恶性疟原虫（Pf）仅依赖于挽救途径来满足其嘌呤核苷酸的需求，从而使该途径成为寄生虫必不可少的。嘌呤核苷酸水平受合成代谢过程和将这些代谢物水解成核苷的核苷酸酶调节。某些apicomplexan寄生虫，包括Pf，具有IMP特异性核苷酸酶1（ISN1）。在这里，我们通过全面的底物筛选显示，Pf ISN1催化肌苷一磷酸（IMP）的去磷酸化并被ATP变构激活。四聚体Pf的晶体结构ISN1揭示了与催化作用紧密相关的域组织的复杂重排。免疫荧光显微镜检查和GFP融合蛋白的表达表明Pf ISN1的胞浆定位以及在该寄生虫的无性和配子期阶段的表达。有关于雌性配子细胞中is1上调的早期证据，本研究报道的结构可能有助于启动可能的传递阻断剂的设计。
恶性疟原虫（Pf）是引起疟疾最严重的形式，是一种嘌呤营养缺陷型，直接从宿主抢救其核碱基和核苷以确保其发育。必不可少的寄生虫生存，嘌呤补救途径构成了一个重要的目标的新的抗疟疾药物开发1，2，3。嘌呤核苷酸对于各种细胞过程（包括DNA和RNA合成），能量代谢物（ATP，GTP）和辅因子（NAD，FAD，FMN，CoA）合成都是必不可少的。在红细胞生成阶段，从人宿主中挽救的腺苷和次黄嘌呤被转化为肌苷单磷酸酯（IMP），这是合成腺苷单磷酸酯（AMP）和鸟苷单磷酸酯（GMP）2的前体。维持正常细胞增殖所需的最佳核苷酸平衡受5'-核苷酸酶等其他过程控制4。这些酶催化核糖核苷和脱氧核糖核苷单磷酸的去磷酸化为其相应的核苷，在某些情况下还具有磷酸转移酶活性5。尽管在人类6、7中有7个5'-核苷酸酶的特征，但在疟原虫物种8中只有一个被注释。根据与酵母对应物9的序列同源性被分类为IMP特异性5'-核苷酸酶（ISN1，EC 3.1.3.99），该酶具有四个特征性的卤代酸脱卤酶（HAD）超家族基序10（补充图 1A）。与人5'-核苷酸酶没有明显的序列相似性。与人们对嘌呤5'-核苷酸酶的胞嘧啶核苷酸酶II（cN-II）类进行了深入研究，缺乏对ISN1的结构-功能关系的研究。疟原虫缺乏在包括人在内的许多原核生物和真核生物中存在的嘌呤5'-核苷酸酶的cN-II类。
最近，Brancucci等人。揭示了恶性疟原虫感知和处理宿主来源的生理信号的能力，并证明存在于宿主血清中的溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）可抑制寄生虫的性分化11。LysoPC耗竭引起的配子细胞形成与300多个基因表达的激活有关，这些基因包括参与磷酸胆碱（PC）生物合成，DNA复制和大分子修饰的基因。有趣的是，ISN1也被强烈诱导。但是，piggyBac转座子插入会在恶性疟原虫中造成全基因组破坏，这表明ISN1在无性阶段是可变的，而不会失去适应性12。为了阐明恶性疟原虫 ISN1（Pf ISN1）的生化和生理功能，我们在此报告底物特异性测定以及酶的动力学参数。此外，我们报告了该酶亚家族成员的晶体结构，即脱辅酶，具有开放和闭合构象的各种配体的变体和复合物的晶体结构。应当指出，在此报告之前，未报告ISN1家族成员的结构。我们还显示了寄生虫的无性和有性阶段的胞质定位。这些结构和功能研究揭示了该5'-核苷酸酶家族中使用的分子反应机理及其通过域间相互作用进行调节的机制。
在疟原虫中，仅感染人类，灵长类和鸟类的物种具有ISN1基因（补充图 1B），而啮齿动物寄生虫物种缺乏同源序列。血浆ISN1序列的长度相似，表现出82-100％的序列同一性。PF3D7_1206100基因编码的444个氨基酸Pf ISN1 包含9个外显子和8个内含子。除了保守的同义外，内含子-外显子的边界也被完全保守，表明在不同疟原虫物种进化过程中基因丢失/获得事件。
从红细胞内寄生虫滋养体阶段分离的RNA的逆转录酶-聚合酶链反应显示存在约1350个碱基对的单剪产物（补充图 1C），从而证实了该基因在红细胞内无性阶段的表达随后的测序验证了预测的剪接点。使用抗Pf ISN1抗体的间接免疫荧光显微镜检查显示恶性疟原虫的红细胞内无性和有性阶段的细胞质定位（图 1a和补充图 2）。此外，恶性疟原虫和伯氏疟原虫的活细胞成像寄生虫游离表达与GFP融合的Pf ISN1证实了细胞质定位（图 1b，c）。
一个用抗间接免疫荧光显微镜Pf的 ISN1抗体上红细胞内无性（3D7株）和性（3D7A株）级的恶性疟原虫。免疫前控制信号的缺失排除了非特异性结合（补充图 2）。如“方法”中所述产生所使用的抗体。如“方法”中所述富集配子细胞。重复该实验至少三遍。在3D7_ Pf ISN1-GFP（b）和Pb ANKA_ Pf ISN1-GFP（c）寄生虫中游离表达的Pf ISN1-GFP融合蛋白的活细胞荧光成像。铅成像ANKA_ Pf的 ISN1-GFP用从独立的小鼠中收集的寄生虫进行至少三次，并且3D7_的成像Pf的用从独立的培养物中收获的寄生虫进行至少三次ISN1-GFP。比例尺对应于1 µm。所指示的阶段仅对应于（a）。源数据作为源数据文件提供。
确定了Pf ISN1晶体结构的活性酶为Apo-，ΔC10截短，ΔN59截短，ATP结合形式，以及无活性的突变体D172N（全长和ΔN30截短）与IMP和Mg结合2+（补充表 1）。所有结构均采用四叉形组件，显示出十字形形状（图 2a），与四元溶液结构（补充表 2，补充图 3和4）一致。每个亚基（图 2a，b）由四个域组成：“ N末端调节域”（NTRD，M1至K59），“ OD”（D60至T143），类似HAD的催化域（CD，F144）到K270，从K371到Q444）和C2上限域13（K271至N370）（图 2b，e）。
四聚Pf ISN1-Apo形式的晶体结构。该结构已安装在25Å分辨率的包络线内，该包络是根据负染色样品的单颗粒重建后计算得出的。构成同四聚体的每个亚基显示不同的颜色编码。指出了如图2c，d所示的方向。b Pf ISN1的一个亚基（单体），其N端调节域（NTRD）为红色，寡聚域（OD）为灰色，催化域为蓝色，帽域为黄色。α螺旋被编号为1至16和β链从A到K. Ç二聚体界面1.虚线表示由一个亚基的OD与另一亚基的帽结构域之间的相互作用形成的二聚体界面。子单元γ和δ（浅灰色）分别位于子单元β（左侧）和α（右侧）之后。红色虚线轮廓划定了一个空腔，该空腔容纳了来自亚基α的NTRD。d二聚体界面2.虚线表示由亚基β和δ的两个OD之间的相互作用形成的二聚体界面。括号中的子单元被描述为表面，而浅灰色的子单元位于背景中（在图中不可见）。e Pf ISN1的线性示意图，带有在其他面板中使用的颜色代码，以及段D394-R406青色和粉红色的Loop L430-Q444。
与其他5'-核苷酸酶14一样，催化结构域具有HAD磷酸酶家族的四个基序特征和α/βRossmann样折叠，并由七个平行的β-折叠链折叠，被八个α-螺旋（α7至α12）包围，α15和α16）（图 2b）。C2帽结构域形成核心的β-折叠（四个反平行的β链），携带参与IMP堆叠的W365，两个α-螺旋（α13和α14）与另一个亚基的低聚结构域（OD）相互作用形成“二聚体”接口1”（图 2c）。此外，来自一个OD的螺旋α3至α5与另一个亚基的OD相互作用形成“二聚体界面2”（图 2d）。最后，NTRD主要由随机螺旋组成，不包含螺旋α1和α2，它们均位于apo构象（Pf ISN1-Apo）的α和β亚基之间（或γ和δ亚基之间，图2c）的接口1上。 。但是，由界面1上两个子单元之间的相互作用所产生的空腔（图 2c）一次只能容纳一个NTRD，从而迫使第二个NTRD定位在其他位置。对于后一个NTRD，直到残基59都没有观察到额外的密度，因此表明它具有很高的柔韧性。当叠加有和没有NTRD的亚基时，整体结构非常相似（RMSD 0.4Å）。Pf的分析ISN1-Apo SAXS数据证实了两个NTRD的高度灵活性，而SAXS约束的建模表明未结构化的NTRD可能位于界面2处（补充图 5）。
HAD家族磷酸酶表现出宽的底物特异性15，16，17。为了深入了解Pf ISN1 的生理功能，筛选了61种可能的底物（补充表 3）。在浓度为10 mM时，发现只有IMP和较低程度的AMP和对硝基苯基磷酸酯（pNPP，非生理性底物）是比活度值为3.2±0.5、0.07±0.03和0.002的底物分别为±0.0002 s -1。Pf ISN1在存在Mg 2+作为辅因子并且在4.0-5.0的pH范围内显示出最大的活性（补充图 6A）。对于IMP，酶的转化率，k cat（app）在pH 4.0-9.0范围内保持不变，而当pH从8.0更改为5.0时，表观K m值下降了194倍（表 1，补充图 6B，C）。IMP具有以p 3个可电离基团ķ 一个 1.5，5.8和9.1的值18，19，其中的前两个值对应于在磷酸盐的-OH基团的离子化，并且所述第三值对应于-N 1嘌呤h的。表观K m的下降这表明在磷酸部分上带有单个负电荷的单阴离子物质是与酶结合的底物形式。表观p K 1和p K 2值分别为4.95±0.32和6.24±0.36（补充图 6B）可能反映了底物电离和酶上的酸基团都参与了结合。
底物/辅因子饱和度图随pH和底物/辅因子的变化而变化。IMP的图在pH 8.0和5.0时都是双曲线的，AMP和Mg 2+在低pH时从双曲线转换为S形，在pH 8.0时pNPP是S形的（补充图 6C–F），因此表明跨亚基的协同作用在四聚体中。在低pH值下，IMP是具有最大催化效率的优选底物（表 1）。另一方面，AMP在低pH值下仍是较差的底物。在pH 8.0时，该酶对pNPP（尽管是非生理性底物）的催化效率比对IMP的催化效率低466倍（表 1）。f与显示该催化特征5的其他嘌呤5'-核苷酸酶不同，ISN1没有以IMP-腺苷作为磷酸盐供体-受体对显示磷酸转移酶活性（补充图 8）。
HAD超家族酶基序I中的两个不变的天冬氨酰残基参与催化，第一个天冬氨酸（D170）是磷酸盐受体，第二个天冬氨酸（D172）配位Mg 2+ 20。突变体D170N，D172N，D172A和D170N-D172N在pH 8.0和5.0时均对IMP无效（图 3）。令人惊讶地，在合成化合物pNPP上，D172N和D172A突变体分别显示出91和15倍的增加的活性（补充图 9A），因此可用于通过抑制pNPP水解来检查IMP结合。由于D172N对IMP的最高结合亲和力（K d（app）为4.5±0.3 µM，而对D172A为83.3±3.9 µM，（补充图 9B））和结构相似性，选择此突变体用于确定配体结合的Pf ISN1的结构。
直方图和误差条分别表示三个独立测量的平均值和SD。直方图上方指示了Pf ISN1 中突变的位置。v，初始速率是产物浓度随时间的变化。NTRD，N端调节域。所有测定中使用的酶和IMP的浓度分别为0.9 µM和10 mM。ATP的浓度为2 mM。用于测定的条件如 补充方法中所述。WT，野生型。源数据作为源数据文件提供。
晶体结构（图 4a，b）证实，IMP-Mg 2+底物主要由四个HAD基序的保守残基和位于β链I上的W365协同作用。核苷酸的碱基部分通过与W365的π堆积相互作用以及与A205（基序II），S207和D367的三个氢键来稳定Sb。糖部分的羟基2'和3'分别与D363和D178形成氢键（图 4a），而核苷酸的磷酸基部分则与D170（Motif I），T204和A205（Motif II）形成氢键。 ，K371（主题III）和N401（主题IV）（图 4b）。镁2+由磷酸部分，D170（基序I），D394和Q395（基序IV）的侧链以及D / N172的主链羰基配位。最终，D402（母题IV）通过盐桥稳定K371侧链，从而完善了这一组织。Motif IV突变体D394V，D402V和突变体D363V，D367V和W365L在两个pH下均对IMP无效，而W365Y和W365F的活性与野生型酶相当（图 3）。这表明残基365的芳族性质对于IMP结合至关重要。
a，b在底物结合状态下IMP结合位点的结构组织。 c ATP结合位点处于预激活状态，与apo结构的C末端环重叠。d NTRD处于构型1.时，NTRD的域间通信。2 Fo - Fc电子密度图（蓝色网格）的轮廓为1σ，Mg 2+被描绘为绿色球体。
此外，紧邻D172的三个高度保守的残基Y176，R218和D178（补充图 1A）可能参与催化过程中催化残基的正确取向（图4b中的 N172 ）。实际上，在两个pH值下，R218L均无活性或高度受损，Y176L表现出明显的活性丧失，而D178V受到的影响较小（图 3）。
嘌呤的5'-核苷酸酶的活性是通过基板和效应分子，如ATP，GTP和2,3- BPG的到变构位点的结合调制的21，22，23。在pH值为8.0的化合物中进行筛选（补充表 4），仅发现ATP是激活剂（补充图 10A），酿酒酵母 ISN1 9也具有这种特征。ATP（补充图10B）具有3.8±0.7 mM的亲和力， 是一种K型激活剂，可将IMP 的K m（app）值降低十倍，而k cat（app）保持不变（表 1），补充图 7K）。在pH 5.0或底物AMP和pNPP上未观察到Pf ISN1 对IMP水解的ATP活化（补充图 7K，M）。与ATP激活Pf ISN1相比，PC和D-肌醇4磷酸酯分别显示出79％和87％的酶活性抑制（补充图 11）。
在ATP结合的野生型酶（Pf ISN1-ATP）的四聚体结构中，仅观察到位于具有未结构化NTRD的两个亚基中的两个ATP分子。核苷酸与由OD的螺旋α6和来自催化结构域的螺旋α7和α16形成的裂口结合（图 2b）。ATP结合在Pf ISN1-Apo结构中C末端环（环L430-Q444）所在的位置（图 4c），这意味着以后结合时必须离开裂缝。H150和ATP的腺嘌呤部分之间发生π堆积，H150在OD的E419（催化结构域）和Y129之间建立了一座桥梁（图 4c）。在ATP存在下，没有观察到Loop的电子密度L430-Q444，表明它已不稳定。有趣的是，在显示结构化NTRD但缺少ATP的两个亚基中，Loop L430-Q444停留在裂缝中。ATP结合后，该酶发生构象变化，其中β和δ亚基中的CD和Cap结构域弯曲，从而比野生型具有更封闭的构象（补充电影 1，整个酶RMSD = 1.56Å）。由于界面1的相互作用，ATP诱导的亚基β和δ的闭合迫使亚基α和γ稍微打开。总体而言，该结构揭示了ATP通过触发Loop L430-Q444的离开而激活了酶，进而促使亚基弯曲，从而增加了对IMP的亲和力。
的Pf的 ISN1-ΔC10突变体通过在C末端10个残基截短的显示八倍更高的催化效率（ķ 猫（APP） / ķ 米（APP）在pH 8）缺乏ATP和在pH 5.0没有变化（表时 1和图。 3）。在pH 8的ATP存在下，活性大大降低。的结构Pf的 ISN1-ΔC10显示一个Pf的 ISN1-ATP结合样构象（RMSD = 0.36），确认环路的作用L430-Q444作为活性调节剂。该变体的ATP抑制作用表明缺少Loop L430-Q444允许一次结合四个ATP，而不是两个，从而形成非生理性中间体。一旦到V H150的突变，Pf的 ISN1 H150V -ΔC10不再由ATP和抑制Pf的 ISN1 H150V -Apo不是由ATP活化的（图 3）。这些观察结果证实了H150在ATP结合中的作用。实际上，在Pf ISN1 H150V -Apo和Pf ISN1 H150V- ΔC10中，V150不再与E419和Y129相互作用，导致效应位点重组，并且在pH 8.0和5.0下的活性增加（图 3和补充图）。 。 12）。
在Pf ISN1-Apo中，带有催化天冬氨酸之一的螺旋α8（残基171-175）占据了磷酸盐部分和Mg 2+的结合位点。在此构象中，E173（基序1）与H398（基序IV）相互作用，而D178和D394暴露于溶剂中。IMP-Mg 2+或Mg 2+结合后（Pf ISN1 D172N -IMP，Pf ISN1 WT -Mg 2+），螺旋α8重组为一个环，并定向E173侧链以容纳底物。同时，D178和D394的侧链翻转进入催化口袋以协调底物，而E173和H398之间的盐桥断裂导致D394和F407之间的链段完全重组（图 5和补充图13）。 α-螺旋D402-F407。同时，四个亚基甚至比Pf ISN1-ATP构象弯曲得更多，以采用观察到的最封闭的形式（补充电影 1）。在后一种构象中，我们没有观察到Pf ISN1-Apo和Pf中的 NTRD。ISN1-ATP结构。实际上，四个NTRD都重新定位在段D394-F407下的接口2 （图 5）。关于Loop L430-Q444，如在Pf ISN1-ATP结构中的ATP结合亚基所见，四个亚基在残基L430之后不显示电子密度。尽管在结晶之前添加了ATP，但在Pf ISN1 D172N -IMP结构中未观察到ATP分子。段D394-F407重组后发生的F396翻转允许与W413，R149和H150进行长距离堆叠。H150略微旋转，从而破坏H150与Y129之间的氢键，并参与重塑效应位点，以及破坏H150与ATP碱基之间的π堆积（如果存在）。所有这些观察结果推断，诱导的拟合机制是通过区段D394-F407的结构重组触发的。后者与效应位点残基形成长距离相互作用（补充图 12），导致环L430-Q444离开在没有ATP或没有ATP分子（如果存在）的情况下，从而允许酶封闭，并通过Cap结构域正确容纳IMP。由于涉及的IMP-结合化学计量，我们观察到在Pf的 ISN1 D172N -IMP结构，每个亚基结合一个IMP-镁2+，特征还观察到Pf的 ISN1 D172N -ΔN30-IMP结构。通过等温滴定热法（ITC）在Pf ISN1 D172N突变体上检测到的IMP-Mg 2+结合化学计量为1：1，证实了结构观察（补充图 14）。
a，d从apo-到b，e -ATP 结合到c，f IMP结合的构象。蓝色箭头表示ATP结合位点，黄色箭头表示IMP结合位点。在（c）和（f）中，Mg 2+被描绘为绿色球。IF1接口1. IF2接口2。
对区段D394-F407突变体D394V，Q395L，F396L，H398V，D402V，F403A，F403L，F403Y和R406L（表 1和图 3）的IMP水解活性的分析强调了这种结构重组的重要性。其中，基序IV残基D394，F396和D402在ISN1序列上是不变的，而Q395和H398是保守的。在与IMP结合的结构中，Q395协调Mg 2 +，F396在与IMP结合时翻转，并与H150形成长距离堆积相互作用，而H150与ATP相互作用，而H398采用载脂蛋白和IMP结合形式的交替构象。突变体Q395L和F396L在pH 8.0和5.0下均对IMP无活性（图 3）。在pH 8下，k cat（app）H398V的变化不改变，但K m（app）下降六倍导致催化效率提高七倍。在pH 5时，催化效率不会改变，因为k cat（app）的三倍增加被K m（app）的五倍增加所抵消（表 1）。ATP对该突变体的激活比野生型酶高三倍（图 3）。与基序IV相邻的F403在具有结构化NTRD，非结构化NTRD和Pf ISN1 D172N的Pf ISN1-Apo单体的结构上显示出不同的侧链构象-IMP。在pH值和存在ATP的情况下，F403A的IMP水解活性均受到损害，而F403L的活性与野生型相当，尽管ATP的活化程度低两倍。F403Y在所有三个条件下均显示出增强的活性（图 3）。这些观察结果表明F403参与催化位点的重组并且有助于稳定螺旋D402-F407（补充图 15）。
对于NTRD，观察到三个不同的构象（“ 1”，“ 2”和“ 3”），其中Pf ISN1-Apo和Pf ISN1-ATP 中均存在构象1和2 ，而仅在Pf中可见构象3 ISN1-IMP（图 5d–f，有关接口定义，请参见图 2）。
如在Pf ISN1-Apo和Pf ISN1-ATP的α和γ亚基中所观察到的，构型1的NTRD完全被结构化（图 4d，图 5d，e，补充图 16），其通过几个氢键和两个盐稳定。桥接器（K41-D394和D60-R406）。在构型2中，NTRD在残基1–59的电子密度中不可见，就像Pf ISN1-Apo和Pf ISN1-ATP的β-和δ亚基一样，而是漂浮在溶剂中（图 5d，e）如SAXS数据所建议（补充图 5）。在Pf中ISN1-Apo结构，构型1的NTRD的K41与显示构型2的NTRD的亚基的D394相互作用。K41L在pH 8.0和pH 5.0均显示出三倍的活性增加，而没有被ATP激活（图 3）。该突变体在pH 8时表现出K m（app）下降四倍，而在pH 5时，K m（app）值增加十倍（表 1）。
在构型3中，所有四个NTRD对于残基36-59都是可见的，并且位于段D394-F407下方的界面2 （图 5f）。螺旋α2经历〜135°旋转拖动兼任NTRD的其余部分在滑动界面2。此外，NTRDs对结构化段的冲击D394-F407（图 5C，附图 15，16）。与构型1的NTRD一起，区段D394-F407形成一个由D60-R406和E173-H398盐桥稳定的环。当NTRD处于构象2时，盐桥D60-R406被破坏，开始形成α-螺旋D402-F407（补充图 16）。IMP-Mg之后2+结合，区段D394-F407被完全结构化为α-螺旋D402-F407，其通过NTRDα2螺旋稳定（补充图 15）。螺旋D402-F407形成后，盐桥D60-R406被重整，可能参与IMP水解后酶的结构重组。R406L在pH 8和pH 5分别下降24和4倍（图3），这证明了这一点 。此外，NTRDs（缺失Pf的 ISN1-ΔN59）失活在pH 8的酶，而在pH 5存在活性的六倍下降。30的N末端残基（缺失Pf的 ISN1-ΔN30）通向三倍在两个pH值8和pH 5（表增加的活性 1和图 3）。此缺失突变体在pH 8处显示k cat（app）增加两倍，而K m（app）值降低相似。然而，在pH 5下，尽管k cat（app）增加了六倍，但对底物的亲和力却受到了损害（K m（app）的增加了八倍，表 1）。的结构Pf的 ISN1 D172N -ΔN30共结晶与IMP（Pf的 ISN1 D172N -ΔN30-IMP）是类似于Pf的 ISN1 D172N -IMP结构（RMSD = 0.46埃），证实仅残基30-59是强制性用于稳定段D394-F407在构象3.活动Pf的三个条件下ISN1-ΔN30-ΔC10是几乎完全或显著抑制（图 3），表明残基1-29的作用是稳定ATP激活后的酶。实际上，结构Pf的 ISN1-ΔN59共结晶与IMP表明，缺乏NTRDs时，段D394-F407不能被稳定的（没有很好地在电子密度定义），并且因此，所述酶是不再能够容纳所述衬底正确（在晶体结构中未观察到IMP）。
在这三个生命王国中，ISN1仅存在于真核生物中，其中83％的选定序列仅限于真菌。此隔开，属于生物的少数Alveolata，绿色植物，原生藻菌，Ichthyosporea和隐藻也具有ISN1。有趣的是，属于Stramenopile门的卵菌与Viridiplantae形成姐妹进化枝，而同时也属于Stramenopiles的硅藻和异藻类藻类则形成了另一个分支。小菜蛾（Vitrella Brasicaformaformis），一种自由生活的光合作用肺泡和疟原虫的祖先也携带ISN1基因（补充图 17））。嘌呤核苷酸酶的cN-II类存在于许多真核生物和原核生物中。尽管进行的反应是相同的，但ISN1和cN-II具有微弱的序列相似性（Pf ISN1和人cN-II 之间〜10 ％的同一性），也反映在三级结构上，这是不可比较的。实际上，对具有现有晶体结构的Pf ISN1的比较研究表明，在HAD磷酸酶家族的已知结构中，NTRD和Loop L430-Q444都不保守。OD，尽管是所有ISN1的共同特征，但在HAD磷酸酶家族中并不保守，这表明在特定于ISN1子家族的四级结构组织中的作用。
结构和功能分析揭示了NTRD在Pf ISN1 催化机理中的重要作用。我们表明，缺乏NTRDs为当Pf的 ISN1-ΔN59活性高度大打折扣。这可能是由于其无法稳定含有普遍存在的HAD家族基序IV的D394-F407段，这对于协调IMP-Mg 2+是必不可少的。我们还表明，尽管残基30–59直接参与催化机理，但残基1–29却在与催化功能相关的构象变化过程中对结构的整体稳定做出了贡献。此外，Pf ISN1-IMP结构显示了IMP-Mg 2+的完全重组-结合位点，这也意味着NTRD的结构和稳定。因此，IMP-Mg 2+结合既诱导NTRDs在四聚体中的定位，又诱导四个亚基的闭合。
筛选潜在的底物和变构效应物证实了该酶对IMP的底物特异性，其中ATP为激活剂，PC和D-肌醇-4-磷酸酯为抑制剂。仅在7-8的生理pH下观察到ATP激活，而在较低pH值下未观察到。尽管在酸性pH（4.0-5.0）而非生理pH值下表现出最大活性，但在恶性疟原虫（无性阶段和配子细胞）中，通过免疫荧光和活体显微镜检查游离表达的ISN1，ISN1均定位于胞质溶胶-GFP融合蛋白。当Pf出现在伯氏疟原虫中ISN1-GFP是游离表达的。胞质5'-核苷酸酶来自其它生物体的已报道具有pH最佳值在5.0-7.0的范围内24，25。发生血红蛋白降解的食物液泡构成了疟原虫的主要酸性区室。本研究中用于定位的多种策略未显示在该酸性区室中的定位。
总体而言，我们的结果表明了一种反应机理（图 6），在生理pH值下（步骤1），ATP仅占据四聚体的四个效应位点中的两个（步骤2），表明IMP-具有不对称结合性质Mg 2+优先结合两个预激活的亚基。另外，两个含ATP的亚基具有其构象2的NTRD，准备在结合IMP-Mg 2+时重组为构象3以稳定区段D394-F407。IMP-Mg 2+在活性位点的出现触发了区段D394-F407的重组，在此期间F396翻转以形成长距离堆积，其中W413，R149和H150重新定向该组氨酸的咪唑环（步骤3）。基于该结构的结论得到以下事实的支持：Pf ISN1 F396L和Pf ISN1 W413L不起作用，而H150V不被ATP激活。因此，H150和Y129之间的氢键以及H150和ATP的氮碱基之间形成的“π堆积”断裂，诱导ATP释放到培养基中。效应位点相互作用的不稳定导致四个亚基的完全关闭，从而使Cap结构域可以堆叠带有W365的IMP的氮碱基（图 6，补充图 12和18）），但缺少W365L的活动。同时，IMP-Mg 2+的结合导致另一个亚基的盐桥D394-K41断裂（补充图 16）。Cap域的闭合引起与两个NTRD的构型1发生空间冲突，迫使后者重新定向为构型2（图 5，补充图 16）。同时，IMP-Mg 2+的水解需要重新打开酶，以释放新形成的肌苷。在这种构象中，在D60和R406之间形成了盐桥，而磷酸天冬氨酰酶中间体的形成使得片段D394-F407启动重组，特别是F403的翻转。由于与W47发生空间冲突，后者很可能参与了Cap域的重新开放和/或NTRD的构型1的返回。突变体R406L证实了盐桥D60-R406在催化循环中的重要性，该突变体的活性受到极大损害。返回到Pf ISN1-Apo构象可以使肌苷释放到培养基中，随后水解天冬氨酰-酶中间体。通过将回路L430-Q444返回到效应位点，可以稳定这种构象（步骤4）。
在第一步骤1（一个 Pf的 ISN1-APO），螺旋α8承载催化天冬氨酸（D172）中的一个，占据磷酸部分和Mg的结合位点2+和K41从亚基α和γ与D394 NTRD形式盐桥分别来自亚基β和δ。在第二步中，在pH 8.0下：ATP仅占据四聚体的四个效应位点中的两个（β和δ亚基）（b），并在ATP结合后诱导这些亚基的闭合，从而在Loop L430离开后激活酶-Q444。在此构象中，ATP的碱基部分与H150形成π堆积，H150稍微转动，并分别通过氢键和盐桥与Y129和E419稳定。（c）一旦被激活，在第三步中，该酶可以结合IMP和Mg 2+。该结合诱导螺旋α8和区段D394-F407的重组。结果，F396翻转产生W413，R149和H150的长距离堆叠。后者略微旋转，与Y129断开氢键，导致ATP离开。封闭该酶可诱导Cap域正确地容纳IMP，并迫使四个NTRD重新定位在界面2上。在pH 4.0-5.0时：ATP不是变构激活剂。IMP可以与四个亚基结合，使酶直接从步骤1（a）进入步骤3（c）。适用于所有pH值：步骤4（d）返回初始apo构型，包括LoopL430-Q444返回效应子结合位点，并将肌苷和P i释放到培养基中。子子单元，IF接口；黑色箭头表示域的全局移动。使用的颜色代码与其他图中的一样。
虽然ISN1存在于恶性疟原虫和某些其他种类的灵长类和鸟类疟疾寄生虫中，但伯氏疟原虫缺乏该酶的同源物。这可能归因于疟原虫物种之间的代谢差异或宿主-寄生虫相互作用的差异，将其限制为仅感染特定类型宿主的寄生虫26。据报道，Pf ISN1是一组宿主特异性溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）的基因之一-响应基因随宿主LysoPC水平的耗尽而转录上调，从而引发恶性疟原虫的性取向和配子发生11。尽管ISN1基因在红细胞生成阶段是可变的，但其在雌性配子细胞中上调的意义尚需进一步研究。
使用MEGA v7 27对ISN1序列进行了系统发育和分子进化分析。
如Trager和Jensen 28所述，维持恶性疟原虫红细胞生成阶段的体外培养。如Fivelman等所述，进行了配子细胞的产生和富集。29和补充方法中提供了详细信息 。伯氏疟原虫 ANKA寄生虫保持在BALB / c小鼠中。通过对寄生虫RNA的反转录PCR获得Pf ISN1基因。
补充表5中提供了用于PCR扩增的引物的序列 。将Pf ISN1基因克隆到pFCENv1和pBCEN5中以获得与GFP的C端融合。所得的质粒pFCENv1_ Pf的 ISN1和pBCEN5_ISN1GFP被用于转染恶性疟原虫和伯氏疟原虫，分别使用已建立的方案30，31与设置细节 补充方法。携带寄生虫的确认线PfISN1-GFP基因通过使用Zeiss活细胞荧光显微镜检查® LSM-510 META共焦显微镜。抗Pf使用纯化的重组Pf ISN1 在兔中产生ISN1抗体，并使用与Pf ISN1 偶联的琼脂糖珠亲和力纯化亲和力。使用该抗体，间接免疫荧光显微镜进行使用Zeiss ® LSM-510 META共焦显微镜检查的定位Pf的 ISN1在红细胞内的阶段的恶性疟原虫。
所有动物（用于抗PfISN1抗体生成的雄性兔和用于维持伯氏疟原虫 ANKA WT和PfISN1-GFP表达寄生虫的小鼠的BALB / c株）实验均遵守控制和感染委员会规定的标准操作程序贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心的动物伦理委员会（IAEC）批准了动物实验监督（CPCSEA）。IAEC受CPCSEA管辖。
使用补充方法中描述的标准程序将野生型和突变体Pf ISN1克隆入pET-21bN 。对于蛋白质表达，使用BL21（DE3）或Rosetta菌株。将细胞沉淀重悬于30 mL裂解缓冲液中，并使用French ©压力细胞压床（Thermo IEC Inc.，美国）在1000 psi下进行六个周期的裂解。裂解缓冲液的成分为50 mM Tris-HCl，pH 8.0、100 mM NaCl，10％（w / v）甘油，0.1 mM PMSF和0.5 mM Tris-（2-羧乙基）膦。将裂解物在14,000×离心 克在5℃和结合至Ni-NTA琼脂糖珠（NI-NTA His-结合上清液45分钟®树脂，Qiagen）在5°C下放置3 h。结合后，将珠子装载到玻璃柱上，并用至少十当量的珠子体积的含有增加浓度的0、20和40 mM咪唑的裂解缓冲液洗涤。蛋白质在5 mL含500 mM咪唑的裂解缓冲液中洗脱。加入一毫摩尔的EDTA以螯合可能已经与蛋白质一起洗脱的Ni 2+离子。洗脱的蛋白用Amicon浓缩®超离心过滤器具有30kDa分子量截断器（Millipore™公司），并加载到填充有Sephacryl™S-200 HR（GE医疗集团生命科学）16mm的×60厘米柱。
使用Chen方法32进行酶活性测定以估计释放的磷酸盐。关于磷酸化代谢产物的所有测定均在pH 8.0和5.0下进行。连续分光光度法测定涉及405 nm吸光度的变化，用于评估pNPP的水解。通过离子对反相HPLC监测使用5'-IMP-腺苷作为供体-受体对的Pf ISN1的磷酸转移酶活性。
使用VP-ITC 确定Pf ISN1 D172N突变体与配体IMP 的复合物的配体结合的化学计量。有关测定条件的详细信息，请参见“ 补充方法”。所有地块和数据通过非线性回归拟合的产生是用GraphPad完成® 5.0版（格拉夫派得软件公司，圣地亚哥，CA）。在补充方法中阐述了用于拟合数据和拟合最佳模型的方程。补充方法中提供了所用所有程序的详细信息 。
如补充方法中所述，进行了结构研究的蛋白质生产和纯化 。携带Pf ISN1基因的不同构建体的质粒被转化到大肠杆菌 BL21-CodonPlus（DE3）-RIL细胞中，除了硒甲硫氨酸衍生物外，携带Pf ISN1基因的质粒被转化到大肠杆菌 B834（DE3）中应变。
使用可商购的结晶试剂盒，在292 K（坐滴中的蒸气扩散）下进行结晶条件筛选。为了筛选，蚊子®从TTP LABTECH结晶机器人使用两个蛋白质/结晶试剂的比例（200 + 200 nL和300 + 100纳升滴在MRC结晶板（分子尺寸）平衡针对70μL）中的溶液使用。将蛋白质在50 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl缓冲液中浓缩至13 mg mL -1，除了进行筛选外，还会在酸性pH下结晶，并将蛋白质存储在50 mM MES pH 5.0和100 mM NaCl中。
收集硒代蛋氨酸衍生物晶体（在ATP存在下结晶）的X射线衍射数据（ID29-ESRF，格勒诺布尔，法国），波长为0.979230，以进行SAD定相。用Phenix AutoSolprogramme 33计算了相和实验电子密度图，并使用Pf ISN1-ATP数据通过Phenix AutoBuild建立了初始模型。Pf ISN1的所有其余结构都通过使用ATP结合结构作为搜索模型的分子置换来解决。
为了收集SAXS数据，将样品浓缩至〜13 mg mL -1。使用DataSW 34和PRIMUS 进行初始处理，并使用GNOM执行P（r）分析。使用DAMMIN和GASBOR从实验数据生成Pf ISN1的从头算模型。使用DAMAVER程序套件对50个生成的模型进行平均和滤波，以生成最终模型35和AllosMod-FoXS服务器36。
将 0.025 mg mL -1的Pf ISN1样品应用于formvar 网格，并用2％（w / v）的硅钨酸钠（pH 7.0）染色。用Tecnai灵巧显微镜在120 kV下操作，以标称×49,000放大倍率记录图像，像素尺寸为1.36Å。在二维分类之前，使用Relion 3.0中的LoG选择器自动选择了大约19,000个Pf ISN1 单个颗粒。选择好看的班级并提交给3D分类轮次。包含2600个粒子的最佳外观地图最终被精炼到20Å分辨率，并具有D1对称性。为了预测Pf ISN1 的功能运动，使用ProDy软件包37进行了NMA计算。
使用DALI服务器38，将Pf ISN1的晶体结构与Rutgers，RCSB的蛋白质数据库中的现有结构进行了比较。
用PyMol（DeLano Scientific LLC，http： //pymol.sourceforge.net/ ）和Chimera 39绘制了三维结构图。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
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