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TET1缺乏症损害人类胚胎干细胞向神经外皮的无形态分化

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发表时间:2020-06-29 17:19作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

TET1缺乏症损害人类胚胎干细胞向神经外皮的无形态分化

TET的5-甲基胞嘧啶(5mC)双加氧酶家族在修饰DNA甲基化的过程中起着至关重要的作用。使用CRISPR,我们使H9人类胚胎干细胞(hESCs)中的TET1基因失活。即使羟甲基胞嘧啶(5hmC)的水平降至野生型细胞的30%,突变的H9 hESC仍然具有多能性。双重SMAD抑制剂诱导的神经分化不受TET1活性丧失的显着影响。但是,在无形态原的条件下,TET1缺乏会显着减少NESTIN + SOX1 +的生成。神经外胚层细胞从野生型细胞的70%到突变细胞的20%。这伴随着PAX6表达水平降低了20倍,PAX6启动子上5hmC的量显着降低。在分化过程中,TET1缺陷型hESCs中TET1催化域的过表达显着增加了5hmC水平和PAX6表达。与这些体外一致数据显示,在缺乏TET1的hESC形成的畸胎瘤中,PAX6表达显着降低。但是,TET1缺乏并不能阻止畸胎瘤中神经管样结构的形成。我们的研究结果表明,TET1缺乏会削弱hESC分化为神经外胚层的内在能力,大概是通过降低人类神经外胚层发育中的关键调节因子PAX6的表达来实现的。

介绍

包括人类胚胎干细胞(hESCs)在内的人类多能干细胞(hPSC)的用途在于其无限自我更新的能力,以及它们在包括细胞替代疗法2在内的许多应用中可以分化为所有类型的体细胞1的潜力到感兴趣的特定细胞类型hPSCs的定向分化是外遗传转化方法345因此,了解hPSCs分化中的表观遗传机制对于破译人类的发展和改善体外难以进入的人类细胞类型的产生至关重要DNA甲基化是表观遗传学调控的主要机制之一6,通过促进局部染色质状态说明书7,调节基因表达的89和与组蛋白修饰配合1011125-甲基胞嘧啶胞嘧啶(5mC)表示主并在哺乳动物DNA甲基化的最佳表征的部件613145MC的活性脱甲基化需要一系列由一零一一年易位(TET)双加氧酶家族的催化氧化反应的151617,其依次氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)至5-羟甲基(5hmC的)15,然后改为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)18后两者的衍生物可以通过DNA修复系统识别和修复胞嘧啶,从而功能性地通过这个过程5MC恢复到Ç 19TET蛋白在发育和疾病的许多重要的细胞过程调节DNA甲基化和它们的功能,因此细胞的表观遗传状态刺激了深入研究的重要作用2021

其中TET家族的三名成员,TET1是最丰富的胚胎干细胞2223几项研究已经产生TET1失功能小鼠ESC 2224或TET1敲除小鼠2526然而,在这些研究中报告的表型有显着的变化,从在发生故障维持多能性的体外24,在分化偏斜谱系定型22,早期胚胎致死性26,或通常正常发育25与受损的海马神经发生27高度可变的表型可能与小鼠的遗传背景和繁殖史有关26小鼠中的冲突表型和人TET1在人成纤维细胞向神经元的表观遗传重编程中的重要作用28促使我们研究人中TET1丢失的后果。在这项研究中,我们使用CRISPR / Cas9系统29灭活了TET1的催化活性,从而产生了TET1缺失的H9 hESC 缺乏TET1的hESC保持多能性,但在无形态发生素的条件下,向神经外胚层和神经元的分化受损。PAX6启动子上的5hmC水平显着降低,PAX6的表达也降低了,PAX6是人30中神经外胚层发育的关键调控因子缺乏TET1的hESCs中TET1催化域的过表达挽救了分化过程中hESCs中5hmC水平和PAX6表达的缺陷。与这些一致,源自TET1缺陷型hESC的畸胎瘤显示PAX6表达显着降低,但包含神经管样结构。该研究揭示了TET1在hESC分化为神经外胚层和神经元中的关键功能。

结果

H9 hESCs中CRISPR介导的TET1的失活

由于TET1的催化活性需要铁结合15,我们设计了一个指导RNA,在人TET1的催化域中的第一个铁结合位点之前引入双链断裂(图   1a)。在H9 hESC中以CRISPR / Cas9介导的基因靶向后,获得了两个在TET1的每个等位基因中具有移码突变的独立克隆。一个克隆(CDKO-1)在TET1每个等位基因的第一个铁结合位点携带1个碱基对(bp)的纯合子缺失(图   1b,c),产生移码突变,在下游形成24 bp的终止密码子。另一个克隆(CDKO-2)在TET1的一个等位基因上具有1 bp的缺失,在另一个等位基因上具有2 bp的缺失(图   1b,c)),分别在下游产生24 bp和20 bp的终止密码子。突变的H9 hESCs的两个品系均具有正常的核型(图   1d)。

图1
图1

H9 hESC中TET1催化域的CRISPR介导突变。a)CRISPR / Cas9在第一个铁结合位点之前引入了双链断裂,以诱导TET1基因中的非同源末端连接。b)从两个hESC克隆(CDKO-1和CDKO-2)的基因组DNA扩增的PCR产物的测序痕迹,显示每个克隆中两个等位基因的移码突变。c)克隆的PCR产物的测序,其显示在CDKO-1克隆中纯合的1bp缺失和在CDKO-2克隆中1bp和2bp的复合杂合缺失。移码突变破坏了铁结合位点和下游催化结构域。d)两个TET1突变体克隆的正常核型。

为了检查TET1突变对DNA甲基化和羟甲基化的影响,我们对从野生型(WT)和H9的两个突变株系分离的基因组DNA进行了点印迹分析,并使用了针对5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲基胞嘧啶( 5mC)。两个突变株系的5hmC水平显着降低,降至野生型H9水平的约30%(图   2a,b)(CDKO-1为30%±7%,CDKO-1为34%±10%)。 CDKO-2,由含12.5 ng DNA的点的强度计算得出)。这种减少是比已经在TET1缺陷小鼠ESC,其中5hmC的60%仍然观察到更严重的2225H9 hESCs中的TET1突变在5mC水平上未产生明显变化(图   2c,d),与以前对Tet1缺陷的mESCs的研究25一致通过质谱法测定,在人类多能干细胞中,5mC占总胞嘧啶的8%,而5hmC仅占总胞嘧啶的0.12%31因此,即使5hmC水平的显着降低也不会导致其前体5mC量的显着变化。免疫染色证实,与野生型H9 hESC相比,两个TET1突变株显着降低了5hmC水平(图   2e,f)和未改变的5mC水平(图   2g,h)。

图2
图2

在缺乏TET1的hESC中降低了5hmC的水平。abWT和TET1缺失的hESC中5hmC的斑点印迹(a)和定量(b)。* p  <0.001,成对的Student t检验,n =3。(cd)点印迹(c)和WT和TET1缺失的hESC中5mC的定量。未经任何成像处理的斑点印迹的完整图像显示在(a)和(c)中。ê˚F)5hmC的染色(ë - E”)和定量(˚F)在WT(ë)和TET1缺失的(e'和e”)hESC。* p  <0.001,学生 -test中,n = 5(ħ)5MC染色(GG”)和定量(ħ)在WT()和TET1缺陷型(G” G”)的hESC。比例尺,100 µm。i-k)用表达GFP或带有FLAG标签的TET1催化结构域(F-TET1CD)的慢病毒感染两个TET1突变型hESC系(KO1和KO2)。用指示的抗体(i印迹总细胞裂解物从这些细胞中分离的基因组DNA用针对5hmC(j)或5mC(k)。* p  <0.05,成对的学生t检验,n = 4。

TET1催化5mC氧化为5hmC的能力取决于催化域(CD)15TET1是一个大基因,具有13个外显子,编码2136个氨基酸的蛋白质。因此,我们通过突变催化结构域使TET1失活。为了测试TET1的催化活性对于我们观察到的表型是否重要,我们使用慢病毒在两个TET1突变hESC系(CDKO1和CDKO2)中过表达了FLAG标签的TET1催化域(FLAG-TET1CD)。FLAG-TET1CD的过表达(图   2i)显着增加了两个突变hESC系中的5hmC水平(图   2j),而没有显着改变5mC水平(图   2k)。

TET1缺乏症不影响人类胚胎干细胞的自发分化

缺乏TET1的hESCs具有正常的启动状态形态,如野生型H9细胞(图   3a-a ”),并表达了多能性标志物,例如NANOG(图   3b-b ”),OCT4(图   3c-c ”)。 ,Tra-1-81(图   3d-d),SSEA4(图   3e-e),Tra-1-60(图   3f-f),SSEA3(图   3g-g)和SOX2 (图   3h-h ”),其程度与H9中的相似,如荧光强度的量化所示(图   3i)。缺乏TET1的hESC在没有bFGF的悬浮培养中形成形态正常的胚状体(EB)(图   3j-j”)。在含血清的培养基中自发分化中,TET1缺陷型EBs产生了所有三个胚层的细胞,例如TUJ1 +外胚层细胞(图   3k-k ”),SMA +中胚层细胞(图   31-1 “)和AFP。+内胚层细胞(图   3m-m)与野生型H9一样有效。

图3
图3

在TET1缺陷型hESC中维持多能性。a–i在野生型(a–h)或TET1缺失(a'-h“)H9 hESC中,指定的多能性标记物(bh”)的相衬图像(a - a “)和免疫染色从每种条件的至少五个独立菌落定量荧光强度,并针对WT(i中的值进行标准化J-M”)野生型(J-米)或TET1缺陷(J” - )H9胚胎干细胞在含有血清的培养基中分化自发通过胚状体(J-J”),如对外胚层标记TUJ1(k - k”),中胚层标记SMA(l - l“)和内胚层标记AFP(m - m”的免疫染色所指示的,对所有三个胚层的细胞进行检测蓝色条,100 µm;白色条形,25 µm。

TET1缺乏症不会损害SMAD抑制剂诱导的定向神经分化

的SMAD途径由SB431542(SB)和dorsomorphin(DM)的抑制驱动的hESC向神经谱系分化323334正如以前在mESC中所做的研究表明,Tet1缺乏会损害神经外胚层的分化,我们将野生型H9和两个TET1缺乏的突变株分化为EB,并分别用10 µM SB431542和5 µM Dorsomorphin处理了7天,并在DMEM / F12和N2补充了另外7天(图   4a)。在分化的第14天,观察到神经外胚层细胞的形态学上无法区分的集落(图   4b-b ”)。这些菌落均匀表达神经外胚层标志物SOX1和NESTIN(图   4c-d”)。定量显示三行细胞中SOX1和NESTIN双阳性细胞的百分比没有显着差异(图   4h)。在第28天,WT和TET1突变株(图4e-e)中,神经培养基中复盖的神经外胚层细胞的进一步分化(图   4a)产生了TUJ1 +细胞   在分化的第50天,所有三系培养物均包含正常形态的神经元(图   4f-f ”),并表达成熟的神经元标记物MAP2和泛神经标记物TUJ1(图   4g-g ”)。在这三系培养物中,MAP2和TUJ1双阳性细胞的百分比没有显着差异(图   4i)。

图4
图4

在双重SMAD抑制下,TET1缺陷型hESC的正常神经分化。a)使用两种SMAD抑制剂SB431542(SB)和dorsomorphin(DM)的神经分化方案图。EB,胚状体。N2,N2补品。b - d”)相差图像(b - b )和免疫染色,在D14时从指定的hESC系获得EB衍生菌落的神经谱系标记SOX1和NESTIN(c - d”)。相应地,在(d - d”中放大了在(c - c”)中染色的代表性菌落e - e”)在D28进行泛神经标记TUJ1的免疫染色。f - g“在D50时成熟神经元的TUJ1和MAP2(g - g”)的相衬图像(f - f“)和免疫染色h来自3个独立实验的D14处SOX1 + NESTIN +神经外胚层细胞的定量i从3个独立实验中量化D50时TUJ1 + MAP2 +成熟神经元。棒,100 µm。

TET1缺乏会损害无形态发生素条件下hESC的神经分化

作为双SMAD抑制人类胚胎干细胞定向到神经外胚层3233,我们研究了TET1缺陷型人类胚胎干细胞的分化中的自由形态发生条件来了解是否人类胚胎干细胞的分化固有程序由TET1突变的影响。将H9或TET1突变型hESC解离为单细胞,将其聚集在不含bFGF的hESC培养基中的Aggrewells中,并悬浮培养7天,然后再铺板以在N2培养基中进行贴壁培养另外7天(图   5a))。在第14天,由EB形成的每个菌落均包含不同百分比的SOX1和NESTIN双阳性神经外胚层细胞,反映了不同菌落中神经外胚层的完整性。我们根据菌落中所有细胞中SOX1和NESTIN双阳性细胞的百分比将这些菌落分为三组,并遵循以下标准(图   5b-d)。百分比大于70%的菌落被分配给“完全”(图   5b-d),百分比在20%和70%之间的菌落被分配给“部分”(图   5b'-c'),而小于20%被分配给“有限”(图   5b” -d”))。TET1缺乏症显着降低了“完全”菌落的百分比并增加了“有限”菌落的百分比,而没有显着改变“部分”菌落的百分比(图   5e)。

图5
图5

TET1缺陷型hESCs的无分化原条件下神经分化的早期受损。a)从第0天到第14天,在无形态发生子的条件下将胚状体(EB)分化成早期神经谱系的方案。N2,N2补充剂。b–d“)通过单个菌落内所有细胞中SOX1 + NESTIN +细胞的百分比将三种类型的神经上皮菌落分类,代表了神经谱系承诺的完整性。完整的菌落,SOX1 +巢蛋白+百分比> 70%(独立通道和合并图像的b–d);具有SOX1 + NESTIN +的部分菌落20-70%(百分比之间'B - d'); 有限,具有SOX1菌落+ NESTIN +百分比<20%(B” - d”)。棒,500 µm。e)WT和H9 hESCs的两个TET1缺陷株在D14形成的每种菌落的百分比。* p  <0.001;Fisher精确检验,每个细胞系n = 40个菌落。

重新克隆菌落并在N2培养基中进一步分化直到第28天,然后在神经培养基中直到第50天(图   6a)。在第28天,与野生型H9和TET1突变体hESCs的SOX1和NESTIN共染色(图   6b-e”)显示,TET1突变体系中SOX1 + NESTIN +神经外胚层细胞显着减少。类型(图   6f)。在第50天,将细胞与泛神经标记物TUJ1和成熟神经元标记物MAP2以及DAPI一起染色(图   6g-j”)。从野生型H9分化而来的培养物中包含许多具有复杂过程的神经元(图   6g),其中许多是MAP2阳性的(图   6h))。相反,两个TET1突变株产生的TUJ1 +细胞没有神经元过程(图   6g'-g”),也没有明显的MAP2表达(图   6h'-h”)。MAP2和TUJ1双阳性细胞的定量显示分别从野生型的41±20%显着降低至两个TET1突变株的1±1%和1±1%(图   6k)。

图6
图6

缺乏TET1的hESC不能在无形态原的条件下分化为神经元。a)在无形态发生原条件下将神经上皮细胞分化为神经元的方案。N2,N2补品。b–f)在分化的第28天,将野生型(b–e)或TET1缺陷型(b'-e“)H9 hESC 产生的神经外胚层细胞染色,用于SOX1(b–b”),NESTIN(c –c”)和DAPI(d–d”)。合并图像(e–e“)用于量化所有DAPI +细胞中的SOX1和NESTIN双阳性细胞的百分比(f)。* p  <0.001,学生的t-test,n =3。(g–k)在第50天,将与野生型或TET1缺陷型H9 hESCs分化的细胞共染色,用于泛神经标记TUJ1(g–g“),成熟神经元标记MAP2。 (h–h”)和DAPI(i–i”)。合并图像(j–j”)用于量化所有DAPI +细胞中MAP2和TUJ1双阳性神经元的百分比k)。* p  <0.001。学生t检验,n =3。条,100 µm。

TET1缺乏症降低PAX6表达和PAX6启动子的羟甲基化

要了解为什么TET1突变会削弱hESC分化为神经系的内在能力,我们在吗啡原形成过程中的分化过程中,测量了神经分化的几个关键早期标志物(如PAX6,SOX1,NESTIN,N-钙黏着蛋白和FOXG1)的表达水平。自由状态。在第14天,在两个TET1突变体中,大多数这些标记基因的表达水平均显着降低,除了仅在一个TET1突变体中观察到SOX1表达显着降低(图   7a)。它证实了神经谱系承诺的系统性缺陷。为了了解这些缺陷的起源,我们在D7时测量了这些基因在EB中的表达,发现所有这些标记基因的表达均显着降低(图   7b)。)。最显着的下降是PAX6的表达,它在TET1突变体中的表达比在WT EB中低约20倍。

图7
图7

缺乏TET1的hESC的神经分化受损,同时PAX6启动子的5hmC含量降低。ab)qRT-PCR测量在无形态发生子条件下与野生型(WT)或TET1缺陷型(CDKO-1和CDKO-2)H9胚胎干细胞分化的细胞中指示的神经谱系标志物的表达水平在第14天(a)和第7天(b)。* p  <0.05,成对的学生t检验,n =3。(c–e)在表达细胞无GFP的条件下分化了两种表达GFP或FLAG-TET1CD的慢病毒感染的TET1突变hESC系(CDKO1和CDKO2)。通过qRT-PCR分析分化的第10天的胚状体的神经上皮细胞基因PAX6(c),FOXG1(d)和SOX1(e的表达水平* p  <0.05,成对的学生t检验,n =6。(fg)hMeDIP测量在吗啡原形成的EBs中PAX6,FOXG1或miR218(与早期神经分化无关的基因)的启动子区域的5hmC含量。游离条件(f)或未分化的hESC(g)。* p <0.05,学生t检验,n =3。(hi)MeDIP测量在无形态发生子条件(h)或未分化hESC(i)中形成的EB中PAX6,FOXG1或miR218启动子的5mC含量

为了检查这些基因的减少是否确实是由TET1催化活性的丧失引起的,我们在慢病毒中两株TET1缺失的hESC(CDKO1和CDKO2)中用慢病毒过度表达了FLAG标签的TET1催化域(TET1CD)或GFP。 。   2I)。这些hESCs在无形态原的条件下分化。在分化的第10天,类胚体中神经外胚层基因(例如PAX6,FOXG1和SOX1)的表达水平在CDKO2中得到了部分挽救,在CDKO1中得到了部分挽救(图   7c-e)。CDKO1的部分拯救可能是由许多因素引起的,例如由于随机基因组整合导致病毒转基因的可变表达,以及无形态原的条件对细胞分化产生的随机影响。

由于PAX6在hESCs分化和人类早期发育过程中作为启动神经外胚层命运的主要转录因子30,我们研究了PAX6启动子的羟甲基化是否受到TET1突变的影响。使用hMeDIP分析,将第7天从EB分离的片段化基因组DNA用抗5hmC进行免疫沉淀。通过qPCR测量免疫沉淀物中PAX6启动子的量。与野生型相比,来自TET1突变体的EB中PAX6启动子中的5hmC水平显着降低(图   7f)。与第14天(图7a)和第7天(图7b)   FOXG1表达降低一致 ),在EB期的TET1突变体中,FOXG1启动子中的5hmC水平也显着降低(图   7f)。作为对照,在与早期神经分化无关的基因miR218的启动子中未发现羟甲基化的显着变化(图   7f)。出乎意料的是,与野生型H9相比,在具有TET1突变的未分化hESC中观察到PAX6启动子和FOXG1启动子的羟甲基化降低(图   7g)。MeDIP分析表明,PAX6启动子和FOXG1启动子上的5mC水平非常低,并且在EB(图7h)或未分化的hESC(图7i之间没有显着差异   )(带有或不带有TET1突变)。PAX6和FOXG1的表达水平太低,无法通过qRT-PCR在野生型H9和TET1突变型hESC中可靠地检测到。

缺乏TET1的hESC在畸胎瘤中PAX6和SOX1的表达降低

为了证实这些体外发现,我们在两个TET1缺陷型品系及其亲本野生型H9 hESCs上进行了畸胎瘤形成测定。从这些畸胎瘤中分离出的总RNA中,我们发现在两个TET1缺陷型hESC形成的畸胎瘤中,PAX6和SOX1的表达水平显着降低(图   8a)。TEC1 的丢失并没有显着改变FOCG1和TUBB3(图8a),中胚层基因(图   8b)和内胚层基因(图   8c等其他皮层基因的表达水平   为了证实PAX6和SOX1的发现,我们对来自畸胎瘤的低温恒温器切片进行了免疫染色。PAX6(图   8d–f,j)和SOX1(图8d)的水平。 8克-J 荧光强度确实显著在由两个TET1缺陷型人类胚胎干细胞形成畸胎瘤降低。作为对照,OTX2的荧光强度在这些畸胎瘤切片中无显着差异(图   8d'-f',j)。尽管PAX6表达降低,但在两个TET1缺陷型hESC和亲本野生型H9 hESC产生的畸胎瘤的低温恒温器切片中发现了PAX6 +神经管样结构(图   8k–m)。对这些畸胎瘤的石蜡切片进行H&E染色后发现,所有三个细菌层都存在组织,包括有色的视网膜上皮,其来源于神经外胚层(图   8n–p)。它证实了在缺乏TET1的畸胎瘤中神经管状结构的形成。

图8
图8

减少TET1缺失的hESC形成的畸胎瘤中PAX6和SOX1的表达降低。ac)定量RT-PCR测量从TET1缺失(KO1和KO2)形成的畸胎瘤中分离出的总RNA 外胚层(a),中胚层(b)或内胚层(c的标记基因表达水平野生型(WT)H9 hESC。* p  <0.05,与WT相比,n = 8-14。KO1和KO2之间没有显着差异。dj)这些畸胎瘤的低温切片被染色为PAX6,OTX2和DNA(d–f'”)或SOX1和DNA(g–i”)。)。量化了这些部分中PAX6,SOX1和OTX2每个细胞的平均荧光强度(j)。* p  <0.05,相对于WT,n =12。KO1和KO2之间无显着差异。这些畸胎瘤的低温恒温器切片中的k–m)PAX6 +神经管样结构。n–p)这些畸胎瘤的石蜡切片的H&E染色。外胚层,外胚层; 中观,中胚层; 内胚层

讨论区

在这项研究中,我们通过在其催化结构域中引入终止密码子来生成TET1缺陷型H9 hESC,从而将5hmC的水平降低至野生型H9细胞中的30%(图   2)。在标准的含血清条件下(图3)和畸胎瘤形成试验(图   8),TET1缺乏症在标记基因表达和hESC分化为所有三个胚层细胞的能力方面并未显着改变多能性   因此,我们的研究与早期研究一致,后者表明小鼠中Tet1的丢失不会显着损害多能性和发育25

取而代之的是,TET1缺乏会损害hESC的内在能力,使其在无形态发生素的条件下分化为神经外胚层(图   5)和神经元(图   6)。损伤伴随着在分化的第7天类胚体中PAX6和FOXG1的表达急剧下降,在第14天在神经外胚层细胞中持续存在(图   7)。在缺乏TET1的畸胎瘤中证实了PAX6和SOX1的表达降低,尽管不是FOXG1降低(图   8)。在多次独立测定中,PAX6表达的持续降低更有意义,因为PAX6是人类胚胎早期hESC分化为神经外胚层和神经外胚层发育的关键调节剂30hESCs中PAX6的过表达驱动多能性神经外胚层的退出,而PAX6敲低则阻止hESCs的分化30在缺乏TET1的hESC中,即使hESCs中的PAX6和FOXG1表达太低而无法可靠地检测到,PAX6和FOXG1的启动子处的5hmC水平也明显降低(图   7g)。因此,在缺乏TET1的hESCs中,PAX6启动子上5hmC的降低为退出hFGF分化bFGF时在胚状体和神经外胚层中表达降低的基因奠定了基础。

在两种SMAD抑制剂(SB431542和dorsomorphin)的存在下,TET1缺陷型hESC的分化不受影响(图   4)。一种可能性是,TET1缺陷型hESC中PAX6表达的降低可能不足以阻止双重SMAD抑制作用提供的强神经分化信号33即使在存在双重SMAD抑制剂的情况下,RNAi直接消融PAX6表达也会阻止hESC分化为神经外胚层30因此,TET1缺失的hESCs中PAX6启动子的羟甲基化可能导致PAX6的表达降低,但不能阻止双重SMAD抑制引起的神经分化。通过生成TET1缺陷型H9 hESC,该研究表明TET1在PAX6启动子的羟甲基化和PAX6 在体外(图   7)和体内(图8的表达中起关键作用),因为PAX6严格调节hESC向神经外胚层的分化。TET1催化活性的丧失并没有显着损害hESCs的多能性,但大大损害了hESCs分化为神经外胚层的内在能力。确实,TET1催化域的过表达挽救了缺乏TET1的hESCs 中5hmC水平的缺陷(图   2i–k)和神经分化(图   7c–e),进一步证明了TET1催化5mC转化为hmC的能力。 5hmC对于支持hESC分化为神经外胚层很重要。人TET1 在体内的功能尽管PAX6表达显着降低,但TET1缺乏并不能阻止畸胎瘤中神经管样结构和神经外胚层衍生物的形成,例如色素化的视网膜上皮形成,因此似乎更细微了(图   8)。其他混杂因素,例如其他TET基因的存在和畸胎瘤形成试验的随机性,可能有助于观察。

方法

CRISPR质粒的构建

使用在线工具http://crispr.mit.edu/设计了TET1-CDKO CRISPR网站(GACTTCTGTGCTCATCCCCACAC)按照先前公布的方案35将相应的行会RNA序列克隆到pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458,Addgene)中使用Surveyor核酸酶测定法(Integrated DNA technologies,IDT)在293T细胞中证实了该CRISPR站点和质粒的功效。

hESC培养和基因编辑

H9 hESCs在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上培养,如先前所述36简而言之,将hESCs在hESC培养基(DMEM / F12、20%KOSR,1x NEAA,1x谷氨酰胺,1x青霉素链霉素,4 ng / ml bFGF)的MEF饲养器上繁殖7天,并用1 mg / ml分散酶(Stemcell Technologies)解离)成小块,并在新的MEF喂料器上按1:6播种。为了在TET1的催化域中产生突变,将H9细胞在mTeSR1(Stemcell技术)培养基37中的基质胶包被的容器(Corning#354277)上培养,每4-5天与Accutase(Stemcell技术)传代为单细胞。将TET1-CDKO CRISPR质粒(10μg)递送至1×10 6使用Nucleofector 2B(Lonza)和程序A23,将H9 hESC悬浮。在基质胶上培养2天后,将细胞解离为单细胞,并通过FACS分选出GFP +细胞,然后将其接种在基质胶上并再培养10天。手工挑选单个H9菌落,解离并作为单个克隆进行培养。使用蛋白酶K从这些单独的克隆中提取基因组DNA。通过PCR扩增TET1的CRISPR靶向位点侧翼的400bp区域(表S1中列出的引物   ),并进行测序以鉴定在至少一个等位基因中具有突变的克隆。将PCR片段克隆到TA载体中并测序以确定突变克隆的确切基因型。

含血清培养基中的自发分化

在MEF饲养细胞上培养7天后,将hESC使用1 mg / ml分散酶解离为中等大小的团块,并转移至T25未处理的培养瓶(Nunc)中,从而在EB培养基(DMEM / F12)中形成胚状体(EB)。 ,20%KOSR,1x NEAA,1x谷氨酰胺,1x青霉素和链霉素)治疗4天。每隔一天更换一次培养基。在传代后的前2天中加入了ROCK抑制剂(Y27632,10 µM)。然后将EB接种在0.1%明胶包被的板上,并在含血清的培养基(DMEM / F12,10%FBS)中培养另外3周,然后再进行细菌层特异性标记物的免疫染色。

神经分化

在MEF饲养细胞上培养7天后,hESC与TryLE分离为单个细胞。我们向超低附着力96孔圆底微孔板(Corning)的每个孔中添加2000个细胞,并在EB培养基中培养细胞。在前4天内添加了ROCK抑制剂(10 µM)。规范的神经分化方案中添加了两种SMADs抑制剂SB431542(10 µM)和Dorsomorphin(5 µM)34,但在无形态原的条件下被省略。在第7天,将EB接种在基质胶包被的平板上,并在N2培养基(DMEM / F12、1x N2补充剂,1x NEAA,1x青霉素/链霉素)中培养。在第14天,将细胞与TryLE解离成单个细胞,并重新铺在基质胶包被的平板上,并在N 2培养基中培养。为了进一步进行神经元分化,将解离的细胞以2×10 4 / cm 2的浓度在神经培养基(神经基底膜,1×B27补充剂,1×谷氨酰胺,1×NEAA,1×青霉素/链霉素,20 x 2)上以聚鸟氨酸/基质胶包被的平板重新铺板。ng / ml NGF,20 ng / ml BDNF,20 ng / ml GDNF),两天后添加0.5 mM dcAMP和2.5 µM DAPT。

点印迹

以下的先前方案进行使用斑点印迹5MC或5hmC的水平的测量28简而言之,使用QIAamp DNA mini Kit(Qiagen)提取hESCs的基因组DNA,在0.1 M NaOH中于100°C变性10分钟,并用等体积的冷2 M醋酸铵(pH 7.2)中和。将稀释至所需浓度的每个样品三微升点在硝酸纤维素印迹膜(Amersham,GE Healthcare)上,并在空气干燥后进行UV交联。将膜在TBST(20 mM Tris,150 mM NaCl,0.1%Tween 20,pH 7.5)中短暂冲洗,并在室温(RT)下与封闭溶液(TBST中3%BSA)孵育1小时,然后与原液一起孵育抗体在封闭液中于4°C稀释过夜。第二天,将膜在TBST中洗涤4次,每次15分钟,并在封闭溶液中与HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时,然后再次在TBST中洗涤4次。

定量RT-PCR

使用Purelink RNA mini试剂盒(Thermo Fisher)提取每个样品的RNA,并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-rad)反转录。使用iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad)在CFX96 Touch™实时PCR检测系统(Bio-rad)中进行实时定量PCR。引物序列列于表   S1中

5mC或5hmC电平的MeDIP / hMeDIP测量

使用MeDIP / hMeDIP 38在PAX6启动子上测量5mC或5hmC水平简而言之,使用QIAamp DNA mini Kit(Qiagen)提取hESCs的基因组DNA,在100 mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀释至300 ng /μl,并在冰上用Sonic 300 Dismembrator(Fisher)片段化至200–600 bp。 。使用MeDIP / hMeDIP试剂盒(活性基序)进行免疫沉淀。在每个反应中,将0.5μg片段化的基因组DNA分别与4μg抗5mC或5hmC的抗体在试剂盒中提供的缓冲液中于4°C孵育过夜,然后按照试剂盒手册用Protein G磁珠沉淀。免疫沉淀用作模板,用于PCR扩增覆盖PAX6启动子或控制基因miR218的特定DNA序列。按照试剂盒的建议,将0.05μg片段化的基因组DNA用作输入。 S1

慢病毒介导的抢救

FUW-TETO-FLAG人类TET1 CD(催化结构域,4252-6411核苷酸),构建并包装在293FT细胞如前所述28在8 ng / ml聚丙烯存在下,用MOW为30的FUW-TetO-FLAG-hTET1CD或FUW-TetO-GFP和M2rTA将CDKO1和CDKO2细胞感染过夜。第二天,将细胞用DMEM / F12洗涤3次,并将1μg/ ml DOX加入培养基中。在1μg/ ml DOX存在下将细胞进一步培养3天。提取基因组DNA,以5mC或5hmC进行斑点印迹。分裂一些细胞以制备EB,并在不含吗啡的含1μg/ ml DOX的条件下培养10天。提取RNA用于qRT-PCR。

免疫荧光

如先前所述进行免疫染色36将细胞用PBS中的4%多聚甲醛固定20分钟,在室温下用0.1%的PBS中的Triton X-100透化30分钟,在室温下在PBS中的3%BSA中封闭60分钟,然后在第一抗体中于室温孵育过夜。 4°C,二级抗体在室温下放置2小时。S2列出了本研究中使用的抗体的信息   在Leica AF6000倒置荧光显微镜上获取荧光图像。对于每种条件,使用10倍放大率的5个独立框架或5个单独的菌落手动进行细胞定量。

畸胎瘤形成测定

如前所述36,将一百万个hESC(野生型H9,CDKO1或CDKO2 TET1突变体H9)与胶原蛋白以1:1的比例混合,并分装成〜10 µl颗粒,将其移植到SCID小鼠的每个肾脏的肾囊下(CB-Igh-1bIcrTac-Prkdcscid / Ros)。使用小鼠的两个肾脏,并且将三只小鼠用于每行hESC。移植后2至3个月,每个hESC系均发现大肿瘤(大小约1厘米)。解剖畸胎瘤组织,以便将一部分溶解在Trizol中以提取总RNA,另一部分固定在4%多聚甲醛中进行包埋和低温恒温器切片,第三部分固定在10%福尔马林中24小时并进行石蜡包埋处理。并用苏木精和曙红染色以进行组织学鉴定。罗斯维尔公园综合癌症中心的机构动物护理和使用委员会批准之后,由罗斯维尔公园综合癌症中心的小鼠肿瘤模型资源进行了畸胎瘤形成试验的所有动物工作。根据相关准则和规定对动物进行所有实验。

统计

所有统计测试均在R 3.0(用于统计计算的R项目)中进行。误差棒代表SD(标准偏差)。分别对WT与CDKO1和WT与CDKO2进行了指示性统计检验,因为它们是独立的比较。在qRT-PCR实验中,使用成对的学生t检验来最小化批次间变异的干扰。




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