甲bpss2242基因，编码在推定的短链脱氢酶/还原酶（SDR）鼻疽时，被认定其表达上调10倍B.杆菌的混合物在高盐浓度培养。先前的研究表明，BPSS2242在适应盐胁迫和发病机理中起着重要作用。然而，其生物学功能仍然未知。在本文中，我们报道了假单胞菌 BPSS2242的生化特性和功能表征。BPSS2242对二乙酰基和甲基乙二醛，有毒的亲电二羰基化合物表现出NADPH依赖性还原酶活性。确定了保守的催化三联体，发现其在催化和辅因子结合中起关键作用。Tyr162和Lys166参与NADPH结合，Lys166的突变会引起构象变化，从而改变蛋白质结构。BPSS2242在大肠杆菌中的过表达增加了细菌在暴露于二乙酰基和甲基乙二醛中的存活率。重要的是，假苹果芽孢杆菌的生存力BPSS2242过表达导致在高盐浓度下培养时遇到的二羰基毒性增加。这是第一个证明BPSS2242负责毒性代谢物的解毒的研究，构成了针对假苹果芽孢杆菌中活性羰基化合物的保护系统。。
类鼻疽杆菌是类鼻疽的病原体，在东南亚和澳大利亚北部的一个严重的传染病流行和非流行地区，包括美国，印度，中国南部，巴西和马拉维越来越认识1，2。假芽孢杆菌是一种生活在土壤和水中的环境腐生细菌，并不断暴露于多种环境中。病原体被报道具有在恶劣的环境中，包括缺少营养素，一个宽的温度范围，和暴露于酸性的，干的，氧化环境中生存的能力3，4。
在泰国，类li虫病在东北地区很常见，据报道死亡率高达40％5。该疾病的高发与土壤中电假芽孢杆菌的存在有关，土壤中的电导率在4-100 dS / m范围内，明显高于其他地区的土壤（2 dS / m）6，7。病原体的活力和培养性报告了长达90天的接触后盐渍土8，9。在添加了高达2.5％（w / v） NaCl的培养基中培养过夜后，假苹果芽孢杆菌可以存活，表明其对盐胁迫的持久性4。在富含盐的培养基10中生长的假芽孢杆菌中，检测到几种代谢酶，转录/翻译调节剂，分子伴侣，耐药蛋白和潜在毒力因子的改变。此外，结果表明，盐暴露病原体侵入更有效肺上皮细胞系A549和显示出对头孢他啶显著更大的阻力，有效的抗生素用于治疗类鼻疽10，11。这表明假芽孢杆菌在盐胁迫下生存和适应的能力。
全球转录分析表明，B. pseudomallei响应盐胁迫通过调节几个基因的转录11。有趣的是，当假芽孢杆菌 K96243在NaCl补充培养基11中生长时，编码假定的短链脱氢酶/氧化还原酶（SDR）的bpss2242基因被上调了十倍。SDR是一个大型蛋白质超家族，其中NAD（P）（H）依赖性氧化还原酶是大多数酶12。特别提款权在许多生物体中发挥重要的生物学作用，因为一些特别提款权的底物是已知作为细胞重要生物分子12，13。在已证明拟假芽孢杆菌 BPSS2242在细菌入侵和细胞内存活中起重要作用。在缺失的BPSS2242突变体（△ BPSS2242）中，侵染肺上皮细胞系A549并在感染初期在巨噬细胞中存活的能力受到损害。另外，△ BPSS2242突变体的细菌粗提物中的葡萄糖脱氢酶（GDH）活性比野生型（WT）14低15倍。这些建议BPSS2242参与的生存，适应和发病机制B.鼻疽。但是，BPSS2242在假芽孢杆菌中的生物学功能以前尚未见报道。
为了研究假芽孢杆菌 BPSS2242的功能和生物学作用，我们彻底表征了该蛋白。将BPSS2242克隆，表达，纯化至均一，并测定其生物物理和生化特性，包括低聚状态，辅因子和底物特异性，热稳定性和动力学参数。为了获得酶催化的更多细节，进行了催化残基的定点诱变，并证明了每个残基在催化中的作用。此外，BPSS2242的在暴露于有毒的二羰基化合物的生物学作用中被评估大肠杆菌表达BPSS2242和B.假单胞菌。
所述bpss2242基因（NCBI参考序列：YP_112245.1）位于上的2号染色体B.假单胞菌分离物K96243和编码一个假定的271个氨基酸的SDR与28.9 kDa的预测分子量（MW）。针对Burkholderia数据库（https://www.burkholderia.com）进行的bpss2242的 BLAST分析显示，致病菌株之间具有高度的序列同一性（补充图S1）。有趣的是，bpss2242的同源物在3'端含有额外的序列，这与本研究中使用的假芽孢杆菌分离株K96243 不同。该附加序列被标识为bpss2241（NCBI参考序列：YP_112244.1），下游的轨迹bpss2242中B.假单胞菌分离物K96243。在氨基酸水平，BPSS2242和BPSS2241由三个氨基酸（谷氨酸，精氨酸和Thr）链接到在其他的单一蛋白质B.杆菌分离物（图 1），提高该BPSS2242和BPSS2241可一起发挥作用的可能性。如果将它们分成两种蛋白质，则BPSS2242的细胞功能可能需要BPSS2241对应物。为了阐明BPSS2241是否参与BPSS2242的催化活性，还构建并研究了重组BPSS2241和包含BPSS2242和BPSS2241（BPSS2242 + 41）的单个蛋白质。
多重序列比对的BPSS2242和BPSS2241的假芽孢杆菌 K96243和其他致病性伯克霍尔德菌的 SDRs 。BPSS2242和BPSS2241的同系物分别用灰色和黑色阴影显示。方框表示在其他分离物中发现的其他氨基酸。
此外，序列分析表明，BPSS2242与SDR超家族的其他成员（包括来自Chryseobacterium sp。的酮还原酶）具有大约30-35％的序列同一性。CA49（CsKR; PDB ID：5X8H），巨大芽孢杆菌的 GDH （BmGDH; PDB ID：1GCO）和肺炎克雷伯菌的丁二醇脱氢酶（KpBDH; PDB ID：1GEG）。BPSS2242还具有SDR超家族的共同特征，其特征在于富含Gly的辅酶结合基序（TGxxxGxG），活性位点基序（YxxxK）和保守的催化三联体（Ser149，Tyr162和Lys166）（图 2）。
BPSS2242和SDR超家族其他成员的多重序列比对。使用BioEdit程序进行比对，并由ESPript渲染。CsKR的二级结构显示在比对上方。NAD（P）（H）结合基序和催化三联体的共有序列分别用三角形和星形突出显示。
补充信息中描述了BPSS2242，BPSS2241和BPSS2242 + 41的基因克隆，蛋白质表达和纯化。bpss2242，bpss2241和bpss2242 + 41的琼脂糖凝胶电泳显示在补充图S2中。BPSS2242从pET23a-表达bpss2242具有C末端His-标签而BPSS2241和BPSS2242 + 41用N末端从pET28a中表达His-标签-bpss2241和的pET28a bpss2242 + 41分别。纯化的重组蛋白的SDS-PAGE分析显示在补充图S3中。为确保纯化的重组蛋白正确折叠，可通过圆二色性（CD）确定这些重组蛋白的二级结构。所有纯化蛋白的CD光谱在208和222 nm处显示负峰，在193 nm处显示正峰，这是α螺旋蛋白的特征（图 3 A–C）。使用带有参考数据集SMP56的CDSSTR程序进一步分析CD数据，从而提供α螺旋，β折叠，匝数和线圈区域15的相对含量。每种纯化蛋白的二级结构含量列于表1。值得一提的是，BPSS2241的α-螺旋含量高于BPSS2242和BPSS2242 +41。为确定BPSS2242的低聚状态，进行了体积排阻色谱分析。观察到一个对应于29.6 kDa分子量的洗脱峰（图 3 D），这表明天然BPSS2242主要以单体形式存在于含有500 mM NaCl的20 mM Tris-HCl pH 8.0中。
纯化的重组蛋白的分析。（A）BPSS2242，（B）BPSS2242 + 41和（C）BPSS2241的CD光谱。（D）用于确定BPSS2242天然状态的标准曲线和凝胶过滤色谱图。（E）BpSDR的二乙酰还原酶测定。阴性对照是没有酶的反应。
为了确定BpSDRs，各种底物，包括糖类，醇类，甾族化合物，醛，酮和脂肪酸的酶的活性，进行了筛选（表2，3基于以前的报告）16，17，18。当使用NADPH作为辅因子时，BPSS2242表现出对二乙酰基和甲基乙二醛的还原酶活性。与二乙酰相比，甲基乙二醛的活性为20％。考虑到氧化反应，当存在NAD +时，BPSS2242表现出与葡萄糖，半乳糖，果糖和木糖的边缘活性。还对纯化的BPSS2242 + 41进行了底物筛选，结果显示与BPSS2242观察到的活性相似。如图3所示 E，BPSS2242 + 41减少二乙酰的活性与单独的纯化BPSS2242和与BPSS2241混合的BPSS2242相当。注意，单独纯化的BPSS2241的活性与阴性对照的活性相当，表明BPSS2241不参与催化。但是，BPSS2241的生物学作用仍然未知。由于BPSS2241对酶催化并不重要，因此，针对BPSS2242进行了进一步的酶学表征。
为了评估有关辅因子特异性的信息，对纯化的BPSS2242进行了辅因子结合测定。热位移分析显示在存在NADPH辅因子的情况下，熔融温度（T m）显着增加。BPSS2242 的T m值为49.67°C，而在存在2 mM NADPH的情况下，T m升高至55.23°C（图 4 A）。另一方面，在存在NAD +或NADH 的情况下，对于BPSS2242，未观察到T m的变化。在存在NADP +的情况下，BPSS2242的T m略微升高至51.90°C，这可能表明该蛋白与NADP +之间的结合较弱。。此外，NADPH浓度对BPSS2242的热稳定性的影响进行了评估，并且这种作用被认为是浓度依赖性的（图 4的B）。
BPSS2242的辅助因子首选项。（A）用于筛选辅因子偏爱的热位移测定。（B）NADPH浓度对BPSS2242的热稳定性的影响。（三）内在荧光分析辅助因子结合。
BPSS2242包含两个色氨酸残基（Trp91和Trp120）；因此，辅因子结合后的结构改变可通过监测固有色氨酸荧光19来评估。与热位移分析所建议的构象变化相一致，在存在NADPH的情况下BPSS2242的荧光发射光谱发生了变化。在NADPH存在下，BPSS2242的荧光强度降低了约1.5倍。相反，与辅酶相比，其他辅因子的存在会稍微改变荧光强度（图 4 C）。
在5.0-8.0的pH范围内测定BPSS2242的pH依赖性活性，结果表明，二乙酰还原的最适pH为6.5（图 5 A）。反应速率增加直到温度达到60°C，然后逐渐降低（图 5 B）。在热变性测定中，BPSS2242在49°C时丧失了一半的还原酶活性（图 5 C）。在高盐浓度（高于75 mM）的存在下，BPSS2242活性受到抑制，而当NaCl浓度为250 mM时，丧失了一半以上的活性（图 5 D）。在NaCl浓度介于5和75 mM之间时，酶的活性得以保持。MgCl 2，CaCl 2和MnCl 2的添加对酶活性没有影响，而Co 2 +，Zn 2 +，Fe 2+和Cu 2+的存在降低了酶的活性，其中FeCl 2和CuCl 2引起严重的蛋白质沉淀（图 5 E）。
BPSS2242的酶促表征。（A）pH和（B）温度对酶活性的影响。NaOAc：醋酸钠；NaP：磷酸钠。（C）BPSS2242的热稳定性分析。（D）NaCl和（E）金属离子对酶活性的影响。控制是没有金属离子的反应。不适用：无活动。BPSS2242的（F）二乙酰和（G）NADPH的动力学图。
确定了稳态动力学参数，BPSS2242的二乙酰基和NADPH的Michaelis-Menten图分别显示在图5 F和G中。二乙酰基的K m和k cat值分别为53 mM和0.25 s -1。对于NADPH，K m和k cat值分别为298 µM和0.27 s -1。BPSS2242对二乙酰的催化效率（0.0048 s -1 mM -1）明显低于其他细菌二乙酰还原酶（4.4-74 s -1 mM -1，表4）; 这表明二乙酰可能不是BPSS2242天然底物20，21，22，23，24，25，26，27，28，29。尽管检测到了甲基乙二醛的还原酶活性，但由于底物浓度增加时背景本底高，因此无法确定该化合物的稳态动力学参数。
在家族的SDR蛋白质，催化三联残基（丝氨酸，酪氨酸和赖氨酸）已被提议作为催化位点的一部分，在酶的催化作用发挥重要作用30，31。为了评估BPSS2242催化三联体在底物特异性和催化中的作用，将每个残基替换为Ala，并表征了与底物和辅因子的相互作用。所有突变体均对二乙酰还原没有催化活性（图 6 A），表明这些残基对BPSS2242的催化活性至关重要。
纯化的BPSS2242 WT和突变体的分析。（A）二乙酰还原酶活性的比较。阴性对照是没有酶的反应。通过（B）CD和（C）固有荧光进行结构分析。（d）热稳定性分析。
为了更加详细地了解这些催化三联体残基的作用，检查了突变对BPSS2242的二级结构的影响（图 6的B）。Ser149Ala和Tyr162Ala的CD谱几乎与野生型相同。然而，注意到在208和222nm处强度降低。相反，Lys166Ala突变体显示出与WT酶不同的CD光谱。这个突变体显示在222纳米和在193nm（图的轻微偏移更负的峰 6的B）。另外，CDSSTR分析表明，与WT相比，Lys166Ala突变体中α-螺旋的相对量减少，表明由催化的Lys166残基突变引起的结构改变（表5）。
还进行了固有荧光分析（图 6 C）。Ser149Ala和Tyr162Ala突变体的发射光谱与WT酶类似，但荧光强度仅略有下降。然而，Lys166Ala突变体的光谱显示移至更长的波长，表明Lys166Ala突变体的色氨酸残基暴露于极性环境。该结果证实Lys166的突变引起BPSS2242的构象变化。为了进一步研究突变的影响，使用热移测定法评估了BPSS2242突变体的热稳定性（图 6 D）。Ser149Ala突变体的T m为48.96°C，与WT相当（T m为49.67°C）。对于Tyr162Ala和Lys166Ala，Tm分别升高2.3和6.1°C。Lys166Ala突变体热稳定性的明显变化可能是由于蛋白质结构的改变。
接下来，评估催化三联体在辅因子结合中的作用。在NADPH存在下，Ser149Ala突变体的T m以与观察到的WT蛋白相似的方式升高至55.82°C（图 4 C，7 A）。相反，在NADPH存在下，Tyr162Ala和Lys166Ala突变体的T m与脱辅酶的T m相似，表明突变酶与辅因子之间没有相互作用（图 7 B和C）。仅在Ser149Ala突变体中观察到与NADPH结合时固有荧光发射的减少（图 7 D–F）。两者合计，研究表明Tyr162和Lys166参与NADPH辅因子结合，这对BPSS2242催化至关重要。
BPSS2242突变体的辅因子结合分析。（A，B和C）NADPH结合后的热变性和（E，F和G）在不存在和存在NADPH的情况下纯化蛋白的发射光谱。
由于BPSS2242是能够催化丁二酮和甲基乙二醛，被称为反应性亲电子物质，破坏大分子和影响细胞的氧化还原状态的还原32，33，我们假设BPSS2242的过表达可以提供针对二羰毒性的保护。因此，BPSS2242的生物学作用在两个被评估大肠杆菌和B.假单胞菌。对于大肠杆菌 BL21（DE3），将表达BPSS2242的细胞的细菌存活率与带有空pET23a质粒的细菌的存活率（对照）进行了比较。IPTG诱导的BPSS2242在大肠杆菌中过表达4小时（图 8）A），将细菌暴露于各种浓度的二乙酰（0–15 mM）和甲基乙二醛（0–7.5 mM）中1 h，并计数存活细胞数以评估二羰基化合物的毒性作用（图 8 B和C）。在存在二羰基化合物的情况下，在所有测试浓度下，表达BPSS2242的大肠杆菌 BL21（DE3）的存活率均显着高于对照。这表明BPSS2242的表达为细菌的生长/存活提供了一些优势。随着二羰基化合物浓度的增加，细菌存活率以浓度依赖性方式降低，其中对照细胞的存活率比过表达BPSS2242的细胞更为严重。
在二羰基毒性胁迫下细菌的存活。（A）BL21（DE3）中的重组蛋白表达。泳道1，未诱导的细胞；泳道2，用1mM IPTG诱导4小时后诱导的细胞；泳道3，可溶部分；泳道4，不溶部分。对照细胞是带有空pET23a质粒的大肠杆菌 BL21（DE3）。暴露于（B）二乙酰和（C）甲基乙二醛后确定了大肠杆菌的存活率。（D）通过RT-PCR 确认在含有0、150mM 和300mM NaCl的LB培养基中生长的假芽孢杆菌的BPSS2242转录水平。盐处理和未处理的假芽孢杆菌 WT，△的存活率BPSS2242突变体，以及暴露于（E）二乙酰和（F）甲基乙二醛的互补菌株。
为了检查BPSS2242在假苹果芽孢杆菌中的解毒功能，使用先前构建的△ BPSS2242突变体14。测定了WT，△ BPSS2242和BPSS2242补充的假芽孢杆菌在补充不同浓度的NaCl和二羰基化合物的培养基中的存活率。最初，进行RT-PCR以评估BPSS2242的表达。结果表明，在存在300 mM NaCl的情况下生长的假单胞菌 BPSS2242的表达上调（图 8 D），与先前的发现11吻合良好。该△BPSS2242突变体未显示BPSS2242表达，而互补菌株中的BPSS2242表达与野生型中观察到的相当。暴露于2.5 mM二乙酰基后，△ BPSS2242假苹果芽孢杆菌的存活率从根本上降低到40–50％，而野生型的存活率仍超过90％（图 8 E）。此外，△ BPSS2242突变体与BPSS2242互补后，其存活率与野生型相似。清楚地表明，将NaCl浓度从0增加到300 mM可以增强假芽孢杆菌的存活。在WT和互补菌株中的表达与NaCl诱导的BPSS2242表达增加有关。对于甲基乙二醛毒性，假小芽孢杆菌的存活率显着提高，并且BPSS2242互补菌株以与WT类似的方式在存在300 mM NaCl的情况下恢复了△ BPSS2242 的存活率（图8 F）。这些结果提供的证据表明，BPSS2242能够在解毒二羰基化合物（丁二酮和甲基乙二醛）的B.假单胞菌。
B.假单胞菌是一种多用途的腐生，可以在不同类型的应力的生存3，4。假疟原虫在极端环境中的持续存在可能会增加流行地区的感染风险。先前的研究显示出上调bpss2242在B.假单胞菌下高NaCl浓度培养11。另外，BPSS2242 B. pseudomallei的侵袭和早期细胞内复制受到损害，表明其在存活和发病机理中的重要作用14。BPSS2242被确定为推定的SDR；然而，其生化和功能作用仍然未知。
生物信息学分析揭示了独特的基因结构bpss2242在B.假单胞菌分离物K96243，基准应变，在这项研究中（补充图。使用S4）。不像K96243的BPSS2242，其他B.杆菌菌株包含其鉴定为BPSS2241在K96243，表明BPSS2242和BPSS2241融合成在其他的单一蛋白质附加部件B.假单胞菌分离物。
在对BPSS2242，与BPSS2241和BPSS2242 + 41混合的BPSS2242进行底物筛选后，未观察到BPSS2241对所有测试底物的酶活性。BPSS2242 + 41显示出与BPSS2242相当的酶促活性。与BPSS2242相比，在补充NaCl的培养基中培养假小芽孢杆菌 K96243 时，BPSS2241没有上调11，表明BPSS2241与催化作用无关。这与在BPSS2241上未发现SDR的保守残基的事实非常吻合。BPSS2241是由69个氨基酸组成的小蛋白，预期分子量为7.4 kDa。此外，非冗余蛋白质数据库中BPSS2241的序列查询无法识别潜在候选者。BPSS2241被预测使用TMHMM具有跨膜（TM）螺旋特征，表明其作为膜锚定蛋白34的功能。CD分析还表明，BPSS2241的α-螺旋含量高于BPSS2242和BPSS2242 +41。据报道，一些SDR包含额外的N或C端跨膜区或从核心结构延伸的信号肽30。BPSS2241可能在稳定BPSS2242 + 41中起作用，因为在纯化过程中BPSS2242 + 41的降解减少了（补充图S3）。在另一方面，的独特的结构组织bpss2242中观察到B.假单胞菌分离物K96243可能受环境的遗传多样性进行说明B.假单胞菌 K96243样品35，36，37。
先前的一项研究报道，在BPSS2242表达的结果下，在存在300 mM NaCl的情况下生长的假芽孢杆菌 K96243的粗裂解物中检测到GDH活性14。但是，BPSS2242没有显示GDH活性。BPSS2242和BPSS2242 + 41均表现出对二羰基化合物，二乙酰基和甲基乙二醛的还原酶活性，并且该活性取决于NADPH。BPSS2242被认为是首选NADP（H）的经典SDR，其中第二个β链后的环中存在碱性残基（Arg42）。此碱性残基被建议将与NADP的2'-磷酸（H）相互作用13，38，39。
通过热位移和固有荧光分析证实了对BPSS2242的NADPH辅酶的偏爱。在存在2 mM NADPH的情况下，BPSS2242 的T m从49.67°C显着增加到55.23°C。此外，仅在NADPH存在下才观察到固有荧光信号的变化，表明NADPH结合后的构象变化。尽管在存在NADP +的情况下注意到T m的变化为2.23°C ，但未检测到针对任何测试底物的脱氢酶活性。在这方面，证明了BPSS2242是NADPH依赖性还原酶。
类似于其他特别提款权，建议催化三联-Ser149，Tyr162和Lys166-在BPSS2242被认为是用于催化关键的30，31。这些残基对Ala的定点诱变消除了酶的活性。Tyr162Ala和Lys166Ala突变体的T m分别为52.01°C和55.77°C，而Ser149Ala共有相似的T m（48.96°C）至WT蛋白。正如CD和固有荧光分析所表明的，Lys166Ala改变了二级结构，α-螺旋含量降低了，该突变体也引起了蛋白质的构象变化。酪氨酸提出以用作催化酸/碱，从NADPH转移质子到衬底的羰基而赖氨酸被发现结合NADPH和降低的pK 一个的Tyr以促进质子转移30，31。在这项研究中，热位移和固有荧光分析表明，Tyr162Ala和Lys166Ala参与NADPH结合。这两个催化残基的突变破坏了蛋白质与NADPH辅酶的结合。
应该指出的是，虽然BPSS2242可以催化二乙酰基的还原，但二乙酰基（53 mM）和NADPH（298 µM）的K m高于其他SDR成员的报告值，但地衣芽孢杆菌二乙酰基还原酶的K m值可比（二乙酰基和NADPH的K m分别为72.4 mM和250 µM）（表4）28。但是，地衣芽孢杆菌二乙酰还原酶是一种高度催化的高效酶（k cat / K m为16.9 s -1 mM -1和5,027 s -1 mM -1分别用于二乙酰和NADPH）。BPSS2242对二乙酰基还原反应的低结合亲和力和催化效率可能表明，二乙酰基化合物不是该酶的天然底物。BPSS2242与其他二乙酰基还原酶相比表现出两个主要不同的特征。首先，BPSS2242的二乙酰基还原酶活性是不可逆的，即无法催化乙酰丙酮的氧化（表3）。然而，双乙酰不可逆还原报道了一些双乙酰还原酶22，25。第二，BPSS2242活性依赖于NADPH而大多数细菌二乙酰基还原酶的利用NADH作为辅因子22，23，24，25，26。BPSS2242的二乙酰基还原酶活性与大肠杆菌的二乙酰基还原酶具有相似的功能，后者优选使用NADPH作为辅因子，并且无法氧化乙酰丙酮底物。但是，大肠杆菌二乙酰基还原酶对NADPH和二乙酰基的K m值分别为20 µM和4.44 mM，比BPSS2242 20低十倍。
丁二酮和甲基乙二醛在许多生物体公认的氧化毒性二羰基化合物32，33。据报道它们会导致细胞活力丧失并抑制细胞生长。因此，它们已被用作抗微生物剂40，41。甲基乙二醛是内生从羟基丙酮磷酸甘油代谢，葡萄糖氧化，脂质过氧化和DNA氧化在各种生物体，包括合成的大肠杆菌和B.假单胞菌42，43，44，45，45。另一方面，二乙酰或2，3-丁二酮是在发酵过程中自然合成的α-二酮46。的NAD（P）超家族的SDR H-依赖性酶和醛-酮还原酶（AKR）超家族是负责二羰解毒两个主要的酶途径的化合物33，47，48，49。NADPH依赖的醛还原酶（ADRs）与AKR和烯醛/一种氧化还原酶共同清除植物拟南芥49中的二羰基。拟南芥在NADPH存在下，ADR可以还原饱和醛，例如丙醛和丁醛，但不能还原NADH。与BPSS2242相似，ADR反应在生理pH下不可逆，表明ADR在消除醛类方面的生理意义。此外，据报道，拟南芥中ADR，AKR和烯醛还原酶的共表达可共同作用，以解毒在高盐度和干旱等胁迫条件下产生的醛。同样，大肠杆菌 ADR可以消除脂质过氧化过程中产生的醛50。在这项研究中，我们已经表明，BPSS2242（一种假定的SDR）的过表达显着增加了大肠杆菌和假芽孢杆菌K96243当细菌在其生理浓度暴露于丁二酮和甲基乙二醛存活41，42，51。这证明了BPSS2242在体内对二乙酰基和甲基乙二醛解毒的能力。
通常，微生物在压力条件下具有其生存适应性。B.假单胞菌 K96243显示出耐受多种胁迫条件，包括高盐条件4，8，9。当B. pseudomallei K96243遇到300 mM NaCl时，观察到了代谢变化，例如糖代谢中的酶上调，丙酮酸脱氢酶和UDP-半乳糖4-表异构酶10。糖酵解活性的增加可提供生存所需的能量10。由于增加的糖酵解活性和脂质代谢，细菌可能会产生细胞毒性的二羰基化合物。根据我们的结果，表明在高盐浓度下生长的假苹果芽孢杆菌 K96243中观察到的BPSS2242的上调可能是降低二羰基化合物的氧化毒性，在盐胁迫下保护细菌的机制之一或部分负责。
Phusion高保真DNA聚合酶获自Thermo Scientific（Waltham，MA，USA）。T4连接酶和限制酶购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。所有细菌培养基均由Bio Basic（加拿大安大略省Markham）提供。NAD（P）+，NAD（P）H和糖类均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。醇，酮，醛和其他化学品购自默克（德国达姆施塔特）和TCI（日本东京）。使用的所有化学药品均为分析纯，按原样使用。
纯化蛋白的二级结构使用CD光谱法评估。使用Amicon Ultra离心过滤器（美国马萨诸塞州默克密理博市），通过对含有10％甘油的20 mM Tris-HCl pH 8.0进行缓冲液交换来去除NaCl。使用Jasco光谱仪（型号J-815）和路径长度为1 mm的石英比色杯，记录了蛋白质浓度为0.2 mg / mL时BPSS2242，BPSS2241和BPSS2242 + 41的远UV-CD光谱。在190-260 nm的波长范围内以50 nm / min的扫描速率收集光谱。将每个样品的五次扫描取平均值，然后用缓冲液扫描减去。
纯化的BPSS2242的天然分子量是通过尺寸排阻色谱法确定的，该色谱法使用配备了Superdex 200递增10/300色谱柱（GE Healthcare，NJ，美国）的AKTA快速蛋白质液相色谱法（FPLC）进行。将纯化的蛋白质（50 µg）上样到预平衡的色谱柱上。使用含有500 mM NaCl的20 mM Tris-HCl pH 8.0以0.5 mL / min的流速进行色谱分离。用蓝色葡聚糖（> 2000 kDa），铁蛋白（440 kDa），过氧化氢酶（232 kDa），醛缩酶（158 kDa），卵清蛋白（43 kDa），糜蛋白酶（25 kDa）和RNase A（13.7 kDa）校准色谱柱。 。通过使用以下公式绘制分布系数（K av）对蛋白质分子量的对数来绘制校正曲线：K av =（V e / Vo）/（V c -V o），其中V c是总床体积，V o是空隙体积，V e是洗脱体积。
为了鉴定可结合至BPSS2242的辅因子，在包含3 µM BPSS2242和5×SYPRO Orange报告染料和2 mM核苷酸辅因子（NAD +，NADP +，NADH和NADPH）的20 µL反应混合物中进行了基于荧光分析的热位移分析）在20 mM Tris–HCl pH 8.0中。使用LightCycler 480实时PCR仪（Roche，曼海姆，德国）以激发和发射波长分别为465 nm和580 nm的温度将反应混合物以20至70°C的温度增量加热。确定每个BPSS2242-核苷酸对的T m。使用GraphPad Prism通过Boltzmann拟合计算T m。T m的变化大于2°C被认为具有统计学意义。
通过固有色氨酸荧光研究了辅因子结合后重组BPSS2242的构象变化。在不存在或存在25 µM NAD +，NADP +，NADH或NADPH 的情况下，总体积为100 µL的样品含有2.5 µM BPSS2242 。使用Synergy H1 Hybrid Reader（BioTek，VT，USA）在25℃的96孔板上收集重组BPSS2242和全酶的内在荧光光谱。激发波长为295 nm，发射光谱记录在300–400 nm范围内。
通过监测摩尔消光系数为6,220 M -1 cm -1的NAD（P）H在340 nm处的吸光度变化，通过分光光度法测量酶的活性。用UV-2700 UV-VIS分光光度计（日本京都岛津市）进行记录。标准反应包含20 mM磷酸钠（pH 6.5），500 µM NADPH，200 mM二乙酰基和50 mM NaCl，并在比色皿中于37°C进行，最终体积为1 mL。
使用NAD（P）（H）作为辅因子，对纯化的重组SDR对不同底物（包括糖，醇，多元醇，类固醇，酮，醛和脂肪酸）进行活性分析。
为了确定动力学参数，将二乙酰基和NADPH用作底物。对于NADPH 的K m的测定，测定方法是将联乙酰的浓度固定在200 mM，将NADPH的浓度从30–1,000 µM改变，而联乙酰的K m通过将NADPH的浓度固定在500 µM，二乙酰的浓度在10–400 mM之间变化。通过使用GraphPad Prism将初始速度拟合到Michaelis-Menten方程来计算动力学常数。
为了研究pH的影响，在以下每种缓冲液的存在量为20 mM的情况下测量了酶的活性：乙酸钠（pH 5.0-5.5），磷酸钠（pH 6.0-7.5）和HEPES（pH 7.0-8.0） ）。
为了研究温度的影响，在25至70°C的温度范围内进行了酶分析。为了进行热稳定性分析，将纯化的酶在25至65°C的不同温度下预孵育20分钟，然后在Thermocycler（Eppendorf，汉堡，德国）中冷却至4°C。在标准条件下测定酶的残余活性，并表示为在25℃下孵育的酶活性的百分比。
在含有1 mM不同二价金属离子（Mg 2 +，Ca 2 +，Co 2 +，Mn 2 +，Zn 2 +，Fe 2+和Cu）的标准反应混合物中，研究了金属离子对BPSS2242活性的影响。2+）。NaCl本身对BPSS2242活性的影响是通过在不同浓度的NaCl（5-500 mM）存在下测量酶活性来确定的。
携带pET23a- bpss2242或空pET23a质粒的大肠杆菌 BL21（DE3）细胞在Luria-Bertani（LB）中于37°C生长，直到OD 600达到1.0，并通过添加1 mM IPTG诱导蛋白质表达，并于20 °C 进一步培养保持4小时。此后，将细胞用各种浓度的二乙酰（5–15 mM）或甲基乙二醛（2.5–7.5 mM）处理1 h。丁二酮和在本研究中使用的甲基乙二醛的浓度，选择基于先前的报道41，48，52，53。对于活细胞计数，将培养物在LB肉汤中连续稀释10倍，然后接种到含有100 µg / mL氨苄青霉素的LB琼脂上。
测定了假二甲基芽孢杆菌 K96243在暴露于二羰基化合物后的存活率。在这项研究中，我们比较了三种假单胞菌 K96243：WT，△ BPSS2242突变体和bpss2242互补菌株的存活率。所述的构建△ BPSS2242突变体和bpss2242补充株先前已经描述14。BPSS2242的表达诱导生长B.杆菌在NaCl 0,150和300mM和如先前所描述通过实时RT-PCR验证54。简而言之，假单胞菌在存在或不存在氯化钠的情况下，于37°C下培养6 h，然后通过向5 ml细菌培养物中添加10 ml RNAprotect细菌试剂（QIAGEN，TX，美国）进行RNA分离，并在室温下孵育5分钟。之后，根据制造商的说明，使用TRIzol（Invitrogen，CA，USA）从细菌沉淀中提取总RNA。为了除去DNA，在使用前，将溶液用DNase（NEB，MA，USA）在37°C下处理10分钟。进行常规的23S RNA基因PCR验证，以DNase处理的RNA样品中没有gDNA污染。随后，对bpss2242进行实时RT-PCR使用KAPA SYBR快速一步法（Kapa Biosystems，MA，USA）在以下条件下克隆基因：在50°C逆转录30分钟，在95°C酶活化10分钟，然后在95°C变性40个循环30秒钟，在CFX96 Touch实时PCR检测系统（美国加利福尼亚州Bio-Rad）中于55°C退火1分钟，并在72°C进行熔融曲线分析1分钟。用于BPSS2242表达的实时RT-PCR引物是BPSS2242-F1（5'ACCGCGCGACCGATATGAACG 3'）和BPSS2242-R2（5'TCCCTTCGCGCTCGTGCAAC 3'）。相对mRNA水平通过表达倍数变化来确定，该表达倍数通过2 -ΔΔCT 使用代表持家基因表达的23S RNA的相对mRNA水平作为比较的基线来计算。
为了评价二羰基化合物的上的存活的影响B.假单胞菌 K96243表达BPSS2242，的过夜培养物B.杆菌 K96243（WT，缺失突变体和互补的污渍）调节OD 600〜0.5接种到含有0,150和300的LB肉汤mM NaCl并在37°C下培养6小时。将盐处理和未处理的细菌均与各种浓度的二乙酰（1–15 mM）或甲基乙二醛（1–7.5 mM）一起孵育。但是，二乙酰基和甲基乙二醛对假芽孢杆菌均具有高毒性。。因此，两种化合物用于测定细胞活力的浓度为1-2.5 mM。1小时后，将细胞连续稀释十倍并铺板进行菌落计数。存活率％= CFU（含有毒的二羰基化合物）×100 / CFU（不含有毒的二羰基化合物）。
在此研究过程中生成或分析的所有数据均包含在此发表的文章及其补充信息中。
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