％，而某些病毒蛋白与SARS-CoV 6的同源性超过90％。与许多其他单链RNA病毒相似，SARS-CoV-2采用类似于胰凝乳蛋白酶的蛋白酶（3CL主蛋白酶或3CL M pro），以使生产的非结构蛋白病毒复制所必需的7，8，9。

3CL M pro切割两个大的重叠多蛋白pp1a和pp1ab至少11个保守位点，包括其自身的N端和C端自动加工位点。该酶具有Leu-Gln↓Ser-Ala-Gly的识别序列，其中↓标记切割位点，但显示序列混杂。病毒对这种蛋白酶的正确功能的绝对依赖性，加上缺乏同源的人蛋白酶，使得3CL M pro成为有吸引力的，尽管困难的，特异性蛋白酶抑制剂10设计的目标。遗憾的是，迄今为止，没有任何蛋白酶抑制剂针对SARS冠状病毒3CL中号的亲已经获得FDA批准，尽管显著的研究工作在过去的十五年11，12，13，14，15，16，17。

所述3CL中号亲结构由三个结构域的18，19。域I（残基8-101）和域II（残基102-184）由反平行的β桶结构组成，是催化域。域III（残基201-303）由五个α螺旋组成，负责酶的二聚作用。基于SARS-CoV的研究3CL中号亲作为单体酶是不具有催化活性的这种螺旋结构域起着蛋白酶功能中起重要作用20，21，22，23，24。因此，3CL M pro通过分子间的相互作用，主要是在螺旋结构域之间形成功能性二聚体（图   1a）。

a二聚体的一个单体显示为橙色卡通，而另一单体显示为蓝绿色表面，催化位点腔突出显示为红色球形的水分子。b催化部位空腔的特写视图，其中催化残留物（Cys145和His41）以紫色突出显示，而位于空腔侧面的残留物以绿色突出显示，水分子显示为红色球形。

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3CL M pro具有独特的多样性，具有非常规的Cys催化残基。与其他胰凝乳蛋白酶样酶和许多Ser（或Cys）水解酶不同，它具有催化的Cys-His二聚体，而不是典型的Ser（Cys）-His-Asp（Glu）三联体8。3CL M pro中的催化残基Cys145和His41 埋在位于蛋白质表面的活性位点腔中。该腔可在位置P1'至P4处容纳四个底物残基，并且侧接来自结构域I和II的残基（图   1b）。

我们在这里介绍与SARS-CoV-2 3CL M pro的功能和抑制剂结合有关的原子细节。为了获得这些见解，我们确定了该酶的室温（293 K）X射线结构，分辨率为2.30Å，可为结构辅助药物设计和分子模拟提供适当而准确的生理相关模板。

室温下3CL Mpro活性位的原子详细信息

我们种植了大晶体（补充图   1），可以在家用光源上使用以确保最小的辐射损伤。在我们的无配体3CL M pro的结构中，催化的Cys145Sγ距His41Nε2为3.8Å，对于形成氢键来说似乎太长了（图   2）。这并不奇怪，考虑到实验的pK 一个的8.0±0.3 Cys145和6.3±0.1值His41测量先前针对SARS 3CL中号亲共享96％的同源性与SARS-CoV的-2酶25，26和硫醇的氢键键合性能差。因此，在我们的结晶条件下（参见“方法”中的“结晶”部分），在pH值为7.0的结晶滴中，两个催化残基都有望在不结合底物或抑制剂的情况下采用不含配体的酶状态不带电荷。

氢键显示为蓝色虚线。Cys145和His41之间的距离显示为黑色虚线，红色虚线表示强C–H…O键。轮廓为1.6σ 的2F O – F C电子密度图以紫色网格显示。所有距离均以埃为单位。

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在该无配体状态下，Cys145的硫醇被质子化，His41的咪唑为中性。催化二重体将由质子从Cys145转移到His41激活，这可能是由于底物结合或在硫对易裂肽键的羰基碳原子的攻击过程中以过渡态发生的缘故。相反，His41与水分子（建议命名为H 2 O cat）形成很强的氢键，而水分子又分别通过与Asp187和His164的侧链形成2.9和3.0Å的氢键而稳定。Asp187的位置通过与附近残基Arg40的盐桥进一步稳定。

H 2 O cat参与复杂的相互作用网络，介导位于结构域II-III连接处的催化His41，保守的His164和保守的Asp187之间的极性接触。毫无疑问的是，该水可能起第三种催化残基的作用，完成3CL M pro中的非规范催化三联体，并通过介导其与带负电荷的Asp187的静电相互作用来稳定His41上的正电荷。催化。我们注意到，在100 K下获得的来自SARS-CoV-2 的无配体3CL M pro的某些X射线结构（例如，PDB ID 6M03）中没有这种潜在的关键水分子。

毫不奇怪，现在出现了许多报道，其中无配体的3CL M pro的 100 K X射线结构已用于各种小分子的分子对接模拟，包括许多被批准用于治疗其他疾病的疗法。使用Coot分子图形程序27中的最小二乘拟合，我们将3CL M pro的室温结构与在100 K（PDB ID 6Y2E）18下获得的结构相叠加。总体来说，结构是与用于RMSD类似Ç α 0.32埃（图的原子   3A）。在室温和100 K结构之间，残基192–198的构象有所不同（图   3b）。）。Ala194的肽键在室温结构中向内翻转，指向P5抑制剂结合袋，在此处其构象类似于3CL M pro与抑制剂N3（PDB ID 6LU7）的复合物中所见19。在室温和100 K结构之间，残基Thr196和Asp197的构象也显着不同。Thr 196的主链羰基氧原子的位置相差1.3Å，Asp197的CG原子相距1.9Å，Asp 197的主链羰基氧原子的位置相差2.6Å。在室温下在无配体酶中观察到的构象可能与候选药物的筛选更相关。

a在100 K（青色）下获得的室温3CL M pro（品红色）的无配体结构与3CL M pro（PDB ID 6Y2E）的无配体结构的叠加。b P5结合袋中的残基192–198在室温和100 K结构之间的构象不同。

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配体结合诱导活性位点构象变化

将我们的蛋白酶的室温结构与结合抑制剂的复合物的结构进行比较也是有益的。为了进行这种比较，我们选择了具有结构长的拟肽抑制剂N3 19的配合物，因为它具有跨越所有底物结合亚位点的取代基，包括位置P4和P5处的取代基，因此与实际底物极为相似。图   4显示了两个结构的叠加。结构比较表明，在活性位点附近酶具有显着的结构可塑性。为了容纳抑制剂，数个二级结构元素从其在无配体形式的室温结构中的位置移开超过1Å。由于配体结合，这种构象变化可以表征为诱导的契合。

3CL M的室温下无配体的结构的叠加亲（绿色个碳原子）与3CL M的结构亲在复合物与抑制剂从SARS-CoV的-2 N3（深紫，PDB ID 6LU7）。结合抑制剂后，残基Met49，Leu50和Met165改变其构象（弯曲的黑色箭头），而带有残基46–50的小螺旋和带有残基166–170的β-发夹环分开，形成带有残基190的环–194包含抑制剂的P5取代基，使其更接近β-发夹环。所有距离均以埃为单位。

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在配体结合上，P2基团附近的小螺旋包含残基46-50，P3-P4取代基附近的β-发夹环残基166-170相距2.4Å，而跨越残基190-194的P5环更靠近P3–P4循环。两种蛋氨酸Met49和Met165通过改变复合物结构中的侧链构象，避免与抑制剂的亮氨酸在P2位置发生冲突。此外，Met49构象的改变级联至Ser46和Leu50的侧链位置的改变。由于抑制剂的结合，更剧烈的构象变化发生在酶的C末端。不料， 2）。

C-末端环构象的剧烈翻转消除了作为无配体形式的二聚体界面的一部分形成的几个氢键，这可能在一定程度上使抑制剂结合形式的二聚体不稳定。为了评估这些酶区域的灵活性，我们对不含配体的3CL M pro进行了1μs的分子动力学（MD）模拟。如补充图3所示   ，在我们的MD仿真中，相同的区域，包括P2螺旋（残基45–50），P5环（残基190–194）和C末端尾部是最动态的，显示了最大均方根波动（RMSF）。因此，这些结构区域具有很好的延展性，可能能够在抑制剂的P2-P5位点容纳各种化学基团。

通过比较此处报道的室温无配体的结构与先前报道的低温无配体的结构和抑制剂结合的结构之间的比较，可以检测到酶活性位点的构象柔性，这使我们建议3CL M pro的室温结构不含配体的形式可能是进行分子对接研究以估计药物结合并实现药物设计的更生理相关的结构。

一般信息

蛋白质纯化用品购自GE Healthcare（美国新泽西州皮斯卡塔韦）。结晶试剂购自Hampton Research（美国加利福尼亚州Aliso Viejo）。

M pro基因克隆至MBP自切割融合

所述3CL中号亲（NSP5中号亲从SARS冠状病毒-2）同样地克隆至SARS-病毒M 亲不同之处在于使用的上游蛋白MBP代替原GST：（17189639 PMID）。合成了针对大肠杆菌表达优化的3CL M pro SARS-CoV-2 基因（补充表   1），并直接克隆到pET15b载体（Bio Basic）中，命名为M pro -pET15b。从M pro中扩增出M pro基因-pET15b，使用以下引物：5'-gggttggaagttttgagcgctgttctgcagtctggtttccgt和5'-gtgatggtgatgatgcggaccctggaaggtaacaccagagcactga，然后在存在dGTP的情况下用T4聚合酶处理。将来自pMHTDelta238的M pro：MBP-TEV-His 7片段的插入载体（PMID：17543538）克隆到载体pMCSG81，并命名为pMCSG81-Delta238。用于克隆M pro用以下引物扩增pMCSG81-Delta238：5'-catcatcaccatcaccattgagatccggctgctand和5'-caaaacttccaacccggcaccgtcgccgttaat。纯化PCR产物，并在dCTP存在下进行T4处理。将得到的经T4处理的片段混合并转化到BL21-Gold（DE3）细胞（安捷伦，加利福尼亚州圣克拉拉）中，并针对氨苄青霉素进行选择。对来自单个菌落的质粒进行纯化和测序。质粒名称命名为pCSGID-Mpro。在该表达系统的N端，该构建体的侧面是麦芽糖结合蛋白，然后是3CL M pro自动裂解位点SAVLQ↓SGFRK（箭头表示裂解位点）对应于病毒多蛋白中NSP4和NSP5之间的裂解。在C端，该构建体编码与His 6标签相连的人鼻病毒3C PreScission蛋白酶切割位点（SGVTFQ↓GP）。真实的N末端是在表达过程中通过3CL M pro自动加工生成的，而真实的C末端是通过PreScission蛋白酶处理生成的，类似于已公开的方法18。

蛋白质表达和纯化

使用羧苄青霉素抗生素（150 mg l -1的培养物）在大肠杆菌（BL21-DE3）细胞中使用补充有1 g l -1葡萄糖的Luria-Bertani 表达3CL M pro。使细胞生长至OD 600为0.8，在37℃诱导前通过加入0.2mM的异丙基的D硫代半乳糖苷。然后将温度降至18°C，3CL M pro过表达18 h。将收获的细胞重悬于含有20 mM TRIS pH = 8、40 mM咪唑，150 mM NaCl和1 mM TCEP的裂解缓冲液中。超声裂解细胞后，以30,000× g离心去除不溶部分30分钟; 然后将上清液加载到HisTrap FF色谱柱上。使用含有20 mM TRIS pH = 8的缓冲液线性梯度洗脱3CL M pro，使用500 mM咪唑，150 mM NaCl和1 mM TCEP。然后合并含有蛋白酶的流分，并以500：1的摩尔比加入含有His 6标签的PreScission蛋白酶（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）。然后将混合物在4°C下用含20 mM TRIS pH = 8、150 mM NaCl和1 mM TCEP的溶液透析18小时，以去除C端His 6标签，得到具有真实N 的3CL M pro -总站和C总站。经PreScission处理的3CL M pro将溶液加到HisTrap FF色谱柱上，以除去PreScission蛋白酶，C末端标签和带有未切割His标签的3CL M pro。在流通物中收集真实的3CL M pro，并浓缩至4 mg ml -1。

结晶

浓缩的蛋白质溶液（4 mg ml -1）首先被送至Hauptman–Woodward医学研究所（纽约州布法罗）的高通量结晶筛选中心，在此处使用96孔静置滴滤板筛选了1536个结晶条件28。薄板状晶体“花”在一周内出现在几种情况下，并在实验室中手动设置以重现晶体生长。在0.1 M BIS-TRIS pH = 6.5，25％PEG3350中生长的晶体外观最好。从这种条件下收集了几种晶体“花”聚集体，并使用汉普顿研究种子珠将其用于制备微种子。对于X射线晶体学，通过将蛋白质样品（4 mg / mL），储液（0.1 M BIS–TRIS pH = 6.5，20％PEG3350）以1：1的比例和0.2混合制成10μL滴状晶体坐滴装置中的μL错误浓度（1：100稀释）。使用微电极测量所得的晶体滴的pH为7.0。单板状晶体在几天内生长（补充图   1a））。为了收集室温衍射数据集，使用MiTeGen（纽约州伊萨卡）的室温毛细管装置安装了3CL M pro晶体（补充图   1b，c）。

X射线数据收集和结构优化

不含配体的3CL M pro的室温X射线晶体学数据是在配备有MicroMax-007 HF X射线发生器和Osmic VariMax光学器件的Rigaku HighFlux HomeLab仪器上收集的。使用Eiger 4 M混合光子计数检测器获得衍射图像。衍射数据使用CrysAlis Pro软件套件（德克萨斯州伍德兰市Rigaku Inc.）集成。然后衍射数据减少，并使用缩放漫无目的29程序从CCP4套件30，使用PDB代码6M03分子置换，然后用MOLREP进行30从CCP4程序套件。蛋白质结构的微细化，使用进行Phenix.refine从凤凰31程序套件和COOT 27分子图形程序。然后用Molprobity 32仔细检查最终结构的几何形状; 补充表2中显示了数据收集和优化的静态信息   。

MD模拟

使用GROMACS 2020 33在适应于沉积结构PDB代码6Y84 的apo 3CL M pro二聚体上制备，进行和分析经典的MD模拟。使用CHARMM36m力场34描述了该系统。使用TIP3P 35水模型和8个Na离子，在离最近池边缘10Å的菱形十二面体中溶解二聚体。应用了周期性边界条件，并使用最速下降算法以不到1000个步长将系统最小化。使用V- rescale 恒温器36和Berendsen稳压器37将系统平衡至300 K和1 bar 。使用与Nose-Hoover 38的跳越式集成进行了1 µs的生产MD，39和Parinello–Rahman联轴器40。使用SHAKE算法41约束所有涉及氢原子的键。每10 ps保存一次原子坐标。RMSD收敛后，针对蛋白质骨架原子计算RMSF。在1 µs的时间范围内，回转半径（R g）值在26.2±0.15Å处的合理不变表示蛋白质二聚体的致密性和稳定性（补充图   3）。