许多人类癌症过表达B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）或X连锁凋亡抑制（IAP）蛋白来逃避细胞死亡。促凋亡ARTS（Sept4_i2）蛋白直接与Bcl-2和XIAP结合，并通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）刺激其降解来促进凋亡。在这里，我们描述了一个模仿ARTS功能的小分子A4。微量热泳分析表明，A4结合XIAP，但不结合细胞凋亡蛋白1（cIAP1）抑制剂。A4结合到XIAP-BIR3（杆状病毒IAP重复序列3）域中一个独特的ARTS结合口袋。像ARTS一样，A4刺激了XIAP和Bcl-2（而非cIAP1）的多泛素化和UPS介导的降解，导致caspase-9和-3的活化和凋亡。此外，XIAP的过量表达可从A4诱导的凋亡中拯救HeLa细胞，符合A4通过对抗XIAP杀死人的想法。另一方面，用SMAC模拟Birinapant处理可诱导肿瘤坏死因子-α（TNFα）分泌并杀死约50％的SKOV-3细胞，向Birinapant处理的细胞中添加A4可显着减少TNFα的分泌并阻断Birinapant诱导的细胞凋亡。这表明A4通过特异性靶向XIAP起作用。由于外周血单个核细胞和正常人乳腺上皮细胞不受影响，A4的作用具有选择性。此外，蛋白质组分析显示，XIAP水平高的癌细胞系对A4的杀伤作用特别敏感。这些结果提供了概念证明，即XIAP中的ARTS结合位点是“可吸收的”。
细胞凋亡对于维持组织稳态和防止各种疾病（包括癌症1）至关重要。半胱氨酸蛋白酶家族中的半胱天冬酶是凋亡的主要执行者2。胱天冬酶的活性通过凋亡抑制剂（IAP）蛋白3的作用而受到抑制。人类有八种IAP，但只有X连锁IAP（XIAP）直接抑制胱天蛋白酶，而凋亡蛋白的细胞抑制剂（cIAP）则可以阻止外在凋亡途径中促凋亡信号复合物的形成。XIAP包含三个杆状病毒IAP重复（录音），其作为蛋白质-蛋白质相互作用结构域的直接结合和胱天蛋白酶3,7的抑制和9 4，5。此外，它包含一个泛素相关的结构域，这使得聚遍在蛋白缀合物和连接酶活性的其E3所需的RING结构域的结合6，7，8。细胞凋亡的调控由泛素-蛋白酶体系统严重依赖于调节蛋白质降解9，10，11。XIAP用作E3连接酶，以促进几种促凋亡蛋白，如SMAC和ARTS的降解12，13，14。
凋亡也由B细胞淋巴瘤2（Bcl-2的）家族成员，该控制线粒体外膜透化（MOMP）调节15，16。该家族含有可以通过一个共同的BH3结构域的复合物促和抗凋亡蛋白15，17，18，19，20。重要的是，高含量的抗细胞凋亡Bcl-2蛋白是许多血液系统恶性肿瘤以及某些实体癌的特征15，21，22，23，24。
为了刺激细胞凋亡，需要克服IAP的功能。这通过IAP拮抗剂，如SMAC / DIABLO的动作25，26，欧米/ HtrA2的27和ARTS 28。ARTS（Sept4_i2）是由的Septin 4（编码的促凋亡蛋白Sept4）基因和唯一的剪接变体Sept4促进细胞凋亡29，30。在人类和小鼠中的研究表明，ARTS可以作为抑癌蛋白。Sept4 / ARTS缺陷小鼠发展各种自发性肿瘤，并且它们在欧盟-Myc的模型已经高度加速淋巴瘤31，32。此外，ARTS表达丢失在白血病患者中的> 70％，在淋巴瘤患者的50％，而在肝细胞癌患者的显著馏分31，33（S. Larisch和H.虎头，未发表的数据）。在活细胞中，ARTS定位于与Bcl-2 13结合的线粒体外膜（MOM）。诱导细胞凋亡后，ARTS易位至细胞质并直接结合并拮抗XIAP。这会导致MOMP上游XIAP的非致死活性半胱天冬酶的抑制和释放。反过来，这些半胱氨酸蛋白酶可切割底物，诸如投标，导致MOMP和细胞凋亡的执行13，34。ARTS通过促进XIAP的泛素化来刺激XIAP的降解13，35。此外，ARTS还可以作为支架使XIAP与Bcl-2紧密结合并促进其降解34。因此，ARTS充当XIAP和MOMP上游Bcl-2的双重拮抗剂。重要的是，ARTS充当XIAP的生理拮抗剂。Sept4 / ARTS缺陷小鼠表达XIAP蛋白水平升高，表明ARTS限制了体内XIAP水平。此外，敲除的在HeLa细胞中，并从Sept4肠上皮细胞ARTS / ARTS敲除（KO）小鼠免受凋亡性细胞死亡13，36。此外，9月4日/ ARTS缺陷小鼠具有增加的造血干细胞和祖细胞（HSPC的）和毛囊干细胞是抗凋亡的数字31，37。此外，在Sept4 / ARTS / XIAP double-KO小鼠中，XIAP功能的丧失抑制了Sept4 / ARTS无效的HSPC对细胞凋亡和细胞自主淋巴增殖的抵抗力31。总的来说，这些结果证明了ARTS通过其作为特定的XIAP拮抗剂的作用，在调节细胞凋亡和作为体内的肿瘤抑制物方面具有重要的生理作用。
ARTS不同于通过其独特的结合XIAP模式所有其它已知的IAP拮抗剂14，38。此外，ARTS特异性诱导XIAP和Bcl-2的降解13，28，34。显著，既XIAP和Bcl-2有助于肿瘤发生和过表达已成为用于开发抗癌治疗剂主要目标39，40，41，42。IAP拮抗剂最初设计基于N-末端肽序列AVPI在发现果蝇收割机/已隐藏和SMAC / DIABLO 5，43，44。Smac模拟物（SMS）以高亲和力与cIAPs和较低的亲和力与XIAP，它们可以降解cIAPs，但不是XIAP绑定38，45，46，47，48。在这里，我们描述了第一个模拟ARTS的小分子A4的鉴定。该化合物直接结合XIAP-BIR3中ARTS的唯一结合位点，但不结合cIAP1。A4促进蛋白酶体介导的XIAP和Bcl-2降解，胱天蛋白酶激活和凋亡。XIAP的过表达抑制了A4诱导的细胞死亡，这与XIAP是A4的主要靶标的想法一致。
HeAT（人类宫颈癌细胞），A375（人类恶性黑色素瘤细胞），Jurkat（人类白血病T细胞）和HEK-293-T（人类胚胎肾细胞）购自ATCC。
DKO BAK / BAX MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）由美国田纳西州孟菲斯市圣裘德市的Joe Opferman博士和以色列特拉维夫大学的Reuven Stein博士提供。
MEF细胞，HeLa，A375和HEK-293-T细胞在完全DMEM培养基（1％丙酮酸钠，1％1-谷氨酸，1％Pen-strep和10％胎牛/牛犊血清）中生长。
Jurkat和T47D（人类转移性导管乳腺癌细胞）细胞在完全RPMI培养基（1％丙酮酸钠，1％1-谷氨酸，1％Pen-strep和10％热灭活的胎牛/牛血清）中生长。
184A1（正常人乳腺上皮细胞）在DMEM / F12完全培养基（1％丙酮酸钠，1％1-谷氨酸，1％Pen-strep，5％供体马血清，100 ng / ml霍乱毒素，20 ng / ml ）中生长毫升表皮生长因子，0.5毫克/毫升氢化可的松，10毫克/毫升胰岛素）。
检查所有细胞系的支原体，并保持在第10代下。
星形孢菌素（STS）购自Fermentek（目录号62996-74-1.5），Birinapant购自Biovision（目录号5297）。
购买了A4小分子（粉末状MW 440.92 g / mol，SMILES：COC（= O）c1 [nH] c2ccc（Cl）cc2c1NC（= O）C [NH +] 1CC [NH +]（Cc2ccccc2）CC1）购自eMolecules，Inc.，eMolecule ID：4424446（供应商InterBioScreen STOCK2S-13772）。将A4溶解在二甲亚砜（DMSO）中，制成30–50 mM的储备液，然后以300× g的密度进行大量移液和离心 持续30 s。接着，将A4悬浮液在37℃浴中温育1分钟，通过移液充分混合并再次离心。将A4储备溶液等分在Eppendorf管中（每管7-10 µl），并保存在-80°C下。等分试样仅使用一次以避免化合物的冻结和融化。在实验中使用之前，将A4等分试样解冻，旋转（设置相同）并通过在Eppendorf管的下部轻轻敲击进行混合。接下来，将化合物溶液在15 ml锥形管中的温暖的完全培养基中以1：100的比例稀释至0.3–0.5 mM的浓度，并通过向上和向下倾斜封闭的小瓶（不要涡旋）将其充分混合。然后将稀释的A4溶液再次稀释至所需的最终浓度（10–30 µM），然后添加到细胞中。
ARTS-小鼠单克隆抗ARTS抗体，以1：1000的稀释度（Sigma A4471）特异性靶向ARTS的独特c端序列（但不靶向其他Septin 4剪接变体）。
XIAP-稀释度为1：1000的小鼠单克隆抗XIAP抗体（BD目录号610717）。或以1：2000稀释度的兔多克隆抗XIAP（sc-11426）。
Bcl-2-小鼠单克隆抗Bcl-2抗体（BD目录号610538），稀释度为1：1000。或由Proteintech（26593-1-AP）或DB Biotech（P22-A目录号DB 132-0.05）制备的兔多克隆抗Bcl-2抗体，两者均以1：5000稀释。
肌动蛋白-小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体（ImmunoTM目录号08691002），稀释度为1：50,000。
裂解的PARP（cPARP）-兔多克隆抗PARP抗体（Abcam目录号ab4830），稀释度为1：1000。
泛素-小鼠单克隆抗泛素（Santa Cruz sc-8017），稀释度为1：2000。
Myc-稀释度为1：1000的小鼠抗Myc单克隆抗体（Cell Signaling目录号2276s）。
微管蛋白—单克隆大鼠抗微管蛋白（Abcam目录号YOL1 / 34），稀释度为1：6000。
GAPDH-稀释度为1：2000的多克隆山羊抗GAPDH（Abcam目录号ab9483）。
BAX-稀释度为1：6000的兔多克隆抗Bax（Proteintech 50599-2-Ig）。
cIAP1-山羊多克隆抗cIAP1 / HIAP-2抗体（R＆D目录号AF8181），稀释度为1：1000。
切割的caspase-3-为了进行免疫荧光分析，我们使用了1：400稀释的纯化的兔抗活性caspase-3抗体克隆C92-605（BD目录号559565）。
裂解的caspase-3-为了通过Western blot检测裂解的caspase-3，我们使用了兔单克隆抗体抗活性Caspase-3 Asp175（BD cat＃cs9664），稀释度为1：1000。
Oncolead Ltd.筛选了跨越18个人体组织的94种不同癌细胞系。该公司使用的平台与一种NIH相同，NCI-60用于评估化合物对多种肿瘤细胞系生存力的影响。简而言之，用一系列六种化合物稀释液处理细胞72小时（每天补充化合物）。72小时后，将细胞固定（将活细胞附着在平板上），然后洗涤以去除死亡和垂死的细胞。然后用染料（磺胺丁丹B）对细胞染色，该染料将所有蛋白质染成紫色，用酶标仪测量，可以定量活细胞。将用化合物处理的细胞数与用DMSO（溶剂）处理的细胞数进行比较。抑制浓度（IC）值的计算方法是：处理72小时后的细胞数除以DMSO（C）处理72小时后的细胞数。IC50是根据剂量-反应图计算的值，该值是IC降低50％的化合物浓度。
根据制造商的说明，使用XTT细胞增殖试剂盒（Biological Industries目录号20-300-1000）和Presto蓝细胞活力试剂（Invitrogen目录号A13262）。将每孔六千至10,000个细胞接种到96孔透明平底TC处理的培养微孔板（＃353072）中，并生长24小时。与XTT或Presto blue试剂在37°C下孵育2小时后，添加A4处理24小时。使用BioTeK ELISA synergyHT酶标仪测量颜色的强度（对于XTT 450 nm激发和630 nm发射，对于Presto蓝测定法560 nm激发和590 nm发射）。使用这两种生存力分析，我们通过将处理过的细胞的结果标准化为用DMSO处理过的细胞（DMSO倍数变化）来确定细胞的生存力。点图由独立的实验组成，
每孔一百万个细胞接种在6孔板中。24小时后，将细胞用20μMA4处理3、6和24小时。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）收集细胞，并再次用PBS洗涤。将细胞以500× g离心 10分钟。然后根据制造商的规程，通过Caspase-9荧光测定试剂盒（BioVision目录号K118），在这些样品中测定了裂解的caspase-9活性。通过ELISA分光光度计（400nm激发和505nm发射）测量荧光水平。通过DMSO对照的绝对值（OD）将结果标准化以评估caspase-9活性。
在96孔（8000个细胞/孔）中培养细胞，并用A4（20μM）处理。在37°C下孵育过夜后，根据制造商的说明将5％CO 2培养箱Caspase-Glo®试剂（Promega，美国）添加到每个孔中，并将板在室温下孵育1 h。使用无限读板的M200PRO TECAN发光计测量每个样品的发光。
将Jurkat细胞用A4加或减Caspase抑制剂Q-VD-Oph（ab141421）处理24 h（1-10 µM），并根据制造商的说明书（Novus目录号NBP2-29373）进行膜联蛋白V / PI染色。在添加A4之前30分钟添加Q-VD-Oph。使用FACSCanto II（BD）进行流式细胞术，并使用FlowJo软件（Treestar）分析数据。
为了进行免疫荧光和共聚焦显微镜检查，将细胞在盖玻片（Marienfeld，Lauda-Konigshofen，德国）上生长，并用A4处理6小时或24小时。接下来，将细胞用PBS洗涤3次，并在室温（RT）下用4％多聚甲醛固定15分钟，然后再洗涤3次。用0.1％Triton X-100在50 mM Tris pH 7.2中进行透化3分钟，然后将细胞用PBS洗涤并在封闭缓冲液（20％正常山羊血清和1％BSA的PBS中）中于30℃孵育30分钟。 RT。然后将细胞与在含1％BSA的PBS中稀释的裂解的caspase-3抗体（BD cat＃559565以1：400）孵育1小时，然后在室温下洗涤3次。然后将盖玻片与二抗在室温下孵育1小时。用PBS清洗后，使用带有4'，6-diamidino-2-phenylindole的VECTASHIELD固定介质固定它们。用尼康A1R共聚焦显微镜拍摄免疫荧光图像。
将细胞与20 µM MG-132（APExBIO cat＃A2585）或Bortezomib（APExBIO cat＃A2614）预孵育6小时。在与蛋白酶体抑制剂一起孵育的最后2小时内，添加了20微摩尔的A4。
我们已经在XIAP-BIR3中ARTS的独特结合位点突变了两个关键氨基酸。使用GFP-WT-XIAP表达构建体，我们突变了氨基酸S278A和N280A（GFP-DM-XIAP）。作为对照，我们使用了GFP-WT-XIAP和GFP空载体。详细的说明在补充材料和方法中。
对于瞬时转染，根据制造商的说明使用以下试剂：Transit-X2（Mirus），jetPEI（Polyplus）和PolyJet（SignaGen）。
细胞在全细胞提取物缓冲液[25mM的HEPES，pH值7.7，0.3M NaCl的，1.5毫摩尔MgCl裂解2，0.2mM的EDTA，0.1％的Triton X-100，100微克/毫升苯甲磺酰氟（PMSF）和蛋白酶抑制剂混合物（Roche，1：100稀释度）]，放在冰上30分钟（15分钟后涡旋一次）。30分钟后，将样品以13,000× g离心 在4°C下放置10分钟。使用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩试剂盒测量含有总蛋白质的上清液的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（12％）分离出40至100 µg的蛋白质，然后转移至PVDF膜上。在室温下，用添加有0.05％Tween-20（PBS-T）的PBS中的5％（w / v）脱脂干燥脱脂奶粉封闭膜1小时。接下来，将一抗在4°C过夜添加或在室温下添加2 h。然后将膜与二抗在室温下孵育1小时，并分别用PBS-T洗涤3次，每次15分钟。
用GFP-空载体，GFP-WT-XIAP或GFP-DM-XIAP转染HEK-293-T细胞，并使其表达构建体24小时。所有样品均用6-Myc-ARTS（Myc标签位于N'末端）共转染。接下来，收获细胞并用含有蛋白酶抑制剂混合物（Complete，Roche）和100μg/ ml的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（Tris-HCl pH 7.5 50 mM，NaCl 150 mM，NP-40（Igepal）0.3％）裂解。毫升PMSF。抗体以每1000 µg蛋白5 µg的浓度使用，并在4°C旋转过夜孵育。第二天，在4°C下旋转4 h，加入与蛋白A / G（Santa Cruz Biotechnology）偶联的琼脂糖珠。将样品在4°C下离心5分钟，然后用RIPA缓冲液洗涤5次。
所有细胞均用Ub-HA（用HA泛素标记）构建体瞬时转染，并用蛋白酶体抑制剂（硼替佐米或MG-132，以20 µM的浓度处理6小时）。另外，对于Bcl-2体内泛素化测定，将细胞用Ub-HA和GFP-载体/ Bcl-2-GFP共转染（GFP标签附着于Bcl-2的N'末端）。蛋白酶体抑制剂孵育4小时后，将A4（20μM）或DMSO加至培养基中2小时。经过6小时的Bortezomib / MG-132和2小时的A4处理后，收获细胞并使用含有蛋白酶的RIPA缓冲液（Tris-HCl pH 7.5 50 mM，NaCl 150 mM，NP-40（Igepal）0.3％）裂解。抑制剂混合物（Complete，Roche），100μg/ ml PMSF，5 mM N-乙基马来酰亚胺和5 mM碘乙酰胺以保持泛素链。离心15分钟后（10,000× g，4℃），将上清液转移到干净的Eppendorf管中。使用抗XIAP抗体（sc-11426或BD＃610717）（下拉内源性XIAP）或抗Bcl-2（Proteintech＃26593-1-AP或DB Biotech P22-A cat＃DB 132）进行免疫沉淀的泛素化测定-0.05）（将过表达的Bcl-2下拉）如上所述，每1000 µg蛋白质使用5 µg抗体。使用抗Ub Ab（Santa Cruz sc-8017）检测到Bcl-2或XIAP的多泛素化形式。
SKOV-3救援测定法是根据Gaither等人的方法进行的。49。具体而言，对于每种处理，将SKOV-3细胞以一式四份接种在96孔板上。24小时后，在存在或不存在A4（2.5和5μM）的情况下，用Birinapant（1 µM）处理细胞24 h。然后将细胞用100μl的PBS洗涤一次。接下来，将100μl的Presto blue试剂（在PBS中按1：5稀释）添加到每个孔中，并将细胞在37°C下孵育2小时。温育2小时后，使用荧光光谱仪（发射560nm，激发590nm）测量吸光度。
用单独的A4（10 µM），单独的Birinapant（1 µM）和两种化合物的组合将SKOV-3细胞处理24小时。DMSO用作阴性对照。根据制造商的规程，使用ELISA Max标准套装（Cat＃430203 BioLegend）测量上清液中的肿瘤坏死因子-α（TNFα）水平。
从约300万个分子中选择30万个可商购的分子，并使用BioSolveIT的LeadIT和SeeSAR软件进行筛选。通过HYDE评分功能50评估，该计算筛选出的化合物具有预测的亲和力在微摩尔至纳摩尔范围内的化合物。确定表现出最佳对接分数的100个排名最高的分子。通过分析来自PDB的XIAP-SMAC晶体结构和我们的数据，可以推断出XIAP-BIR3中ARTS的独特结合位点，如Bornstein等人所述。14。补充材料和方法中提供了详细说明。
使用XIAP-BIR3 14中唯一ARTS结合位点的位点映射信息，我们使用Glide 51进入3HL5.PDB晶体结构52，进行了初步的虚拟筛选。使用标准方案，将如上所述鉴定出的化合物在有活性位点和无活性位点的情况下都停放在模型中。
使用重组ARTS，XIAP，Bcl-2和cIAP1蛋白，由德国的WuXi AppTech公司的CreLux进行了微尺度热泳（MST）结合测定。具体地，为了用未标记的XIAP进行实验，将荧光标记（NT650）共价附于蛋白质（马来酰亚胺偶联）。标记是在含有50 mM HEPES pH 7.0、150 mM NaCl和0.005％Tween-20的缓冲液中进行的。补充材料和方法中提供了详细说明。
下载了EMBL-EBI Expression Atlas储存库中所有细胞系的蛋白质组学数据（https://www.ebi.ac.uk/gxa/home）。这包括在总共13个数据集中，其中10个包含了我们93个细胞系中所代表的细胞系。从93个细胞系中检索了40个蛋白质组学数据。从每个数据集中，收集了四个基因的数据：ACTB，GAPDH，XIAP和Bcl-2。前两个用于XIAP和Bcl-2表达水平的标准化。将所有数据进行log 10转化，并计算XIAP或Bcl-2与任一标准化基因之间的比率。使用Wilcoxon秩和检验比较不同类型肿瘤细胞之间的IC50值（μM）。对几对癌症类型进行了测试（补充表1）。
为了检查A4 IC50与XIAP或Bcl-2表达之间的相关性，根据细胞系的来源组织/器官对细胞系进行分类，并对至少由四种不同细胞系代表的组织/器官进行分析（补充表1）。和2）。考虑到这些指定基因的此类值可能存在偏差，我们进一步排除了> 1.0的值（表达比）。实际上，在这些样品中，GAPDH或肌动蛋白的表达水平比其他样品低2–3个数量级。然后，我们使用Pearson和Spearman相关性计算了XIAP表达比率之间的相关性。使用R包“ stats”中的函数cor.test计算相关性并检验其显着性。相关性被认为对p ＜0.05。
所有图形均使用PRISM软件制作。使用PRISM的单向方差分析评估重要性。p <0.05被认为是显着的。
既SMAC和ARTS结合BIR3结构域在XIAP 14，38，53。使用ARTS和SMAC的站点映射信息，我们使用Glide 54 Schrodinger 55进入3HL5.PDB晶体结构52进行了计算机屏幕筛选。在计算屏幕中发现的所有XIAP配体都结合到SMAC位点（“ SMAC结合袋”，图1a），而不是ARTS结合位点（图1b）。图1b说明了XIAP-BIR3中ARTS和SMAC的结合口袋的独特性质。为了进一步证明XIAP中的BIR3结构域包含ARTS的独特结合位点，我们生成了XIAP的双突变表达构建体（DM XIAP），其中两个氨基酸被丙氨酸替代（S278A和N280A）。免疫沉淀测定表明，与野生型（WT）相比，ARTS结合此突变型XIAP的能力大大降低（图1c）。这证实了XIAP在其BIR3结构域中包含ARTS的独特结合位点。
a，b XIAP-BIR3中ARTS的结合位点不同于SMAC / Diablo。a所有以前报道过，XIAP配体与XIAP-BIR3中相同的，特征明确的“ SMAC域”结合（“ SMAC结合袋”）。BIR3结构域的可公开获得的晶体结构的叠加预测，所有先前描述的配体均仅与SMAC结构域结合。b XIAP-BIR3中的ARTS和SMAC / Diablo绑定袋不重叠。ARTS和SMAC装订袋的示意图。左侧显示了XIAP-BIR3，上面带有虚拟化合物（青色）以说明口袋的形状。ARTS结合位点靠近SMAC结合位点，但两个位点之间没有重叠。C将HEK-293-T细胞与6-Myc-ARTS和GFP-WT-XIAP或6-Myc-ARTS与GFP-DM-XIAP-S278A-N280A共转染。使用抗Myc抗体将ARTS下拉，然后用抗XIAP抗体进行免疫印迹。结果表明，与6-Myc-ARTS与GFP-WT-XIAP的结合相比，GFP-DM-XIAP-S278A-N280A与6-Myc-ARTS的结合减少（n = 3）。d – g基于结构的计算屏幕识别化合物A4是结合XIAP-BIR3中ARTS口袋的强力候选者。d XIAP的BIR3结构域中ARTS结合位点的表面（灰色）用前100个配体的最佳最佳拟合结合位置建模（紫色，BioSolveIT Ltd）。Ë，˚FA4与XIAP-BIR3的相互作用。e A4与XIAP-BIR3的2D相互作用。A 4和主链羰基之间的氢键用虚线表示，疏水接触用绿线表示，相互作用的氨基酸用绿色标记。f化合物A4（以粗米色显示）与ARTS结合位点的结合方式。A4每个原子周围的球表示对结合亲和力的单独贡献：绿色表示正和红色的负贡献，没有球表示对结合没有贡献。氢键以绿色虚线表示。该模型预测A4与T271的主干相互作用，但是另一种可能性是A4与T274的主干相互作用，而不是T271。GA4以球棒模型显示。XIAP-BIR3中不同的ARTS结合位点的表面以灰色显示，特定的氨基酸以蓝色的棒表示。预期A4与T271之间的蛋白质主链（绿色虚线）和F270之间的哌嗪环的氮以及其他氮与酰胺氮形成三个H键相互作用。
以前的努力全部集中在化合物结合SMAC口袋53，56，57。为了鉴定特异性结合ARTS结合口袋的化合物，进行了基于结构的计算对接筛选。100个排名靠前的对接化合物的叠加显示它们覆盖了ARTS特异性结合位点表面内的所有不同子口袋（图1d）。这表明通过筛选方案彻底探索了XIAP-BIR3的结合表面。化合物A4是排名最高的分子之一，预计将与不同ARTS结合位点的蛋白质骨架形成三个H键相互作用：在T271与哌嗪环的氮之间以及F270与另一个氮与酰胺之间氮气（图1e）。但是，A4也可能与T274的骨架相互作用而不是与T271相互作用（图1f，g）。有趣的是，对接图揭示了异常弯曲的对接位置，因此配体转离SMAC结合位点。这使吲哚环暴露于表面，表明它可能是ARTS可及的表面（图1g）。）。A4是甲基5-氯-3-[[2- [4-（苯基甲基）哌嗪-1-基]乙酰基]氨基] -1 H-吲哚-2-羧基。它与Lipininski的5条规则非常吻合，因此具有潜在的未来药物开发前景。
我们首先在A375，表达高水平XIAP的黑素瘤细胞系和表达高水平Bcl-2的Jurkat T淋巴瘤细胞系上测试了我们排名最高的分子的作用。使用PrestoBlue™细胞活力试剂和XTT细胞活力试剂盒，该初始功能筛选测试了100种得分最高的化合物中76种的死亡诱导作用。图2a显示了与促凋亡试剂STS相比，其中某些化合物的代表性结果。从这些屏幕中，我们确定A4是有效的细胞杀手（图2aI，II和补充图1a，b）。A4还诱导HeLa，Jurkat和T47D人癌细胞的细胞死亡（图2bII，2cI，II，2bI，2cI和5cII）。值得注意的是，用A4处理这些细胞会导致裂解的caspase-3水平升高，裂解的caspase-3和-7活性升高（分别见图3aI–III，3bI和图3c）。此外，在用A4处理后，在A375细胞中检测到了裂解的caspase-9的水平和活性增加（分别为图3bII和3d），这与细胞数量的强烈减少有关（补充图1c，d）。最后，使用Annexin V / PI FACS分析和cPARP作为细胞凋亡标记，我们发现半胱天冬酶抑制剂Q-VD-Oph可以阻断A4诱导的细胞凋亡（图3e–g）。这些结果表明，像ARTS一样，A4通过激活caspase-3和-9促进细胞凋亡。
a点图代表Jurkat（I）和A375细胞（II）在计算屏幕中用不同化合物处理24小时后的细胞活力。用不同浓度的STS诱导凋亡（持续3小时）作为阳性对照（n = 3）。b A4（24 h）对Jurkat（n = 5; I）和HeLa细胞（n = 3; II）细胞活力的剂量反应。点代表每个独立实验的一式三份的平均值；条形代表平均值。误差线；SEM，单向方差分析，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。CHeLa和Jurkat细胞在A4处理下分别在HeLa细胞中分别发生4、24 h和Jurkat细胞24 h凋亡的代表性明场显微图像（I）。放大倍数×10，比例尺= 50 µm。（II）HeLa细胞数量的量化（上图）。计算来自五个不同图像（帧）的总细胞数的平均值，并将其标准化为DMSO处理的细胞（n = 4）。点代表每个独立实验的平均5帧；酒吧; SEM，单向方差分析，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。
a（I）用A4处理6和24小时后裂解的caspase-3（cCasp-3，绿色）的免疫荧光图像。放大倍数×40，比例尺= 50 µm。（II，III）定量化为经DMSO处理的细胞（n = 3）的激活的胱天蛋白酶-3（I）染色阳性的细胞百分比。点代表每个独立实验的平均5帧；酒吧; SEM，单向方差分析，** p <0.01，*** p <0.001。b（I，II）在Jurkat细胞（I）或A375细胞中对XIAP和裂解的caspase-3（cCasp-3）（c）或裂解的caspase-9（cCasp-9）表达的XIAP进行代表性蛋白质印迹（WB）分析（II）经A4处理（n = 3）。C用A4处理的HeLa细胞中的Caspase-3 / 7活性。数据针对DMSO处理的细胞进行标准化（n = 3）。d cCasp-9活性在A4处理过的A375细胞中测量（n = 3）。点代表每个独立实验的一式三份的平均值；酒吧; SEM，单向方差分析，** p <0.01。e – g存在或不存在Q-VD-Oph的A4处理过的Jurkat细胞。e来自对膜联蛋白V / PI染色的Jurkat细胞进行FACS分析的代表性点图。f在不存在或存在Q-VD-Oph（ON）的情况下，用A4处理后对膜联蛋白V染色呈阳性而对PI染色呈阴性的Jurkat细胞的定量（n = 4）。点代表一式三份实验的平均值。酒吧; SEM，单向方差分析，* p <0.05，** p <0.01。g在不存在或存在Q-VD-Oph的A4处理的Jurkat细胞中，表达cCasp-9和裂解的PARP（cPARP）的代表性WB（n = 3）。
内源蛋白文理直接结合XIAP和Bcl-2 28，34。同样，使用MST分析，我们发现A4对重组XIAP具有相对较高的结合亲和力（K d = 348 nM），但与cIAP1没有结合（图4a）。，而数据未显示，CreLux）。为了检查A4是否可以模拟ARTS的功能，我们测试了A4是否可以刺激XIAP和Bcl-2的降解，这是将ARTS与其他已知促凋亡蛋白区分开的功能。我们测试了一些其他顶级化合物在多种细胞系中降低XIAP和Bcl-2内源性水平的能力。通过减少这两种靶蛋白，A4表现出明显的效果，并被选择用于进一步表征（未显示其他化合物的数据）。A4处理的HeLa细胞中XIAP水平的剂量依赖性降低与凋亡增加有关（图4b）。在用A4治疗后2小时，XIAP和Bcl-2水平降低（图4c，d）。该作用是特异性的，因为在此时间点未观察到cIAP1降低（图4d）。接下来，我们发现向A4处理的细胞中添加两种不同的蛋白酶体抑制剂（MG-132和Bortezomib）分别恢复了A375和HeLa细胞中XIAP和Bcl-2的水平（图4e，f）。最后，使用体内泛素化试验，我们发现A4处理的HEK-293-T中Bcl-2和XIAP的多泛素化形式的积累显着增加（图4g，h）。这表明A4诱导的XIAP和Bcl-2蛋白水平的降低是通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的降解而发生的。由于Bcl-2通过结合和中和Bax的促凋亡功能而起作用，并且由于A4降低了Bcl-2的水平，因此我们还检查了Bax的水平是否影响A4诱导的凋亡。为此，我们用A4处理了Bax / Bax DKO MEF，并将它们与WT MEF进行了比较。我们观察到与WT MEF相比，Bax / Bax DKO MEF中的caspase-9活性和cPARP显着降低（补充图2a）。这表明A4诱导的杀伤受Bax影响。我们得出的结论是，A4模仿ARTS的功能，涉及UPS介导的XIAP和Bcl-2降解，caspase-3和-9的激活以及细胞凋亡的诱导。
AST与荧光标记的重组XIAP结合的 MST（微型热泳）分析显示K d为348±228 nM 的直接结合。A4没有与cIAP1结合。b A4引起XIAP的剂量依赖性降低，这与凋亡增加有关。WB分析显示凋亡标记物裂解的PARP（cPARP）呈剂量依赖性，这与A4处理24 h的HeLa细胞中XIAP含量呈剂量依赖性降低相关（n = 3）。c WB分析显示，用A4处理后，A375细胞中Bcl-2和XIAP水平降低（n = 3）。d用A4处理2 h（n = 3）的HeLa细胞中XIAP，Bcl-2 cIAP1和cPARP表达水平的代表性WB分析。È代表WB分析XIAP和Bcl-2的处理后与A4的表达用于在A375细胞（有或无蛋白酶体抑制剂硼替佐米的存在2小时Ñ = 3）。f在不存在或存在蛋白酶体抑制剂MG-132的HeLa细胞中，用A4处理2小时后XIAP和Bcl-2表达的代表性WB分析（n = 3）。g，h在用A4处理后，Bcl-2和XIAP的体内泛素化测定。用Ub-HA瞬时转染HEK-293-T细胞（g（h））和GFP-Bcl-2或GFP-vector作为对照（g）。将细胞与MG-132预孵育6小时，并在最后2小时添加A4。将Bcl-2或内源性XIAP蛋白分别用抗Bcl-2（g）或抗XIAP（h）下拉，然后用抗泛素抗体进行免疫印迹（n = 3）。
为了确定杀灭A4对各种类型癌症的特异性，测试了代表18种不同类型癌症的94种癌细胞系。确定用A4处理的每个细胞系的IC 50值（Oncolead Ltd）。对A4杀伤最敏感的癌症是血液学原因（8/12个不同的细胞系），黑素瘤（3/5个细胞系），胰腺癌和4/7肺癌。重要的是，代表健康的正常细胞的外周血单核细胞（PBMC）和正常的人上皮乳腺细胞184A1未被A4杀死（图5a，补充表1和图5cI）， 分别）。为了探讨XIAP和Bcl-2蛋白的水平是否影响对A4的敏感性，我们分析了可用的网络蛋白质组并寻找相关性。尽管在大多数蛋白质组（32个蛋白质组中的28个）中发现了有关XIAP表达水平的数据，但仅在少数蛋白质（32个蛋白质组中的9个）中检测到Bcl-2表达数据（数据未显示）。在乳腺癌，卵巢癌和肾癌中，XIAP表达水平（与肌动蛋白的比率，GAPDH）与对A4的敏感性（IC50，μM）之间存在显着相关性（图5bI，II和补充表1和2）。XIAP水平高的癌细胞系对A4的杀伤作用特别敏感（图5bI，II和补充表1和2）。这些结果支持了A4是一种特定的XIAP拮抗剂的观点，并且表明A4具有治疗过表达XIAP的癌症的潜力。为了进一步确认A4作为XIAP的特异性拮抗剂，我们进行了SKOV-3拯救试验49。SKOV-3卵巢癌细胞对SMs高度敏感49。SM的通过拮抗cIAPs，导致细胞死亡时，由TNFα生产的XIAP依赖性增加补充的事件采取行动47，48，58。在SKOV-3细胞中，XIAP是产生TNFα所必需的，TNFAP可以将cIAP募集到复合物中，该复合物通过外在途径激活caspase-8和细胞凋亡（图6a）49。敲除SKOV-3细胞中的XIAP可抵抗SMs 49。与cIAPs相比，我们利用这种测定方法来研究A4对XIAP的特异性。用1μMSM Birinapant处理24小时可杀死约50％的SKOV-3细胞。重要的是，向Birinapant处理的细胞中添加A4显着阻断了Birinapant诱导的细胞凋亡（图6b）。此外，Birinapant治疗导致TNFα分泌到SKOV-3细胞的培养基中，并且A4的添加显着减少了分泌的TNFα（图6c）。接下来，我们发现XIAP的过表达消除了A4诱导的细胞死亡（图6dI，II）。总体而言，这些结果表明A4通过特异性拮抗XIAP诱导细胞凋亡来模拟ARTS的功能。根据我们的结果，我们提出了A4作用机理的两个替代模型。第一个模型提出，与XIAP结合后，A4可能会通过促进RING基序与泛素结合（E2）酶的相互作用，诱导变构构象变化，从而导致XIAP E3连接酶活性的激活。在该模型中，A4导致XIAP介导的泛素化水平普遍升高，并且XIAP和Bcl-2均降解。一种替代模型是，A4与ARTS一样，以低亲和力或短时间（“命中并运行”）直接结合XIAP和Bcl-2。这招募XIAP与Bcl-2紧密接近，并刺激泛素化和蛋白酶体介导的复合物降解。在这两种模型中，癌细胞“ XIAP”和“ Bcl-2”水平的降低“归因于”这些蛋白的高水平会引发细胞凋亡（图2。6e）。
用A4处理的94个肿瘤细胞系（NCI-60扩展组）的 IC50值（μM）。使用六种浓度的A4来计算每个细胞系的IC50值。观察到A4对各种癌细胞系的不同细胞死亡作用。正常的PBMC（外周血单个核细胞）对A4杀伤具有抵抗力。b（I）散点图，表示在蛋白质组中标准化为肌动蛋白水平的XIAP的表达。在乳腺癌，卵巢癌和肾癌细胞系中，发现高水平的XIAP与被A4杀死的敏感性之间存在显着相关性。虚线表示线性回归。阴影表示回归的95％置信区。（II）在将XIAP表达水平归一化为GAPDH或肌动蛋白之后，计算了Pearson和Spearman相关性并测试了显着性。有效码：“ p <0.05”；** p <0.01；*** p ＜0.001。c（I，II）在184A1正常人乳腺细胞（n = 4）和T47D人导管乳腺癌细胞（n ＝ 6）用不同浓度的A4处理24小时。点代表一式三份实验的平均值。酒吧; SEM，单向方差分析，**** p <0.0001。
用于评估A4对XIAP拮抗作用的特异性的SKOV-3分析的图解。SKOV-3细胞可被SMAC模拟物（如Birinapant）有效杀死。Birinapant对cIAP1的抑制作用通过涉及TNFα和NF-κB的自分泌反馈回路导致凋亡。在该系统中，Birinapant诱导的杀灭需要XIAP功能49。b在不存在或存在A4的情况下，用Birinapant（1μM）处理的SKOV-3细胞的细胞活力（n = 6）。点代表一式三份实验的平均值。酒吧; SEM，单向方差分析，**** p <0.0001。C用ELISA测定的DMSO，A4，Birinapant（1μM）和Birinapant与A4组合处理后的SKOV-3细胞上清液中的TNFα水平（pg / ml）（n = 3）。点代表一式三份实验的平均值。酒吧; SEM，单向方差分析，**** p <0.0001。d（I）XIAP的过表达抑制A4诱导的细胞凋亡。用空载体或XIAP转染HeLa细胞，并用A4处理24h。使用Presto blue试剂测定细胞活力。将在用XIAP转染的A4处理的细胞中测得的细胞活力标准化为空载体转染的细胞（倍数变化）。XIAP的过表达导致A4诱导的细胞死亡的抑制（变化1.2倍）（n = 4）。点代表每个独立实验的一式三份的平均值。酒吧; SEM，单向方差分析，** p <0.01。（II）用A4处理后在HeLa细胞和过表达XIAP的HeLa细胞中XIAP和cPARP表达的代表性WB分析（n = 3）。e A4诱导凋亡机制的拟议模型。我们考虑两个主要型号为A4的作用机制（一）。与XIAP结合后，A4可能会促进RING基序与泛素结合（E2）酶的相互作用，从而导致变构构象变化，从而导致XIAP E3连接酶活性的激活。在此模型中，A4会导致XIAP介导的泛素化水平普遍增加，从而解释XIAP和Bcl-2的蛋白酶体降解增加。b在替代模型中，A4以低亲和力或短时间（“命中并运行”）直接结合XIAP和Bcl-2。这招募XIAP与Bcl-2紧密接近，并刺激其泛素化和蛋白酶体介导的降解。在这两种模型选择中，“相信”这些蛋白质的高水平降低癌细胞中XIAP和Bcl-2的水平将迫使细胞凋亡启动。我们建议，A4代表一类新型的ARTS模拟化合物，通过其目标蛋白的双重降解起作用。
我们确定了一种小分子A4，其至少可以模拟促凋亡ARTS蛋白的某些特性。A4为甲基5-氯-3-[[2- [4-（苯基甲基）哌嗪-1-基]乙酰基]氨基] -1 H-吲哚-2-羧基，具有相对简单的化学结构，符合Lipininski定律五分之一，使其非常适合将来可能的化学修饰。尽管尺寸很小，但A4概括了先前描述的ARTS的许多特定生化和功能特性。首先，像ARTS一样，A4绑定到XIAP-BIR3，但不绑定cIAP1。第二，A4，像ARTS，可以启动XIAP和Bcl-2的泛素化和降解，导致胱天蛋白酶活化和细胞凋亡（图4克，H，3A-G ）13，34。第三，A4特异性拮抗XIAP的功能，而不是cIAP1，如抑制A4在过表达XIAP的细胞中的凋亡作用（图6dI–II，1c）以及其抑制SM诱导的细胞的能力所证实。在SKOV-3试验中死亡（图6a–c）。总的来说，这些观察结果支持A4是小分子ARTS模拟物的结论。通过对XIAP-BIR3中的ARTS结合表位表现出最高的对接亲和力来鉴定A4，这与SMAC的对接亲和力不同（图1b，d）14。这与目前所有与XIAP的SMAC结合位点结合的XIAP配体形成了鲜明的对比（图1a））。这些发现具有重要意义，表明XIAP中的ARTS结合位点是“可吸收的”，而A4作为一种独特的抗癌药物，有望在未来的发展中发挥作用。
两个主抗凋亡蛋白，XIAP和Bcl-2的双下调，已报道引起增强的细胞凋亡，增加的敏感性对化疗和能够克服癌细胞的电阻59，60，61。据我们所知，A4是第一个可促进这两种重要的抗凋亡蛋白降解的化合物。
重要的是，表达高水平XIAP的癌细胞对A4杀伤特别敏感，而未观察到对非恶性PBMC（图5a，b和补充表1）和184A1正常人上皮性乳腺细胞的影响（图5b）。5cI）。这表明A4对癌细胞具有选择性活性。
Bcl-2的是，因为它在宽范围的癌症，这使得它们抗凋亡刺激和化疗剂中高度表达的癌症疗法的重要靶标18，21，23，62，63。一系列高亲和力，小分子Bcl-2的抑制剂，已经开发64，65，和用于BH3模拟物化合物和Bcl-2特异性抑制剂Venetoclax（ABT-199）已被批准的食品和药物管理局癌症治疗66，67，68，69，70。但是，它仍然对这些药物的效用延伸到其它类型的癌症的重要目标71，72。XIAP是用于癌症治疗的另一个有前途的药物靶标38，45，46，73。XIAP沉默可以使细胞对化学疗法和TRAIL受体激动剂敏感，并降低对化学疗法的抵抗力45。此外，XIAP可以与其他IAP的异聚复合物和调节稳定性cIAP1和cIAP2 74，75。有趣的是，靶向XIAP可以绕过Bcl-2介导的对TRAIL的抗性，并与TRAIL合作以在体外和体内抑制胰腺癌的生长76。总之，这些观察结果表明内在和外在凋亡途径之间的联系，特别是XIAP和Bcl-2在调节细胞死亡中的重叠作用。因为我们的结果表明A4既是XIAP又是Bcl-2的抑制剂，具有双重功能，所以它可能对多种过表达一种或两种蛋白的多种肿瘤有效。
当前开发的IAP拮抗剂绝大多数化合物（主要是SM的）通过结合并抑制XIAP而不是降解它充当38，73。类似地，BH3模拟物，如Venetoclax，通过结合并抑制Bcl-2的作用20，72。因此，A4的另一个吸引人的特点是它刺激了XIAP和Bcl-2的UPS介导的降解，而不是结合并抑制了其功能（图4b-h）。靶蛋白的降解已经成为一种有希望的治疗策略，特别是在癌症，和蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）目前正在开发的18，77，78。优势包括降低全身性药物浓度的潜力及其可能伴随的细胞毒性副作用，以及降低通常是抑制性蛋白质的靶蛋白表达增加的负荷的能力78。由于许多类型的癌症被“认为”是高水平的Bcl-2和/或XIAP，因此我们提出了能够促进其降解的药物将引起人们的极大兴趣。在这种情况下，我们建议A4在这方面可以有很大的希望。与PROTACS相似，A4促进UPS介导的底物降解（图4g，h），并且有可能利用此功能来开发具有显着改善的治疗能力的药物。
我们考虑了A4作用机理的两个主要模型：（A）与XIAP结合后，A4会诱导变构构象变化，从而导致XIAP E3连接酶活性的激活，可能是通过促进RING基序与泛素结合（E2 ）酶。在此模型中，A4引起XIAP定向泛素化的普遍增加，从而解释了蛋白酶体介导的XIAP和Bcl-2降解的增加。显示出对于SMS的动作上CIAP1涉及的构象变化的类似机构79，80。为了解释A4诱导的Bc-2降解，该模型建议A4刺激XIAP的一般E3连接酶活性，可能是通过诱导更有利于与E2泛素结合酶相互作用的构象来实现的（图6e）。 。此外，该模型假设Bcl-2相对于XIAP在多泛素化和降解方面存在重要的动力学差异：（A）Bcl-2在初始阶段是首选的底物，然后进行XIAP自缀合。（B）另一个模型是A4直接与XIAP和Bcl-2结合，从而将它们募集到紧密附近以刺激泛素化和蛋白酶体介导的降解（图6e））。在这两种模型中，癌细胞“ XIAP”和“ Bcl-2”的减少“归因于”这些蛋白质的高水平都会刺激细胞凋亡。
总体而言，我们在这里描述了模拟ARTS化合物的鉴定，该化合物代表了开发癌症疗法的一种新的有前途的方法。我们建议，A4代表一类新型的ARTS模拟化合物，可通过其目标蛋白的双重降解而发挥作用，并为独特的抗癌药物的潜在开发提供了有希望的起点。
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