基质金属蛋白酶（MMPs）是由基质金属蛋白酶（TIMPs）的组织抑制剂调节的蛋白水解锌内肽酶。我们评估了MMP和TIMP作为颅内出血（ICH）临床工具的潜力。自发的非创伤性ICH患者来自两家医院：纳瓦拉市的Complejo Hospitalario Hospital（CHN = 29）和Vall d´Hebron（VdH = 76）。评估了MMP-1，-2，-7，-9，-10和TIMP-1的血浆水平及其与临床，放射学和功能变量的关系。我们进一步研究了TIMP-1（0.05–0.2 mg / Kg）在实验性尾巴出血模型中的作用。在CHN中，与大叶性血肿相比，深层患者的TIMP-1与入院血肿量有关，MMP-7升高。在VdH中，入院血肿量与TIMP-1和MMP-7相关。合并两家医院的数据后，我们观察到TIMP-1升高1 ng / ml与出血量增加0.14 ml相关（β= 0.14，95％CI = 0.08-0.21）。同样，接受TIMP-1（0.2 mg / Kg）的小鼠表现出较短的出血时间（p <0.01）。因此，在两个独立的ICH人群中TIMP-1与血肿量的相关性提示其作为ICH生物标志物的潜力。此外，增加的TIMP-1可能不足以抵消MMPs的上调，表明TIMP-1的给药可能是ICH的有益策略。在两个独立的ICH队列中，TIMP-1与血肿量的相关性表明其作为ICH生物标志物的潜力。此外，增加的TIMP-1可能不足以抵消MMPs的上调，表明TIMP-1的给药可能是ICH的有益策略。在两个独立的ICH队列中，TIMP-1与血肿量的相关性表明其作为ICH生物标志物的潜力。此外，增加的TIMP-1可能不足以抵消MMPs的上调，表明TIMP-1的给药可能是ICH的有益策略。
中风是世界范围内导致死亡和残疾的第二大原因1。颅内出血（ICH）占所有卒中的10–15％，是破坏力最大的亚型2。但是，与缺血性中风不同，在过去的几十年中，ICH的发病率并未下降3，也未开发出具体的治疗方法4。几乎40％的ICH患者会在前30天内死亡，只有20％的幸存者会实现独立功能5。
ICH是一种复杂的疾病，其特征是血管破裂和渗入脑实质，导致血肿扩大，局部缺血和神经元丢失6。最常见的ICH是大叶或深处，且在入院血肿量，血肿生长和结局方面存在差异7。ICH病理生理学涉及几个因素，包括：（a）细胞外基质（ECM）的重塑，在生理条件下可维持动脉壁的完整性，弹性和强度，（b）血脑屏障的破坏（ BBB），这有助于水肿形成和神经元变性和（c）参与继发性脑损伤的炎症应答8，9。
基质金属蛋白酶（MMPs）是锌依赖性内肽酶，具有蛋白水解活性，可促进ECM降解，组织重塑和再生10。MMPs的催化活性受基质金属蛋白酶（TIMPs）11的组织抑制剂调节。TIMP家族的四个成员（TIMP 1-4）是广谱抑制剂，可直接与MMP 12的催化域结合。
脑损伤后，MMPs及其抑制剂的作用可能至关重要，因为它们都参与早期急性损伤以及后期的组织恢复13。临床研究已观察到增加的MMP-2，-3，-9和血液和ICH的患者的脑脊液TIMP-1水平时相比，正常人群14，15，这表明蛋白酶/抑制物很可能以后参与脑损伤自发性ICH，可能与患者的预后有关16。在过去的几年中，我们小组研究了MMP在不同神经血管疾病中的作用。我们发现TIMP-1水平与颅脑外伤和恶性大脑中动脉闭塞的患者的病死率相关17，18，19，而MMP-2表达可能在淀粉样血管病的脑出血患者的发展受到牵连 20。此外，在广泛的临床前研究中，MMPs与血肿扩大，水肿增长和神经元丢失有关 16。但是，它们作为治疗或诊断临床工具的潜力尚未完全确定。
在这项研究中，我们探讨了两个独立队列的ICH患者中几种MMP和TIMP-1的血浆水平及其与血肿量和位置以及其他临床，放射学和功能变量的关系。此外，我们进一步研究了TIMP-1在实验性尾巴出血模型中的作用。
表1和表2显示了根据入院时血肿位置和随访数据对这两个队列的临床和人口统计学特征 。
在CHN队列中（表 1），中位[四分位间距，IQR]年龄为76 [66-85]岁，女性中几乎40％，高血压为52％，中风的严重程度为中度（中位[IQR]，NIHSS = 8 [4– 17]）。ICH后90天，死亡率达到33％（n = 9），幸存者为中度至重度残疾（mRS = 4 [2-6]）。大叶ICH患者（n = 16，55％）与深处相比，入院时有更大的血肿量（38 [19–69] mL大叶与8 [4–17] mL深，p <0.001）和24 ICH发作后–48小时（42 [23–58] mL大叶与9.4 [3.6–18] mL深，p = 0.004）。深部血肿患者有较高的高血压患病率（二分法）（p = 0.089）。与大叶相比，深部血肿患者仅MMP-7水平更高（中位[IQR]，深21.1 [15.5-24.3] ng / mL，大叶15.3 [13.0-19.0] ng / mL，p = 0.048）。在这两个ICH地点之间，我们在功能结局，死亡率或其余MMP和TIMP-1方面没有发现差异（表 1）。
在VdH队列中（表 2），ICH患者的中位[IQR]年龄为72 [66-80]岁，女性中近44％，近90％的人患有高血压，中风严重程度从中度到重度（中位[IQR]，NIHSS = 12 [6.7 –19.2]）。ICH后90天，死亡率为31％（n = 21），幸存者表现为中度至重度残疾（mRS = 4 [2-6]）。ICH的位置在28例（37％）中为大叶，在48例（63％）中为深。正如中国队列研究报告的那样，与入院时较深的位置相比，大叶血肿患者的出血量也更大（43.7 [15.55-77] mL大叶与5.8 [3.25-19.27] mL深，p = 0.0001）和24 ICH后–48小时（39 [20.2–48.11] mL大叶vs 5.7 [3.3-14.8] mL深，p = 0.0015）。此外，与大叶相比，深部血肿患者的高血压患病率更高（分别为94％和75％，p = 0.047），而葡萄糖水平则更低（124 [108–147.75]深对141.4 [116.75-216.5] mg / mL大叶，p = 0.036）。没有观察到血肿位置与任何功能结局，死亡率，MMP或TIMP-1有显着相关性（表 2）。
我们进行了单变量分析，以评估血浆MMP和TIMP-1与临床和放射学变量之间的关系（表3和表 4）。
首先在中国队列研究中，所研究的MMP与心血管危险因素，功能结局或死亡率均无关（补充表 1）。但是，TIMP-1水平与入院血肿量呈正相关（0.19； 95％CI 0.09至0.28 p = 0.001，表 3））。我们还评估了入院血肿量与不同临床和放射学参数之间的关联。入院NIHSS（2.8; 95％CI 1.1至4.4，p = 0.002），90天死亡率（46; 95％CI 12.5至79.5，p = 0.009）和心室血液（44.2; 95％CI 12.2至76.2，p = 0.008）与入院血肿量呈正相关。此外，具有大叶位置的患者的出血量明显高于具有深叶位置的患者（43.7； 95％CI为14.5至72.8，p = 0.005）。高血压患者的血肿量较低（-32.2； 95％CI -63.4至-0.94，p = 0.044，表 3）。
在VdH队列中，MMP-2水平与年龄（0.95; 95％CI 0.27至1.63，p = 0.007），mRS 90天（3.8; 95％CI 0.48至7.07，p = 0.025），高血压和90死亡率（OR = 1.032，95％CI 1.002至1.064，p = 0.039，OR = 1.025，95％CI 1.003至1.048，p = 0.027）。MMP-10水平与年龄（11.7; 95％CI 1.4至21.9，p = 0.025）和糖尿病（OR = 1.001，95％CI 1.000至1.003，p = 0.021）相关，女性中MMP-9水平较低患者（-59.9； 95％CI -98.1至-7.7，p = 0.022，补充表 2）。此外，我们再次观察到，入院血肿量与TIMP-1水平呈正相关（0.17； 95％CI为0.03至0.32，p = 0.022，表 4），但与MMP-7水平呈正相关（0.83； 95％CI为0.32至1.34）。 ，p = 0.002，表 4）。关于入院血肿量与其他临床和放射学参数之间的关联，我们发现该变量与血糖水平（0.25; 95％CI 0.1至0.41 p = 0.0021），年龄（1.3; 95％CI 0.4至2.3）正相关。 ，p = 0.007），死亡率（48.7； 95％CI 29.4至68.0，p <0.001）和入院NIHSS（2.05； 95％CI 0.99至3.11，p <0.001）。再次，具有大叶位置的患者的出血量明显高于具有深叶位置的患者（46.2； 95％CI 29.9至62.6，p <0.001）。高血压患者的血肿量更低（-28.94； 95％CI -55.1至-2.78，p = 0.033，表 4）。
我们旨在通过多元回归分析进一步分析两个队列中观察到的血浆TIMP-1与入院时出血量的关系。
首先，在中国队列研究中，多变量分析显示，在所有测试模型（模型1至3，表5）中，调整了混杂因素后，TIMP-1与出血量之间存在显着关联 。在单变量和多变量分析中，VdH队列均进一步证实了这种关联（表 6）。
当我们合并两个队列的结果时，我们观察到TIMP-1与血肿体积之间具有统计学意义的关联（总体β= 0.14，95％CI = 0.08-0.21，图 1）。这些结果表明TIMP-1可能是ICH的潜在生物标志物。
固定效应荟萃分析，评估ICH患者入院TIMP-1和血肿量的效果。调整了两个队列的位置，高血压和NIHSS的Beta系数（队列1 = CHN，队列2 = VdH）。
在发现血肿量与TIMP-1之间存在关联之后，我们进一步探索了TIMP-1在tPA诱发的出血的实验模型中的作用。我们的结果表明，TIMP-1的实验剂量（0.05 mg / Kg）并未减少允许的最大出血时间（30分钟）。但是，注射最高剂量的TIMP-1（0.2 mg / Kg）的小鼠出血时间短得多（1.8±0.7 vs. 28.3±3.3 min，p <0.01，图 2a），失血量（15.3± 4.7 vs. 42.8±14.9μL，p <0.05，图 2b）。这些结果表明，TIMP-1可能能够控制实验性出血。
TIMP-1在小鼠实验性尾巴出血中的作用。（a）用盐水（n ＝ 5），TIMP-1（0.05mg / Kg，n ＝ 4）和TIMP-1（0.2mg / Kg，n ＝ 3）处理的动物的出血时间。（b）在实验性出血模型后获得失血。与盐水相比，** p <0.01和* p <0.05。
这项研究的主要目的是探讨两个独立的ICH患者队列中MMP和TIMP-1与临床，放射学和功能变量之间的关系。ICH 21后，血肿量和扩张与不良预后，神经系统损害和残疾有关。我们首次报道，入院时TIMP-1的循环水平与血肿量有关，而与高血压，NIHSS和两个独立的ICH患者队列中的血肿位置无关。
TIMP-1是MMPs的内源性抑制剂，在正常条件下存在于组织中以调节MMPs的活性22。关于TIMP1在ICH中的作用的研究很少。在这项研究中，我们报道了在两个独立的队列中，TIMP-1与血肿量显着相关，并经过综合荟萃分析，表明TIMP-1可能是ICH中潜在的关键生物标志物。这些结果与其他研究一致，这些研究表明ICH急性期TIMP-1的浓度升高，在中风发作后的第一周仍保持高度持续23，并表明TIMP-1与早期死亡率相关24，支持TIMP-1作为ICH中严重性生物标志物的潜在作用。TIMP-1分泌增加可能被诱导减少MMPs活性，从而防止进一步的脑损伤25。但是，这可能不足以抵消MMP随之而来的上调。同样，据报道与症状性ICH 26和蛛网膜下腔出血（SAH）27相关的MMP-9 / TIMP-1比值相对增加，支持了以下假设：MMP / TIMPs水平的扰动可能会导致与脑动脉瘤相关的基质破坏28。
此外，我们发现，TIMP-1的给药（循环水平约10倍）能够控制小鼠实验性急性出血。这些发现与总体思路一致，即在脑出血，损伤和发炎的情况下，MMP和TIMP之间的动态平衡可能会失衡，因此，增强方程式抑制剂一侧的任何方法都可能是有益的29，30。支持这一假说的人，先前在TIMP-1基因敲除小鼠中的数据显示加剧了BBB的破坏和脑损伤[ 31]，而腺病毒TIMP-1在小鼠中的过表达，缺血后脑损伤量，神经元损伤和BBB渗漏减少了[ 32]。。此外，MMP抑制剂显著降低出血和出血中的实验模型中，包括ICH脑损伤33，34。
影响ICH预后的主要因素之一是血肿的位置。深部和大叶为主35，通常会导致不同的血肿量。尽管该参数与ICH预后相关，但很少有关于MMP与血肿位置相关性的临床数据。Abilleira 等。报道了深相关性ICH患者血浆MMP-9水平较高[ 36]。在脑的区域血肿周围此外，在脑淀粉样ICH，通常位于肺叶区域，MMP-2和-9个上调20，37。在我们的研究中，与深部血肿患者相比，深部血肿位置较高的CHN患者血浆MMP-7水平升高。MMP-7 /基质溶素是一种小的，分泌的金属蛋白酶，能够消化细胞外基质38的大量蛋白质。最近一项基于人群的队列研究进行了10多年，报道高血清MMP-7与自发性SAH发生风险增加独立相关，表明其可能用作SAH的预测指标39。同样，针对MMP-7空小鼠的多项研究表明，MMP-7在严重炎症过程中的强烈表达会导致无法修复的组织损伤40。此外，我们在VdH队列中观察到了这种金属蛋白酶与血肿体积的关联。因此，我们的结果表明，MMP-7可能参与了深部ICH的病理生理，尽管它可能部分取决于危险因素，因此，必须进行进一步的研究以确认这些数据。
在这项研究中发现的其他关联，例如与年龄和糖尿病相关的MMP-10和与年龄，高血压和90天死亡率相关的MMP-2，仅在VdH中具有显着意义，这可能是由于该人群的样本量更大和统计功效较高。但是，在校正ICH的危险因素后，这些关联消失了。关于高MMP-10的水平与微血管并发症的在1型糖尿病临床和实验研究的关联先前的数据41，42可以解释的关联在ICH的患者中发现。关于MMP-2，若干研究支持MMP-2的伴随糖尿病患者的高血压和死亡率和患者的心脏衰竭43，44。但是，对于自发性ICH患者，仅在住院的最初24小时内入院时发现MMP-2水平升高，23尤其是远离急性ICH的β淀粉样蛋白损伤血管中的组织水平升高20。因此，将来有较大样本量的研究可能会证实这些数据。
我们的工作有几个局限性：首先，我们系列的小样本量使我们的结果需要仔细解释。因此，在得出明确的临床结论之前，应在较大的队列研究中确认本研究的数据。观察性研究设计不允许我们建立TIMP-1与血肿量之间的因果关系，尽管在尾部出血实验模型中TIMP-1减少了出血时间的影响支持了TIMP-1可能是血栓形成的假说。控制ICH中血肿量的有效策略。但是，可能会使用缺陷小鼠进行ICH的其他实验模型。
我们首次报道了在两个独立的ICH队列中循环TIMP-1与血肿量相关，并且当我们合并两个队列的结果时，提示TIMP-1作为ICH的生物标志物的潜力。此外，TIMP-1的使用可显着减少实验性出血。因此，可以认为ICH增加TIMP-1水平可能不足以抵消MMP的上调，并且其外源给药可能是ICH的有益策略，以减少MMP活性并恢复MMP / TIMPs平衡。 。
自发性非创伤性ICH患者来自西班牙两家不同的三级医院（表1和表 2）：来自Navarra的Complejo Hospitalario de Navarra的队列研究（n = 29），收集于2016年2月至2017年6月之间；以及从2012年8月至2013年12月间从瓦尔达德希伯伦大学（VdH）医院收集的大量患者（n = 76）。这些前瞻性研究得到Navarra政府伦理委员会（63/2015）和加泰罗尼亚的批准政府[PR（AG）157-2011]分别。根据赫尔辛基宣言，所有患者或其“合法授权代表”均提供了书面知情同意书。该研究仅包括自发性非创伤性上颅内脑出血（ICH）的患者，这些患者是由急诊部入院时通过初始颅内非对比计算机断层扫描（CT）由中风病房的有经验的神经科医生诊断出来的。排除患有脑干/下脑出血ICH和/或继发性ICH（血管畸形，动脉瘤，肿瘤，伴有出血性转化的缺血性中风）的患者。我们排除了颅内出血的其他原因，如硬膜下血肿，硬膜外出血和蛛网膜下腔出血。然而，我们包括经历蛛网膜下腔和脑室内出血（IVH）的患者，尽管总是与并发实质性血肿相关。系统性癌症和炎性系统性疾病患者也被排除在研究之外。如Aguilar I先前所报道，由经验丰富的神经科医生根据其位置对ICH进行分类 硬膜外出血，蛛网膜下腔出血。然而，我们包括经历蛛网膜下腔和脑室内出血（IVH）的患者，尽管总是与并发实质性血肿相关。系统性癌症和炎性系统性疾病患者也被排除在研究之外。如Aguilar I先前所报道，由经验丰富的神经科医生根据其位置对ICH进行分类 硬膜外出血，蛛网膜下腔出血。然而，我们包括经历蛛网膜下腔和脑室内出血（IVH）的患者，尽管总是与并发实质性血肿相关。系统性癌症和炎性系统性疾病患者也被排除在研究之外。如Aguilar I先前所报道，由经验丰富的神经科医生根据其位置对ICH进行分类等。45。人口统计学资料和先前的抗血小板和/或抗凝治疗均已登记。根据现行指南，某些患者已表明抗凝作用逆转。
主要的影像学结果是出血量（入院量和随后的24-48小时后），血肿位置，血肿扩大（在最初的24小时内超过6 mL或33％的增长）和IVH。血肿体积通过使用ABC / 2法进行定量46，47。这种经过充分验证的方法包括测量血肿的最大轴向尺寸（A），同一切片的垂直直径（B）以及通过计算血肿的切片数量估算出的颅尾尺寸（C）存在，然后将该数字乘以切片厚度。通过将这三个维度相乘并除以2来估计血肿体积，该2可以估计椭圆的简化体积。
入院时使用美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）48评估临床严重程度，ICH评分49评估初始预后。功能性预后由改良的Rankin量表（mRS）50和发病后90天的死亡率定义，以评估患者的中期预后。入院时已注册了由mRS评估的先前功能状况。
住院（入院）时从两个研究队列中获得了静脉血的血浆血浆样品。所有样品在收集后的4小时内进行处理，并保存在-80°C下。在开始任何实验之前，将样品在冰上解冻并彻底涡旋。在Luminex 200平台（Luminex Technology，Comercial Rafer SL，西班牙）和TIMP上，使用MAP Human MMP面板2（Milliplex，Millipore，达姆施塔特，德国）测量血浆MMP-1，-2，-7，-9，-10。 -1是在自动ELISA系统（Triturus，Movaco，西班牙）中使用TIMP-1的ELISA试剂盒（美国明尼阿波利斯的R＆D Systems）测量的。所有实验均由盲人研究人员根据制造商的说明进行。
在5周大的雄性C57 / BL6J小鼠（n = 12，西班牙恩维戈）中进行了出血分析。在这项研究中所有实验均根据对道德动物护理和使用实验动物的（2010/63 / EU）和纳瓦拉动物研究审查委员会的大学（参见批准欧共体准则进行了46，12）。实验方案如补充图1所示。 。简而言之，将动物用2.5％异氟烷麻醉，俯卧，并通过眼神经丛注射tPA（0.05 mg / Kg）。五分钟后，通过股静脉导管注射TIMP-1（0.05和0.2 mg / Kg）或生理盐水（在40分钟内推注10％推注和90％灌注）。开始治疗5分钟后，用手术刀刀片切开尾部的远端5mm段。将尾巴立即浸入装有预热盐水的试管中（在水浴中37°C）。出血时间定义为直到出血停止最多30分钟为止的时间。失血定义为在30分钟内收集的血液量，并在分光光度计（瑞士Tecan Sunrise）中测量吸光度，并根据已知量的血液生成的标准曲线进行量化33。
定义了所有临床，放射学和功能变量的描述性统计量（中位数，四分位间距，频率和百分比）。使用Shapiro-Wilk检验评估正常性。对于连续变量，使用Student t检验或Mann-Whitney U检验，对于分类变量使用χ2检验或Fisher精确检验，对ICH位置（深度和大叶指数ICH）之间入院时的特征进行双变量比较。考虑到两个队列中p <0.1的阈值，与单变量分析中与终点相关的所有协变量都包含在研究目标分子（MMP和TIMP-1）的多元线性回归分析中。由于其中一个群组的样本量较小，因此考虑对以下基准模型进行调整：模型1，TIMP-1，位置，和高血压（是/否）；模型2，TIMP-1，位置和NIHSS。最后，我们进行了固定效果的荟萃分析，将来自我们两个队列的数据进行了荟萃分析。使用Mann-Whitney U两尾检验对来自实验模型的数据进行统计分析。
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